本发明属于生物
技术领域：
，尤其是涉及一种能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物及其应用。
背景技术：
：间充质干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能干细胞，广泛存在于多种成体组织或围产期组织中，如骨髓、脂肪、牙髓、胎盘、脐带等。脐带间充质干细胞更方便提取，并且更易获得。在再生医学的应用中，脐带间充质干细胞具有更强的抑制内皮细胞及组织凋亡，调节免疫的作用，而这些作用与其所分泌的复合细胞因子有非常密切的作用。在脐带间充质干细胞培养过程中会分泌多种细胞因子，如表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，fgf)、血小板生长因子(plateletgrowthfactor，pdgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)、转化生长因子(transforminggrowthfactorbeta，tgf-β)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)、白介素6(interleukin6，il-6)等。这些因子大都具有与皮肤生长、血管生长、皮下组织再生有关的生物活性，能够有效调控机体细胞信号传导，活化人体细胞进而生理性修复或替代机体损伤、衰老细胞，促进改善皮肤再生修复。传统技术通过向干细胞培养基中添加诱导成分，刺激干细胞分泌细胞因子，但还未有公开有诱导组合物，能够很好的用于刺激脐带间充质干细胞分泌细胞因子。技术实现要素：基于此，本发明的主要目的是提供一种能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物。将该组合物添加至高糖dmem中形成的诱导培养基，用该诱导培养基能够刺激脂肪脐带间充质干细胞分泌细胞因子。本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：一种能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物，所述的组合物包括：1mg～5mg维生素a、50mg～100mg谷氨酰胺、0.5mg～2mg溶血磷脂酸、0.01mg～0.1mg淫羊藿素。在其中一些实施例中，所述的组合物包括：1mg～3mg维生素a、50mg～75mg谷氨酰胺、0.5mg～1mg溶血磷脂酸、0.01mg～0.05mg淫羊藿素。在其中一些实施例中，所述的组合物包括：2.5mg～3.5mg维生素a、70mg～80mg谷氨酰胺、0.8mg～1.2mg溶血磷脂酸、0.03mg～0.05mg淫羊藿素。本发明的另一目的是提供一种上述的组合物在诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子中的应用。本发明的又一目的是提供一种诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基，所述培养基是通过向每100ml高糖dmem中添加终浓度为1mg～5mg的维生素a、50mg～100mg的谷氨酰胺、0.5mg～2mg的溶血磷脂酸、0.01mg～0.1mg的淫羊藿素制备而成。在其中一些实施例中，所述培养基是通过向每100ml高糖dmem中添加终浓度为1mg～3mg的维生素a、50mg～75mg的谷氨酰胺、0.5mg～1mg的溶血磷脂酸、0.01mg～0.05mg的淫羊藿素。在其中一些实施例中，所述培养基是通过向每100ml高糖dmem中添加终浓度为2.5mg～3.5mg的维生素a、70mg～80mg的谷氨酰胺、0.8mg～1.2mg的溶血磷脂酸、0.03mg～0.05mg的淫羊藿素。本发明的再一目的是提供一种诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的方法，所述的方法包括如下步骤：(1)取脐带间充质干细胞，于传代培养基中进行传代培养；(2)弃去所述传代培养基，清洗细胞，换成权利要求5至7任一项所述的诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基继续培养。在其中一些实施例中，所述步骤(2)包括将步骤(1)所得细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，在采用诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基继续培养1h～3h后，每隔10h～15h将机械牵拉细胞培养盒的弹性膜一次性拉长5％～15％。在其中一些实施例中，步骤(2)中，弃去所述传代培养基是在传代培养至细胞生长密度达到50％～65％时进行的；所述清洗采用磷酸盐缓冲液；所述继续培养的时间为24h～48h。与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：本发明将维生素a、谷氨酰胺、溶血磷脂酸、淫羊藿素以合适用量配合，形成能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物。将该组合物添加至高糖dmem中形成的诱导培养基，用该诱导培养基能够刺激脐带间充质干细胞分泌细胞因子。特别是在诱导培养的过程中配合适当的机械牵拉物理刺激，能进一步增强脐带间充质干细胞分泌细胞因子的量。另外，本发明选用脐带间充质干细胞避开了社会伦理争议，增殖较快、免疫排斥低。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明所涉及的脐带间充质干细胞的分离、培养可以但不局限于如下步骤：(1)在超净台中取出运输液中的脐带，放于培养皿中，用清洗液洗涤数遍已去除脐带表面的血液。(2)将清洗后的脐带，剪成2cm～3cm长的小段于培养皿，用清洗液逐个洗涤数遍，已去除残留在里面的血液。步骤(1)、(2)中采用的清洗液为质量浓度为0.9％的无菌生理盐水。(3)每一段再经无抗0.9％的无菌生理盐水清洗数遍，将羊膜动静脉管剥离，只保留华通氏胶体。(4)将所有的华通氏胶体移至50ml离心管中，加入1倍～2倍的生理盐水，用剪刀将其剪碎，离心5min。(5)弃去上清，将所得组织沉淀平均分于60cm2的培养皿中，待其贴壁加入8ml脐带间充质干细胞培养基(lonza12-725f)，放于37℃，5％二氧化碳培养箱培养。(6)当培养步骤(5)脐带块2d，对其进行半换液处理，即加入4ml新鲜脐带间充质干细胞培养基。(7)培养4d，组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，可记为p0代，进行全换液处理；(8)培养5d～6d，间充质干细胞融合度达到90％，弃去脐带组织块和原有培养液，2ml生理盐水洗涤一次，弃去。(9)加入2ml0.25(w/v)％胰酶溶液，放于培养箱中消化30s，加入2ml盐水进行稀释消化液，轻轻吹到细胞使其脱落，获得细胞悬液。(10)上述(9)所制得的细胞悬液经100μm滤网过滤以去除残余的组织碎片，300g，离心5min，弃去上清，加3ml新鲜培养基重悬细胞沉淀，并以1:3的比例进行传代。实施例1本实施例提供一种能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物及其应用。具体地，是将该组合物添加至高糖dmem中，制备成诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基，刺激脐带间充质干细胞分泌细胞因子。一、诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基(见表1)：100ml高糖dmem、3mgva、75mg谷氨酰胺、1mg溶血磷脂酸、0.05mg淫羊藿素。二、诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的方法：(1)取脐带间充质干细胞，于脐带间充质干细胞培养基中培养，待细胞长至85％左右时，继续于脐带间充质干细胞培养基中进行传代培养；(2)将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有脐带间充质干细胞培养基，用pbs洗三遍，换成诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基进行培养，培养2h后，每隔12h据机械牵拉培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长10％，置于二氧化碳培养箱培养连续培养36h；(3)收集各个时间段的细胞培养上清液，10000rpm，4℃，离心10min，以除去细胞碎片；(4)收集的上清液，经0.22μm滤膜过滤，然后通过40kd超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100d超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液，即可；(5)浓缩液可冷冻干燥，保存，获得细胞因子。实施例2本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处包括：一、诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基(见表1)：100ml高糖dmem、1mgva、50mg谷氨酰胺、0.5mg溶血磷脂酸、0.01mg淫羊藿素。二、步骤(2)中：将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有脐带间充质干细胞培养基，用pbs洗三遍，换成诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基进行培养，培养1h后，每隔10h据机械牵拉培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长5％，置于二氧化碳培养箱培养连续培养24h；其他操作同实施例1。实施例3本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处包括：一、诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基(见表1)：100ml高糖dmem、5mgva、100mg谷氨酰胺、2mg溶血磷脂酸、0.1mg淫羊藿素。二、步骤(2)中：将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有脐带间充质干细胞培养基，用pbs洗三遍，换成诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基进行培养，培养3h后，每隔15h据机械牵拉培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长15％，置于二氧化碳培养箱培养连续培养48h；其他操作同实施例1。表1对比例1本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括步骤(2)中采用无血清培养基lonza12-725f培养代替诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基。本对比例的步骤(2)如下：将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有脐带间充质干细胞培养基，用pbs洗三遍，换成无血清培养基培养，培养2h后，每隔12h据机械牵拉培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长10％，置于二氧化碳培养箱培养连续培养362h。其他操作同实施例1。对比例2本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基的配方不同。本对比例采用诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基的配方(参见表1)如下：100ml高糖dmem、、75mg谷氨酰胺、1mg溶血磷脂酸、0.05mg淫羊藿素。其他操作同实施例1。对比例3本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基的配方不同。本对比例采用诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基的配方(参见表1)如下：100ml高糖dmem、3mgva、1mg溶血磷脂酸、0.05mg淫羊藿素。其他操作同实施例1。对比例4本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基的配方不同。本对比例采用诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基的配方(参见表1)如下：100ml高糖dmem、3mgva、75mg谷氨酰胺、0.05mg淫羊藿素。其他操作同实施例1。对比例5本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基的配方不同。本对比例采用诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基的配方(参见表1)如下：100ml高糖dmem、3mgva、75mg谷氨酰胺、1mg溶血磷脂酸。其他操作同实施例1。对比例6本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括步骤(2)中未对细胞进行机械牵拉物理刺激。本对比例的步骤(2)如下：将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有培养基，用pbs洗三遍，换成诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基进行培养，置于二氧化碳培养箱培养连续培养72h，期间不进行机械牵拉物理刺激。其他操作同实施例1。对比例7本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括步骤(2)中对细胞进行机械牵拉物理刺激的参数设定不同。本对比例的步骤(2)如下：将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有脐带间充质干细胞培养基，用pbs洗三遍，换成诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基进行培养，培养6h后，每隔6h据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长20％，置于二氧化碳培养箱培养连续培养36h；其他操作同实施例1。对比例8本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括步骤(2)既未采用本发明的培养基进行诱导，也未配合采用机械牵拉物理刺激。本对比例的步骤(2)如下：将p3～p5细胞传至细胞培养皿中，细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有脐带间充质干细胞培养基，用pbs洗三遍，换成新鲜的脐带间充质干细胞培养基进行培养，连续培养36h；其他操作同实施例1。实验例1、培养条件对细胞因子分泌的影响实施例1及对比例6-8不同培养条件对细胞分泌细胞因子的影响。用elisa试剂盒对表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和血管内皮细胞生长因子(vegf)为代表的细胞因子进行检测。表2组别实施例1对比例6对比例7对比例8egf(ng/ml)75.7668.5660.2640.83fgf(ng/ml)120.34105.45105.7880.28vegf(ng/ml)60.5850.2153.4420.75从上表可知：实施例1的效果优于对比例，说明间充质干细胞在本发明的刺激培养基和机械牵拉环境下培养，细胞分泌细胞因子的能力增强。实验例2、诱导脐带间充质干细胞分泌细胞因子的培养基的配方对细胞因子分泌的影响用实施例1、2、3及对比例1～5不同培养基刺激脐带间充质干细胞，测试对脐带间充质干细胞分泌细胞因子的影响。用elisa试剂盒对表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和血管内皮细胞生长因子(vegf)为代表的细胞因子进行检测。表3从上表可知：实施例1至实施例3整体细胞因子含量高，并且实施例3、实施例2、实施例1细胞因子含量呈上升趋势，实施例1效果最佳，这说明，本发明的培养基培养存在优选范围。实施例的效果整体优于对比例，这说明，本发明的培养基能够刺激脐带间充质干细胞分泌细胞因子，如果本发明的培养基种类被替换，或者配方中的组分缺失，都将会为本申请的效果带来负面影响。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12