禽流感疫苗的制备方法及其产品与流程

本发明涉及禽流感疫苗的制备方法及其产品，尤其涉及采用无血清悬浮培养技术制备禽流感疫苗的方法以及得到的禽流感疫苗产品，属于禽流感疫苗活疫苗的制备领域。

背景技术：

禽流感疫苗传统的生产方式大多采用鸡胚培养体系，生产成本昂贵，且残留物可能引起过敏反应；且用于疫苗生产的鸡胚为有计划供应，无法应对大规模的禽流感疫情的暴发。因此采用鸡胚培养体系生产的禽流感疫苗其质量和数量难以控制，迫切需要开发连续、.稳定、大规模且经济有效的动物细胞培养系统，以提高禽流感病毒疫苗的生产效率，降低生产成本。相比鸡胚培养体系而言，采用动物细胞(如df-1细胞)培养系统生产禽流感疫苗具有病毒分离阳性率高、病毒敏感性高、应急性强、生产效率高和可减少宿主蛋白成分污染等优点，具有广阔的应用前景。

传统的df-1细胞培养多数采用有血清贴壁培养，然而血清成份复杂，并增加了产物分离纯化的难度；血清来源有限，价格昂贵，生产成本高；血清的质量因动物个体、血清产地、生产批号不同而产生波动，使得实验和生产难以实现标准化。df-1细胞是贴壁依赖性的细胞，只有贴附到基质表面其才能存活、增殖和表达产物。传统的df-1细胞培养方法采用二维单细胞层培养，由于受到基质表面积限制，加之消化工艺复杂、生产时间长和生产成本高等困扰，难以实现df-1细胞大规模培养。而df-1细胞全悬浮培养体系除了可以突破细胞生长表面限制之外，细胞培养环境更加均一，利于生产规模的放大和监控。df-1细胞全悬浮培养有很多优点：无需昂贵的微载体，可以省去消化收获细胞的操作，从而有效降低生产成本，缩短生产时间，提高生产效率；由于无需贴附基质，故对培养器皿的表面性状要求不高，还可以节约设备空间，提高设备的利用率，便于扩大生产规模；生产过程中无需微载体和消化液，从而可大大减少杂质引入，简化产品的后期分离纯化过程,降低成本。

目前已有报道采用全悬浮的mdck细胞来培养禽流感病毒，但该细胞对于禽类来说属于异源细胞，会引起禽类免疫系统的强烈反应，从而浪费机体的免疫潜力。采用全悬浮df-1细胞可以代替mdck细胞增殖禽流感病毒具有明显的优势，首先它是商品化的禽源细胞系，其次对于禽类病毒来讲它是同源的，对病毒更敏感，而且细胞的生长密度大，培养病毒的滴度更高。

因此，将df-1细胞进行全悬浮驯化培养获得适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的细胞以及将其应用于禽流感疫苗的制备，对于降低禽流感疫苗的生产成本和污染风险、进行规模化生产等均具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一株适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞；

本发明的目的之二是应用所驯化获得的适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞(df-1细胞)制备禽流感疫苗，该制备方法采用悬浮培养技术降低禽流感疫苗的生产成本和污染风险，能够进行规模化工业生产。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明将传代鸡胚成纤维细胞(df-1细胞)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得一株适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞，该细胞被命名为df-1-xf。

本发明首先采用逐步降低血清的方法驯化df-1细胞以适应低浓度血清培养：本发明将含10％新生牛血清的mem培养液中稳定生长的df-1细胞长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的mem培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×10⁵cells/ml传代于含5％新生牛血清的mem培养液中；经过数代后，df-1细胞在含5％新生牛血清的mem培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯化培养；以同样的方法使df-1细胞逐步适应含1％新生牛血清的mem培养条件。随着血清使用浓度的降低，df-1细胞贴壁生长的形态逐步发生改变，最终经无血清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。df-1细胞从血清浓度10％降到5％，细胞未出现肉眼可见的形态差异，没有表现出不适应。当血清浓度降低至1％时，细胞生长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复，但细胞形态出现变圆的趋势，仅有个别细胞呈现出稍悬浮生长的状态。被动悬浮培养适应，df-1细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在悬浮培养驯化后期，悬浮df-1细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明df-1细胞已经适应了无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态；本发明经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的df-1细胞命名为df-1-xf细胞。

本发明将驯化培养获得适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的df-1-xf细胞提交到专利认可的机构进行保藏，其保藏编号是：cgmccno.16295，分类命名是：适应全悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞；保藏日期是：2018年9月6日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理中心普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明进一步提供了一种应用所述的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的df-1-xf细胞制备禽流感疫苗的方法，包括：

(1)将df-1-xf细胞接种到摇瓶中进行振荡培养；(2)向振荡培养后的细胞接种禽流感病毒进行增殖培养；(3)收获病毒液；(4)将病毒液灭活后，配苗，即得禽流感疫苗。

本发明分别将禽流感病毒接种至鸡胚、传代cef细胞、传代mdck细胞和悬浮df-1-xf细胞进行病毒增殖，分别对收获的病毒液进行血凝价比较，比较结果表明，采用悬浮df-1-xf细胞培养禽流感病毒显著高于采用鸡胚培养、传代cef细胞和传代mdck细胞培养禽流感病毒收获的血凝价。

步骤(1)中所述的振荡培养时间可以是12-96小时；本发明进一步通过试验发现，振荡培养时间对于病毒培养后的血凝价影响较大；本发明将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于摇瓶中，分别于细胞培养24小时、36小时、48小时和60小时，从恒温摇床中取出摇瓶，静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液。结果表明，细胞培养60h后接种禽流感病毒，病毒血凝价最高可达11log2；因此，步骤(1)中所述的振荡培养时间优选为60h。

本发明将df-1-xf细胞以接种于摇瓶，培养48h后从恒温摇床中取出摇瓶，分别以批培养和沉淀换液两种方式处理接种病毒。批培养即直接接种禽流感病毒，同时补加终浓度为2μg/ml的tpck-胰酶；沉淀换液即摇瓶静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液，接种禽流感病毒后同时补加终浓度为2μg/ml的tpck-胰酶，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒血凝价，以确定最适的接毒工艺。试验结果发现，换液工艺收获病毒的血凝价比批培养工艺高，批培养24小时检测不到病毒血凝价，接毒后72小时达到血凝价最高为7log2，换液工艺在接毒后24小时就能产生出较高血凝价5log2，接毒后72小时达到最高血凝价。

因此，本发明在步骤(2)优选采用沉淀换液这种方式接种病毒，即：将振荡培养完成后的细胞进行静止让细胞完全沉淀，弃去上清；向沉淀细胞补加病毒生长液后接种禽流感病毒并同时补加终浓度为1-12μg/ml的tpck-胰酶。

本发明进一步发现，所补加的tpck-胰酶的终浓度对于病毒液的培养效果也有较为显著的影响；为了筛选出最佳的tpck-胰酶的终浓度，本发明将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于250ml的摇瓶，培养60h后从恒温摇床中取出摇瓶，在超净台中静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液。按moi为0.001接种禽流感病毒，分别补加终浓度为2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml的tpck-胰酶。培养过程中每隔24小时取样，测定病毒血凝价，以确定最适tpck-胰酶浓度。结果发现，在tpck-胰酶终浓度为2μg/ml和4μg/ml的条件下病毒增殖速度相似，最高病毒血凝价均为11log2，而当tpck-胰酶终浓度为8μg/ml和10μg/ml时，细胞迅速破碎，病毒血凝价较低。因此，本发明优选采用加入tpck-胰酶最佳的浓度为2-4μg/ml，最优选为2μg/ml。

本发明更进一步的发现，接毒剂量对于病毒液的血凝价影响也非常大，为了摸索筛选出最佳的接毒剂量，本发明将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于250ml的摇瓶，培养60h后从恒温摇床中取出摇瓶，静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液。分别按moi为0.01、0.001和0.0001接种禽流感病毒，同时补加终浓度为2μg/ml的tpck-胰酶。培养过程中每隔24小时取样，测定病毒血凝价，以确定最适接毒剂量。结果发现，当病毒接毒剂量moi为0.001时，病毒血凝价最高可达11log2；因此，在步骤(2)中优选以moi为0.001的接毒剂量向细胞接种禽流感病毒。

步骤(2)中所述的增殖培养时间可以是24-96h，优选为72h；其中，所述的增殖培养的条件还包括：ph控制为7.2、溶氧(do)为50％、温度36℃、搅拌转速为100r/min；

步骤(4)中所述的配苗包括：

(a)制备油相:将白油93份，span-805份，混合后加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌，备用；

(b)水相制备：取tween-807份，加入灭活病毒液93份，充分振摇，使tween-80完全溶解为止；

(c)乳化：取油相2份，放于乳化剂中，搅拌，同时加入水相1份，加完后，再进行搅拌，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液使其终浓度为0.01％。

本发明禽流感疫苗的制备方法采用无血清悬浮培养技术，与血清贴壁培养技术相比，本发明制备方法无需昂贵的微载体，省去了消化收获细胞的操作，显著降低了污染风险和生产成本，有效缩短了生产时间；本发明制备方法所制备的禽流感疫苗安全性好、效价高；不需要贴附基质，可节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。

附图说明

图1df-1细胞驯化过程中的细胞形态变化；a:悬浮培养初期；b:悬浮培养后期。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料

毒种：禽流感病毒(h9亚型)hy株，该株细胞保藏编号为cgmccno5409.，保藏日期为2011年10月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院。

实施例1适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的df-1细胞的驯化培养采用逐步降低血清的方法驯化df-1细胞以适应低浓度血清培养。将含10％新生牛血清的mem培养液中稳定生长的df-1细胞长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的mem培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×10⁵cells/ml传代于含5％新生牛血清的mem培养液中。经过数代后，df-1细胞在含5％新生牛血清的mem培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯化培养。以同样的方法使df-1细胞逐步适应含1％新生牛血清的mem培养条件。将适应了1％新生牛血清培养条件的df-1细胞在细胞三角瓶中进行悬浮培养驯化适应。细胞培养液为上海源培df-1无血清培养基，细胞初始接种密度为1.0×10⁶cells/ml，转速设置为160r/min，置于5％co2培养箱中进行悬浮培养。

随着血清使用浓度的降低，df-1细胞贴壁生长的形态逐步发生改变，最终经无血清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。df-1细胞从血清浓度10％降到5％，细胞未出现肉眼可见的形态差异，没有表现出不适应。当血清浓度降低至1％时，细胞生长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复，但细胞形态出现变圆的趋势，各别细胞呈现出稍稍悬浮生长的状态。被动悬浮培养适应，df-1细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在悬浮培养驯化后期，悬浮df-1细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明df-1细胞已经适应了无血清悬浮状态生长，将其命名为df-1-xf细胞。

实施例2禽流感疫苗的制备

1.将实施例1所驯化培养获得的df-1-xf细胞按照0.75×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到摇瓶中在摇床中进行振荡培养，培养48小时后静止让细胞沉降，待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液；按moi为0.01的接毒剂量接种禽流感病毒，同时补加终浓度为4μg/ml的tpck-胰酶，培养72h收获病毒液。其它悬浮培养条件：ph控制为7.2、溶氧(do)为50％、温度36℃、搅拌转速为100r/min；

2.灭活

将无菌检验合格的病毒液加入甲醛溶液，使甲醛溶液终浓度为0.2％。置37℃摇床上灭活24小时，期间振摇1次。

3.半成品检验

4.无菌检验

取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

5.灭活检验

取10日龄spf鸡胚8枚，各尿囊腔接种灭活病毒液0.1ml，置36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定血凝价，并盲传1代，测定血凝价：

采新鲜spf公鸡血，经抗凝处理，以pbs清洗血球3次，配制成1％鸡血球pbs液。在ha检测96孔板上用定量稀释器于每排各孔中加pbs25μl。吸取25μl待测样品于第1孔中，连续对倍稀释该样品至第11孔，弃去25μl，第12孔不加样品作为对照。每孔中补加25μlpbs，然后每孔分别加入25μl1％鸡血球pbs液，在振板器上振动20s，室温下作用20min。以出现完全凝集的最大稀释度为该样品的血凝价。灭活前对收获的病毒液测定ha效价，为9log2。

6.灭活疫苗的配制

6.1油相制备

取注射用白油93份，span-805份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121℃高压灭菌20分钟，备用。

6.2水相制备

取tween-807份，加入灭活病毒液93份，充分振摇，使tween-80完全溶解为止。

6.3乳化

取油相2份，放于乳化剂中，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后，再以2900r/min搅拌6分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。乳化后，取10ml疫苗以3000r/min离心15分钟，应无分层现象。

实施例3禽流感疫苗的制备

1.将实施例1所驯化培养获得的df-1-xf细胞按照0.75×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到摇瓶中在摇床中进行振荡培养，培养36小时后静止让细胞沉降，待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液；按moi为0.0001的接毒剂量接种禽流感病毒，同时补加终浓度为8μg/ml的tpck-胰酶，培养72h收获病毒液。其它悬浮培养条件：ph控制为7.2、溶氧(do)为50％、温度36℃、搅拌转速为100r/min；

2.灭活

将无菌检验合格的病毒液加入甲醛溶液，使甲醛溶液终浓度为0.2％。置37℃摇床上灭活24小时，期间振摇1次。

3.半成品检验

4.无菌检验

取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

5.灭活检验

取10日龄spf鸡胚8枚，各尿囊腔接种灭活病毒液0.1ml，置36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定血凝价，并盲传1代，测定血凝价：

采新鲜spf公鸡血，经抗凝处理，以pbs清洗血球3次，配制成1％鸡血球pbs液。在ha检测96孔板上用定量稀释器于每排各孔中加pbs25μl。吸取25μl待测样品于第1孔中，连续对倍稀释该样品至第11孔，弃去25μl，第12孔不加样品作为对照。每孔中补加25μlpbs，然后每孔分别加入25μl1％鸡血球pbs液，在振板器上振动20s，室温下作用20min。以出现完全凝集的最大稀释度为该样品的血凝价。灭活前对收获的病毒液测定ha效价，为8log2。

6.灭活疫苗的配制

6.1油相制备

取注射用白油93份，span-805份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121℃高压灭菌20分钟，备用。

6.2水相制备

取tween-807份，加入灭活病毒液93份，充分振摇，使tween-80完全溶解为止。

6.3乳化

取油相2份，放于乳化剂中，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后，再以2900r/min搅拌6分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。乳化后，取10ml疫苗以3000r/min离心15分钟，应无分层现象。

实施例4禽流感疫苗的制备

1.将实施例1所驯化培养获得的df-1-xf细胞按照0.75×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到摇瓶中在摇床中进行振荡培养，培养24小时后静止让细胞沉降，待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液；按moi为0.01的接毒剂量接种禽流感病毒，同时补加终浓度为2μg/ml的tpck-胰酶，培养72h收获病毒液。其它悬浮培养条件：ph控制为7.2、溶氧(do)为50％、温度36℃、搅拌转速为100r/min；

2.灭活

将无菌检验合格的病毒液加入甲醛溶液，使甲醛溶液终浓度为0.2％。置37℃摇床上灭活24小时，期间振摇1次。

3.半成品检验

4.无菌检验

取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

5.灭活检验

取10日龄spf鸡胚8枚，各尿囊腔接种灭活病毒液0.1ml，置36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定血凝价，并盲传1代，测定血凝价：

采新鲜spf公鸡血，经抗凝处理，以pbs清洗血球3次，配制成1％鸡血球pbs液。在ha检测96孔板上用定量稀释器于每排各孔中加pbs25μl。吸取25μl待测样品于第1孔中，连续对倍稀释该样品至第11孔，弃去25μl，第12孔不加样品作为对照。每孔中补加25μlpbs，然后每孔分别加入25μl1％鸡血球pbs液，在振板器上振动20s，室温下作用20min。以出现完全凝集的最大稀释度为该样品的血凝价。灭活前对收获的病毒液测定ha效价，为9log2。

6.灭活疫苗的配制

6.1油相制备

取注射用白油93份，span-805份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121℃高压灭菌20分钟，备用。

6.2水相制备

取tween-807份，加入灭活病毒液93份，充分振摇，使tween-80完全溶解为止。

6.3乳化

取油相2份，放于乳化剂中，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后，再以2900r/min搅拌6分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。乳化后，取10ml疫苗以3000r/min离心15分钟，应无分层现象。

实施例5禽流感疫苗的制备

1.将实施例1所驯化培养获得的df-1-xf细胞按照0.75×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到摇瓶中在摇床中进行振荡培养，培养60小时后静止让细胞沉降，待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液；按moi为0.01的接毒剂量接种禽流感病毒，同时补加终浓度为10μg/ml的tpck-胰酶，培养72h收获病毒液。其它悬浮培养条件：ph控制为7.2、溶氧(do)为50％、温度36℃、搅拌转速为100r/min；

2.灭活

将无菌检验合格的病毒液加入甲醛溶液，使甲醛溶液终浓度为0.2％。置37℃摇床上灭活24小时，期间振摇1次。

3.半成品检验

4.无菌检验

取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

5.灭活检验

取10日龄spf鸡胚8枚，各尿囊腔接种灭活病毒液0.1ml，置36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定血凝价，并盲传1代，测定血凝价：

采新鲜spf公鸡血，经抗凝处理，以pbs清洗血球3次，配制成1％鸡血球pbs液。在ha检测96孔板上用定量稀释器于每排各孔中加pbs25μl。吸取25μl待测样品于第1孔中，连续对倍稀释该样品至第11孔，弃去25μl，第12孔不加样品作为对照。每孔中补加25μlpbs，然后每孔分别加入25μl1％鸡血球pbs液，在振板器上振动20s，室温下作用20min。以出现完全凝集的最大稀释度为该样品的血凝价。灭活前对收获的病毒液测定ha效价，为7log2。

6.灭活疫苗的配制

6.1油相制备

取注射用白油93份，span-805份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121℃高压灭菌20分钟，备用。

6.2水相制备

取tween-807份，加入灭活病毒液93份，充分振摇，使tween-80完全溶解为止。

6.3乳化

取油相2份，放于乳化剂中，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后，再以2900r/min搅拌6分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。乳化后，取10ml疫苗以3000r/min离心15分钟，应无分层现象。

实施例6禽流感疫苗的制备

1.将实施例1所驯化培养获得的df-1-xf细胞按照0.75×10⁶cells/ml为细胞初始接种密度接种到摇瓶中在摇床中进行振荡培养，培养48小时后静止让细胞沉降，待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液；按moi为0.01的接毒剂量接种禽流感病毒，同时补加终浓度为2μg/ml的tpck-胰酶，培养72h收获病毒液。其它悬浮培养条件：ph控制为7.2、溶氧(do)为50％、温度36℃、搅拌转速为100r/min；

2.灭活

将无菌检验合格的病毒液加入甲醛溶液，使甲醛溶液终浓度为0.2％。置37℃摇床上灭活24小时，期间振摇1次。

3.半成品检验

4.无菌检验

取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

5.灭活检验

取10日龄spf鸡胚8枚，各尿囊腔接种灭活病毒液0.1ml，置36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定血凝价，并盲传1代，测定血凝价：

采新鲜spf公鸡血，经抗凝处理，以pbs清洗血球3次，配制成1％鸡血球pbs液。在ha检测96孔板上用定量稀释器于每排各孔中加pbs25μl。吸取25μl待测样品于第1孔中，连续对倍稀释该样品至第11孔，弃去25μl，第12孔不加样品作为对照。每孔中补加25μlpbs，然后每孔分别加入25μl1％鸡血球pbs液，在振板器上振动20s，室温下作用20min。以出现完全凝集的最大稀释度为该样品的血凝价。灭活前对收获的病毒液测定ha效价，为7log2。

6.灭活疫苗的配制

6.1油相制备

取注射用白油93份，span-805份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121℃高压灭菌20分钟，备用。

6.2水相制备

取tween-807份，加入灭活病毒液93份，充分振摇，使tween-80完全溶解为止。

6.3乳化

取油相2份，放于乳化剂中，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后，再以2900r/min搅拌6分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。乳化后，取10ml疫苗以3000r/min离心15分钟，应无分层现象。

试验例1禽流感疫苗的安全性试验

用3-4周龄spf鸡10只，各肌肉注射疫苗2ml，逐日观察14日；结果发现，供试验的10只鸡全部健活，无因疫苗引起的局部和全身不良反应。

试验例2禽流感疫苗的效力检验试验

用3-4周龄spf鸡15只，其中10只鸡每只肌肉注射的疫苗(实施例2制备的灭活疫苗)0.3ml，5只鸡不接种作为对照。接种后21日，连同对照鸡5只，分别采血，免疫鸡hi抗体效价的几何平均值为1:870，对照鸡hi抗体效价均不高于1:4。

试验例3禽流感疫苗的制备工艺优化试验

1.试验方法

1.1批培养与换液工艺的选择

将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于250ml的摇瓶，培养48h后从恒温摇床中取出摇瓶，分别以批培养和沉淀换液两种方式处理接种病毒。批培养即直接按moi为0.01接种禽流感病毒，同时补加终浓度为2μg/ml的tpck-胰酶；沉淀换液即摇瓶静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液，moi为0.001接种禽流感病毒，同时补加终浓度为2μg/ml的tpck-胰酶。培养过程中每隔24小时取样，测定病毒血凝价，以确定最适的接毒工艺。

1.2接毒时间的选择

将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于摇瓶中，分别于细胞培养24、36、48和60小时。从恒温摇床中取出摇瓶，静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液。按moi为0.001接种禽流感病毒，同时补加终浓度为2μg/ml的tpck-胰酶。培养过程中每隔24小时取样，测定病毒血凝价，以确定最佳接毒时间。

1.3接毒剂量的选择

将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于250ml的摇瓶，培养60h后从恒温摇床中取出摇瓶，静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液。分别按moi为0.01、0.001和0.0001接种禽流感病毒，同时补加终浓度为2μg/ml的tpck-胰酶。培养过程中每隔24小时取样，测定病毒血凝价，以确定最适接毒剂量。

1.4tpck-胰酶浓度的选择

将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于250ml的摇瓶，培养60h后从恒温摇床中取出摇瓶，在超净台中静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液。按moi为0.001接种禽流感病毒，分别补加终浓度为2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml的tpck-胰酶。培养过程中每隔24小时取样，测定病毒血凝价，以确定最适tpck-胰酶浓度。

2.试验结果

2.1禽流感病毒培养工艺选择

2.1.1批培养与换液工艺的选择

换液工艺收获病毒的血凝价比批培养工艺高，批培养24小时检测不到病毒血凝价，接毒后72小时达到血凝价最高为7log2，换液工艺在接毒后24小时就能产生出较高血凝价5log2，接毒后72小时达到最高血凝价10log2。

表1两种工艺的病毒血凝价(log2)

2.1.2接毒时间的选择

将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的初始密度接种于摇瓶中，分别于细胞培养24、36、48和60小时，从恒温摇床中取出摇瓶，静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液。结果表明，细胞培养60h后接种禽流感病毒，病毒血凝价最高可达11log2，即最佳接毒时间为细胞培养60h，结果见表2。

表2不同接毒时间对病毒血凝价的影响(log2)

2.1.3接毒剂量的选择

将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的密度接种于摇瓶中，细胞培养60小时后，从恒温摇床中取出摇瓶，静止数分钟待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液。分分别按moi为0.01、0.001和0.0001接种禽流感病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒血凝价。结果表明，moi为0.001时，病毒血凝价最高可达11log2，即最佳接毒剂量为moi为0.001，结果见表3。

表3不同接毒剂量对病毒血凝价的影响(log2)

2.1.4tpck-胰酶浓度的选择

对加入不同浓度tpck-胰酶后的病毒增殖情况结果见表3。其中在tpck-胰酶终浓度为2μg/ml和4μg/ml的条件下病毒增殖速度相似，最高病毒血凝价均为11log2，而当tpck-胰酶终浓度为8μg/ml和10μg/ml时，细胞迅速破碎，病毒血凝价较低。即加入tpck-胰酶最佳的浓度为2μg/ml，结果见表4。

表4不同tpck-胰酶浓度对病毒血凝价的影响(log2)

试验例4不同培养方式收获的禽流感病毒液血凝价的比较试验

1.试验方法

1.1鸡胚培养增殖禽流感病毒

将病毒用灭菌生理盐水作1000倍稀释后，经绒毛尿囊腔接种9-10日龄spf鸡胚，每胚0.1ml，置36℃孵育，选择接种48-96h死亡的鸡胚，收集尿囊液。

1.2原代细胞cef培养增殖禽流感病毒

取对数生长的cef细胞，按0.2v/v％接种病毒，加入含有2μg/mltpck胰酶的dmem细胞培养液，置36℃含有5％co2培养箱中培养，于96h收获病毒液。

1.3传代细胞mdck细胞培养增殖禽流感病毒

取对数生长的mdck细胞，按0.2v/v％接种病毒，加入含有2μg/mltpck胰酶的dmem细胞培养液，置36℃含有5％co2培养箱中培养，于72h收获病毒液。

1.4悬浮细胞df-1-xf培养增殖禽流感病毒

将df-1-xf细胞以0.75×10⁶个/ml的密度接种于7l生物反应器中，细胞培养60小时后，静止待细胞完全沉降后弃去上清，补加同体积的病毒生长液。按moi为0.001接种禽流感病毒，培养72h收获病毒液。其它悬浮培养条件：ph控制为7.2、溶氧(do)为50％、温度36℃、搅拌转速为100r/min。

2.试验结果

分别将禽流感病毒接种至鸡胚、传代cef细胞、传代mdck细胞和悬浮df-1-xf细胞进行病毒增殖，分别对收获的病毒液进行血凝价比较，结果表明，悬浮df-1-xf细胞培养禽流感病毒比鸡胚培养、传代cef细胞和传代mdck细胞培养禽流感病毒收获的血凝价高，达11log2。

表5不同培养方式接毒后禽流感病毒血凝价(log2)