一株可降解石油烃的菌株及其应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株可降解石油烃的菌株及其应用。

背景技术：

石油作为一种化石燃料，组成成分较复杂，主要由各种环烷烃、烷烃及芳香烃等组成，随着工业化的发展，汽油、柴油等石油提炼品已经成为人类生活中不可或缺的能源，石油在开采、提炼、运输及应用过程中都会对环境产生很大的威胁，会污染我们种植粮食作物的土壤，污染海洋及地下水的水源，而这些都是与我们的生活息息相关的，石油污染的治理和修复已成为亟待解决的难题，传统的处置方法主要以物理化学法为主，不但收效甚微，而且还会造成二次污染，微生物修复技术主要是通过微生物的作用将石油污染物降解为无毒稳定的产物，如水、二氧化碳及一些无机物等，具有经济效益高、环境友好、作用效果明显等优点。

利用微生物方法治理石油污染的关键在于寻找到具有高效石油烃降解活性、不会造成二次污染、培养条件简单、抗冲击能力强的菌株，因此，从自然界筛选高效石油烃降解菌菌株是研究人员的重要任务之一。近年来，有关石油烃降解菌株的研究时有报道，专利cn104017747a公开了一种含油污泥中石油降解菌cgmcc8647，该菌株对饱和烃的降解率最高达20.47％，30d内对总石油烃的降解率为39.69％，总石油烃浓度为注明；专利cn104651280a公开了一株石油降解菌cgmccno.9913，该菌株在最适降解条件下反应18d后对含200ppm原油溶液的降解率达71.4％；专利cn105505812a公开一株石油降解菌株cctccm2015537，该菌株能够在以石油为唯一碳源和能源的培养基中生长，但未明确其降解时间及其降解率。

上述三株石油降解菌均系自主筛选分离，对石油烃有一定的降解效果，但降解周期均较长，降解率偏低，产业化应用中会增加运行成本，在一定程度上限制了菌株的应用推广。

因此找寻可降解石油烃的菌株成为本领域技术人员难以解决的问题。

技术实现要素：

本发明针对上述技术存在的不足，提供了一株可降解石油烃的菌株，可用于石化污水处理中，所述菌株经过16srdna鉴定分别为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，该菌株已于2018年7月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株代码为yjy18-06,保藏号为cgmccno.16154,应用时将该菌株制备的菌剂应用于石化含油废水的生物法处理，按照0.1‰接种量投入石化好氧池o1，处理7d后池中的泡沫浮渣已全部降解，除油率达到90.4％。本发明的菌株对石油烃类物质具有较好的降解特性，并且不会对环境造成二次污染，提高含油污水的处理效率，可将其应用于石油污染物的生物降解及油污土壤的生物修复等领域。

本发明的具体技术方案是：

从山东京博石油化工有限公司厂区及山东清远环保工程有限公司提供的样品中分离出6株能产生噬油斑的菌落，并分别进行分离纯化；

从6株产生噬油斑的菌落中选出3株噬油斑比较大的菌株；

对3株待选菌进行比较深入的遗传稳定性及石油烃降解效率等研究，最终筛选出一株石油烃降解效率高、易于培养且有稳定的传代特性的菌株，将其命名为c2。

该菌株形态特征革兰氏阳性菌，无荚膜，杆状；该菌株在普通营养琼脂上形成圆形突起的菌落，菌落表面粗糙不透明，呈污白色，在液体培养基中生长时，常形成皱酺；

发明人对其进行进行了16srdna测序，其核苷酸序列如seqidno：1所示，该序列为菌株的16srdna的全序列；所测得的16srdna序列进行blast比对，比对结果显示，该菌株的16srdna的核苷酸序列与芽孢杆菌属(bacillussp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的菌株有100％的同源性。

因此发明人将其菌株代码命名为yjy18-06；并对其进行了生物保藏，其生物保藏编号为cgmccno.16154；

获得上述菌株后，发明人还提供了对应的菌剂生产方法如下：

(1)菌种活化：将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20℃-25℃)活化4h-8h，活化时无需额外补加培养基；

(2)液体种子制备：在无菌操作台上，用10ml灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入100ml灭菌的常规lb液体培养基中，振荡培养12-18h制备种子液；

(3)发酵：

①发酵培养基配方：葡萄糖1.5％、玉米粉1％、豆粕4％、尿素0.2％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.03％、硫酸亚铁0.005％、cacl20.02％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水；

②发酵罐灭菌：121℃下灭菌半小时；

③摇瓶倒种:罐压下降至接近零，打开接种口，按体积比1‰倒入步骤(2)中的种子液；

④发酵控制：温度35℃，罐压0.05mpa，起始转速200rpm，溶氧≧20％，空气1：1；

⑤发酵终点判断：溶氧降为20％，ph上升至8.8即为发酵完成；

⑥菌剂应用：菌剂应用于无组织废气的处理时要将其吸附与载体上，因此菌剂应用时最好是现发酵现用，直接用菌液进行挂菌。

菌株驯化方法如下：

以石化污水处理的好氧池污泥为驯化基质，隔油池隔出的污油为驯化原料，菌剂添加量为体积比1‰，含油量从100ppm开始驯化，每个梯度稳定两个周期后继续提量，按照体积比2％-3％的梯度增加污油量，含油量最终驯化至1000ppm。

本发明所获得的菌株对石油烃类物质有高效降解效果，具体验证方法如下：

a.噬油斑实验：

lb固体平板上加入2ml原油，用涂布棒将原油均匀涂布在培养基上，取5cm大小的无菌滤纸平贴于原油层，取20ul活化的菌液滴加到滤纸上，放于35℃培养箱中培养，定期观察噬油斑；其中观察记录时间分别为0h、12h、18h、24h；

结果如图1所示，图中显示12h时菌株已降解约1/2的平板原油，随着时间的延长菌株的噬油斑随之增加，到24h时平板上只剩约1/10的原油，同时噬油斑处的菌落生长较好。

b.摇瓶除油实验：

活化除油效果较好的菌株，按5％接种量分别接入含500ppm原油的无机盐培养基中，35℃，170rpm振荡处理，每隔一定时间取样检测溶液除油率，同时做空白对照。

取样时间分别为8h、16h、24h、32h、48h，检测样品中总油含量，进行除油率计算。

结果如图2和图3所示，配制含500ppm的原油溶液，随着处理时间的延长实验组中的原油含量逐渐减少，加菌处理48h后的摇瓶瓶壁上无油污，溶液表面无明显油花，溶液颜色呈褐色，无沉淀，原油降解率为53.8％。

在上述实验的基础上，发明人将上述菌剂应用于石化污水处理厂的处理装置中，特别是好氧池o1池具体方法如下：

菌株发酵后的菌液按照体积比万分之一的比例加入石化好氧池o1池中进行除油效果验证。

从图4中可以明显观察到投加菌体3d后池中污泥泡沫浮渣明显减少，降解率达到44.6％，5d后池中只剩部分污泥泡沫，降解率达到56.9％，对o1池进行了为期一周的跟踪检测，随着时间的延长加菌池污泥表面的泡沫浮渣逐渐减少，图5中可以看出除油率稳步增加，7d时除油率可达90.4％；

可见本发明所提供的菌株对于石油烃类有明显的降解效果。

综上所述，利用本发明提供的菌株制备的菌剂应用于石化含油废水的生物法处理，按照0.1‰接种量投入石化好氧池o1，处理7d后池中的泡沫浮渣已全部降解，除油率达到90.4％。本发明的菌株对石油烃类物质具有较好的降解特性，并且不会对环境造成二次污染，提高含油污水的处理效率，可将其应用于石油污染物的生物降解及油污土壤的生物修复等领域。

保藏信息

保藏时间：2018年7月25日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心

保藏编号：cgmccno.16154

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名:枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)

附图说明

图1为噬油斑实验结果示意图；

图中a为0h，b为12h，c为18h，d为24h；

图2为摇瓶降解原油实验结果示意图；

图中a为0h，b为24h，c为48h；

图3为500ppm原油溶液48h内的降解率趋势图；

图4为石化好氧池o1池现场处理图；

图中a为处理3d实验组；b为处理3d空白组；c为处理5d实验组；d为处理5d空白组；

图5为石化好氧池o1池7d除油率趋势图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。

实施例1菌株的获得

从山东京博石油化工有限公司厂区及山东清远环保工程有限公司提供的样品中分离出6株能产生噬油斑的菌落，并分别进行分离纯化；

从6株产生噬油斑的菌落中选出3株噬油斑比较大的菌株；

对3株待选菌进行比较深入的遗传稳定性及石油烃降解效率等研究，最终筛选出一株石油烃降解效率高、易于培养且有稳定的传代特性的菌株，将其命名为c2。

该菌株形态特征革兰氏阳性菌，无荚膜，杆状；该菌株在普通营养琼脂上形成圆形突起的菌落，菌落表面粗糙不透明，呈污白色，在液体培养基中生长时，常形成皱酺；

发明人对其进行进行了16srdna测序，其核苷酸序列如seqidno：1所示，该序列为菌株的16srdna的全序列；所测得的16srdna序列进行blast比对，比对结果显示，该菌株的16srdna的核苷酸序列与芽孢杆菌属(bacillussp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的菌株有100％的同源性。

因此发明人将其菌株代码命名为yjy18-06；并对其进行了生物保藏，其生物保藏编号为cgmccno.16154。

实施例2菌株的发酵

(1)菌种活化：将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20℃-25℃)活化4h-8h，活化时无需额外补加培养基；

(2)液体种子制备：在无菌操作台上，用10ml灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入100ml灭菌的常规lb液体培养基中，振荡培养12-18h制备种子液；

(3)发酵：

①发酵培养基配方：葡萄糖1.5％、玉米粉1％、豆粕4％、尿素0.2％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.03％、硫酸亚铁0.005％、cacl20.02％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水；

②发酵罐灭菌：121℃下灭菌半小时；

③摇瓶倒种:罐压下降至接近零，打开接种口，按体积比1‰倒入步骤(2)中的种子液；

④发酵控制：温度35℃，罐压0.05mpa，起始转速200rpm，溶氧≧20％，空气1：1；

⑤发酵终点判断：溶氧降为20％，ph上升至8.8即为发酵完成；

⑥菌剂应用：菌剂应用于无组织废气的处理时要将其吸附与载体上，因此菌剂应用时最好是现发酵现用，直接用菌液进行挂菌。

菌株驯化：

以石化污水处理的好氧池污泥为驯化基质，隔油池隔出的污油为驯化原料，菌剂添加量为体积比1‰，含油量从100ppm开始驯化，每个梯度稳定两个周期后继续提量，按照体积比2％-3％的梯度增加污油量，含油量最终驯化至1000ppm。

实施例3小试实验

a.噬油斑实验：

lb固体平板上加入2ml原油，用涂布棒将原油均匀涂布在培养基上，取5cm大小的无菌滤纸平贴于原油层，取20ul活化的菌液滴加到滤纸上，放于35℃培养箱中培养，定期观察噬油斑；其中观察记录时间分别为0h、12h、18h、24h；

结果如图1所示，图中显示12h时菌株已降解约1/2的平板原油，随着时间的延长菌株的噬油斑随之增加，到24h时平板上只剩约1/10的原油，同时噬油斑处的菌落生长较好。

b.摇瓶除油实验：

活化除油效果较好的菌株，按体积比5％接种量分别接入含500ppm原油的无机盐培养基中，35℃，170rpm振荡处理，每隔一定时间取样检测溶液除油率，同时做空白对照。

取样时间分别为8h、16h、24h、32h、48h，检测样品中总油含量，进行除油率计算。

总含油量的测定方法为红外吸收光谱法。

结果如图2和图3所示，配制含500ppm的原油溶液，随着处理时间的延长实验组中的原油含量逐渐减少，加菌处理48h后的摇瓶瓶壁上无油污，溶液表面无明显油花，溶液颜色呈褐色，无沉淀，原油降解率为53.8％。

实施例4菌剂的应用

某石化污水处理厂好氧池进水中含油量超标，造成系统冲击，将菌株发酵后的菌液按照体积比万分之一的比例加入石化好氧池o1池中进行除油效果验证，其中好氧池ph控制在7-8，温度30-35℃，溶氧控制在2-4mg/l。

从图4中可以明显观察到投加菌体3d后池中污泥泡沫浮渣明显减少，降解率达到44.6％，5d后池中只剩部分污泥泡沫，降解率达到56.9％，对o1池进行了为期一周的跟踪检测，随着时间的延长加菌池污泥表面的泡沫浮渣逐渐减少，图5中可以看出除油率稳步增加，7d时除油率可达90.4％。

序列表

<110>黄河三角洲京博化工研究院有限公司

<120>一株可降解石油烃的菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1415

<212>dna

<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)

<400>1

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