以巨噬细胞为载体的纳米硫化铜粒子的制备方法与流程

本发明涉及纳米粒子转染细胞的方法，特别是涉及一种以巨噬细胞为载体的纳米硫化铜粒子的制备方法，属于化学、生物与材料领域。

背景技术：

癌症是当今威胁人类健康的主要疾病之一。近年来提出的近红外光介导的光热治疗，能够对肿瘤组织进行定点清除并且对正常组织具有较低的毒副作用，为肿瘤的治疗提供了新的方法。纳米材料在生物医学方面的应用和研究是纳米科技的一个十分重要方面。研究纳米技术在生命医学上的应用，可以在纳米尺度上比较清楚认识生物大分子的精细结构及相应功能的关系，获取生命信息或物质。

靶向递送常基于抗原抗体结合、碱基互补配对等原理，但由于肝脏首过效应等因素靶向效率仍有待提高。近年来，以肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages,tam）为目标的肿瘤研究成为了热点。其中，以tam为载体，提高纳米颗粒的输送效率，从而更加有效地诊断和治疗癌症。特别是，tam能够大量吞噬纳米材料并且将纳米载体运载至肿瘤厌氧区域，为药物在肿瘤部位的富集及组织穿透做出了巨大的贡献。

纳米光热治疗技术具有适用范围广、非侵入、选择性强、过程简单、正常组织损伤小等优点，在肿瘤治疗、药物释控、光控植入材料等领域展现出巨大的应用价值。作为一种半导体晶体材料，硫化铜纳米粒子具有强烈的近红外吸收，其主要机制是源于电子d-d能级之间的跃迁，硫化铜纳米粒子具有良好的的光热稳定性，这也为其在光热治疗中的应用提供了条件。空心结构的材料因其独特的空心结构所形成的大吸收截面，故硫化铜纳米空心球具有更高的光热转换效应。

使用tam转染光热疗纳米粒子，将其应用于肿瘤治疗当中，利用其光热转化效应杀死肿瘤细胞，同时也可以携带抗肿瘤药物，以实现对药物的控释。本发明利用简单易行的方法将光热疗纳米粒子与巨噬细胞组装在一起，与单纯的光热疗纳米粒子相比，该纳米复合物的生物相容性更好，纳米药物被巨噬细胞吞噬可避免被机体免疫系统识别和清除，生物相容性和体内循环时间得到很大程度的提高。如何提高转染效率是制备该种纳米粒子的关键。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以巨噬细胞为载体的纳米硫化铜粒子的制备方法，该转染纳米粒子具有生物相容性好，分散均匀、转染率高的特点。所得的产物能满足临床应用的需求。

本发明目的通过下述方案实现：一种以巨噬细胞为载体的纳米硫化铜粒子的制备方法，其特征在于采用芯片技术，在高流体流量的条件下，实现纳米硫化铜与巨噬细胞充分接触，同时在纳米硫化铜表面修饰与巨噬细胞亲和性的分子，具体包括以下步骤：：

（1）纳米硫化铜的制备与修饰

（2）芯片制作与细胞转染

采用计算机辅助设计和热压技术制备pmma芯片，芯片由上下两层片基组成，上层是细胞植入层，下层是细胞培养层；上层设有细胞及其培养基质注入口，采用注射泵注入，注射泵的推进速度0.1ml/h-0.3ml/h；下层层设有细胞培养室、纳米硫化铜分散液的流体通道和进口、纳米硫化铜和细胞混合液的流体蛇形通道和出口，0.1ml/h-0.3ml/h，上层的注入口与下层的培养室位置完全对应。

所述步骤（1）纳米硫化铜的制备与修饰：将聚乙烯吡咯烷酮溶解在可溶性铜盐的水溶液中，加入等体积的ph=9-11的氢氧化钠溶液，在室温搅拌条件下加入0.1mol/l的水合肼，柠檬酸三钠0.1-1.0mol/l，反应2-5分钟；将得到的水溶液中加入硫化钠，在30-60℃下水浴加热2小时得到硫化铜空心球产物，样品经离心分离，再分别用去离子水和无水乙醇洗涤多次；

将纳米硫化铜重新分散于水中，调节ph为5-9，加入与柠檬酸三钠等摩尔的甘露糖化精蛋白、nhs和edc，室温下搅拌24小时后，将产物过滤，离心，洗涤，得到所需产物。

可溶性铜盐为硫酸铜或氯化铜或醋酸铜，溶液的cu²⁺浓度为0.002-0.008mol/l,聚乙烯吡咯烷酮与cu²⁺的摩尔量比为（0.1-0.2）：1，水合肼与cu2+的摩尔比为4:1。

硫化钠与cu²⁺的摩尔比为（1-10）：1。

所述步骤（2）中芯片由上下两层片基组成，上下两层为长方体，大小完全一致；上下两层用胶水紧密相连，不漏气，不漏液。

上下两层长方体的长宽高为5厘米、3厘米和2毫米。

所述步骤（2）中上层的注入口为圆形，直径为2毫米。

所述步骤（2）中下层的培养室为圆形，直径为1厘米，高度为2毫米；分散液流体通道和混合液流体蛇形通道为直径为1毫米的管状结构。

所述步骤（2）中纳米硫化铜负载时浓度为10-100μg/ml。

所述步骤（2）中细胞和培养基为raw264.7细胞和rpmi1640培养基。

该转染纳米粒子具有生物相容性好，分散均匀、转染率高的特点。所得的产物能满足临床应用的需求。

附图说明

图1为上层芯片结构的设计图。

其中，11为细胞及其培养基质注入口。

图2为下层芯片结构的设计图。

其中，21为细胞培养室，22为纳米粒子分散液的流体通道和进口，23为纳米粒子和细胞混合液的流体蛇形通道和出口。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

实施例1

一种以巨噬细胞为载体的纳米硫化铜粒子的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）纳米硫化铜的制备与修饰

称取0.24g聚乙烯吡咯烷酮溶解在25ml的2mmol/l氯化铜溶液中，加入25ml的ph=10的氢氧化钠溶液，在室温搅拌条件下加入0.1mol/l的水合肼2ml，柠檬酸三钠0.1mol/l，反应5分钟，然后加入0.2mmol硫化钠，在60℃下水浴加热2小时得到硫化铜空心球产物，样品经离心分离，再分别用去离子水和无水乙醇洗涤多次。

将纳米硫化铜重新分散于水中，调节ph为9，加入与柠檬酸三钠等摩尔的甘露糖化精蛋白、nhs和edc，室温下搅拌24小时后，将产物过滤，离心，洗涤。

（2）芯片制作与细胞转染

pmma芯片结构如图1所示。将raw264.7细胞和rpmi1640培养基注入到上层的细胞及其培养基质注入口；将100μg/ml纳米硫化铜通过下层的流体通道和进口，采用注射泵注入到细胞培养室，注射泵的推进速度0.1ml/h。混合后的液体经过流体蛇形通道和出口被收集用于进一步检测。

结果：纳米硫化铜转染率94%。

实施例2

一种以巨噬细胞为载体的纳米硫化铜粒子的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）纳米硫化铜的制备与修饰

称取0.24g聚乙烯吡咯烷酮溶解在25ml的3mmol/l硝酸铜溶液中，加入25ml的ph=11的氢氧化钠溶液，在室温搅拌条件下加入0.1mol/l的水合肼2ml，柠檬酸三钠0.5mol/l，反应5分钟，然后加入0.3mmol硫化钠，在60℃下水浴加热2小时得到硫化铜空心球产物，样品经离心分离，再分别用去离子水和无水乙醇洗涤多次。

将纳米硫化铜重新分散于水中，调节ph为7，加入与柠檬酸三钠等摩尔的甘露糖化精蛋白、nhs和edc，室温下搅拌24小时后，将产物过滤，离心，洗涤。

（2）芯片制作与细胞转染

pmma芯片结构如图1所示。将raw264.7细胞和rpmi1640培养基注入到上层的细胞及其培养基质注入口；将50μg/ml纳米硫化铜通过下层的流体通道和进口，采用注射泵注入到细胞培养室，注射泵的推进速度0.2ml/h。混合后的液体经过流体蛇形通道和出口被收集用于进一步检测。

结果：纳米硫化铜转染率90%。

实施例3

一种以巨噬细胞为载体的纳米硫化铜粒子的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）纳米硫化铜的制备与修饰

称取0.24g聚乙烯吡咯烷酮溶解在25ml的5mmol/l氯化铜溶液中，加入25ml的ph=10的氢氧化钠溶液，在室温搅拌条件下加入0.1mol/l的水合肼2ml柠檬酸三钠1.0mol/l，反应5分钟，然后加入0.5mmol硫化钠，在60℃下水浴加热2小时得到硫化铜空心球产物，样品经离心分离，再分别用去离子水和无水乙醇洗涤多次。

将纳米硫化铜重新分散于水中，调节ph为7，加入与柠檬酸三钠等摩尔的甘露糖化精蛋白、nhs和edc，室温下搅拌24小时后，将产物过滤，离心，洗涤。

（2）芯片制作与细胞转染

pmma芯片结构如图1所示。将raw264.7细胞和rpmi1640培养基注入到上层的细胞及其培养基质注入口；将20μg/ml纳米硫化铜通过下层的流体通道和进口，采用注射泵注入到细胞培养室，注射泵的推进速度0.2ml/h。混合后的液体经过流体蛇形通道和出口被收集用于进一步检测。

结果：纳米硫化铜转染率86%。