抗体融合蛋白、制备方法及其应用与流程

本发明属于药物领域，具体涉及抗体融合蛋白、制备方法及其应用。
背景技术：
：双特异性抗体(bispecificmonoclonalantibody,bsab)是一种人工制作出来的可以同时结合两种不同抗原的特殊抗体。双特异性抗体能够同时识别肿瘤靶细胞和免疫效应细胞，因此兼有抗体特异性和介导效应细胞的细胞毒作用的双重功能。双特异性抗体能将效应细胞聚集于肿瘤部位并激活效应细胞发挥抗肿瘤作用，其杀伤肿瘤细胞的作用机理包括细胞增殖、细胞因子释放、细胞毒性多肽和酶的调控。体内及临床研究证明双特异性抗体介导的免疫治疗可使部分动物的肿瘤缓解，临床上可使肿瘤患者病情减轻，延长生命。因此，双特异性抗体介导的免疫活性细胞在肿瘤治疗中的应用具有良好的前景。双特异性抗体在自然状态下不存在，只能通过人工制备。本领域中双或多特异性抗体能够结合2种以上抗原，可以利用细胞融合、化学缀合或重组dna技术产生。最近己经开发了广泛多样的重组双特异性抗体形式，例如通过融合例如igg抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如co1oma,m.j.,等,naturebiotech.15(1997)159-163；wo2001077342；和morrison,s.l.,naturebiotech.25(2007)1233-1234)。此外，还开发了能够结合2种以上抗原的诸多其他新型形式，其中抗体中心结构(iga、igd、ige、igg或igm)不再保持如双抗体、三链抗体或四链抗体、minibodies和若干单链形式(scfv、bis-scfv)(holliger,p.,等，naturebiotech.23(2005)1126-1136；fischer，n.，和léger，o.，pathobio1ogy74(2007)3-14；shen,j.，等，journa1ofimmunogica1methods318(2007)65-74；wu,c.，等.,naturebiotech.25(2007)1290-1297)。在一种方法中，利用细胞杂交瘤(quadroma)技术(见mi1stein,c.和a.c.cue11o,nature，305(1983)537-40)生成了与天然抗体非常类似的双特异性抗体，所述细胞杂交瘤技术基于表达具有所需的双特异性抗体特异性的鼠单克隆抗体的两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合。因为在产生的细胞杂交瘤细胞系中的两个不同抗体重链和轻链的随机配对，所以生成至多10种不同抗体类型，其中只有一种是所需的功能双特异性抗体。由于存在错配副产物和显著降低的产率，其意味着需要复杂的纯化程序(参见例如morrison,s.l.,naturebiotech25(2007)1233-1234)。一般地，如果使用重组表达技术，则相同的错配副产物问题仍存在。用于避开错配副产物问题的方法，称为“凸起一进入一孔洞(knobs-into-ho1es)”，目的在于通过将突变引入ch3结构域以修饰接触界面来迫使两个不同抗体重链配对。在一条链上，大体积氨基酸被具有短侧链的氨基酸替换，以形成“孔洞”。相反地，将具有大侧链的氨基酸引入到另一个ch3结构域中，以形成“凸起”。通过共表达这两条重链，观察到与同型二聚体形式(“孔洞一孔洞”或“凸起-凸起”)相比高产率的异二聚体形式(“凸起-孔洞”)(ridgway,j.b.,presta,l.g.,carter,p.和wo1996027011)，异二聚体的百分比可以通过利用噬菌体展示法重建两个ch3结构域的相互作用表面和引入二硫键来稳定该异二聚体而得到进一步增加(merchant,a.m.，等,naturebiotech16(1998)677-681；atwell，s.,ridgway,j.b.,wells,j.a.，carter，p.,j.mol.biol.270(1997)26-35)。这种策略的一个重要制约是两个母体抗体的轻链必须相同，以防止错配和形成失活的分子。除“杵臼”结构之外，还可通过igg和igach3的链交换(strand-exchangeengineereddomain，seed)技术实现不同半抗体的fc配对(davis,j.h,等.,proteineng.des.sel.,2010,23(4):195-202.)。为了解决不同轻链正确装配的问题，近年来又开发了双细胞系分别表达半抗体、体外装配的新工艺。受到人体igg4抗体在生理条件下自然发生的半抗体随机交换过程的启示，genmab公司开发了fae(fab-armexchange)双功能抗体技术(gramer,m.j,等.,mabs2013,5(6):962-973.)。在两个目标抗体igg1重链ch3区分别引入k409r和f405l两个点突变，就能够形成类似于igg4抗体的半抗体交换重排。将突变后的两个不同igg1抗体在两个cho细胞系中分别表达并完成半抗体轻重链间的装配，经过蛋白a亲和纯化后，利用温和的氧化剂系统可在体外实现异源半抗体之间的精确装配。除了共用序列相同的轻链或进行体外装配，通过crossmab技术也可促进抗体轻链的正确装配。代表产品是罗氏公司的ang-2/vegfcrossmabch1-cl。crossmab技术是在“杵臼”改造的基础上，将ang-2抗体fab结构域中的cl与ch1互换，而vegf抗体的fab结构则保持不变。经过改造的ang-2抗体轻链不易与vegf抗体的重链发生错配，同时“杵臼”结构可促进两条重链异源二聚化(schaefer,w,等.,procnatl.acad.sci.usa,2011,108(27):11187-11192.)。此外，还可以将两个单链抗体(scfv)或者两个fab通过肽段链接，形成双功能抗体片段。具有代表性的是德国micromet公司开发的bite(bispecifict-cellengager)系列产品。该系列产品是将抗cd3单链抗体与不同抗肿瘤细胞表面抗原单链抗体通过肽段进行连接获得的(baeuerle,p.a,等.,cancerres.,2009,69(12):4941-4944.)。这类抗体结构的优点是分子量小、可以在原核细胞中表达、不需要考虑正确装配的问题；缺点是由于没有抗体fc段，不能介导相应的生物学功能、半衰期短等。另外，现有技术的相关双特异性抗体蛋白还存在瞬转表达量不高，亲和力也不高的不足之处，且有的纯化工艺复杂，难以达到工业化生产的需要。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种抗体融合蛋白、制备方法及其应用。该双特异性抗体融合蛋白，表达量高，装配率高，亲和力高，便于纯化，使用proteina或proteinl一步纯化纯度即可达到95％以上。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了抗体融合蛋白，其包括：(i)特异性结合第一抗原的抗体；(ii)柔性肽；(iii)特异性结合第二抗原的融合蛋白。在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体包括轻链可变区、轻链恒定区、重链可变区、重链恒定区1、重链恒定区2、重链恒定区3中的一个或多个片段。在本发明的一些具体实施方案中，还包括铰链区。在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体融合蛋白包括：a1).特异性结合第一抗原的抗体的轻链可变区、轻链恒定区、柔性肽以及特异性结合第二抗原的融合蛋白，即vl-cl-linker-trap；和b1).特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、部分铰链区、柔性肽以及特异性结合第二抗原的融合蛋白，即vh-ch1-patialhinge-linker-trap；或所述抗体融合蛋白包括：a2).特异性结合第一抗原的抗体的轻链；和b2).特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3，即vh-ch1-linker-trap-ch2-ch3；或所述抗体融合蛋白包括：a3).特异性结合第一抗原的抗体的轻链；和b3).特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、重链恒定区2和重链恒定区3、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白，即vh-ch1-ch2-ch3-linker-trap；或所述抗体融合蛋白包括：a4).特异性结合第一抗原的抗体的轻链可变区、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3，即vl-linker-trap-ch2-ch3；和b4).特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3，即vh-linker-trap-ch2-ch3。在本发明的一些具体实施方案中，所述柔性肽为(g4s)n，其中n为大于0的整数；优选为1～10的整数。在本发明的一些具体实施方案中，所述轻链恒定区(cl)和所述重链恒定区1(ch1)能够形成异源二聚体，所述轻链恒定区(cl)的末端半胱氨酸残基可以与重链的铰链区上的半胱氨酸残基形成二硫键。在本发明的一些具体实施方案中，重链的铰链区之间的半胱氨酸残基能形成二硫键。在本发明的一些具体实施方案中，其中第一重链的重链恒定区3(ch3)的结构域和第二重链的重链恒定区3的(ch3)结构域被改变为促进形成所述抗体融合蛋白的结构。在本发明的一些具体实施方案中，所述改变为：c)改变第一重链的重链恒定区3(ch3)的结构域：在与二价双特异性抗体内的第二重链的重链恒定区3(ch3)的结构域的初始界面相接触的第一重链的重链恒定区3(ch3)的结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有大于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基，在所述第一重链的重链恒定区3(ch3)的结构域的界面内生成凸起，所述凸起可以定位在所述第二重链的重链恒定区3(ch3)的结构域的界面内的凹洞中；且d)改变第二重链的重链恒定区3(ch3)的结构域：在与二价双特异性抗体内的第一重链的重链恒定区3(ch3)的结构域的初始界面相接触的第二重链的重链恒定区3(ch3)的结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有小于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基，在所述第二重链的重链恒定区3(ch3)的结构域的界面内生成凹洞，在所述凹洞中可以定位所述第一重链的重链恒定区3(ch3)的结构域的界面内的凸起。在本发明的一些具体实施方案中，所述重链中，所述具有大于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基由精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸组成；所述具有小于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基由丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸组成。在本发明的一些具体实施方案中，(iv)所述重链具有如seqidno.4或seqidno.5或seqidno.6或seqidno.7所示的氨基酸序列；且(v)所述轻链具有如seqidno.8或seqidno.9或seqidno.10所示的氨基酸序列；或(vi)(iv)或(v)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(iv)或(v)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(vii)、与(iv)或(v)所述序列90％以上同源性的氨基酸序列；或(viii)与(iv)或(v)所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的氨基酸序列；所述抗体融合蛋白能够特异性的结合hpd-l1和hvegf-a；所述第一抗原为hpd-l1，所述第二抗原为hvegf-a。在本发明的一些具体实施方案中，所述多个为2到10个。在本发明的一些具体实施方案中，其具有：(ix)氨基酸序列为seqidno.4的重链，和氨基酸序列为seqidno.8的轻链；或(x)氨基酸序列为seqidno.5的重链，和氨基酸序列为seqidno.9的轻链；或(xi)氨基酸序列为seqidno.6的重链，和氨基酸序列为seqidno.9的轻链；或(xii)氨基酸序列为seqidno.7的重链，和氨基酸序列为seqidno.10的轻链。在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体融合蛋白能够特异性的结合hpd-l1和hvegf-a；所述第一抗原为hpd-l1，所述第二抗原为hvegf-a。在本发明的一些具体实施方案中，抗体融合蛋白fabt结构的重链氨基酸序列如seqidno.4所示，轻氨基酸序列如seqidno.8所示；抗体融合蛋白ftf结构的重链氨基酸序列如seqidno.5所示，轻氨基酸序列如seqidno.9所示；抗体融合蛋白iggt结构的重链氨基酸序列如seqidno.6所示，轻氨基酸序列如seqidno.9所示；抗体融合蛋白fvt结构的重链氨基酸序列如seqidno.7所示，轻氨基酸序列如seqidno.10所示。本发明还提供了编码所述抗体融合蛋白的核苷酸，具有(xiii)、如seqidno.4或5或6或7所示的重链可变区的核苷酸序列；如seqidno.8或9或10所示的轻链可变区的核苷酸序列；或(xiv)、如seqidno.4或5或6或7所示的重链可变区的核苷酸序列的互补序列；如seqidno.8或9或10所示的轻链可变区的核苷酸序列的互补序列；或(xv)、与(xiii)或(xiv)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(xiii)或(xiv)的核苷酸序列不同的序列；或(xvi)、与(xiii)或(xiv)或(xv)所述序列90％以上同源性的序列。在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有与(xiii)或(xiv)或(xv)或(xvi)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(xiii)或(xiv)或(xv)或(xvi)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多个为2到10个。本发明还提供了一种表达载体，包括所述的核苷酸，及其表达载体转化获得的细胞。本发明还提供了一种结合物，包含与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价连接的所述抗体融合蛋白。本发明还提供了一种偶联物，其由所述抗体融合蛋白和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。本发明还提供了所述的抗体融合蛋白和/或所述的结合物和/或所述的偶联物在制备治疗疾病的药物和/或诊断疾病的组合物中的应用；所述疾病为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤或黑素瘤。本发明还提供了一种药物组合物，包括所述的抗体融合蛋白和/或所述的结合物和/或所述的偶联物。本发明还提供了一种试剂盒，包括所述的抗体融合蛋白和/或所述的结合物和/或所述的偶联物。本发明还提供了一种所述的抗体融合蛋白和/或所述的结合物和/或所述的偶联物治疗疾病的方法，所述疾病为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴瘤白血病、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、急性淋巴瘤白血病、神经胶质瘤、黑素瘤、糖尿病性黄斑水肿或湿性黄斑病变。本发明还提供了所述的抗体融合蛋白的制备方法，取所述的载体转化宿主细胞，在容许合成所述抗体融合蛋白的条件下培养所述宿主细胞，从培养物中收集所述抗体融合蛋白。本发明提供的抗体融合蛋白，表达量高，哺乳动物细胞293e中瞬转表达量100-150mg/l；装配率高，正确装配率超过95％；亲和力高，单边抗体/融合蛋白和抗原结合kd值与阳性对照单克隆抗体/融合蛋白和抗原结合kd值相当；便于纯化，使用proteina或proteinl一步纯化纯度即可达到95％以上。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示fabt结构双特异性抗体融合蛋白示意图；图2示ftf结构双特异性抗体融合蛋白示意图；图3示iggt结构双特异性抗体融合蛋白示意图；图4示fvt结构双特异性抗体融合蛋白示意图；图5示fabt、ftf、iggt和fvt结构双特异性抗体融合蛋白瞬转表达sds-page检测结果：m为maker；泳道1、2分别为fabt的非还原电泳和还原电泳；泳道3、4分别为ftf的非还原电泳和还原电泳；泳道5、6分别为iggt的非还原电泳和还原电泳；泳道7、8分别为fvt的非还原电泳和还原电泳；图6(a)、图6(b)分别示fabt、ftf、iggt和fvt结构双特异性抗体融合蛋白瞬转表达上清elisa检测结果；图7示fabt、ftf、iggt和fvt结构双特异性抗体融合蛋白纯化后sds-page检测结果：m为maker；泳道1、2分别为fabt经proteinl纯化后的非还原电泳；泳道2、4分别为ftf经mabselectsure纯化后的还原电泳；泳道5、6分别为iggt经mabselectsure纯化后的非还原电泳；泳道7、8分别为fvt经mabselectsure纯化后的还原电泳；图8示fabt、ftf、iggt和fvt结构双特异性抗体融合蛋白纯化后elisa检测结果；图9示fabt、ftf、iggt和fvt结构双特异性抗体融合蛋白阻断细胞vegfa信号通路的活性检测结果；图10示fabt、ftf、iggt和fvt结构双特异性抗体融合蛋白t细胞激活活性检测结果；图11示fabt、ftf、iggt和fvt结构双特异性抗体融合蛋白动物药效实验结果。具体实施方式本发明公开了一种抗体融合蛋白、制备方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明的双特异性抗体融合蛋白，其包括：a).特异性结合第一抗原的抗体的轻链可变区、轻链恒定区、柔性肽以及特异性结合第二抗原的融合蛋白，即vl-cl-linker-trap；和b).特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、部分铰链区、柔性肽以及特异性结合第二抗原的融合蛋白，即vh-ch1-patialhinge-linker-trap。或c).特异性结合第一抗原的抗体的轻链；和d).特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3，即vh-ch1-linker-trap-ch2-ch3。或e).特异性结合第一抗原的抗体的轻链；和f).特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、重链恒定区2和重链恒定区3、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白，即vh-ch1-ch2-ch3-linker-trap。或g).特异性结合第一抗原的抗体的轻链可变区、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3，即vl-linker-trap-ch2-ch3；和h).特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3，即vh-linker-trap-ch2-ch3。进一步的，所述柔性肽为(g4s)n，n为大于0的整数。进一步的，其中cl和ch1能形成异源二聚体，cl的末端半胱氨酸残基可以与重链的铰链区上的半胱氨酸残基形成二硫键。或进一步的，其中两条重链的铰链区之间的半胱氨酸残基能形成二硫键。进一步的，其中一条重链的ch3结构域和另一条重链的ch3结构域被改变为促进形成所述双特异性抗体融合蛋白的结构。所述的双特异性抗体融合蛋白，可做如下改变，所述改变为：a)改变第一重链的ch3结构域：在与二价双特异性抗体内的第二重链的ch3结构域的初始界面相接触的第一重链的ch3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有大于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基，在第一重链的ch3结构域的界面内生成凸起，所述凸起可以定位在第二重链的ch3结构域的界面内的凹洞中；且b)改变第二重链的ch3结构域：在与二价双特异性抗体内的第一重链的ch3结构域的初始界面相接触的第二重链的ch3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有小于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基，在第二重链的ch3结构域的界面内生成凹洞，在所述凹洞中可以定位第一重链的ch3结构域的界面内的凸起。上述的具有大于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基由精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸组成。上述的具有小于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基由丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸组成。进一步的，所述双特异性抗体融合蛋白为特异性的结合hpd-l1和hvegf-a的双特异性抗体，该具体双特异性抗体融合蛋白fabt结构的重链氨基酸序列如seqidno.4所示，轻氨基酸序列如seqidno.8所示；该具体双特异性抗体融合蛋白ftf结构的重链氨基酸序列如seqidno.5所示，轻氨基酸序列如seqidno.9所示；该具体双特异性抗体融合蛋白iggt结构的重链氨基酸序列如seqidno.6所示，轻氨基酸序列如seqidno.9所示；该具体双特异性抗体融合蛋白fvt结构的重链氨基酸序列如seqidno.7所示，轻氨基酸序列如seqidno.10所示。本发明的用于制备按照上述双特异性抗体融合蛋白的方法，其包括下列步骤:a)用以下各项转化宿主细胞，一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链可变区、轻链恒定区、柔性肽以及特异性结合第二抗原的融合蛋白的核酸分子，和一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、部分铰链区、柔性肽以及特异性结合第二抗原的融合蛋白的核酸分子。或一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链的核酸分子；和一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3的核酸分子。或一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链的核酸分子；和一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、重链恒定区2和重链恒定区3、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白的核酸分子。或一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链可变区、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3的核酸分子；和一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3的核酸分子。b)在容许合成所述双特异性抗体融合蛋白的条件下培养所述宿主细胞；和c)从所述培养物中回收所述抗体融合蛋白。本发明的宿主细胞，其包括一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链可变区、轻链恒定区、柔性肽以及特异性结合第二抗原的融合蛋白的核酸分子，和一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、部分铰链区、柔性肽以及特异性结合第二抗原的融合蛋白的核酸分子。或一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链的核酸分子；和一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3的核酸分子。或一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链的核酸分子；和一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、重链恒定区1、重链恒定区2和重链恒定区3、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白的核酸分子。或一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链可变区、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3的核酸分子；和一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链可变区、柔性肽、特异性结合第二抗原的融合蛋白、重链恒定区2和重链恒定区3的核酸分子。本发明的的双特异性抗体融合蛋白的组合物，包括治疗有效量的上述任一种双特异性抗体融合蛋白和可药用的载体、药用辅配物或药用赋形剂，优选的，所述组合为药用组合物(即药物)或诊断组合物。进一步的，所述药物组合物，其包括上述的人一种双特异性抗体融合蛋白和至少一种药用赋形剂。本发明的双特异性抗体融合蛋白，其具有如下优异的技术效果：1、表达量高，哺乳动物细胞293e中瞬转表达量100-150mg/l；2、装配率高，正确装配率超过95％；3、亲和力高，单边抗体/融合蛋白和抗原结合kd值与阳性对照单克隆抗体/融合蛋白和抗原结合kd值相当；4、便于纯化，使用proteina或proteinl一步纯化纯度即可达到95％以上。本发明提供的抗体融合蛋白、其制备方法及应用中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1：双特异性抗体融合蛋白制备1、双特异性抗体融合蛋白瞬时转染表达载体的构建材料结合人vegf-a的trap(seqidno.1)序列来自再生元公司的上市药物“eylea”(序列见中国专利cn103349781b序列表中﹤210﹥6)；抗人pd-l1的人源单克隆抗体来自于047ab-6的vl(seqidno.2)和vh(seqidno.3)的序列，所述047ab-6是金赛对天然人源库进行淘筛得到，也可参见中国专利cn201810044303.1；igg1重链恒定区ch1的编码核苷酸、铰链区和fc的编码核苷酸，和kappa链恒定区的核苷酸。方法选择pgs003构建双特异性抗体融合蛋白(4个，结构示意图见图1至图4)的重链和轻链的表达载体。根据vegfr1domain2和vegfr2domain3的编码核苷酸，抗人pd-l1的人源化单克隆抗体047ab-6的vl和vh的编码核苷酸，igg1重链恒定区ch1的编码核苷酸、铰链区和fc的编码核苷酸，和kappa链恒定区的核苷酸序列及载体中的多克隆位点设计引物。经pcr扩增后，使用体外重组的方法(南京金斯瑞，cloneezpcrcloningkit)将4个重链编码序列和3个轻链编码序列克隆至pgs003，如表1。测序鉴定目的基因正确插入后，将重组表达载体转化大肠杆菌top10f’，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃振荡培养16小时。使用zymoresearch的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，最后将质粒溶于1ml超纯水，用分光光度计测定质粒浓度和od260/280。od260/280在1.8～1.9为纯度较高的质粒dna。表1、重链和轻链瞬时转染表达载体列表重链表达载体名称重链氨基酸序列轻链表达载体名称轻链氨基酸序列h1seqidno.4l1seqidno.8h2seqidno.5l2seqidno.9h3seqidno.6l3seqidno.10h4seqidno.72、在哺乳动物细胞293e中的转染、表达和检测将上述4个重链表达载体和3个轻链表达载体中h1表达anti-hpd-l1的vh和结合hvegf-a的融合蛋白，l1表达anti-hpd-l1的vl和结合hvegf-a的融合蛋白，h2表达anti-hpd-l1的vh和结合hvegf-a的融合蛋白，l2表达anti-hpd-l1的vl，h3表达anti-hpd-l1的vh和结合hvegf-a的融合蛋白，l3表达anti-hpd-l1的vl和结合hvegf-a的融合蛋白，h4表达anti-hpd-l1的vh和结合hvegf-a的融合蛋白。上述载体按照h1+l1(fabt结构)、h2+l2(ftf结构)、h3+l2(iggt结构)和h4+l3(fvt结构)组合后进行2ml293e体系的瞬时转染表达评估，其中fabt、ftf、iggt和fvt结构的linker均为(g4s)3。检测表达量及抗体与人vegf-a和人pd-l1结合的elisa检测值，结果见图5、表2、表3和图6。fabt、ftf、iggt和fvt结构的表达、组装以及与抗原的结合都很好。使用293e在freestyle培养基中进行fabt、ftf、iggt和fvt结构的放大瞬时转染表达。转染前24小时，在1l细胞培养瓶中接种0.5×106细胞/ml的293e细胞300ml，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取300μl的293fectin加入到5.7ml的optimem中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将fabt和ftf结构分子所用到的表达质粒总量各300μg使用optimem稀释至6ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％co2温箱中120rpm摇床培养7天。表2、fabt、ftf、iggt和fvt结构的瞬时转染装配率lanebandpeakaveragetracepeakxtraceband％numbernumberintintintxmm1138.41221.984209.3948043.24299％128.4827.9518.41567.442168.56826.215360.67324730.62699％2210.1638.16111.51782.943166.90728.937377.71225271.57799％3212.1368.81512.439150.9594155.28416.841178.2389553.7199％表3、fabt、ftf、iggt和fvt结构的瞬时转染表达量抗体名称fabtftfiggtfvt表达量(mg/l)100150150100实施例2：优选抗体的纯化及检测fabt结构蛋白纯化：2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，经过proteinl(ge)层析，利用20mm枸橼酸-枸橼酸纳，ph3.0洗脱，用1mtrisbase调节ph至中性。纯化样品利用4～20％梯度胶(金斯瑞生物科技有限公司)进行sds-page检测纯化蛋白质，结果见图7和表4，结果显示fabt纯度为95％。ftf结构蛋白纯化：2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，经过mabselectsure(ge)层析，利用20mm枸橼酸-枸橼酸纳，ph3.0洗脱，用1mtrisbase调节ph至中性。纯化样品利用4～20％梯度胶(金斯瑞生物科技有限公司)进行sds-page检测纯化蛋白质，结果见图7和表4，结果显示ftf纯度为95％。iggt结构蛋白纯化：2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，经过mabselectsure(ge)层析，利用20mm枸橼酸-枸橼酸纳，ph3.0洗脱，用1mtrisbase调节ph至中性。纯化样品利用4～20％梯度胶(金斯瑞生物科技有限公司)进行sds-page检测纯化蛋白质，结果见图7和表4，结果显示iggt纯度为95％。fvt结构蛋白纯化：2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，经过mabselectsure(ge)层析，利用20mm枸橼酸-枸橼酸纳，ph3.0洗脱，用1mtrisbase调节ph至中性。纯化样品利用4～20％梯度胶(金斯瑞生物科技有限公司)进行sds-page检测纯化蛋白质，结果见图7和表4，结果显示fvt纯度为95％。表4、fabt、ftf、iggt和fvt结构的纯化后纯度lanebandpeakaveragetracepeakxtraceband％numbernumberintintintxmm1150.01621.287202.75410140.94499％2167.74727.728264.10517892.32199％222.0431.2280.9751.993158.90322.344212.82812536.20899％320.8210.3530.3740.374157.72825.974185.55110711.48899％428.1917.9316.29551.562实施例3：优选抗体结合人vegf-a及人pd-l1的elisa检测1、第一抗原包被：人pd-l1-his(金赛自构，seqidno.11)用pbs稀释成1μg/ml，加至96孔酶标板中，每孔50μl，4℃下孵育过夜。2、封闭：洗板三次后用3％bsa封闭，每孔250μl，37℃条件下孵育2小时。3、加候选抗体：洗板3次后，加入起始浓度为10mg/ml2倍稀释12个浓度梯度候选抗体样品或阳性对照或阴性对照。每孔50μl，25℃条件下孵育1小时。4、加入第二抗原：洗板三次后，人vegf-a-mfc(金赛自构，seqidno:12)用pbs稀释成10μg/ml，加至96孔酶标板中，每孔50μl，25℃条件下孵育1h。5、加二抗：洗板3次后，加入hrp标记链霉亲和素(1:10000)，每孔50μl，25℃条件下孵育1小时。6、显色：洗板4次后，加tmb显色液，每孔50μl，室温下避光显色10分钟。7、终止：直接加入50μl每孔的终止液终止反应。8、检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其od值，保存原始数据整理。结果见图8和表5，纯化后的分子fabtec50＝0.05834，ftfec50＝0.08869，iggtec50＝0.1041，fvtec50＝0.1661。表5、fabt、ftf、iggt和fvt结构的纯化后elisa检测ec50值抗体名称fabtftfiggtfvtec500.058340.088690.10410.1661实施例4：优选抗体亲和力测定使用biacoret200仪器检测fabt和ftf结构的亲和力。具体方法如下：将人pd-l1-his(金赛自构，seqidno.11)及人vegf-a-his金赛自构，seqidno:13)偶联在cm5生物传感芯片(ge)上，将不同浓度的抗体以30μl/min流速流过芯片，抗原与候选抗体进行结合，结合时间为120s，解离时间为300s。用biaevalution软件(ge)进行动力学拟合，获得亲和力常数结果如下表6表7，fabt、ftf、iggt和fvt与pd-l1的亲和力分别为6.16e-10m、1.04e-12m、6.37e-13m和3.37e-09m；fabt、ftf、iggt和fvt与vegf-a的亲和力分别为1.75e-09m、2.00e-09m、2.77e-08m和2.40e-09m。具体实施例中特异性结合hpd-l1和hvegf-a的双特异性抗体，该具体双特异性抗体融合蛋白fabt结构的重链氨基酸序列如seqidno.4所示，轻氨基酸序列如seqidno.8所示；该具体双特异性抗体融合蛋白ftf结构的重链氨基酸序列如seqidno.5所示，轻氨基酸序列如seqidno.9所示；该具体双特异性抗体融合蛋白iggt结构的重链氨基酸序列如seqidno.6所示，轻氨基酸序列如seqidno.9所示；该具体双特异性抗体融合蛋白fvt结构的重链氨基酸序列如seqidno.7所示，轻氨基酸序列如seqidno.10所示。表6、候选双特异性分子与pd-l1的亲和力测定结果抗体名称ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)rmax(ru)fabt3.20e+051.97e-046.16e-1020.7ftf1.83e+051.90e-071.04e-1226.4iggt2.34e+051.58e-076.37e-1333.7fvt1.27e+054.29e-043.37e-0918.6pd-l1阳性抗体3.64e+054.12e-071.13e-1227.9表7、候选双特异性分子与vegf-a的亲和力测定结果抗体名称ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)rmax(ru)fabt7.84e+051.37e-031.75e-0914.6ftf3.11e+056.24e-042.00e-098.2iggt3.66e+051.02e-032.77e-099.2fvt3.22e+057.74e-042.40e-098.4eylea阳性融合蛋白6.17e+059.32e-041.51e-0913.2实施例5：优选抗体阻断细胞vegfa信号通路活性测定nfat-re-luc2p-kdr-hek293细胞(金赛自构，在hek293细胞表面表达vegfa受体kdr，当vegfa与hek293细胞表面的kdr结合后，启动下游信号通路，nfat与nfat顺式原件结合让luc2p表达产生荧光)30000/50μl/well接种96孔板，各抗体最高终浓度1μm，3倍稀释，10个梯度(加样浓度4μm，25μl/well)，vegfa蛋白终浓度50ng/ml(加样浓度200ng/ml，25μl/well)，温箱孵育4h后裂解细胞，报告基因法检测。结果见图9，优选双特异性分子对于vegfa信号的阻断活性与对照分子eylea相当。实施例6：优选抗体t细胞激活活性测定cho-pdl1-cd3l细胞(金赛自构，在cho细胞表面表达pdl1和cd3l)40000/well接种于96孔板，置于培养箱中贴壁过夜。047ab-6样品、双特异性抗体融合蛋白(fabt、ftf、iggt和fvt)送检4个样品。初始浓度687.5nm，3倍稀释，10个浓度点。加入稀释抗体后加入jurkat-pd1-nfat细胞(金赛自构，在jurkat细胞表面表达pd1。当cho表面的cd3l与jurkat细胞结合后启动cho细胞内信号通路，使cho细胞发荧光，而当cho细胞表面的pdl1和jurkat表面的pd1结合后则阻止nfat信号通路，不能发出荧光)，100000/well加入培养板中。轻拍混匀孵育6h，6h后加入bio-glo检测。结果见图10，fabt、ftf、iggt和fvtt细胞激活活性略低于对照抗体047ab-6。实施例7：优选抗体动物药效测定模型：mc38(结直肠癌细胞)，2×105cells/mouse，皮下接种c57bl/6小鼠。给药：皮下瘤体积约100-150mm3时将小鼠随机分组，每组6只，腹腔给药，每周给药2次，共给药3周；047ab-6，3mg/kg；eylea，2mg/kg；联合用药，047ab-6+eylea,3mg/kg+2mg/kg，早晚给药；fabt，2mg/kg；ftf，3.8mg/kg；iggt，3.8mg/kg；fvt，3.8mg/kg。结果如图10和表8所示：对照抗体047ab-6和eylea单药抑瘤率分别为12％和54％，047ab-6和eylea联合用药抑瘤率达到68％，双特异性抗体融合蛋白抑瘤率高于联合用药，其中ftf和iggt的抑瘤率分别达到90％和92％。表8、候选双特异性分子抑瘤率drugtgi(％)047ab-612eylea54combination68fabt70ftf90iggt92fvt81以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>长春金赛药业股份有限公司<120>抗体融合蛋白、制备方法及其应用<130>mp1808197<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>205<212>prt<213>结合人vegf-a的trap(trapbindingtohumanvegf-a)<400>1seraspthrglyargprophevalglumettyrsergluileproglu151015ileilehismetthrgluglyarggluleuvalileprocysargval202530thrserproasnilethrvalthrleulyslyspheproleuaspthr354045leuileproaspglylysargileiletrpaspserarglysglyphe505560ileileserasnalathrtyrlysgluileglyleuleuthrcysglu65707580alathrvalasnglyhisleutyrlysthrasntyrleuthrhisarg859095glnthrasnthrileileaspvalvalleuserproserhisglyile100105110gluleuservalglyglulysleuvalleuasncysthralaargthr115120125gluleuasnvalglyileasppheasntrpglutyrproserserlys130135140hisglnhislyslysleuvalasnargaspleulysthrglnsergly145150155160serglumetlyslyspheleuserthrleuthrileaspglyvalthr165170175argseraspglnglyleutyrthrcysalaalaserserglyleumet180185190thrlyslysasnserthrphevalargvalhisglulys195200205<210>2<211>107<212>prt<213>047ab-6的vl(vlof047ab-6)<400>2aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysseralaserglnaspvalthrthrala202530valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrseralaserpheprotyrargglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrmettyrhisproser859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>3<211>118<212>prt<213>047ab-6的vh(vhof047ab-6)<400>3gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalasertyrphepropheseraspser202530trpilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alatrpileserprotyrglyglysersertyrtyralaaspserval505560glnaspargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysarghistrpproglyglypheasphistrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalserser115<210>4<211>443<212>prt<213>h1(h1)<400>4gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalasertyrphepropheseraspser202530trpilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alatrpileserprotyrglyglysersertyrtyralaaspserval505560glnaspargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysarghistrpproglyglypheasphistrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro115120125leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly130135140cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn145150155160serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln165170175serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser180185190serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser195200205asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysgly210215220glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserserasp225230235240thrglyargprophevalglumettyrsergluileprogluileile245250255hismetthrgluglyarggluleuvalileprocysargvalthrser260265270proasnilethrvalthrleulyslyspheproleuaspthrleuile275280285proaspglylysargileiletrpaspserarglysglypheileile290295300serasnalathrtyrlysgluileglyleuleuthrcysglualathr305310315320valasnglyhisleutyrlysthrasntyrleuthrhisargglnthr325330335asnthrileileaspvalvalleuserproserhisglyilegluleu340345350servalglyglulysleuvalleuasncysthralaargthrgluleu355360365asnvalglyileasppheasntrpglutyrproserserlyshisgln370375380hislyslysleuvalasnargaspleulysthrglnserglyserglu385390395400metlyslyspheleuserthrleuthrileaspglyvalthrargser405410415aspglnglyleutyrthrcysalaalaserserglyleumetthrlys420425430lysasnserthrphevalargvalhisglulys435440<210>5<211>666<212>prt<213>h2(h2)<400>5glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530valmethistrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpmet354045glytyrileasnprotyrasnaspglythrlystyrserglulysphe505560lysglyargvalthrilethrargaspthrseralaserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglyglyleuphethrpheaspasntrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleu115120125alaproserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycys130135140leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser145150155160glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser165170175serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser180185190leuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasn195200205thrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysglyglyglygly210215220serglyglyglyglyserglyglyglyglyserseraspthrglyarg225230235240prophevalglumettyrsergluileprogluileilehismetthr245250255gluglyarggluleuvalileprocysargvalthrserproasnile260265270thrvalthrleulyslyspheproleuaspthrleuileproaspgly275280285lysargileiletrpaspserarglysglypheileileserasnala290295300thrtyrlysgluileglyleuleuthrcysglualathrvalasngly305310315320hisleutyrlysthrasntyrleuthrhisargglnthrasnthrile325330335ileaspvalvalleuserproserhisglyilegluleuservalgly340345350glulysleuvalleuasncysthralaargthrgluleuasnvalgly355360365ileasppheasntrpglutyrproserserlyshisglnhislyslys370375380leuvalasnargaspleulysthrglnserglyserglumetlyslys385390395400pheleuserthrleuthrileaspglyvalthrargseraspglngly405410415leutyrthrcysalaalaserserglyleumetthrlyslysasnser4204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