一种柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法与流程

本发明单体化合物提取分离技术领域，具体而言，涉及一种脂溶性营养成分的分离方法，尤其涉及一种柑橘果渣中无色类胡萝卜素高效制备及分离方法。

技术背景

类胡萝卜素分为c40的碳氢化合物(胡萝卜素，carotene)和碳氢化合物的含氧衍生物(叶黄素，xanthophyls)，由高等植物、藻类和微生物合成。自然界存在的类胡萝卜素有700多种，它们由8个异戊二烯单元组成，异戊二烯单元的排列在中心处是反向对称的排列，使得中心的两个甲基处于1，5位的关系。无色类胡萝卜素(八氢番茄红素和六氢番茄红素)是有色类胡萝卜素合成的前体物质，通过去饱和酶的催化加氢，无色类胡萝卜素可转化为有色类胡萝卜素，有色类胡萝卜素再经环化、异构化、羟基化形成自然界多种颜色的类胡萝卜素组成(xu,c.-j.,fraser,p.d.,wang,w.-j.,&bramley,p.m.(2006).differencesinthecarotenoidcontentofordinarycitrusandlycopene-accumμlatingmutants.journalofagricμlturalandfoodchemistry,54(15),5474-5481.doi:10.1021/jf060702t)。八氢番茄红素和六氢番茄红素分子式分别为c40h64(mw＝544da)和c40h62(mw＝542da)，它们分别是具有9和10个双键的烯烃。近年的研究证明无色类胡萝卜素比有色类胡萝卜素更具有较好的生物利用率(mapelli-brahm,p.,desmarchelier,c.,margier,m.,reboμl,e.,melendezmartinez,a.j.,&borel,p.(2018).phytoeneandphytoflueneisolatedfromatomatoextractarereadilyincorporatedinmixedmicellesandabsorbedbycaco-2cells,ascomparedtolycopene,andsr-biisinvolvedintheircellμlaruptake.molecularnutrition&foodresearch.doi:10.1002/mnfr.201800703)。无色类胡萝卜素八氢番茄红素和六氢番茄红素可以单独或相互作用与其他食物成分的结合，有益健康。使用无色类胡萝卜素，能够延缓uv-b光诱导小鼠肿瘤的外观与数量。用富含无色类胡萝卜素的番茄粉喂养前列腺癌的模式大鼠，能够降低前列腺癌带来的死亡风险。另外，无色类胡萝卜素被证实能够缓解乳腺癌和子宫内膜癌(meléndez-martínez,a.j.,mapelli-brahm,p.,&stinco,c.m.(2018).thecolourlesscarotenoidsphytoeneandphytofluene:fromdietarysourcestotheirusefμlnessforthefunctionalfoodsandnutricosmeticsindustries.journaloffoodcompositionandanalysis,67,91-103.doi:https://doi.org/10.1016/j.jfca.2018.01.002)。

目前，无色类胡萝卜素的单体八氢番茄红素和六氢番茄红素的标品仅依赖进口，每毫克的售价均在8000元以上。而无色类胡萝卜素在红肉脐橙中的含量高达85％，具有含量高、极性低的特点。然而，国内外尚无文献报道从红肉脐橙等柑橘果渣中提取分离无色类胡萝卜素的相关研究，尤其是八氢番茄红素和六氢番茄红素极性相近，分离难度大，提取效率低，这显然限制了无色类胡萝卜素单体在功能食品领域中的应用。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，从而在有效利用柑橘果渣的基础上实现了无色类胡萝卜素的高效制备与分离。

为了实现本发明的技术目的，本发明人采用高效逆流色谱从柑橘果渣中分离无色类胡萝卜素，实现了无色类胡萝卜素的高效制备，同时使用半制备高效液相色谱柱对无色类胡萝卜素进一步分离，能够得到高纯度的八氢番茄红素和六氢番茄红素单体。具体地，本发明的技术方案概括如下：

一种柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，该方法包括以下步骤：

(1)将柑橘果渣低温烘干，粉碎，作为提取无色类胡萝卜素的原料；

(2)采用乙醇-正己烷复合溶剂分次提取原料中总类胡萝卜素，所述的乙醇-正己烷复合溶剂中v乙醇：v正己烷＝1：(0.7-3.5)；

(3)在步骤(2)得到的提取液中加水清洗除杂，取上层己烷层，减压蒸干，得类胡萝卜素粗提物；

(4)采用v正己烷：v二氯甲烷：v乙腈＝10：(2-3)：(6-9)的混合液，静置分层，混合液下相作为高效逆流色谱的固定相，上相作为流动相，将步骤(3)得到的类胡萝卜素粗提物用所述上相复溶后注入逆流色谱，以2.5-5.0ml/min的流速洗脱，收集洗脱液；

(5)将步骤(4)得到的洗脱液减压蒸干，得到膜状无色类胡萝卜素；

(6)采用高效液相制备色谱法对膜状无色类胡萝卜素进一步分离，分别得到八氢番茄红素、六氢番茄红素。

进一步优选地，如上所述的柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，其中步骤(1)中烘干的工艺参数为：果渣平铺1-3cm，45-65℃、0.08-0.12psi条件下烘干，时间为24-48h。

进一步优选地，如上所述的柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，其中步骤(2)中所述的乙醇-正己烷复合溶剂中v乙醇：v正己烷＝1：(1.5-3.0)。

进一步优选地，如上所述的柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，其中步骤(2)中提取的料液比为1：(8-13)，500-1000rmp转速搅拌下提取0.3-1.0h，重复2-4次，合并提取液。

进一步优选地，如上所述的柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，其中步骤(3)的具体操作步骤为：将提取液置于分液漏斗中，用等体积的蒸馏水清洗2-4次，除去残留固体杂质，收集上层己烷层，减压蒸干得到类胡萝卜素粗提物。

进一步优选地，如上所述的柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，其中步骤(4)所述的混合液中v正己烷：v二氯甲烷：v乙腈＝10：2.5：7.5。

进一步优选地，如上所述的柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，其中步骤(6)中高效液相制备色谱法的条件为：

高效液相半制备色谱柱ymcc30，规格10mm×250mm，5μm；

流动相a为甲醇，流动相b为叔丁基甲醚；洗脱流速0.8-1.2ml/min；洗脱梯度：100％a，0min；60％a，40min。

进一步优选地，如上所述的柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，其中目标组分的收集时间为：28min开始收集八氢番茄红素，收集2min；31min开始收集六氢番茄红素，收集7min，其中包含六氢番茄红素和其异构体。

再进一步优选地，如上所述的柑橘果渣中无色类胡萝卜素的提取分离方法，其中所述的柑橘果渣为红肉脐橙果渣。

与现有技术相比，本发明实现从柑橘果渣中分离制备无色类胡萝卜素，通过高速逆流色谱能够得到高含量的无色类胡萝卜素混合物，采用半制备色谱柱对纯化的无色类胡萝卜素进行分离，可得到高纯度的八氢番茄红素单体和六氢番茄红素单体。该方法获得的无色类胡萝卜素在功能食品领域中具有巨大的应用价值，同时制备色谱得到的高纯度无色类胡萝卜素单体也能弥补我国国产标品的空白。

附图说明

图1：逆流色谱以3ml/min的流速上样，连续两次分离红肉脐橙果渣中无色类胡萝卜素，收集到的无色类胡萝卜素为八氢番茄红素与六氢番茄红素的混合物。

图2：逆流色谱以4ml/min的流速上样，连续两次分离红肉脐橙果渣中无色类胡萝卜素，收集到的无色类胡萝卜素为八氢番茄红素与六氢番茄红素的混合物。

图3：逆流色谱以3ml/min的流速上样，单次分离红肉脐橙果渣中无色类胡萝卜素，收集到的无色类胡萝卜素为八氢番茄红素与六氢番茄红素的混合物。

图4：逆流色谱以5ml/min的流速上样，单次分离红肉脐橙果渣中无色类胡萝卜素，收集到的无色类胡萝卜素为八氢番茄红素与六氢番茄红素的混合物。

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明涉及的柑橘果渣中无色类胡萝卜素高效制备及分离方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

红肉脐橙果渣平铺1cm，减压烘干24h(50℃，0.1psi)，打粉，过160目筛，置于100ml离心管，按照料液比为1g：10ml加入提取剂乙醇：正己烷＝3：2(v：v)，置于磁力搅拌器，700rmp提取0.5h，重复3次，合并提取液，至于分液漏斗中，用等体积的蒸馏水清洗三次，除去残留固体杂质，收集上层有机相，旋转蒸发仪(35℃)减压蒸干，得到附着在真空瓶中的类胡萝卜素粗提物，待用。

正己烷：二氯甲烷：乙腈＝10：2.5：7.5(v：v：v)混合液2l，置于分液漏斗，静置分层。混合液下相作为高效逆流色谱固定相，上相作为流动相。蒸干的类胡萝卜素粗提物用25ml上相复溶后注入逆流色谱，以3ml/min的流速洗脱，32min开始收集，收集8min。连续两次上样，实现无色类胡萝卜素的连续富集。无色类胡萝卜素经逆流色谱分离制备的图谱如图1所示。

基于waters2695高效液相色谱，采用半制备色谱柱ymc-park-ods-a(10mm×250mm，5μm)进一步分离逆流色谱制备的无色类胡萝卜素。流动相a：甲醇；流动相b：叔丁基甲醚(mtbe)；流速1min/l，洗脱梯度：0min，100％a；40min，60％a。逆流色谱制备的无色类胡萝卜素经旋转蒸发(35℃)后，采用2ml的流动相复溶，上样量为50μl收集时间：28min开始收集八氢番茄红素，收集2min，为八氢番茄红素；31min开始收集六氢番茄红素，收集7min，其中包含六氢番茄红素和其异构体。液相检测八氢番茄红素的浓度为0.18mg/ml，六氢番茄红素和其异构体的浓度为0.020mg/ml，纯度均大于95％。

实施例2

红肉脐橙果渣真空干燥、打粉、过筛，置于100ml离心管，按照料液比为1g：10ml加入提取剂乙醇：正己烷＝1：1(v：v)，置于磁力搅拌器，700rmp提取0.5h，重复3次，合并提取液，至于分液漏斗中，用等体积的蒸馏水清洗三次，收集上层有机相，旋转蒸发仪减压蒸干，待用。

正己烷：二氯甲烷：乙腈＝10：2.5：7.5(v：v：v)混合液2l，置于分液漏斗，静置分层。混合液下相作为高效逆流色谱固定相，上相作为流动相。蒸干的类胡萝卜素粗提物用25ml上相复溶后注入逆流色谱，以4ml/min的流速洗脱，27min开始收集，收集8min。连续两次上样，实现无色类胡萝卜素的连续富集。无色类胡萝卜素经逆流色谱分离制备的图谱如图2所示。

基于waters2695高效液相色谱，采用半制备色谱柱ymc-park-ods-a(10mm×250mm，5μm)进一步分离逆流色谱制备的无色类胡萝卜素。流动相a：甲醇；流动相b：叔丁基甲醚(mtbe)；流速1min/l，洗脱梯度：0min，100％a；40min，60％a。逆流色谱制备的无色类胡萝卜素经旋转蒸发(35℃)后，采用2ml的流动相复溶，上样量为80μl收集时间：28min开始收集八氢番茄红素，收集2min，为八氢番茄红素；31min开始收集六氢番茄红素，收集7min，其中包含六氢番茄红素和其异构体。液相检测八氢番茄红素的浓度为0.25mg/ml，六氢番茄红素和其异构体的浓度为0.027

mg/ml，纯度均大于95％。

实施例3

红肉脐橙果渣真空干燥、打粉、过筛，置于100ml离心管，按照料液比为1g：10ml加入提取剂乙醇：正己烷＝4：3(v：v)，置于磁力搅拌器，700rmp提取0.5h，重复3次，合并提取液，至于分液漏斗中，用等体积的蒸馏水清洗三次，收集上层有机相，旋转蒸发仪减压蒸干，待用。

正己烷：二氯甲烷：乙腈＝10：2.5：7.5(v：v：v)混合液2l，置于分液漏斗，静置分层。混合液下相作为高效逆流色谱固定相，上相作为流动相。蒸干的类胡萝卜素粗提物用25ml上相复溶后注入逆流色谱，以3ml/min的流速洗脱，32min开始收集，收集10min。无色类胡萝卜素经逆流色谱分离制备的图谱如图3所示。

基于waters2695高效液相色谱，采用半制备色谱柱ymc-park-ods-a(10mm×250mm，5μm)进一步分离逆流色谱制备的无色类胡萝卜素。流动相a：甲醇；流动相b：叔丁基甲醚(mtbe)；流速1min/l，洗脱梯度：0min，100％a；40min，60％a。逆流色谱制备的无色类胡萝卜素经旋转蒸发(35℃)后，采用2ml的流动相复溶，上样量为100μl收集时间：28min开始收集八氢番茄红素，收集2min，为八氢番茄红素；31min开始收集六氢番茄红素，收集7min，其中包含六氢番茄红素和其异构体。液相检测八氢番茄红素的浓度为0.35mg/ml，六氢番茄红素和其异构体的浓度为0.031mg/ml，纯度均大于95％。

实施例4

红肉脐橙果渣真空干燥、打粉、过筛，置于100ml离心管，按照料液比为1g：10ml加入提取剂乙醇：正己烷＝1：3(v：v)，置于磁力搅拌器，700rmp提取0.5h，重复4次，合并提取液，至于分液漏斗中，用等体积的蒸馏水清洗三次，收集上层有机相，旋转蒸发仪减压蒸干，待用。

正己烷：二氯甲烷：乙腈＝10：2.5：7.5(v：v：v)混合液2l，置于分液漏斗，静置分层。混合液下相作为高效逆流色谱固定相，上相作为流动相。蒸干的类胡萝卜素粗提物用25ml上相复溶后注入逆流色谱，以5ml/min的流速洗脱，26min开始收集，收集6min。无色类胡萝卜素经逆流色谱分离制备的图谱如图4所示。

基于waters2695高效液相色谱，采用半制备色谱柱ymc-park-ods-a(10mm×250mm，5μm)进一步分离逆流色谱制备的无色类胡萝卜素。流动相a：甲醇；流动相b：叔丁基甲醚(mtbe)；流速1min/l，洗脱梯度：0min，100％a；40min，60％a。逆流色谱制备的无色类胡萝卜素经旋转蒸发(35℃)后，采用2ml的流动相复溶，上样量为120μl收集时间：28min开始收集八氢番茄红素，收集2min，为八氢番茄红素；31min开始收集六氢番茄红素，收集7min，其中包含六氢番茄红素和其异构体。液相检测八氢番茄红素的浓度为0.37mg/ml，六氢番茄红素和其异构体的浓度为0.033mg/ml，纯度均大于95％。