调控水稻穗发育的基因ESP的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种调控水稻穗发育的基因esp的应用，具体涉及利用图位克隆策略分离克隆一种控制水稻穗型的基因esp、该基因的生物学功能验证、遗传转化以及作为穗发育调控基因在水稻穗型遗传改良中的应用。

背景技术：

水稻是我国乃至世界上的重要粮食作物，全世界超过一半人口以稻米为主食。水稻的穗长和着粒密度是影响产量的重要因素，因此，阐明穗发育的遗传基础和分子调控机理有助于改良水稻的穗型和产量。

水稻的穗型在自然进化和人为驯化研究中具有重要意义。从野生稻到栽培稻的驯化过程中，水稻的穗型发生了巨大的变化，野生稻一般穗型松散，着粒密度较低，而栽培稻穗型相对紧凑，着粒密度高。因此，研究穗发育的遗传机理可以为水稻的进化研究提供有力的证据和线索。

表观遗传变异极大地丰富了真核生物的表型多样性，表观遗传等位基因可为作物育种提供新的遗传资源。目前，在水稻中通过表观遗传控制重要农艺性状的报道相对比较少，将表观遗传变异应用于水稻育种的案例更是鲜有。因此通过克隆表观遗传控制水稻重要农艺性状的基因，对水稻遗传改良和丰富品种遗传多样性具有重要意义。

穗型是水稻重要的农艺性状，由多个因素共同决定，包括穗长、一次和二次枝梗数、颖花/籽粒数以及籽粒重等，阐明稻穗形成机制对于水稻穗型塑造及提高水稻产量有着重要意义。近年来，科学家在水稻穗型调控方面开展了广泛而深入的研究，并取得了重要进展(淳雁,李学勇.水稻穗型的遗传调控研究进展.植物学报,2017(01):19-29)。但是，目前对稻穗形成的分子调控机制的认识还非常有限。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种调控水稻穗发育的基因esp。该基因在水稻穗型调控中具有重要作用，因此该基因的克隆有利于丰富水稻穗型调控的分子机制。

本发明从野生型水稻中花11的后代中筛选到一个突变体esp(epigeneticshortpanicle)，该突变体稻穗变短，着粒密度变大，穗直立。遗传分析表明，该突变为不完全显性遗传。利用图位克隆策略已获得突变体候选基因os01g0356951，目前尚没有关于该基因功能方面的研究。因此，本发明的目的基因esp是一个调节水稻穗发育和穗型的新基因。

本发明的另一目的在于提供上述调控水稻穗发育的基因esp的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种调控水稻穗发育的基因esp在调节水稻穗发育及穗型中的应用。

进一步的，所述的调控水稻穗发育的基因esp在水稻穗型改良育种中的应用。

更进一步的，所述的调控水稻穗发育的基因esp在培育直立密穗水稻品种中的应用。

所述的调控水稻穗发育的基因esp，为下列a或b核苷酸序列：

a.序列表seqidno：1所示的dna序列；

b.以上a通过碱基插入、缺失或替换而获得的仍具有调节水稻穗发育及穗型功能的类似物。

含有上述调控水稻穗发育的基因esp的重组表达载体、转基因细胞系和重组菌的应用也属于本发明的保护范围。

因此，1)水稻突变体是研究水稻基因功能的理想材料。本发明采用图位克隆方法分离了突变体候选基因，该基因位于水稻第1染色体，命名为esp(epigeneticshortpanicle)，目前尚没有关于该基因功能方面的研究。本发明的水稻esp突变体植株略矮而穗长显著缩短，穗型直立且着粒密度增加。遗传分析表明，突变表型呈不完全显性遗传。有趣的是，该突变有低频率的自发回复突变现象，因而个别单株不同分蘖甚至同一稻穗的不同的穗分支可呈现野生型与突变型共存的现象。这些表型是典型的表观遗传变异所特有的，暗示esp突变体可能是1个表观遗传变异造成的突变。

2)基因表达分析显示esp基因在突变体中表达显著提高。但是测序分析表明，esp基因(包括该基因启动子区及3'末端下游区域)没有发现dna序列的改变。因此，我们推测目的基因可能发生了表观遗传变异。

3)基于上述推测，本发明申请人通过亚硫酸氢盐测序法，分析了甲基化修饰变异情况。dna甲基化修饰与基因表达调控密切相关。一般来讲，如果发生甲基化，往往抑制基因表达，而去甲基化则会造成基因过量表达。本发明研究表明，esp基因3'末端下游临近区段甲基化异常(去甲基化)引起了esp基因过量表达。

4)由于突变体表型并非esp功能缺失造成，为了进一步验证其功能，我们构建了玉米ubi(ubiquitin)启动子驱动的esp过量表达载体pcubi1390-esp-oe，通过农杆菌(eha105)介导，转化野生型水稻中花11，通过pcr检测转基因阳性植株。结果表明，esp过量表达转基因植株表型与突变体类似。上述功能互补试验表明，本发明获得的候选基因esp是控制水稻穗型的目的基因。

5)上述水稻esp基因的应用，是指该基因在水稻穗型改良育种中的应用。所述的水稻穗型改良育种的方式包括转基因育种和杂交育种，其方法是：转基因育种，将含有esp基因的重组表达载体导入植物细胞，通过改变esp基因的表达水平获得穗型发生改变了的转基因水稻，例如在水稻中提高esp基因的表达可以培育直立密穗水稻品种。杂交育种，利用上述穗型变异的转基因水稻作为亲本，通过杂交选育法改良水稻穗型，即通过将所获得的穗型发生改变了的转基因水稻与拟改良的水稻品种杂交，然后选育穗型改良了的水稻品种。

所述的含有esp基因的重组表达载体可通过现有的植物表达载体构建；所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体，如pcambia1300、pcambia2300、pcubi1390等；含有esp基因的重组表达载体可通过基因枪、显微注射、原生质体介导、花粉管通道、农杆菌介导等各种物理、化学及生物学方法导入到宿主植物细胞或组织中；被导入的宿主植物优选为水稻。

在构建含有esp基因的重组表达载体时，在esp基因的转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异性或诱导型启动子，如35s启动子、ubi启动子等。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行改造后再使用，包括加入抗生素抗性基因或其它标记基因等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明通过图位克隆方法，从水稻中克隆得到一个表观遗传修饰调控的水稻穗发育基因esp，突变体表型分析及互补分析表明获得的esp基因在水稻穗型调控中具有重要作用，为水稻穗型遗传改良提供了新的基因资源，为水稻分子设计育种提供了新的材料选择。

2.水稻稻穗可划分为弯曲穗，半直立穗和直立穗三种类型。在灌浆结实期，直立穗型可有效减少遮光，有利于改善群体结构与受光态势，对水稻增产有重要作用。在水稻中提高esp的表达可以培育直立密穗水稻品种，具有很强的可操作性，为拓宽现有的直立穗型品种的遗传基础开辟了新途径。

3.本发明证实了esp在水稻穗型调控中的作用，不仅丰富了水稻穗型调控的分子机制，在揭示稻穗发育机理方面具有重要理论意义，也为研究水稻穗型进化提供了新的线索。

附图说明

图1为实施例1中esp突变体和野生型(粳稻，中花11)的表型；其中，图a和图b分别是野生型、突变杂合体中的嵌合体和突变杂合体的株型和穗型，图c、d和e分别为野生型和突变纯合体穗发育时期植株表型、主茎和幼穗形态；wt为野生型，epi-sp(+/-)为突变杂合体，epi-normal为突变杂合体中嵌合体具正常表型的稻穗，chimeric为突变杂合体中的嵌合体，epi-sp为突变杂合体的稻穗，epi-sp(-/-)为突变纯合体。

图2为实施例2中esp突变体和野生型中花11的穗型和穗部性状，其中，图a为野生型和突变杂合体的穗型和粒型，图b、c和d图分别为野生型和突变杂合体的穗长、一次枝梗长度和一次枝梗数。

图3为实施例3中esp基因的图位克隆和表达分析，其中，图a为图位克隆所用的标记和候选基因分析，图b为图a所示的定位区间3个基因(os01g0356900、os01g0357100和os01g0357200)的相对表达分析，图c为esp基因(os01g0356951)在野生型、突变杂合体和突变纯合体中的表达情况，图d为esp基因在嵌合突变体的正常稻穗(n，即epi-normal)和突变表型(sp，即epi-sp)稻穗的基因表达分析，图e为esp基因在嵌合体不同表型后代的基因表达分析；25srna为基因表达分析的内参基因。

图4为实施例4中esp基因的dna甲基化和基因表达分析，其中，图a和图b为野生型和突变体中esp基因3′端存在dna甲基化差异，图c为甲基化抑制剂5-aza-dc处理野生型中花11后esp基因的表达分析。

图5为实施例5中esp基因过量表达转基因植株表型，其中，图a为野生型和过量表达esp基因的单株表型，图b为野生型和过量表达esp基因的稻穗；oe为过量表达转基因表型。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中pcubi1390载体为常用的超表达载体，peasy-t1(北京全式金)；大肠杆菌dh5α和农杆菌eha105为常用的菌株，多数分子生物学实验室均有保存；水稻品种为野生型粳稻中花11(公开使用的水稻品种，市售)。

实施例中的主要试剂为：限制性内切酶、taq酶、t4连接酶、pyrobesttaq酶、kod、rnasea、5xall-in-onertmastermix反转录试剂盒等购自于takara(大连)、promega、neb、abm等生物公司；dntps购自于genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自于上海捷瑞生物工程公司；trlzolrna提取试剂盒购自于invitrogen公司；ms培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(amp)、卡那霉素(kan)、硫酸庆大霉素(gen)、利福平(rif)等抗生素等购自sigma；实施例中所使用的其它化学试剂均为进口或国产分析纯。实施例中所使用的引物由睿博兴科公司合成，测序在擎科和天一辉远公司进行。

实施例1水稻esp突变体表型和遗传效应分析

在种植的野生型粳稻中花11的后代中，筛选到一种略矮而穗长显著缩短，穗型直立且着粒密度增加的植株，命名为水稻esp突变体。

在籽粒灌浆期和成熟期，分别对野生型和突变杂合体的植株和穗型进行拍照，表型如图1a和1b所示，esp杂合突变体的穗子相比于野生型较短，着粒密度增大(图1a和1b)。有趣的是，该突变有低频率的自发回复突变现象，因而个别单株不同分蘖甚至同一稻穗的不同的穗分支可呈现野生型与突变型共存的现象。esp纯合突变体和野生型的苗期表型如图1c所示，esp纯合突变体植株较矮小，叶片短，顶端优势减弱。在穗发育初期，esp纯合突变体的穗发育受到严重影响，穗顶端发育停滞、坏死，导致不能形成有效穗(图1d和1e)。

为了分析esp突变体的遗传特性，调查分析了突变体自交后代210个植株的性状，分为3种表型，其中58株类似于野生型表型，103株表现出短穗、密穗表型(杂合突变体)，49株表现出矮生表型(纯合突变体)，三种表型的分离比为1:1.78:0.84(符合1:2:1，χ²＝0.85，p>0.05)。以上结果表明，esp突变体表型属于单基因控制的不完全显性突变。

实施例2esp突变体穗部性状分析

对灌浆完成到黄熟前的esp杂合突变体和野生型水稻穗子进行拍照，并对穗长、粒型、一次枝梗数和一次枝梗长等穗部性状进行统计分析，结果如图2所示。esp杂合突变体的穗长显著变短(图2a和2b)，一次枝梗长度也显著缩短(图2c)，而粒型和一次枝梗数没有显著变化(图2a和2d)，说明esp主要通过影响水稻穗的一次枝梗发育，进而影响穗型和穗长，对一次枝梗数目和粒型基本没有影响。

实施例3esp基因的图位克隆和候选基因表达分析

利用esp突变体与籼稻品种华粳籼74(公开使用的水稻品种，市售)构建的f2群体(esp与华粳籼74杂交得到f1，f1自交得到f2群体)，对esp进行基因定位，将其初步定位在第1号染色体上的ssr标记rm583和rm9之间，遗传距离为42.4cm。根据日本晴和9311参考序列，在这两个标记间发展indel(insertion-deletion)标记，进一步把esp基因定位在水稻第1号染色体的51.2kb的区间(图3a)。在这个区间内有4个基因，分别为os01g0356900、os01g0356951、os01g0357100和os01g0357200。

为了鉴别候选基因esp，分别对这4个基因在esp突变体和野生型中的表达量进行了检测，具体步骤如下：

(1)trizol法提取野生型和esp突变体的rna。

(2)用abm公司的5xall-in-onertmastermix反转录试剂进行逆转录第一链(cdna)合成，按照产品说明书操作。

(3)用neb公司的lunauniversalqpcrmastermix试剂进行荧光定量pcr检测，选用25srna基因作为内参对照基因，依照产品说明书完成操作。

所用引物序列如下：

os01g0356900f(5′-3′):catcgagatcaaggtgagca；

os01g0356900r(5′-3′):gaagtcgttgaaccggatgt；

01g0356951f(5′-3′):atcgctatctcgccgagtc；

01g0356951r(5′-3′):cagcaagtctccacagtcca；

os01g0357100f(5′-3′):ggaggacctcatcgacaaga；

os01g0357100r(5′-3′):gttcgggatcacgatgttct；

os01g0357200f(5′-3′):ggcttcgtctaccagctcaa；

os01g0357200r(5′-3′):ccccttgatcttcaatttgc；

25srnaf(5′-3′):aaggccgaagaggagaaaggt；

25srnar(5′-3′):ttggcgggccgttaagcagaaaaga。

荧光定量pcr反应程序为：

对野生型和esp突变体中4个基因进行表达分析的结果显示，os01g0356900、os01g0357100和os01g0357200这3个基因在esp突变体中的表达量和野生型相比没有显著差异(图3b)，os01g0356951基因在野生型中几乎检测不到，但是在esp突变体中其表达水平显著上调，且该基因的表达量在纯合体中高于杂合体(图3c)。以上基因表达分析结果表明，os01g0356951可能是esp的候选基因。

本发明进一步对突变嵌合体植株(esp突变体有低频率的自发回复突变现象，因而同一单株不同分蘖甚至同一稻穗的不同的穗分支可呈现野生型与突变型共存的现象。在本发明中将既有正常表型稻穗又有突变表型稻穗的突变体植株，命名为突变嵌合体植株。)的os01g0356951表达量进行分析，结果表明，嵌合体有直立密穗表型的分蘖其os01g0356951基因的表达量高于同一植株上正常表型的分蘖(图3d)。此外，跟踪检测表明嵌合突变体自交后代中有直立密穗表型的植株均呈现os01g0356951基因高表达的特征，正常表型(epi-normal)的植株os01g0356951基因的表达与野生型(粳稻中花11)无异(图3e)。以上结果表明，突变体中的直立密穗表型是由于os01g0356951基因的过量表达所引起的，进一步支持os01g0356951就是esp的候选基因。

实施例4突变体和野生型esp基因甲基化分析

为了寻找突变位点，本发明依据水稻基因组序列数据设计引物，扩增野生型和突变体的目的区段，测序分析表明，在51.2kb定位区间内没有发现dna序列的改变，但是esp候选基因的表达量却有极显著的差异，因此，我们推测目的区段可能发生了表观遗传变异。为此，本发明通过亚硫酸氢盐测序法分析了甲基化修饰变异情况，方法参照文献(zhang,xq,sunj,caox,songx.epigeneticmutationofrav6affectsleafangleandseedsizeinrice.plantphysiol,2015,169(3):2118-2128)，操作步骤简述如下：

(1)用亚硫酸氢盐处理野生型(野生型中花11)和esp突变体基因组dna，处理后，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。

(2)设计引物，以处理前的基因组dna为模板，用esp-ttrgf和esp-ttrgr进行pcr扩增；以处理后的基因组dna为模板，用esp-ttrgf和esp-ttrbsr进行pcr扩增。引物序列如下：

esp-ttrgf(5′-3′)：ggtgataattttggaggttgtag；

esp-ttrgr(5′-3′)：tgcaggattgaattcctgataaact；

esp-ttrbsr(5′-3′)：tacaaaattaaattcctaataaact。

(3)将目的片段纯化进行ta克隆，挑选阳性克隆测序。

(4)将用亚硫酸氢盐处理测得的序列与未处理序列比对，统计甲基化位点和数量，并分析野生型和突变体的甲基化差异。

结果表明，esp基因的3′端下游发生了dna去甲基化(图4a和4b)，其具体的甲基化变异位点发生在esp基因下游289～601bp区间(图4b)。

很多研究表明，dna去甲基化通常可以导致基因的过量表达(li,etal.single-baseresolutionmapsofcultivatedandwildricemethylomesandregulatoryrolesofdnamethylationinplantgeneexpression.bmcgenomics2012,13:300)。本发明中，突变体esp基因下游区段的去甲基化引起了esp基因的过量表达，进而导致突变表型，与上述结论相吻合。

为了进一步阐明esp基因的表达与甲基化修饰的关系，本发明利用甲基化抑制剂5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-2’deoxycytidine，5-aza-dc)处理野生型中花11萌发的种子，甲基化抑制剂处理方法参照文献(changs,pikaardcs.transcriptprofilinginarabidopsisrevealscomplexresponsestoglobalinhibitionofdnamethylationandhistonedeacetylation.jbiolchemi,2005,280:796-804)，然后取7天龄的幼苗对esp基因进行表达量分析(表达量分析所用的引物是01g0356951f和01g0356951r)。结果表明，相比于未用5-aza-dc处理的幼苗，甲基化抑制剂5-aza-dc处理的幼苗中，esp基因的表达量显著上调(图4c)，说明esp基因下游区段的的去甲基化引起了esp基因的过量表达，是调控esp基因表达的关键因素，进而导致突变表型。

实施例5功能互补验证

为了验证esp基因的功能，本发明利用pcubi1390载体构建了玉米ubi(ubiquitin)启动子驱动的esp超表达载体，命名pcubi1390-esp-oe，通过农杆菌eha105介导，转化水稻品种中花11，进行esp功能互补验证，步骤如下：

(1)以esp基因序列(seqidno：1)为模板，设计如下引物：

1390-esp-kpni-f：5′-ggggtaccagatcgaaaaaatcgctatctc-3′；

1390-esp-bamhi-r：5′-cgggatccctagttcttttaaaaatttg-3′。

(2)利用引物对进行pcr扩增esp基因，获得的目标基因片段用kpni和bamhi双酶切、回收，连接到用同样酶酶切后回收的线性化pcubi1390载体上，形成pcubi1390-esp-oe载体，测序。esp基因和双酶切后的表达载体pcubi1390的连接用dnaligationkitver.2.0试剂盒。

(3)将测序正确的pcubi1390-esp-oe载体转化农杆菌eha105。

(4)将含重组质粒pcubi1390-esp-oe的农杆菌eha105菌种转化到野生型中花11的愈伤，经过预培养、浸染、共培养，筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽到大田得到转基因植株。

水稻转基因的具体方法参照“中国发明专利cn201510009631.4、水稻b3转录因子家族基因rav2的应用”。

功能互补实验结果如图5所示，其中，esp基因的超表达载体pcubi1390-esp-oe转化到野生型中花11得到转基因阳性株oe，其稻穗变短，着粒密度变大，穗直立，表型与突变体类似。以上研究结果表明，esp突变体表型确实是由esp基因的过量表达引起的。此外，本实施例也表明，通过上调esp基因表达获得直立密穗水稻品种具有极强的可操作性。

综上所述，本发明得出结论：esp基因的3′端下游临近区段dna甲基化修饰变异是激活esp基因转录进而产生突变表型的原因；esp基因对水稻穗型具有重要的负向调控作用；通过调节esp基因表达水平对于水稻穗型遗传改良具有极强的可操作性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>调控水稻穗发育的基因esp的应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>633

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>esp基因序列

<400>1

agatcgaaaaaatcgctatctcgccgagtcgccagtcaccgcctcgacgccggtcgccgt60

accgccggcgctgcacgcccccctccaagccgtcgccccatcgcccccagccgcccagtg120

gtggggcggcggatgccgagcttggcgaggttgccgaggacgaaccaggcgaggaggacg180

aggatcttgtcgacgagccagagcgggagccacgccatgagcaacacggcgagctcgaac240

gtggacttgccgagcacctcgccagggaggacgtggacggcgtcgcgcaccaccatcgcc300

gggagggcgctgtggtcgcacaggtcgagcgacaccaccatgccggagttgccgcacccg360

acgacgagcaccttcttgccgcggtacgcctcgccggacttgtagaccgcgacatgcatc420

acctcgctgctatatttgttcttggactgtggagacttgctgtcagtgggtgtgttcaga480

attgctgctgcagcttgcagcgaatttgtgatgcagcagctgcagcttgtatggctgccg540

agtagagcgagtgttgctatctgtttttgttctctttttcagaaatttcgcccgcaaatt600

ttaaatttgaattcaaatttttaaaagaactag633

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物os01g0356900f

<400>2

catcgagatcaaggtgagca20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物os01g0356900r

<400>3

gaagtcgttgaaccggatgt20

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物01g0356951f

<400>4

atcgctatctcgccgagtc19

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物01g0356951r

<400>5

cagcaagtctccacagtcca20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物os01g0357100f

<400>6

ggaggacctcatcgacaaga20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物os01g0357100r

<400>7

gttcgggatcacgatgttct20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物os01g0357200f

<400>8

ggcttcgtctaccagctcaa20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物os01g0357200r

<400>9

ccccttgatcttcaatttgc20

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物25srnaf

<400>10

aaggccgaagaggagaaaggt21

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物25srnar

<400>11

ttggcgggccgttaagcagaaaaga25

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物esp-ttrgf

<400>12

ggtgataattttggaggttgtag23

<210>13

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物esp-ttrgr

<400>13

tgcaggattgaattcctgataaact25

<210>14

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>esp-ttrbsr

<400>14

tacaaaattaaattcctaataaact25

<210>15

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>1390-esp-kpni-f

<400>15

ggggtaccagatcgaaaaaatcgctatctc30

<210>16

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>1390-esp-bamhi-r

<400>16

cgggatccctagttcttttaaaaatttg28