桉树枯萎病快速检测方法与流程

本方法属于分子生物学技术领域，具体涉及桉树枯萎病快速检测方法。

背景技术：

桉树(eucalyptusssp.)是我国重要的经济树种，福建南安地区桉树枯萎病是由茄病镰刀菌(fusariumsolani)引起的一种枝干病害，严重制约着桉树产业的发展。茄病镰刀菌已被报道可引起杨树、西瓜、马铃薯等多种林木和作物的枯萎。不过，在南安地区发病桉树枝干上分离到若干不同种镰刀菌，这为病原菌的鉴定带来一定程度的困难。传统方法鉴定病原菌较为繁琐、费时。精确的区分出病原菌、进行快速精准的检测已成大势所趋。近年来，随着分子生物学的不断发展，分子标记方法的普及，为病原菌检测带来了新的途径。随机扩增多态性（randomamplifiedpolymorphicdna，rapd）分子标记技术是以pcr技术为基础，利用一系列不同的碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸链(通常为8-10bp)为引物，对所研究基因组dna进行pcr扩增。其具有信息量大、费用小等优点。但由于随机引物扩增所需要的退火温度较低，所以扩增产物易出现稳定性差、重复性差、效率低的问题。为了解决这些问题，一般将稳定性较差的rapd标记转化为退火温度较高、更稳定的序列特异扩增区域标记（sequencecharacterizedamplifiedregion，scar）。本发明在利用rapd与scar分子标记技术，成功检测出桉树枯萎病病原菌，为福建南安地区桉树枯萎病防治带来新的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供桉树枯萎病快速检测方法，该方法操作简便，检测速度快，检测灵敏度高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

桉树枯萎病快速检测方法为以scar特异性引物为引物，从含桉树枯萎病致病菌的样品中提取的基因组dna为模板，进行pcr扩增，检测桉树枯萎病致病菌的存在。

上述scar特异性引物，是根据rapd特异性片段序列，利用dnaman软件，设计所得。其正向引物为f9，具体序列为：

seqidno.1：5’-tcggttgtcgcaaagact-3’，

其反向引物为r9，具体序列为：

seqidno.2：5’-gggaagttgtgtcagcatt-3’。

进一步的rapd特异性片段是运用rapd分子标记技术，选择含桉树枯萎病致病菌茄病镰刀菌（fusariumsolani）在内的9株镰刀菌作为供试菌株，以供试菌株基因组dna为模板，以随机引物p38为引物，通过随机引物pcr从茄病镰刀菌中扩增获得的的特异性片段。供试菌株及其来源见表1。随机引物pcr反应体系为：12.5μlpcrmix，1μl10μmol·l^-1的随机引物p38，1μl40ng·μl^-1的dna模板，ddh2o补足至25μl，。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后延伸10min，4℃保存。

上述随机引物p38的序列为：seqidno.4：5’-aggtgtgcca-3’。

上述rapd特异性片段的具体序列为：seqidno.3。

seqidno.3：

5’-aggtgtgccatgctgggtatggttagattttcttggttataaccagtcataaccagc

tataaccagttaccaccagttataacccttacggccagttataatcggtaacaaccacccactgcaattaacttatgataggaatggatgtcagttgtcggtcggttgtcgcaaagactgcaactcgttgactggcacaggaaacaagagagtctgcagaacgagaataaaagtggcaagtttttttccttctgtctaattccacacgaagttggttgcccgccaaaattttggcataagttcccctactaaaatgctgacacaacttcccctgccaaaatttggcataacttcccctgtccaacttcctggcacacct-3’

表1供试菌株及其来源

上述检测桉树枯萎病致病菌pcr反应的反应体系为：12.5μlpremix；引物f9/r9(10μmol·l^-1)各1μl；1μl模板dna(40ng·μl^-1)；ddh2o补足至25μl。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后延伸10min，4℃保存。

本发明的优点在于：

本发明运用rapd和scar分子标记技术首次从分子层面对桉树枯萎病致病菌茄病镰刀菌（fusariumsolani）进行快速检测。检测方法简便快捷，检测所用特异性引物灵敏度高，在dna基因组浓度为0.4fg/μl浓度时也能检测到致病菌的存在。

附图说明

图1随机引物p38扩增图谱。泳道m：dl2000marker；泳道1-3：桉树枯萎病致病菌茄病镰刀菌（fusariumsolani）；泳道4-11：其它供试菌株。

图2引物f9/r9特异性验证。泳道m：dl2000marker；泳道1-3：桉树枯萎病致病菌茄病镰刀菌（fusariumsolani）；泳道4-11：其它供试菌株；泳道ck：阴性对照。

图3scar特异性引物f9/r9灵敏度检测。泳道m：dl2000marker；泳道1-10：不同dna浓度，1：400ng/μl、2：40ng/μl、3：4ng/μl、4：400pg/μl、5：40pg/μl、6：4pg/μl、7：400fg/μl、8：40fg/μl、9：4fg/μl:10：0.4fg/μl；泳道ck：阴性对照。

图4桉树枝干组织特异性检测。泳道m：dl2000marker；泳道1：桉树枯萎病致病菌茄病镰刀菌（fusariumsolani）；泳道2：接种致病菌枝干；泳道ck1：健康植株；泳道ck2：ddh2o。

图5土壤特异性检测。泳道m：dl2000marker；泳道1：桉树枯萎病致病菌茄病镰刀菌（fusariumsolani）；泳道2：桉树枯萎病致病菌茄病镰刀菌（fusariumsolani）+无菌土；泳道ck1：ddh2o+无菌土；泳道ck2：ddh2o。

具体实施方式

实施例1

材料：供试菌株：含桉树枯萎病致病菌茄病镰刀菌（fusariumsolani）在内的9株镰刀菌，其菌种及来源见表2。

表2供试菌种及其来源

供试菌株的基因组dna提取方法为采取omega公司的真菌基因组dna提取试剂盒进行提取。以供试菌株的基因组dna为模板，以10bp大小的随机引物p38seqidno.4：5’-aggtgtgcca-3’做引物，以rapd分子标记技术进行pcr扩增。pcr反应体系为：12.5μlpcrmix（premix购自广州擎科生物技术有限公司），随机引物p381μl（10μmol·l^-1），1μl40ng·μl^-1的dna模板，10.5μlddh2o。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后延伸10min，4℃保存。扩增电泳图谱见图1所示。图1结果表明，只有桉树枯萎病致病菌（fusariumsolani）扩增出一条大小为376bp的特异性片段，而其它供试菌株则不能扩增出此片段。经反复试验，该条带清晰、稳定，认为此条带为桉树枯萎病菌特异性片段。

实施例2特异片段克隆、测序

将实施例1扩增所得的特异片段用tiangen凝胶回收试剂盒进行回收，将回收产物连接到peasy-t1载体，再转化至大肠杆菌感受态细胞trans-t1，转化后涂布于含有20μl氨苄青霉素（50mg·ml^-1）、16μiptg（50mg·ml^-1）和40μlx-gal（20mg·ml^-1）的la固体培养基上37℃培养过夜，进行蓝白斑筛选，挑取拟含有重组质粒的白斑进行pcr鉴定。将含有重组质粒的菌液送至广州擎科生物公司进行测序。

在测序所得序列中找到随机引物及其反向互补序列所在位置，去掉两端载体序列，得到rapd特异性片段序列全长，大小为376bp，其具体序列如seqidno3。将rapd特异性序列在genbank中在线比对，未发现同源序列。根据rapd特异性片段序列，利用dnaman软件，设计一对scar特异性引物f9/r9。正向引物f9，序列为seqidno.1：5’-tcggttgtcgcaaagact-3’，位于rapd特异性片段序列的159~176bp处；反向引物r9，序列为seqidno.2：5’-gggaagttgtgtcagcatt-3’；位于特异性片段序列的310~328处，扩增目的片段大小为170bp。

seqidno.3：

aggtgtgccatgctgggtatggttagattttcttggttataaccagtcataaccagctataaccagttaccaccagttataacccttacggccagttataatcggtaacaaccacccactgcaattaacttatgataggaatggatgtcagttgtcggtcggttgtcgcaaagactgcaactcgttgactggcacaggaaacaagagagtctgcagaacgagaataaaagtggcaagtttttttccttctgtctaattccacacgaagttggttgcccgccaaaattttggcataagttcccctactaaaatgctgacacaacttcccctgccaaaatttggcataacttcccctgtccaacttcctggcacacct

注：阴影部分为随机引物及其反向互补序列，下划线部分为设计的scar特异性引物正反向序列

实施例3scar特异性引物的特异性验证

利用设计的scar特异性引物f9/r9为引物，以对9株供试菌株的基因组dna为模板，进行pcr扩增。pcr反应体系为：12.5μlpremix；引物f9/r9(10μmol·l^-1)各1μl；1μl模板dna(40ng·μl^-1)；ddh2o补足至25μl。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。

电泳结果见图2所示。电泳结果显示，只有桉树枯萎病致病菌能够扩增出一条大小约为170bp的目的条带，其他供试菌株和对照均无条带产生，说明所设计的引物具有特异性。挑选亮度高的条带从琼脂糖凝胶上切割、回收纯化后进行连接、转化，将含有重组质粒的菌液送至广州擎科生物有限公司进行测序，将测序结果与rapd筛选出的特异片段序列用dnaman软件进行比对，对比结果显示，二者相似性达到99％，二者检测结果相同，进一步证明本发明的特异性引物具有特异性，且rapd标记成功转化为更稳定的scar标记。

实施例4scar特异性引物灵敏度检测

将致病菌基因组dna浓度按10倍梯度稀释，用scar特异性引物f9/r9分别对不同浓度的基因组dna进行pcr扩增，以ddh2o为对照。结果见图3所示，dna基因组浓度为0.4fg/μl时，仍有特异性条带产生，对照无条带产生，该引物具有高的灵敏度。

实施例5桉树枯萎病致病菌的特异性检测

分别以桉树枯萎病致病菌、接种桉树枯萎病病原菌的桉树枝干组织的基因组dna为模板，用scar特异引物f9/r9进行pcr扩增，以ddh2o和健康桉树枝干组织为对照，结果见图4。结果显示，以病原菌和接种致病菌的桉树枝干的基因组dna为模板，均能扩增出一条大小为170bp的条带，而健康桉树枝干和ddh2o均无条带产生。因此表明，该特异引物能从含有桉树枯萎病致病菌的桉树枝干上检测到致病菌的存在，这为桉树枯萎病的预警与提前防治带来了新的方法。

将桉树枯萎病致病菌孢子悬浮液浓度调整为1×10⁷ml^-1，加入1g灭菌土壤中，阴性对照加入等量ddh2o。以桉树枯萎病致病菌、接种桉树枯萎病致病菌的无菌土壤所提取的基因组dna为模板，用scar特异引物f9/r9进行pcr扩增，以ddh2o和加ddh2o的无菌土为对照。扩增结果见图5所示，结果表明scar特异性引物可以从含桉树枯萎病致病菌的土壤中检测到致病菌的存在。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>桉树枯萎病快速检测方法

<130>4

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

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tcggttgtcgcaaagact18

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<211>19

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gggaagttgtgtcagcatt19

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<211>376

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aggtgtgccatgctgggtatggttagattttcttggttataaccagtcataaccagctat60

aaccagttaccaccagttataacccttacggccagttataatcggtaacaaccacccact120

gcaattaacttatgataggaatggatgtcagttgtcggtcggttgtcgcaaagactgcaa180

ctcgttgactggcacaggaaacaagagagtctgcagaacgagaataaaagtggcaagttt240

ttttccttctgtctaattccacacgaagttggttgcccgccaaaattttggcataagttc300

ccctactaaaatgctgacacaacttcccctgccaaaatttggcataacttcccctgtcca360

acttcctggcacacct376

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<213>p38

<400>4

aggtgtgcca10