一种生物降酚菌剂及其应用方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，提供了一种生物降酚菌剂及其应用方法。

背景技术：

酚被广泛地用作化工生产的原料，用来制造多种工业产品。在生产这些工业产品的过程中会排出不同污染浓度的酚类废水。酚是一种高毒物质，它对原生质会产生很大的生物毒性。不同浓度的酚，可以使蛋白质不同程度的变性和沉淀。酚会对生物细胞造成直接伤害，并具有极强的上皮细胞腐蚀性。长期的接触或是饮用被其污染的水会出现慢性中毒现象；它也会影响水生生物的正常的生长和繁殖，浓度大时，甚至会造成水生生物的大量死亡；同时含酚废水用于灌溉农田时，也会导致农作物减产和死亡。

含酚废水的处理方法包括：物理法、化学法和生物法。其中物理和化学处理法都存在成本高、操作复杂、容易造成二次污染等缺陷。生物法主要是利用具有高效降解苯酚类物质能力的微生物的分解转化能力，将水中的酚类化合物转化为无机物，使废水得到净化，达到国家排放标准。就现有的工艺技术而言，生物法与物理、化学方法相比，具有经济、高效的优点，更重要的生物法是可以实现无害化、无二次污染，处理水量大、产泥量低，是目前研究较多的含酚废水处理技术。

目前生物处理技术只局限于处理低浓度的含酚废水，高浓度含酚废水的高生物毒性，制约了这一技术的应用，且现有技术中基本还是以单一菌种治理含酚废水为主，难以达到更好的提升，因此分离和选育具有高耐受能力和降解能力的菌株或菌群应用于生物强化技术显得尤其重要。找寻针对含酚废水更加适用的降酚菌剂成为本领域技术人员难以解决的问题。

技术实现要素：

本发明针对上述技术存在的不足，提供了一种高效生物降酚菌剂及其应用方法，该复合菌剂由两种菌组成，所述菌株分离自含酚污水处理系统，经过16srdna鉴定分别为产碱菌和蜡样芽孢杆菌，两个菌株保藏编号分别为cgmccno.16158和cgmccno.16157，应用时，根据污水系统中进水挥发酚的含量，按照0.1-1g/l的量添加，将产碱菌与蜡样芽孢杆菌菌粉按重量比1-3:1混合活化后使用，12小时内的降酚能力达99％。本发明的菌种易于培养扩繁，制备为固体菌粉，便于运输与储存，在使用时可根据进水水质的情况选择添加菌粉的量及比例，菌种分离自污水处理系统中环境适应性强、耐酚能力强，最大耐受能力可达3000mg/l、降解浓度高、降解速度快、不易造成二次污染，且经过实验表明，复合菌降解酚类化合物的效果和处理效率远大于单一菌种。

本发明的发明人首先获得了两株具有较好降酚效果的微生物，其分别为产碱菌(alcaligenesspp)和蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)，

发明人将其分别命名为yjy18-10和yjy18-09；

并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，其保藏编号：产碱菌为cgmccno.16158，蜡样芽孢杆菌为cgmccno.16157，鉴定结果为存活。

上述的产碱菌的形态特征革兰氏阴性菌，无荚膜，短杆状，普通营养琼脂培养基上形成圆形的小菌落，呈乳白色或微黄色；蜡样芽孢杆菌的形态特征革兰氏阳性，无荚膜，杆状，菌落大，圆形或近似圆形、无色素、稍有光泽的白色菌落；

发明人分别对其进行了16srdna测序，其核苷酸序列分别为seqidno：1和seqidno：2所示，该序列为菌株的16srdna的全序列。所测得的16srdna序列进行blast比对，在分子水平上确定为产碱菌和蜡样芽孢杆菌。

在获得上述菌株后发明人进一步提供了其应用于酚类废水处理时的方法如下：

首先利用上述菌株获得菌粉，菌粉的获得方法如下：

(1)发酵培养：将产碱菌、蜡样芽孢杆菌分别接种于灭菌后发酵培养基中发酵培养获得各自的菌液；在温度为28-30℃的条件下，发酵罐培养至溶氧上升，ph下降；

(2)制备菌粉：将发酵液离心后，添加辅料混匀，烘干后即得到固体菌粉，更为具体的步骤如下：

1)菌种活化：在无菌操作台上，取1～5μl冻存的产碱菌和蜡样芽孢杆菌分别于含有lb液体培养基的试管内，28-32℃，130-180rpm培养18-24h；

2)种子制备：在无菌操作台上，将活化的菌种转入含有灭菌液体lb培养基的三角瓶内，每三角瓶内分装200ml该培养基，一支活化的试管菌种接种一个三角瓶，然后28-32℃，130～180rpm培养18-24h；

3)接种发酵罐：首先将发酵罐罐体、管线、空气过滤器进行空消，121℃，空消30min，待温度降低后，注入培养基，然后对培养基进行实消，121℃，实消30min；待温度降至28-32℃时进行接种；

4)发酵条件：接种量v/v5-10％；培养温度28-32℃；ph：6.8-7.0；初始转速：200rpm；发酵罐压：0.05mpa；通气量比：1:1；发酵周期：16-24h；

5)菌粉制备：发酵结束后，添加硅藻土、玉米淀粉吸附菌体，之后烘干、粉碎即可得到相应菌粉。

通过上述方法获得的菌粉，其菌粉菌量单菌可达到9×10⁹-5×10¹⁰个/g。

上述步骤中，lb液体培养基的配方为：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母浸粉5g/l，ph7.0-7.2，溶剂为水；

用于发酵罐中的培养基中，针对产碱菌的发酵培养基组成为：

按重量份计为：1.0-1.5份蛋白胨，0.5-1份酵母提取物，1-1.5份氯化钠，96-97.5份软化水；

针对蜡样芽孢杆菌的发酵培养基组成为：按重量份计为：1-1.5份葡萄糖，1-1.5份豆粕，0.2-0.3分硝酸铵，0.01-0.03份硫酸锰，0.03-0.07份硫酸镁，0.02-0.05份氯化钠，0.02-0.05份氯化钙，0.003-0.005份硫酸亚铁，96.5-97.7份软化水；

(3)菌种复配：通过两次单因素实验，筛选降解效果最明显的组合。

获得上述菌粉后，应用于污水系统时，其投加比例按照好氧池的有效容积的重量体积比(g/l)1‰-1％进行投加，该菌粉需将其活化后用于降酚处理，用于活化的两者菌粉的重量比产碱菌菌粉:蜡样芽孢杆菌菌粉为1-3:1，更优选为两者比例为1:1。

上述菌种复配过程中的污水系统的污水取自石化二浮出水，ph6.8-7.1；

上述菌粉在使用时的活化方法为：

菌粉按照1-5g/l的重量体积比进行接种，于营养盐溶液中在28-32℃，130-180rpm摇床培养1-2h进行活化，其中营养盐溶液的组成如下：按重量份计为：

0.3-0.5份磷酸氢二钾；0.01-0.02份硫酸亚铁；0.1-0.3分氯化钙；0.3-0.5份磷酸二氢钾；0.1-0.5分硫酸镁；0.01-0.03份硫酸锰；0.1-0.2份氯化钠；0.5-1份硝酸铵，97-98.6份软化水；

在上述活化盐溶液中，同时按照比例添加300mg/l的苯酚作为唯一碳源进行活化处理；

加入上述菌剂后即可对含酚废水进行处理，但是一般需要控制处理时的废水ph6.0-7.0，温度25-35℃，本发明所提供的菌剂可处理进水酚的含量低于3000mg/l的污水；上述条件下，本发明所提供的菌剂可以更好的工作。

本发明所发明的菌剂是由污水处理系统中获得的经过筛选的耐受力强的菌种，且发明人采用了产碱菌菌粉和蜡样芽孢杆菌菌粉复配的复合菌剂进行处理，与常规单一菌种组成的菌剂相比，环境适应性更强，同时其组成明确，质量可控，两菌种复配后得到的复合菌剂可提高其对酚的耐受能力最高为3500mg/l，远高于现有单一菌种的耐受能力；

本发明的制备工艺中，将菌剂制备成菌粉是为了避免后续运输的问题，便于储存和运输，方便扩大其使用范围，而在使用前通过活化，诱导其降酚能力的发挥，发明人通过对两种菌种的比例进行复配，筛去其中耐受力差、降解效果不稳定、降解能力差的组合，最终得到了上述两种菌粉的最佳配比，构建了高效降酚菌剂体系，经中试验证，该复合菌剂对酚的最大耐受能力在3500mg/l左右，模拟生产装置24h稳定降酚能力达3000mg/l；在稳定降酚能力的同时，cod降解80％，氨氮降低40％以上；

除此之外本发明的复合菌剂发酵周期短，单个菌剂发酵时间24-48h，采用中试发酵罐可以满足生产要求，可以批量生产；所采用的发酵培养基为常规的农副产品及营养盐，无需苯酚等驯化，改善生产环境，减少对环境的污染，降低了生产和使用的成本；

综上所述，本发明的菌种为纯种易于培养扩繁，制备为固体菌粉，便于运输与储存，菌种分离自污水处理系统，环境适应性强、耐酚能力强、降解浓度高、降解速度快、不易造成二次污染。

发明人对两个菌株进行了生物保藏，其保藏信息如下：

保藏信息

保藏时间：2018年7月25日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心

保藏编号：cgmccno.16157

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名:蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)

保藏时间：2018年7月25日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心

保藏编号：cgmccno.16158

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名:产碱菌(alcaligenesspp)

附图说明

图1为实施例1中的菌剂在3000mg/l的挥发酚浓度下测定的其24h的挥发酚降解曲线；

可见实施例1中提供的菌剂处理污水时，在12h内挥发酚含量基本呈直线状态下降，到第12h时已全部降解，其效果远高于空白组。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。

实施例1菌株的获得

从含酚污水处理系统附近的土壤取样，分离筛选得到单菌共30株，其中具有降解挥发酚能力的菌株有14株；

从14株具有降酚能力的菌株中，通过提高苯酚浓度，同时对其遗传稳定性及适用范围等研究，筛选到两株降解挥发酚效率高、易于培养且能够稳定遗传的菌株；

发明人分别对其进行了16srdna测序，其核苷酸序列分别为seqidno：1和seqidno：2所示，该序列为菌株的16srdna的全序列。所测得的16srdna序列进行blast比对，在分子水平上确定为分别为产碱菌(alcaligenesspp)和蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)，

发明人将其分别命名为yjy18-10和yjy18-09；并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，其保藏编号：产碱菌为cgmccno.16158，蜡样芽孢杆菌为cgmccno.16157，鉴定结果为存活。

上述的产碱菌的形态特征革兰氏阴性菌，无荚膜，短杆状，普通营养琼脂培养基上形成圆形的小菌落，呈乳白色或微黄色；蜡样芽孢杆菌的形态特征革兰氏阳性，无荚膜，杆状，菌落大，圆形或近似圆形、无色素、稍有光泽的白色菌落。

实施例2菌粉的获得

利用上述菌株获得菌粉，菌粉的获得方法如下：

(1)发酵培养：将产碱菌、蜡样芽孢杆菌分别接种于灭菌后发酵培养基中发酵培养获得各自的菌液；在温度为28-30℃的条件下，发酵罐培养至溶氧上升，ph下降；

(2)制备菌粉：将发酵液离心后，添加辅料混匀，烘干后即得到固体菌粉，

两种菌粉的制备更为具体的步骤如下：

1)菌种活化：在无菌操作台上，取1-5μl冻存的产碱菌和蜡样芽孢杆菌于含有lb液体培养基的试管内，28-32℃，130-180rpm培养18-24h；

2)种子制备：在无菌操作台上，将活化的菌种转入含有灭菌液体lb培养基的三角瓶内，每三角瓶内分装200ml该培养基，一支活化的试管菌种接种一个三角瓶，然后28-32℃，130-180rpm培养18-24h；

3)接种发酵罐：首先将发酵罐罐体、管线、空气过滤器进行空消，121℃，空消30min，待温度降低后，注入培养基，然后对培养基进行实消，121℃，实消30min；待温度降至28-32℃时进行接种；

4)发酵条件：接种量v/v5-10％；培养温度28-32℃；ph：6.8-7.0；初始转速：200rpm；发酵罐压：0.05mpa；通气量比：1:1；发酵周期：16-24h；

5)菌粉制备：发酵结束后，添加硅藻土或玉米淀粉吸附菌体，之后烘干、粉碎即可得到相应菌粉。

通过上述方法获得的菌粉，其菌粉菌量单菌可达到9×10⁹-5×10¹⁰个/g。

上述步骤中，lb液体培养基的配方为：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母浸粉5g/l，ph7.0-7.2，溶剂为水；

液体培养基中，针对产碱菌的发酵培养基组成为：

按重量份计为：1.0-1.5份蛋白胨，0.5-1份酵母提取物，1-1.5份氯化钠，96-97.5份软化水；

针对蜡样芽孢杆菌的发酵培养基组成为：按重量份计为：1-1.5份葡萄糖，1-1.5份豆粕，0.2-0.3分硝酸铵，0.01-0.03份硫酸锰，0.03-0.07份硫酸镁，0.02-0.05份氯化钠，0.02-0.05份氯化钙，0.003-0.005份硫酸亚铁，96.5-97.7份软化水。

实施例3复合菌剂的利用1

实施例2获得的菌粉在使用时需要提前进行活化，活化方法为：

菌粉按照1-5g/l的重量体积比进行接种于营养盐中进行活化，活化条件为：28-32℃，130-180rpm摇床培养1-2h进行活化，

其中营养盐溶液的组成如下：按重量份计为：

0.3-0.5份磷酸氢二钾；0.01-0.02份硫酸亚铁；0.1-0.3分氯化钙；0.3-0.5份磷酸二氢钾；0.1-0.5分硫酸镁；0.01-0.03份硫酸锰；0.1-0.2份氯化钠；0.5-1份硝酸铵，97-98.6份软化水。

在上述活化盐溶液中，同时按照比例添加300mg/l的苯酚作为唯一碳源进行活化处理；

1.处理水质：某石化公司污水处理厂二浮出水，cod：3000-3200mg/l，挥发酚：400-500mg/l,氨氮：80-100mg/l，通过添加工业苯酚调节进水中的挥发酚浓度达到下述试验中的要求，所采用的工业苯酚中的苯酚含量99％以上；

2.水处理量：共6m³

3.处理方法及工艺：利用复合菌剂技术处理含酚废水，按照好氧池的有效容积的重量体积比(g/l)0.1-1％进行投加，复合菌剂中产碱菌菌粉:蜡样芽孢杆菌菌粉的重量比分别为1:1，3:1，1:3；

具体使用过程如下：处理池中添加一部分好氧污泥，菌剂投加按照1％的重量体积比(g/l)添加，两种菌剂按照相应的比例活化后添加，曝气使溶氧在2mg/l以上，闷曝两天后每天进出水一次共1m³，控制处理时的污水条件满足：污水ph6.0-7.0，温度25-35℃同时逐步添加工业苯酚提高进水酚含量，以不添加降酚复合菌的活性污泥作为对照，进水酚含量在2000mg/l时24h后，1:1及3:1的实验组挥发酚降解率为99％，1:3实验组的降解率在95％，进水酚含量在3000mg/l时24h后，1:1及3:1的实验组挥发酚降解率仍可维持99％，空白组降酚率在挥发酚含量提高至1500mg/l时，降解率已不足20％；可见产碱菌菌粉:蜡样芽孢杆菌菌粉的比例在1-3:1这一范围内，其耐受的进水含酚量最高，且降解率最佳。

实施例4复合菌剂的利用2

按照实施例3的方法活化菌粉，验证其对其他挥发酚类物质的降解能力。

1.处理水质：某石化公司污水处理厂污水，cod：3000-3200mg/l，挥发酚：400-500mg/l,氨氮：80-100mg/l，添加石化酚萃取装置的回收苯酚调节进水浓度，回收苯酚中的苯酚含量约为90％，其他为一些杂酚；

2.水处理量：共6m³

3.处理方法及工艺：利用复合菌剂技术处理含酚废水，按照好氧池的有效容积的重量体积比(g/l)0.1-1％进行投加，复合菌剂中产碱菌菌粉:蜡样芽孢杆菌菌粉的重量比为1:1；

具体使用过程如下：处理池中添加一部分好氧污泥，处理池中添加一部分好氧污泥，菌剂投加按照0.5％的重量体积比(g/l)添加，曝气使溶氧在2mg/l以上，闷曝两天后每天进出水一次共1m³，控制处理时的污水条件满足：污水ph6.0-7.0，温度25-35℃同时逐步提高进水酚含量，以不添加降酚复合菌的活性污泥作为对照，进水酚含量在3000mg/l时24h后挥发酚降解率为99％，3200mg/l时，降解率在95％以上，3500mg/l时，降解率约为85％，空白组降酚率后期已不足20％；

同时在3000mg/l的挥发酚浓度下测定其24h的挥发酚降解曲线，每4h取样一次，见附图1，由图中可以看出实验组在12h内挥发酚含量基本呈直线状态下降，到第12h时已全部降解。

实施例5复合菌剂的利用3

按照实施例3的方法活化菌粉，验证其对其他挥发酚类物质的降解能力。

1.处理水质：某小型焦化公司污水处理厂，水质指标：cod：2800-3000mg/l，挥发酚：300-400mg/l,氨氮：150-180mg/l，为验证其降解能力，按照实施例3中的方式通过添加工业苯酚逐步提高进水挥发酚含量；

2.水处理量：共6m³

3.处理方法及工艺：利用复合菌剂技术处理含酚废水，按照好氧池的有效容积的重量体积比(g/l)1％进行投加，复合菌剂中产碱菌菌粉:蜡样芽孢杆菌菌粉的重量配比为1:1。

具体处理过程如下：处理池中添加一部分该污水处理系统的好氧污泥，按照上述比例添加降酚菌剂，曝气使溶氧在2mg/l以上，闷曝两天后每天进出水一次共1m³，同时通过添加工业苯酚逐步提高进水酚含量，同时以不添加降酚复合菌的活性污泥作为对照，进水酚含量在3100mg/l时24h后挥发酚降解率为99％，3300mg/l时，降解率在95％以上，3500mg/l时，降解率约为85％，空白组进水挥发酚含量在800mg/l时降酚率明显下降，不到20％。可见本发明所提供的复合菌剂对酚的最大耐受能力在3500mg/l，远高于现有菌剂。

序列表

<110>黄河三角洲京博化工研究院有限公司

<120>一种生物降酚菌剂及其应用方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1432

<212>dna

<213>产碱菌(alcaligenesspp)

<400>1

tgaatatcaccgtggtagcgccctccttgcggttaggctacctacttctggtgaaaccca60

ctcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcgacattct120

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<210>2

<211>1055

<212>dna

<213>蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)

<400>2

ccatgggcgggctatacatgcaagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagt60

tagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgg120

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