一种多环芳烃降解菌及其检测多环芳烃污染的方法和应用与流程

本发明属于环保生物技术领域，尤其涉及一种多环芳烃降解菌及其检测多环芳烃污染的方法和应用。

背景技术：

中国工业生产主要以石油工业为主，石油的大量使用，导致环境中的石油化工污染物越来越多，其中多环芳烃是其最常见的污染物之一。多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbon，pahs)是分子中含有两个以上苯环的碳氢化合物，包括菲、萘、蒽、芘和苯并芘等。多环芳烃具有高疏水性、高熔点、高沸点、低蒸汽压的特点，并且化学性质稳定，不易挥发。这些特性使得多环芳烃在自然界可以沉积在土壤和水体底泥中，通过食物链传递和积累，进而对动物、人类产生致癌、致畸变和致突变等危害。因此，检测环境土壤和底泥中的多环芳烃，对环境污染的及时发现和治理具有重要意义。

环境中多环芳烃的现有检测方法包括：气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、纳米材料电极检测法等，如中国专利申请201610032357.7公开了一种高灵敏检测多环芳烃的电化学方法，中国专利申请201610551686.2公开了一种气相色谱-质谱检测多环芳烃的方法，中国专利申请201610101319.2公开了一种环境样品中16种多环芳烃的高效液相色谱分析方法。上述检测方法受限于昂贵、高端的检测仪器或检测材料(如：气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、纳米修饰氧化铟锡电极)，检测操作复杂且成本高昂，难以大规模推广应用。

经文献调研发现，moraxella(莫拉克斯氏菌属)在生物修复中的报道不多，仅有的几篇报道集中在染料生物降解方面。例如：文献(biodegradationofthetextiledyemordantblack17(calcon)bymoraxellaosloensisisolatedfromtextileeffluent-contaminatedsite.worldjournalofmicrobiologyandbiotechnology,march2014,volume30,issue3,pp915–924)报道了moraxellaosloensis可以降解铬蓝黑r染料；文献(nachiyar,c.v.,sunkar,s.,kumar,g.n.,karunya,a.,ananth,p.b.,prakash,p.,&jabasingh,s.a.(2012).biodegradationofacidblue113containingtextileeffluentbyconstructedaerobicbacterialconsortia:optimizationandmechanism.jbioremedbiodeg,3(162),2.)报道了moraxellaosloensis可以降解酸性兰113。尚未发现moraxella在多环芳烃污染检测或降解方面的报道。

因此，提供一种无需专业设备、操作简便的多环芳烃污染的检测方法，对于污染的及时发现和治理以及人类健康安全具有重要意义。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题(需要专业设备、操作复杂、检测成本高等)，本发明从moraxella中筛选出一种新的多环芳烃降解菌，名称及注明的鉴别特征：moraxellaosloensiscfp312，分类学名称：moraxellaosloensis，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60595，保藏日期为2018年10月18日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，并进一步将该菌用于多环芳烃污染的检测和治理，无需使用昂贵的专业设备或检测材料，该菌可降解多环芳烃并同步产生橙红色色素，专一性和重现性好，降解效率高，便于直观判断，适用范围广，对于多环芳烃污染的及时发现和治理具有重要意义。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。

本发明提供一种多环芳烃降解菌，其菌株名称为moraxellaosloensiscfp312，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60595。

本发明提供的多环芳烃降解菌moraxellaosloensiscfp312具有较强的多环芳烃降解能力和专一性，不同化邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二乙酯和甲苯等底物，经底物谱检测实验，邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二乙酯、甲苯、二甲苯、间苯二甲酸、邻氯甲苯、邻氯苯胺和对甲基苯酚的检测结果均为阴性。以菲为例，本发明提供的多环芳烃降解菌moraxellaosloensiscfp312在24h对400mg/l菲的降解率高达95.2％。在降解多环芳烃的过程中，同步产生可见吸收峰处于474nm的橙红色色素。在底物多环芳烃浓度为0～2.25mmol/l时，该菌株产生的色素浓度与多环芳烃含量呈线性相关，可用于定量检测底物多环芳烃的含量。

优选地，所述多环芳烃包括萘、菲和芘。

此外，本发明还提供一种多环芳烃降解菌检测多环芳烃污染的方法，包括如下步骤：

s1样品的前处理：在待测区域设置10～20个采样点，各采样点间隔18～22cm，每个采样点从地表以下5cm～10cm处采集样品，将各采样点采集的样品混合均匀并烘干，得到待测样品；

s2待测样品中多环芳烃的萃取：将添加0.06～0.15g/lβ-环糊精的无机盐培养基和步骤s1得到的待测样品按8～12ml：1g的用量比于容器中混合均匀，置于恒温振荡器中4～25℃萃取1～2h，离心，收集上清液，得到含多环芳烃的萃取检测液；

s3多环芳烃降解菌的接种和发酵：取步骤s2得到的含多环芳烃的萃取检测液于三角瓶中，接种所述的多环芳烃降解菌，于28～32℃、120～180r/min恒温震荡培养22～28h，随后取出培养液，离心，收集上清液，得到发酵液；

s4多环芳烃的含量检测：将步骤s3得到的发酵液在474nm下测量其吸光度，对照构建的标准曲线，得出多环芳烃的含量。

采用上述检测方法，充分利用了多环芳烃降解菌moraxellaosloensiscfp312的降解代谢特性，即在降解多环芳烃的同时同步产生橙红色色素，便于直观判断，且在一定范围内，该菌株产生的色素浓度与多环芳烃含量呈线性相关，无需使用昂贵的专业设备或检测材料即可实现多环芳烃的定性和定量含量，操作简便，适用范围广。

通过在无机培养基中添加少量的β-环糊精，可起到增溶萃取土壤和/或底泥样品中的多环芳烃的作用，提高了萃取效率。

优选地，所述样品为土壤样品，每个采样点从地表以下5cm处采集样品。对于土壤样品，各采样点采样100～250g土壤。

优选地，所述样品为底泥样品，每个采样点从底泥表层以下10cm处采集样品。对于底泥样品，各采样点采样250～500g底泥。

优选地，所述无机盐培养基包括如下组分：na2hpo40.8g/l、kh2po40.2g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.001g/l、(nh4)2so41g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、fecl3·3h2o0.005g/l、cacl2·2h2o0.1g/l。na2hpo4、kh2po4、(nh4)6mo7o24·4h2o、(nh4)2so4、mgso4·7h2o、fecl3·3h2o、cacl2·2h2o主要为moraxellaosloensiscfp312提供除碳源以外的其他无机营养。

优选地，所述步骤s2中，恒温振荡器的转速为180～220r/min，离心的转速为3500～4500r/min。

优选地，所述步骤s3中，调ph至8.0，于30℃、150r/min恒温震荡。

优选地，所述步骤s3中，离心的转速为7000～9000r/min。

此外，本发明还提供一种多环芳烃降解菌在土壤和/或底泥的多环芳烃污染治理中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明提供一种新的多环芳烃降解菌moraxellaosloensiscfp312，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60595，具有较强的多环芳烃降解能力和专一性，在24h对400mg/l菲的降解率高达95.2％；

(2)本发明发现了多环芳烃降解菌moraxellaosloensiscfp312在降解多环芳烃的同时同步产生橙红色色素的降解代谢特性，并进一步用于多环芳烃污染的检测和治理，便于直观判断，无需使用昂贵的专业设备或检测材料即可实现多环芳烃的定性和定量含量，操作简便，重现性好，显著降低了检测周期和检测成本，适用范围广。

(3)本发明通过在无机培养基中添加少量的β-环糊精，可起到增溶萃取土壤和/或底泥样品中的多环芳烃的作用，提高了萃取效率。

(4)本发明还提供了多环芳烃降解菌moraxellaosloensiscfp312在土壤和/或底泥的多环芳烃污染治理中的应用，对于生态环境调查、污染的及时发现和治理以及人类健康安全具有重要意义。

附图说明

图1多环芳烃降解菌moraxellaosloensiscfp312降解多环芳烃产生的橙红色色素的全波长扫描图。

图2降解产生的橙红色色素的光吸收与多环芳烃摩尔浓度的标准曲线。

多环芳烃降解菌moraxellaosloensiscfp312，于2018年10月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60595。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明所涉及的moraxellaosloensiscfp312菌株为发明人从江西赣州赣江河流多环芳烃污染的底泥中筛选所获得，该菌株在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmccno：60595。本发明实施例中的土壤分别来自江西赣州的汽车加油站、汽车修理店、电子工业园附近土壤。本发明实施例中的底泥分别来自江西赣州的污水处理厂排污口、城市河涌的底泥。

无机盐培养基：na2hpo40.8g/l、kh2po40.2g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.001g/l、(nh4)2so41g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、fecl3·3h2o0.005g/l、cacl2·2h2o0.1g/l。

实施例1moraxellaosloensiscfp312菌种的筛选和鉴定

一、菌种筛选

本发明提供的多环芳烃降解菌株为moraxellaosloensiscfp312，分离自江西赣州赣江河流底泥中。菌株的具体筛选方法为：从河流底泥中取2g底泥样品加入到含有多环芳烃(具体为菲)的无机盐培养基中培养3天，稀释后涂平板再培养3天挑选单菌落后划线保存菌种。测试所保藏菌种的多环芳烃降解能力，并优选出一株能高效降解多环芳烃并同步产橙红色色素的菌株。

二、菌种鉴定

菌落形态特征：白色、圆形、个头较小、略显透明、表面光滑湿润、易于挑起、边缘齐整、有光泽。

显微形态特这：菌体为球形。

生理生化特征：革兰氏阴性细菌(革兰氏染色阴性)；接触酶、氧化酶、硝酸盐还原、反硝化反应阳性；不能利用肌醇、d-山梨醇、l-鼠李糖、蔗糖、d-(+)-蜜二糖、苦杏仁苷、l-阿拉伯糖、d-(+)-α-乳糖、d-木糖；β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、柠檬酸盐利用、产硫化氢、尿素酶、吲哚实验、vp实验、明胶水解实验阴性。

底物谱鉴定：菲、萘阳性并产橙红色色素，降解多环芳烃产生的橙红色色素的全波长扫描图如图1所示。邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二乙酯、甲苯、二甲苯、间苯二甲酸、邻氯甲苯、邻氯苯胺、对甲基苯酚阴性。

分子鉴定结果：16srdna序列如下所示：

agcaggcggagctaccatgcagtcgacgatgattatctagcttgctagatatgattagtggcggacgggtgagtaacatttaggaatctgcctagtagtgggggatagctcggggaaactcgaattaataccgcatacgacctacgggtgaaagggggcgcaagctcttgctattagatgagcctaaatcagattagctagttggtggggtaaaggcccaccaaggcgacgatctgtaactggtctgagaggatgatcagtcacaccggaactgagacacggtccggactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttttggttgtaaagcactttaagcagggaggagaggctaatggttaatacccattagattagacgttacctgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgagtgtaggtggctcattaagtcacatgtgaaatccccgggcttaacctgggaactgcatgtgatactggtggtgctagaatatgtgagagggaagtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagcttcctggcataatattgacactgagattcgaaagcgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctactagccgttggggtccttgagactttagtggcgcagttaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatagtgagaatcctgcagagatgcgggagtgccttcgggaattcacatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttttccttatttgccagcgggttaagccgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggtaggtacagagggttgctacacagcgatgtgatgctaatctcaaaaagcctatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcagatcagaatgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtctattgcaccagaagtaggtagcctaacgcaagagggcgctaccacggattcgaggtcg，即seqidno：1。

三、moraxellaosloensiscfp312的保藏

通过以上鉴定结果，确认cfp312属于moraxella属的新菌，将其命名为cfp312，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60595。

实施例2cfp312降解多环芳烃的条件筛选

挑取moraxellaosloensiscfp312单菌落于3mllb液体培养基中，30℃、150r/min振荡培养12小时，获得对数生长期种子液。

无机盐培养基：na2hpo40.8g/l、kh2po40.2g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.001g/l、(nh4)2so41g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、fecl3·3h2o0.005g/l、cacl2·2h2o0.1g/l。

实验以多环芳烃菲作为菌种降解的唯一碳源、以无机盐培养基作为培养体系，考察24小时以内，moraxellaosloensiscfp312在ph2～11、温度20～45℃、摇床转速100～300、接种量10～1000μl、底物浓度5～1000mg/l的条件下对多环芳烃菲的降解情况。结果表明：moraxellaosloensiscfp312的最佳降解条件为ph8.0、温度30℃、摇床转速150rpm，接种量为100μl。在24h对400mg/l菲的降解率高达95.2％。

实施例3cfp312降解产生的橙红色色素的光吸收与多环芳烃摩尔浓度的标准曲线

吸光度指的是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的以10为底的对数(即lg(i0/i1))。

多环芳烃含量以摩尔浓度方式表示，与质量浓度换算公式如下所示：

多环芳烃质量浓度mg/l(或mg/kg)＝多环芳烃摩尔浓度mmol/l×多环芳烃分子量。

标准曲线的构建包括如下步骤：在30ml无机盐培养基中分别添加浓度为0、0.28、0.56、1.12和2.24mmol/l的多环芳烃(菲)，接种100μlmoraxellaosloensiscfp312后在ph8.0、温度30℃、摇床转速150rpm的条件下培养24h；随后取出培养基并在8000rpm下离心10min去除细胞，用可见分光光度计检测上清液中色素的吸光度。此外，发明人将菲改为等摩尔质量的萘或芘，构建得到的标准曲线相同，偏差在合理误差范围内。

降解产生的橙红色色素在474nm的光吸收与多环芳烃(菲)摩尔浓度的标准曲线如图2所示。从图2可知，在底物多环芳烃浓度为0～2.25mmol/l时，该菌株产生的色素浓度与多环芳烃含量呈线性相关，r²＝0.9937。因此，本发明构建的检测方法适用于菲、萘、芘的单独检测，也适用于多种多环芳烃的同时检测，检测得到的是多环芳烃的总量。

实施例4cfp312对土壤样品中多环芳烃的降解及指示作用。

取某汽车加油站、汽车修理店、电子工业园等地区周围土壤，设置16个采样点，各采样点间隔20cm，每个采样点从地表以下5cm处采集样品200g，将各采样点采集的样品混合均匀并烘干，得到待测样品；将添加0.1g/lβ-环糊精的无机盐培养基与待测样品按10ml：1g的用量比于容器中混合均匀，置于恒温振荡器中20℃萃取1h，4000r/min离心，收集上清液，得到含多环芳烃的萃取检测液。

将萃取检测液平均分成2份，其中一份在ph8.0、温度30℃、摇床转速150rpm，moraxellaosloensiscfp对数生长期种子液的接种量为100μl的条件下降解24h。随后，取培养基离心去除细胞得到上清液测其吸光度(od值)，对照构建的标准曲线换算得到土壤中多环芳烃的总含量。

另外一份萃取检测液采用高效液相色谱法测定多环芳烃的总含量。用agilent1260高效液相色谱仪、安捷伦c18色谱柱(5μm,150毫米×4.6毫米)和安捷伦g1314bc自动可变波长紫外可见检测器进行高效液相色谱(hplc)分析。检测波长为254nm，流动相为乙腈：水(80:20)，流速为1.0ml/min，保留时间分别为1.9min(萘)、2.7min(菲)、3.4min(芘)。

两种方法测定的多环芳烃含量对比如表1所示：

表1本发明方法与色谱法测定土壤样品多环芳烃含量的结果对比

结果表明，本发明提供的利用moraxellaosloensiscfp312检测土壤多环芳烃污染的方法与高效液相色谱相比，检测偏差在10％以内，具有较高的准确性。此外，本发明提供的检测方法成本低廉，无需高端设备或检测材料，操作简便，判断方法直观易懂，适用范围广，易于推广。

实施例5cfp312对底泥样品中多环芳烃的降解及指示作用。

取赣江某河段、某污水处理厂排污口、某河涌地区底泥样品，设置12个采样点，各采样点间隔20cm，每个采样点从地表以下10cm处采集样品400g，将各采样点采集的样品混合均匀并烘干，得到待测样品；将添加0.1g/lβ-环糊精的无机盐培养基与待测样品按10ml：1g的用量比于容器中混合均匀，置于恒温振荡器中20℃萃取1h，4000r/min离心，收集上清液，得到含多环芳烃的萃取检测液。

将萃取检测液平均分成2份，其中一份在ph8.0、温度30℃、摇床转速150rpm，moraxellaosloensiscfp对数生长期种子液的接种量为100μl的条件下降解24h。随后，取培养基离心去除细胞得到上清液测od值，对照构建的标准曲线换算得到土壤中多环芳烃的总含量。

另外一份萃取检测液采用高效液相色谱法测定多环芳烃的总含量。用agilent1260高效液相色谱仪、安捷伦c18色谱柱(5μm,150毫米×4.6毫米)和安捷伦g1314bc自动可变波长紫外可见检测器进行高效液相色谱(hplc)分析。检测波长为254nm，流动相为乙腈：水(80:20)，流速为1.0ml/min，保留时间分别为1.9min(萘)、2.7min(菲)、3.4min(芘)。

两种方法测定的多环芳烃含量对比如表2所示：

表2本发明方法与色谱法测定底泥样品多环芳烃含量的结果对比

结果表明，本发明提供的利用moraxellaosloensiscfp312检测土壤多环芳烃污染的方法不适合底泥样品中多环芳烃含量极低(如<0.03mmol/kg)时的检测。对于具有一定多环芳烃含量的底泥，与高效液相色谱相比，本发明方法的检测偏差在10％以内，具有较高的准确性。此外，本发明提供的检测方法成本低廉，无需高端设备或检测材料，操作简便，判断方法直观易懂，适用范围广，易于推广。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>江西理工大学

<120>一种多环芳烃降解菌及其检测多环芳烃污染的方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1431

<212>dna

<213>moraxellaosloensiscfp312

<400>1

agcaggcggagctaccatgcagtcgacgatgattatctagcttgctagatatgattagtg60

gcggacgggtgagtaacatttaggaatctgcctagtagtgggggatagctcggggaaact120

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