一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液及其应用的制作方法

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及一种应用于荧光pcr平台的多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂的缓冲液及其应用。

背景技术：

rt-pcr（reversetranscriptionpcr，逆转录pcr，或称为反转录pcr），是聚合酶链式反应的一种广泛应用的变性。在rt-pcr过程中，一条rna链被逆转录称为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。rt-pcr的关键步骤是rna的反转录，要求rna模板为完整的且不含dna、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成随细胞性白细胞病毒（avianmyeloblastosisvirus，amv）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus，mmlv）反转录酶。

rt-pcr通常有一步法rt-pcr和两步法rt-pcr两种方法，一步法rt-pcr操作简便，rt和pcr之间无需开管，能够减少污染的可能性，rt过程得到的cdna产物全部用于pcr扩增，使得一步法的灵敏度更高，但是单管反应是rt和pcr都不能够在最佳反应条件下进行并且容易相互干扰；两步法rt-pcr方法种，rt和pcr分别在最优的条件下进行使两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活且严谨，适合对付未知模板或者较为困难的模板。

pcr反应增强剂和稳定剂常见的有：二甲亚砜(dmso)、甘油、牛血清白蛋白(bsa)、甲酰胺、非离子去污剂、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵、甜菜碱(betaine)和海藻糖（trehalose）中的一种或多种，它们对pcr反应的影响虽然有所不同，但都可提高pcr的扩增效率。其中，1％-10％二甲亚砜能改变引物模板配对反应的熔解温度，从而改善gc含量高的dna的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但当浓度高时（大于10％）时会降低保真性。5％-20％甘油可提高产量，增加酶的稳定性。0.1μg/μl-1μg/μl牛血清白蛋白能提高pcr反应的效率，同时减少体系中pcr抑制物对反应的影响。1.25％-10％甲酰胺可促进某些“引物-模板”退火，降低带有二级结构的dna的变性温度。硫酸铵能增加反应体系的离子强度，改变dna的变性及退火温度，调节酶活。0.5-2m甜菜碱有助于高gc含量和长dna片段的pcr反应。2%-5%海藻糖可作为pcr增强剂，通过降低dna双链融解温度，维持taqdna聚合酶稳定性，提高pcr反应效率，可作为酶稳定剂，维持酶的活性及热活化后的酶活性。可中和抑制剂对dna聚合酶的抑制作用，维持pcr扩增效率。可以根据实际需要，选择其中的一种或多种。

技术实现要素：

本发明提供了一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液，以一步法rt-pcr为方法基础，针对可能的影响因素采取相应的措施，设计了一种rt-pcr缓冲液。

本发明特征在于：优化了rt-pcr实验pcr反应缓冲液，特别是加入了一定剂量的pcr反应增强剂dmso、稳定剂海藻糖。对于一步法rt-pcr反应中的逆转录反应效率和dna扩增检测反应效率有很大程度的提高，能够同时满足rna逆转录反应和荧光pcr反应的高效率进行。

本发明提供一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液，包括tris盐、硫酸铵、氯化镁和氯化钾的水溶液，所述缓冲液ph值为8.0~10.0，所述缓冲液中tris盐、硫酸铵、氯化镁和氯化钾的浓度分别为50~100mm、10~50mm、1.0~5.0mm和25~100mm。更优选的，所述缓冲液ph值为9.2，所述缓冲液中tris盐、硫酸铵、氯化镁和氯化钾的浓度分别为75mm、20mm、3mm和80mm。

本发明提供一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液，还包括pcr反应增强剂二甲基亚砜和稳定剂海藻糖，所述缓冲液中二甲基亚砜和海藻糖溶质百分数分别为1~10%和2~5%。更优选的，所述反应液中二甲基亚砜和海藻糖的溶质百分数分别为2%（v/v）和4%（m/v）。

本发明提供一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液，所述缓冲液在多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂中的应用，所述方法包括：

（1）配制10×所述缓冲液

配制10×rt-pcrbuffer，包含tris盐750mm、硫酸铵200mm、氯化镁30mm、氯化钾800mm、海藻糖40%（m/v）、二甲基亚砜20%（v/v）、tween-201‰（v/v）、以及ddh2o。

（2）引物探针的设计

将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告，根据甲型流感病毒基因设计引物探针如下：

flua-f:5’-gaccratcctgtcacctctgac-3’（seqidno.1）；

flua-r:5’-gggcattytggacaaakcgtctacg-3’（seqidno.2）；

p-flua:5’fam-agtcctcgctcactgggca-3’mgb（seqidno.3）；

根据乙型流感病毒基因设计引物探针如下：

flub-f:5’-gctactgatgatcttacagtggaggatga-3’（seqidno.4）；

flub-r:5’-gctttgaatgtccttcattaagacgctc-3’（seqidno.5）；

p-flub:5’hex-catcggatcctcaactcactct-3’mgb（seqidno.6）；

根据ms2噬菌体基因设计引物探针如下：

ms2-f:5’-ggaaacccgattccctcagca-3’（seqidno.7）；

ms2-r:5’-catgtttgaatggccggcgtctat-3’（seqidno.8）；

p-ms2:5’cy5-cagcaaactccggcatctac-3’mgb（seqidno.9）。

（3）待检测模板的准备

从咽拭子样本中获取病毒基因组rna，推荐使用商业化的试剂盒提取病毒基因组，测定基因组rna浓度和纯度。

（4）配制多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂

配制rt-pcr检测反应试剂，包含10×rt-pcrbuffer、dntpmix、dutp、检测引物探针、逆转录酶、taqdna聚合酶、udg酶、待检测模板，ddh2o。

（5）荧光pcr扩增

pcr反应由第一阶段和第二阶段构成：

第一阶段为逆转录阶段，其条件为：

温度50℃，时间15分钟

第二阶段为扩增检测阶段。其条件为：

预变性：温度为95℃，时间为3分钟；

变性、退火延伸为50次循环

变性：温度为95℃，时间为10秒；

退火延伸：温度为60℃，时间为45秒；（设置荧光信号采集）。

（6）结果分析

在上述检测反应体系与温度循环程序条件下，观察检测反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增s型曲线，如果形成对数扩增s型曲线则该待检基因组rna为该特异性反应体系所代表的阳性。

附图说明

附图1检测反应中flua标准品检测结果；

附图2检测反应体系中flub标准品检测结果；

附图3检测反应体系中ms2标准品检测结果。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图对本发明的实施方案予以说明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通常采用常规条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的荧光定量pcr仪型号为abi7500。

实施例1一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液的配制

（1）配制10×rt-pcrbuffer，包含tris盐750mm、硫酸铵200mm、氯化镁30mm、氯化钾800mm、海藻糖40%（m/v）、二甲基亚砜20%（v/v）、tween-201‰（v/v）、以及ddh2o。

（2）使用电子分析天平分别称取tris盐9.09g，硫酸铵2.64g，六水合氯化镁0.61g，氯化钾5.96g，海藻糖40g于100ml蓝盖瓶中，加入80mlddh2o用玻璃棒搅拌溶解。

（3）使用ph计测定上述溶液ph值，然后用盐酸将上述溶液ph值调节至9.2。

（4）向上述溶液中加入二甲基亚砜10ml，充分振荡混匀。

（5）在100ml容量瓶中使用ddh2o将上述溶液定容至100ml，然后将100ml溶液转移至100ml蓝盖瓶中，按体积比1‰向溶液中加入100μltween-20，充分混匀备用。

实施例2引物探针的设计

（1）检测甲型流感病毒基因设计引物探针如下：

flua-f:5’-gaccratcctgtcacctctgac-3’；

flua-r:5’-gggcattytggacaaakcgtctacg-3’；

p-flua:5’fam-agtcctcgctcactgggca-3’mgb；

（2）检测乙型流感病毒基因设计引物探针如下：

flub-f:5’-gctactgatgatcttacagtggaggatga-3’；

flub-r:5’-gctttgaatgtccttcattaagacgctc-3’；

p-flub:5’hex-catcggatcctcaactcactct-3’mgb；

（2）检测ms2噬菌体基因设计引物探针如下：

ms2-f:5’-ggaaacccgattccctcagca-3’；

ms2-r:5’-catgtttgaatggccggcgtctat-3’；

p-ms2:5’cy5-cagcaaactccggcatctac-3’mgb。

实施例3待检测模板的准备

从样本中获取病毒基因组rna，推荐使用商业化的试剂盒提取病毒基因组，测定基因组rna浓度和纯度。

实施例4一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂的配制

配制25μlrt-pcr检测反应试剂，包含10×rt-pcrbuffer2.5μl、dntpmix0.2mm、dutp0.064mm、检测引物探针各0.2µm、逆转录酶2.5u、taqdna聚合酶5u、udg酶0.5u、待检测模板2μl，剩余用ddh2o补足至25μl。

实施例5上机检测

在abi7500仪器上按照下表设置温度循环及信号采集程序：

注：*处设置fam、hex、cy5三通道采集荧光信号。

实施例6结果分析

在上述pcr反应体系与温度循环程序条件下，在内控信号形成正常对数扩增s型曲线的前提条件下，观察特异性pcr反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增s型曲线，如果形成对数扩增s型曲线则该待检样本为该特异性反应体系所代表的病毒类型的阳性。例如：某待检样本在上呼吸道病毒检测反应体系a检测荧光信号（fam通道）形成对数扩增s型曲线，则提示该样本为甲型流感病毒阳性。

附图1检测反应中flua标准品检测结果，检测图显示检测体系检测荧光信号（fam通道）形成对数扩增s型曲线，则判断该体系能够检测出甲型流感病毒。

附图2检测反应中flub标准品检测结果，检测图显示检测体系检测荧光信号（hex通道）形成对数扩增s型曲线，则判断该体系能够检测出乙型流感病毒。

附图3检测反应中ms2标准品检测结果，检测图显示检测体系检测荧光信号（cy5通道）形成对数扩增s型曲线，则判断该体系能够检测出ms2噬菌体病毒。注意：

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

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<110>organizationname:苏州旷远生物分子技术有限公司

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