一种激活Notch1信号通路的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种激活notch1信号通路的方法。

背景技术：

notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，它们调节从海胆到人等多种生物细胞的发育。notch信号影响细胞正常形态发生的多个过程，包括多能祖细胞的分化、细胞凋亡、细胞增殖及细胞边界的形成。

notch1是notch基因家族的成员，它由egf-like重复区和一个包含多种结构域的胞内段(nicd)组成(图1)。notch1蛋白经过三次剪切，可释放胞内段进入细胞质，再进入细胞核与转录因子csl结合，形成nicd/csl转录激活复合体，活化hes1等分化拮抗基因的转录。活化notch1以激活下游hes1等因子成为了相关研究包括抗癌药物研究中的一种手段。

直接将notch1基因的胞内段转入细胞表达，是激活notch1信号通路最直接的方法之一。但对具体区域的选取，对外源片段的转录、翻译以及蛋白产物的活性影响很大。目前尚未见相关的报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种扩增notch1基因部分片段的引物对，其中一条引物的序列包括如seqidno.1所示序列；其中另一条引物的序列包括如seqidno.2或4所示序列的反向互补序列。

进一步地，两条引物的序列分别还包括dna内切酶位点序列。

进一步地，所述酶切位点为：ecor1和hindiii的酶切位点。

前述的引物对中，其中至少1条引物的序列含有ha-tag序列。

更进一步地，其中一条引物的序列如seqidno.5所示；另一条引物的序列如seqidno.6或7所示。

本发明还提供了前述引物在激活notch1信号通路中的用途。

本发明还提供了一种激活notch1信号通路的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)使用权利要求1所述引物pcr扩增模板dna，得到pcr产物；

2)将前述pcr产物连接到载体中；

3)将载体转入动物或人类细胞；

所述模板dna是包含notch1胞内段序列的dna。

进一步地，步骤2)所述载体是pcmv-xl4载体。

进一步地，步骤3)所述细胞是人乙肝病毒感染的肝癌细胞。

本发明的引物可以扩增得到notch1基因的部分片段，该片段能在细胞内大量表达，且能对下游的hes1基因起到很好的激活作用。

本发明的方法能有效激活notch1信号通路，可以广泛应用于抗癌药物的研究中，比如：激活notch1信号通路构建恶性肿瘤模型。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是notch1基因的结构图。

图2是westernblot检测图。

图3是notch1mrna荧光定量统计图。

图4是hes1mrna荧光定量统计图。

具体实施方式

实施例nicd及nicd-δpest质粒转乙肝细胞

1.引物设计

1.1扩增区域选取

通过实验，选择了notch1基因的第5543-7930号碱基(nicd区)以及第5543-6961号(nicd-δpest区)碱基作为扩增区域。

1.2引物序列

nicd区和nicd-δpest区的正向引物相同，反向引物不同。

为了方便载体构建，在正向引物(forward)中加入ecor1酶切位点，在反向引物(reverse)中加入hindiii位点；为了方便后期检测是否成功插入，还在reverse中加入了ha-tag序列；另外，为了实现目的片段的高效、正确转录，还在forward中加入了转录起始序列kozac，在reverse中加入了att序列(在反向互补后为终止密码子taa)。引物的设计结构如下：

forward：taa(随机序列)gaattc(ecorlsite)gccgcc(kozacsequence：转录起始序列)atg(起始密码子)cggcggcagcatggccagctctggttc(靶序列，seqidno.1)；

nicd-reverse的互补序列：atcgcccgcattccggaggccttcaag(靶序列，seqidno.2)tacccatacgatgttccagattacgct(ha-tag序列，seqidno.3)taa(终止密码子)aagctt(hindiiisite)att(随机序列)；

nicd-δpest-reverse的互补序列：agtctccgtccgtgcccctcaaccac(靶序列，seqidno.4)tacccatacgatgttccagattacgct(ha-tag序列，seqidno.3)taa(终止密码子)aagctt(hindiiisite)att(随机序列)。

具体引物序列如表1所示。

表1引物信息

2.质粒构建

1)扩增

使用notch1intracellulardomain(nicd1)-pcw107-v5质粒(addgene，美国)作为模板，分别使用表1所述引物扩增第一节所述nicd区和nicd-δpest区序列。

2)连接载体

使用ecor1/hindiii双酶切的pcmv-xl4载体与前述扩增序列连接，获得pcmv-xl4-nicd-ha和pcmv-xl4-nicdδpest-ha质粒，分别简称nicd质粒和nicd-δpest质粒。

3.细胞实验

转染nicd及nicd-δpest质粒进入人乙肝病毒感染的肝癌细胞(hepg2.2.15.7和hepad38)后，提取细胞总蛋白和总rna，实施westernblot检测ha标记蛋白，实施qpcr实验检测notch1以及notch1靶基因hes1的mrna相对水平。

其中，对照组(control)为转入pcmv-xl4空载体的细胞。

4.结果

westernblot结果如图2所示，使用ha抗体的印迹实验得到了具有ha-tag的nicd以及nicd-δpest条带。

qpcr结果如图3和图4所示，转染nicd及nicd-δpest质粒进入乙肝细胞后后都成功升高notch1以及notch1靶基因hes1的mrna的表达，其中hes1的表达提高了约60％，表明notch1信号通路得到有效激活。

综上，本发明的引物可以扩增得到notch1基因的部分片段，该片段能在细胞内大量表达，且能对下游的hes1基因起到很好的激活作用。本发明的方法能有效激活notch1信号通路，在抗癌药物研究等notch1通路相关研究中具有良好的应用价值。

sequencelisting

<110>四川大学华西医院

<120>一种激活notch1信号通路的方法

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