本发明属于生物
技术领域：
，具体地说，本发明涉及一种bcr-abl融合基因定量检测的方法及试剂盒。
背景技术：
：白血病，也称作血癌，是造血干细胞的恶性克隆性疾病。白血病细胞在骨髓产生，在散布到血液及全身。根据国外统计，白血病约占肿瘤总发病率的3％左右，是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤。白血病的发病率在男性中为4.8-7.1/10万，女性中为3.2-4.6/10万；在世界各国中，欧洲和北美发病率最高，其死亡率为3.2-7.4/10万人口。亚洲和南美洲发病率较低，死亡率为2.8-4.5/10万人口。慢性髓系白血病(cml)恶性细胞呈现典型的费城(ph)染色体，即9q34的abl原癌基因与22q11的bcr基因融合而成t(9；22)转录并翻译成具有高酪氨酸蛋白激酶活性的bcr/abl融合蛋白。它的表达激活了酪氨酸蛋白激酶，改变了细胞的蛋白酪氨酸水平和肌动蛋白结合能力，激活多种信号传导途径，使细胞过度增殖而使细胞调控发生紊乱。由于abl和bcr基因的断裂点及融合方式的不同，最终可以产生相应的3种不同bcr-abl融合基因的异构体，分别为主要型(m)，次要型(m)和微小型(μ)，其中，主要型与次要型达到95％以上。主要型即e13a2或e14a2，表达p210融合蛋白，见于97-98％的cml患者中；次要型即e1a2，表达p190融合蛋白，见于75％的all患者中；微小型即e6a2，e8a2或e19a2等，表达p230融合蛋白，见于2-3％的cml患者中。目前bcr-abl融合基因常用的检测包括细胞遗传学分析、荧光原位杂交、免疫分型、聚合酶链式反应等检测方法。(1)细胞遗传学分析，采集骨髓或外周血进行短期培养，常规收获并制备染色体，骨髓标本同时加做直接法，核型分析均采用rhg显带技术。但白血病细胞分裂指数低，染色体形态短小，容易显带不清，结构复杂或细微改变不容易准备识别。(2)荧光原位杂交(fish检测)，采集骨髓或外周血作为研究对象，对分裂中期和间期核细胞均能检测，对隐匿型和变异性也可同步检测分析。灵敏度较高，特异性较好，但常见的双色单融合探针检测bcr/abl融合基因时，会因为bcr和abl基因信号随机分布或光学重叠，导致4％-10％的假阳性率。(3)免疫分型，采用流式细胞仪(fcm)，溶血剂(optiplysec)、改变细胞膜渗透性试剂盒及fitc标记的抗体，可对大量细胞进行快速分析，准确方便。但fcm法需要特殊仪器，操作技术要求较高，价格昂贵，且结果重复性不好。(4)聚合酶链式反应，主要有两种：一种是rt-pcr，直接检测慢粒bcr-ablmrna。但由于引物错配和非特异性退货发生，容易产生非特异性结果；另一种为taqman探针荧光定量pcr，taqman探针5’端标记一个荧光分子，3’端标记一个荧光淬灭分子。当探针完整时，两者发生荧光共振能量传递(fret)。pcr扩增时，由于taq酶5’→3’外切酶活性，将探针水解，使荧光分子和淬灭分子间距增大，荧光监视系统检测到荧光信号。但其对ct值依赖较高，准确度不够，且灵敏度不好。2.3发明解决方案(5)数字pcr，数字pcr(dpcr)能实现核酸分子的绝对定量，在检测bcr-abl基因融合时具有较高的灵敏度和特异性。其通过物理或化学分割的方式，将一个pcr反应体系分配到上万个微小的反应器中，在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板pcr扩增”。扩增结束后，通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。因此，dpcr无需建立标准曲线，可直接确定低至单拷贝待检靶分子的绝对数目。大量研究表明，可通过监测患者的bcr-abl融合基因转录水平来评估酪氨酸激酶抑制剂(tki)的疗效，从而早期识别耐药或疾病进展，从而指导干预治疗。综上，现阶段需要一种高灵敏度地能快速可靠地同时检测bcr-abl融合基因主要型和次要型mrna的表达水平的方法及试剂盒。因此，本领域技术人员致力于开发可同时检测多种白血病融合基因和突变基因的检测方法，以提高检测效率降低检测成本。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种bcr-abl融合基因定量检测的方法及试剂盒。在本发明的第一方面，提供了一种定量检测bcr-abl融合基因的引物对组，所述引物对组包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物序列seqidno.:1所示；所述第一下游引物序列如seqidno.:3所示。在另一优选例中，所述引物对组还包括第二上游引物，所述第二上游引物序列seqidno.:2所示。在另一优选例中，所述引物对组还包括内控引物对，所述内控引物对包括：seqidno：5所示的内控上游引物；和seqidno.:6所示的内控下游引物。本发明的第二方面，提供了一种定量检测bcr-abl融合基因的探针组，所述探针组包括seqidno.:4所示的探针序列。在另一优选例中，所述探针组还包括seqidno.:7所示的内控探针序列。在另一优选例中，seqidno：4核苷酸序列的5’端标记有fam、3’端标记有bhq1。在另一优选例中，seqidno：7核苷酸序列的5’端标记有vic、3’端标记有bhq1+zip。本发明的第三方面，提供了一种定量检测bcr-abl融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对组。在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述试剂盒还包括rt-缓冲液，所述rt-缓冲液包括(nh4)2so4、kcl、tris-hcl、mgcl2、和dtt。在另一优选例中，所述试剂盒还包括rna酶，所述rna酶包括dntps、热启动taq酶、和逆转录酶。在另一优选例中，所述试剂盒还包括7-deaza-dgtp。本发明的第五方面，提供了一种定量检测bcr-abl融合基因的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待检测样本，并提取待测样本基因组核酸；(2)制备dpcr扩增反应体系，进行扩增反应：其中，所述dpcr扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本；本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述检测为非诊断目的的；比如可以采用本发明的方法进行公共卫生领域的信息分析，或者在新药研发过程中对源自模型动物的待测样本进行分析。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具体实施方式本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种定量检测bcr-abl融合基因的方法和试剂盒，针对两种bcr-abl融合基因类型仅需两条不同的上游引物，共同的下游引物与一条荧光标记的探针和一套abl内参基因检测系统进行检测。使用本发明提供的特异性引物与探针，只需1管即可检测bcr-abl的2种融合类型，可计算is％，进而判断出分子学反应(mmr)。本发明能检测出is％为0.0032％，即达到分子学反应mr4.5灵敏度高。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。数字pcr，数字pcr(dpcr)能实现核酸分子的绝对定量，在检测bcr-abl基因融合时具有较高的灵敏度和特异性。其通过物理或化学分割的方式，将一个pcr反应体系分配到上万个微小的反应器中，在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板pcr扩增”。扩增结束后，通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。因此，dpcr无需建立标准曲线，可直接确定低至单拷贝待检靶分子的绝对数目。本发明人对现有的白血病相关基因变异，进行深入比对分析后，设计了引物和探针，再对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于多重数字pcr扩增的引物以及探针序列，在此基础上提供了定量检测bcr-abl融合基因的检测试剂盒。本发明的方法可以基于stilla数字pcr平台，定量检测慢性髓系白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)等血液系统肿瘤中bcr-abl融合基因主要型和次要型mrna的表达水平。本发明的bcr-abl融合基因定量检测试剂盒内含的引物、探针及包括该引物探针混合液和dpcr反应液(特别是添加7-deaza-dgtp使得阳性信号荧光值增高，达到更高灵敏度)。本发明的检测方法和试剂盒具有高灵敏度，可以达到is％＝0.0032％，即分子学反应mr4.5。本发明提供了一种基于数字pcr平台，一步法定量检测慢性髓系白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)等血液系统肿瘤中bcr-abl融合基因主要型和次要型mrna的表达水平的方法、引物、探针及其试剂盒，具有实验过程简单、绝对定量、引探用量低、样本易获取等优点。本发明利用添加7-deaza-dgtp达到阳性信号荧光值增高，并且提高灵敏度。本发明的技术方案如下：一种基于数字pcr平台，定量检测慢性髓系白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)等血液系统肿瘤中bcr-abl融合基因主要型和次要型mrna的表达水平的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。提供了用于检测bcr-ablp210或bcr-ablp190融合基因转录水平所需的特异性引物及探针。添加7-deaza-dgtp使得阳性信号荧光值增高，达到更高灵敏度。本发明公开了一种定量检测慢性髓系白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)等血液系统肿瘤中bcr-abl融合基因主要型和次要型mrna的表达水平的引物、探针：所述检测bcr-ablp210融合基因的上游引物核苷酸序列如seqidno：1所示，所述检测bcr-ablp190融合基因的上游引物核苷酸序列如seqidno：2所示，所述检测bcr-ablp210融合基因和bcr-ablp190融合基因的下游引物序列如seqidno：3所示，所述检测abl内控基因的上游引物核苷酸序列如seqidno：5所示，所述检测abl内控基因的下游引物核苷酸序列如seqidno：6所示；所述探针包括检测bcr-abl融合基因转录水平的探针和内控基因abl探针；所述bcr-abl融合基因转录水平的探针的核苷酸序列如seqidno：4，内控的探针核苷酸序列如seqidno：7所示。进一步，所述seqidno：4核苷酸序列的5’端标记有fam、3’端标记有bhq1，所述seqidno：7核苷酸序列的5’端标记有vic、3’端标记有bhq1+zip。优选地，所述上游引物在反应体系中的终浓度为0.8μmol/l，所述下游引物在反应体系中的终浓度为0.8μmol/l，所述融合基因探针在反应体系中的终浓度为0.3μmol/l；所述内控上游引物在反应体系中的终浓度为1.5μmol/l，所述内控下游引物在反应体系中的终浓度为1.5μmol/l，所述内控探针在反应体系中的终浓度为0.2μmol/l；所述bcr-abl融合基因和内控的引物探针序列如下表，检测bcr-abl融合基因的引物探针核苷酸序列信息：上述pcr引物和标有不同类型荧光的探针可用于对bcr-abl融合情况的主要型(bcr-ablp210)和次要型(bcr-ablp190)型别进行检测，根据结果呈现的荧光信号有无，判断样本dna模板是否融合；上述引物和探针根据人bcr-ablp210、bcr-ablp1902种型别的融合基因和abl基因组dna序列设计并合成，可以检测bcr-ablp210、bcr-ablp1902种融合类型；bcr-abl基因的常见融合类型如下：bcr-ablp210由b3a2或b2a2转录形成bcr/abl融合mrna，编码210da分子量的胞浆蛋白p210；bcr-ablp190由ela2接头的杂合mrna，编码p190融合蛋白；所述特异性引物和探针，能够准确检测bcr-abl基因是否发生融合，在检测融合的同时，可以直接得出基因转录本水平以正确评价患者疗效。采用融合基因探针检测bcr-abl拷贝数与内控探针检测abl拷贝数，通过拷贝数比例来确定bcr-abl是否发生基因融合及计算出is％，根据bcr-ablis进而判断出分子学反应(mmr)。本发明结合dpcr系统使得检测体系可以达到分子学反应mr4.5。上述特异性引物和探针所制备的试剂盒，基于dpcr平台可检测bcr-abl融合基因的两种融合类型，为患者是否需要进行靶向治疗提供参考，也可用于白血病患者的高灵敏度早期检测和疗效监测。本发明还公开了一种bcr-abl融合基因检测的试剂盒，包括用于配制dpcr反应液的引物探针混合液、rt-buffer、rna酶、fluoresceinsodiumsalt、7-deaza-dgtp、对照样本和rnase-free水，其中，引物探针混合液包括如下成分，如表1，表1引物探针混合液其中，所述用于检测bcr-abl融合基因和abl内控基因的引物与探针分别如下，所述检测bcr-ablp210融合基因的上游引物核苷酸序列如seqidno：1所示，所述检测bcr-ablp190融合基因的上游引物核苷酸序列如seqidno：2所示，所述检测bcr-ablp210融合基因和bcr-ablp190融合基因的下游引物序列如seqidno：3所示，所述检测abl内控基因的上游引物核苷酸序列如seqidno：5所示，所述检测abl内控基因的下游引物核苷酸序列如seqidno：6所示；所述探针包括检测bcr-abl基因融合的探针和abl内控探针；所述bcr-abl基因融合探针的核苷酸序列如seqidno：4，其5’端标记有fam荧光报告基团，所述abl内控探针的核苷酸序列如seqidno：7所示，其5’端标记有vic荧光报告基团，所述所有探针的3’端标记有bhq1荧光淬灭基团，abl内控探针的3’端标记加zip修饰；当bcr-abl基因发生融合时，融合基因探针与上下游引物所扩增的目的片段结合，释放fam荧光信号；所述内控引物与探针是根据人abl基因保守片段设计并合成的，用于检测含有未发生基因融合的abl基因；所述dpcr反应液的rt-buffer包括如下成分，如表2，表2rt-buffer编号组分组分中的主要成分1rt-buffer(nh4)2so4、kcl、tris-hcl、mgcl2、dtt所述dpcr反应液的7-deaza-dgtp能够显著提高阳性信号荧光值，达到阳性与背景区分度更佳。所述对照品包括如下成分，如表3，表3对照样本优选地，所述gdna对照的细胞株dna混合液中含有caco2细胞株核酸；所述阳性对照的细胞株dna混合液中含有：检测bcr-ablp210融合基因的外合大片段1；检测bcr-ablp190融合基因的外合大片段2；检测abl内参基因的外合大片段3。本发明所述试剂盒适用样本为外周血dna核酸。本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测均设置阴性对照组、gdna对照组和阳性对照组，当检测结果的阳性对照组为阳性，且阴性对照组和gdna对照组均为阴性时，表明实验结果有效。本发明所述试剂盒的检测灵敏度可以达到0.0032％，即分子学反应mr4.5。本发明还公开了一种bcr-abl融合基因定量检测的方法，具体步骤包括：1.处理待测样本并提取样本dna模板；优选地，待测样本为外周血dna核酸；2.配制dpcr反应体系，将待测样本dna模板、特异性引物和探针、rt-buffer、rna酶、fluoresceinsodiumsalt、7-deaza-dgtp及rnase-free水混合，制备得到dpcr反应液；dpcr反应液构成如表4，表4dpcr反应液特异性引物和探针1μldna模板5μlrt-buffer5μlrna酶3μl7-deaza-dgtp1μlfluoresceinsodiumsalt2.5μlrnase-free水补足至25μl3.将sapphirechip平稳地放置于实验台上，轻轻旋转白盖1/4圈，丢弃白盖，移取25μl配制的dpcr反应液加入到sapphirechip的孔井中，静置2-3min盖上白色长盖。4.打开naicageode微滴生成扩增系统和气压泵开关，确认气压泵输出压力和微滴生成扩增系统输入(input)压力稳定在1150+/-50mbar，若不在此范围内，将其调整至1150+/-50mbar。5.根据“数字pcr实验protocol”设置反应程序：partitionat40℃，“sapphirev1”，第一阶段，50℃逆转录30分钟；第二阶段，95℃预变性10分钟；第三阶段，95℃变性30秒，56℃延伸30秒，45个循环；releasep。6.轻轻地将sapphirechip放置于加入模块上，盖上naicageode机器盖，确认程序无误后，点击“play”按钮，开始生成微滴和pcr反应程序。7.用“crytalreader”软件对扩增结果进行扫描，并在界面内打开“cristalminder”对扫描结果进行分析，并基于泊松分布统计原理计算出各样本中靶标分子的拷贝数；8.根据各荧光信号的强度和比例，判定待测样本是否发生融合，进而计算出is％(is％＝bcr-abl融合基因拷贝数/abl内参基因拷贝数×100％)。本申请采用dpcr检测原理如下：dpcr技术是把单个pcr管中的反应试剂划分成约上万个微反应，每个微反应中或不含待检核酸靶标分子，或含有1个至数个待检核酸靶分子，且每个微反应都作为一个独立的pcr反应单元。pcr过程结束后，对微反应逐个进行荧光检测，识别出阴/阳性反应。含有不同dna模板的微反应释放出不同荧光信号，没有模板的微反应则不产生荧光信号。最后，根据泊松分布统计原理及阳性微反应的比例计算出待检靶标分子拷贝数。由于dpcr结果的判读仅判断有无扩增，不依赖ct值，对pcr反应抑制剂的耐受能力大大提高，不需要参考品和标准曲线就可以精确定量，为本专利提供了一种全新的技术思路与手段。在本发明的一个优选地实施方式中，本发明的方法包括步骤：步骤一、待测样本dna模板提取抽取白血病患者外周血8-10ml置于edta或枸橼纳抗凝剂的采血管中，做好标记确保标签信息无误后，4℃保存。使用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170666号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取；建议采用分光光度计(如nanodrop2000超微量分光光度计或其他分光光度计仪器)对提取后的核酸进行检测，核酸的纯度应满足a260/a280比值范围在1.8-2.2之间，浓度应不低于10ng/μl，模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。步骤二、dpcr体系的制备dpcr体系配制前准备：取出试剂盒中的特异性引物和探针、rt-buffer、rna酶、fluoresceinsodiumsalt、7-deaza-dgtp、rnase-free水等，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制dpcr体系；dpcr体系构成如表5：表5dpcr体系特异性引物和探针1μlrt-buffer5μlrna酶3μlfluoresceinsodiumsalt2.5μl7-deaza-dgtp1μlrnase-free水补足至20μl所述引物探针的核苷酸序列信息分别如下：检测bcr-abl融合基因的引物探针核苷酸序列信息：表6步骤三、加样取步骤一所制备的样本dna模板5μl及试剂盒中的各对照样本5μl，加样至步骤二配制的dpcr反应体系的八连管中，使每管dpcr反应液的总体积为25μl；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于制备微反应；所述试剂盒的对照样本如表7：表7试剂盒的对照样本所述gdna对照样本为含有abl基因的野生型核酸样本，来源于caco2细胞株dna；阳性对照是将2种含有bcr-abl融合基因模板dna与abl内参基因模板dna分别按一定比例混合；其中，含有bcr-ablp210融合基因阳性的dna模板来源于外合大片段1，含有bcr-ablp190融合基因阳性的dna模板来源于外合大片段2，含有abl内参基因的dna模板来源于外合大片段3；阴性对照样本为rnase-free水。步骤四、制备微反应和pcr扩增取25ml配制的dpcr反应液，借助气压泵和naicageode微滴生成扩增系统机器将其自动、均匀地细分成35000个纳升级的反应单元并直接pcr反应扩增。pcr扩增的反应条件：partitionat40℃，“sapphirev1”，第一阶段，50℃逆转录30分钟；第二阶段，95℃预变性10分钟；第三阶段，95℃变性30秒，56℃延伸30秒，45个循环；releasep。步骤五、结果读取及分析将sapphirechip用“crytalreader”软件对扩增结果进行扫描，对实验命名、荧光染料和基因名称、led曝光时间、样品名称和chipid条形码等信息进行设置。并在界面内打开“cristalminder”对扫描结果进行分析，查看fam通道和vic通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本及无模板对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种bcr-abl融合基因定量检测的方法、引物、探针与试剂盒。本试剂盒优化了特异性引物探针，针对两种bcr-abl融合基因类型仅需两条不同的上游引物，共同的下游引物与一条荧光标记的探针和一套abl内参基因检测系统进行检测。使用本发明提供的特异性引物与探针，只需1管即可检测bcr-abl的2种融合类型，可计算is％，进而判断出分子学反应(mmr)。本发明能检测出is％为0.0032％，即达到分子学反应mr4.5灵敏度高。具有过程优化简单、所需样本少、性能稳定高效、高准确性等优点，能分辨出单个拷贝的差异，实现真正意义上的绝对定量，数据分析自动化，结果可实时观察。检测过程液滴生成与pcr扩增一体化完全闭管完成，有效降低了pcr产物污染和操作失误的风险。本发明适用于对白血病患者的bcr-abl融合基因转录水平进行监测，并评估酪氨酸激酶抑制剂(tki)的疗效。实现治疗效果的动态追踪，从而早期识别耐药或疾病进展，从而指导干预治疗。这是探索白血病早期诊断与高效治疗的一条可行途径，值得推广应用。下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。实施例1：试剂盒一种bcr-abl融合基因定量检测的试剂盒的组成成分、包装及数量(48反应/盒)，如表8，表8试剂盒的组成成分、包装及数量实施例2：灵敏度检测及最低检出率实验gdna对照样本为含有bcr-abl融合基因野生型的核酸来源于caco2细胞株dna；灵敏度参考品由2种bcr-ablp210融合基因和bcr-ablp190融合基因模板dna与abl内参基因模板dna(内参基因拷贝数≥104)分别按一定比例混合，混合液的is％分别为0.1％、0.01％、0.0032％；其中，bcr-ablp210和bcr-ablp190模板dna来源于人工合成大片段1、2；阴性对照为rnase-free水；取阴性对照、gdna对照、灵敏度参考品各5μl，加样至步骤二配制的dpcr反应体系的八连管中，使每管dpcr反应液总体积为25μl；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于微反应制备；取25μl配制的dpcr反应液，借助气压泵和naicageode微滴生成扩增系统机器将其自动、均匀地细分成35000个纳升级的反应单元并直接pcr反应扩增。pcr扩增的反应条件：partitionat40℃，“sapphirev1”，第一阶段，50℃逆转录30分钟；第二阶段，95℃预变性10分钟；第三阶段，95℃变性30秒，56℃延伸30秒，45个循环；releasep；将sapphirechip用“crytalreader”软件对扩增结果进行扫描，对实验命名、荧光染料和基因名称、led曝光时间、样品名称和chipid条形码等信息进行设置。并在界面内打开“cristalminder”对扫描结果进行分析，查看fam通道和vic通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本及无模板对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值；用dpcr系统对本发明的灵敏度和最低检出率进行检测，当上述阳性对照样本混合液理论is％的值分别为0.1％、0.01％、0.0032％时，实际测得的is％如表9所示，表9灵敏度检测结果试剂盒的灵敏度检测结果与理论值相符，表明引物与探针具有较好的特异性，灵敏度检测良好；当bcr-abl拷贝数与abl拷贝数混合的阳性样本is％为0.0032％时，dpcr系统可稳定检测出相应融合型别，实际检测is％分别平均为0.0032％、0.0031％、0.0031％，因此，本发明的可检出is％为0.0032％。实施例3：准确性检测根据所测得对照样本的拷贝数，制备准确性参考品将2种bcr-ablp210融合基因和bcr-ablp190融合基因模板dna与abl内参基因模板dna(内参基因拷贝数≥104)分别按一定比例混合，制得is％为0.01％的混合液。每种准确性参考品做2个重复实验，共4管；取bcr-ablp210融合基因准确性参考品5μl，bcr-ablp190融合基因准确性参考品5μl加样至步骤二所配制的dpcr反应体系的八连管中，使得dpcr反应液的总体积为25μl；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于微反应制备；取25μl配制的dpcr反应液，借助气压泵和naicageode微滴生成扩增系统机器将其自动、均匀地细分成35000个纳升级的反应单元并直接pcr反应扩增。pcr扩增的反应条件：partitionat40℃，“sapphirev1”，第一阶段，50℃逆转录30分钟；第二阶段，95℃预变性10分钟；第三阶段，95℃变性30秒，56℃延伸30秒，45个循环；releasep；将sapphirechip用“crytalreader”软件对扩增结果进行扫描，对实验命名、荧光染料和基因名称、led曝光时间、样品名称和chipid条形码等信息进行设置。并在界面内打开“cristalminder”对扫描结果进行分析，查看fam通道和vic通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本及无模板对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值；用dpcr系统对本发明试剂盒的准确性进行检测，得到结果如表10，表10：准确性检测结果根据上表所述结果，各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，符合理论定性标准，表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。实施例4：临床应用实验抽取15例白血病患者外周血8-10ml置于edta或枸橼纳抗凝剂的采血管中，提供血样的15名患者已进行荧光定量pcr检测，并且明确为bcr-abl基因融合类型种1种，或者不含bcr-abl基因融合；做好样本标记并确保标签信息无误，4℃保存。使用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170666号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取；建议采用分光光度计(如nanodrop2000超微量分光光度计或其他分光光度计仪器)对提取后的核酸进行检测，核酸的纯度应满足a260/a280比值范围在1.8-2.2之间，浓度应不低于10ng/μl，模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。取每个样本的dna模板5μl及试剂盒中对照样本各5μl，加样至步骤二配制的dpcr反应体系的八连管中，使每管dpcr反应液的总体积为25μl；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于微反应制备；取25μl配制的dpcr反应液，借助气压泵和naicageode微滴生成扩增系统机器将其自动、均匀地细分成35000个纳升级的反应单元并直接pcr反应扩增。pcr扩增的反应条件：partitionat40℃，“sapphirev1”，第一阶段，50℃逆转录30分钟；第二阶段，95℃预变性10分钟；第三阶段，95℃变性30秒，56℃延伸30秒，45个循环；releasep；将sapphirechip用“crytalreader”软件对扩增结果进行扫描，对实验命名、荧光染料和基因名称、led曝光时间、样品名称和chipid条形码等信息进行设置。并在界面内打开“cristalminder”对扫描结果进行分析，查看fam通道和vic通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本及无模板对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值；检测结果为：15例样本中，5例样本呈bcr-abl融合阳性，其余样本为阴性，所检结果与荧光定量pcr检测的结果一致性为100％。对比例1本发明人对bcr-abl融合基因的基因序列，进行深入比对分析后，针对目标序列设计了数十对引物和数十种探针，期望获得能够同时检测2种融合类型的引物组和检测探针。由于引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，很难获得有效的多重数字pcr扩增引物以及探针序列。本发明人通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于同时检测2种融合类型的多重数字pcr扩增的引物、探针序列及其组合。实验中发现，即使在已经基本确定针对各目标核酸的引物对和探针序列的情况下，不同引物对组合进行多重扩增的效果也存在显著地差异。例如，使用如下的对照引物对进行检测，其它检测步骤和条件同上述实施例：对照引物对1：ccgtggagctgcagatgct(seqidno.:8)，cagtgccataagcggcacc(seqidno.:9)；对照引物对2：tctccctgacatccgtgga(seqidno.:10)，gcagatctggcccaacgat(seqidno.:11)。按照实施例2的方法进行灵敏度检测，检测结果表明对照引物对1可检出is％为0.01％；对照引物对2可检出is％为0.1％；对照引物对1和对照引物对2的灵敏度均较差。按照实施例3的方法进行准确性检测，结果表明对照引物对1和对照引物对2的准确性较差，无法进行理论定性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中山大学达安基因股份有限公司<120>一种bcr-abl融合基因定量检测的方法及试剂盒<130>00020<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>1ctccagactgtccacagcattc22<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>2ttggttgtcgtgtccgagg19<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>3gcgagaaggttttccttggag21<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>4cggcttcactcagaccctgaggct24<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>5cttggcgcaaaatgttgg18<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>6gagcggcttcactcagacc19<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>7cctgaagctggtgggctgcaa21<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>8ccgtggagctgcagatgct19<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>9cagtgccataagcggcacc19<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>10tctccctgacatccgtgga19<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>11gcagatctggcccaacgat19当前第1页12