人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株及其构建方法与流程

本发明涉及细胞株构建领域，尤其涉及一种人源oat1-mrp2-ugt2b7三重稳定转染细胞株构建方法及功能验证。

背景技术：

药物代谢转运是体内药物处置的关键因素，直接影响药物的安全性及治疗效果。随着生物技术的发展，建立体外高表达细胞模型日益成为研究药物处置机制、相互作用以及安全性的首选模型。目前已有报道的研究代谢转运的细胞模型包括caco2细胞(人结直肠癌细胞系)、高表达转运体mdckii细胞模型(如mdckii-hocts、mdckii-hoatps、mdckii-hmdr1、mdckii-hbcrp、mdckii-mrp2、mdckii-hmdr1-hbcrp等)以及hek293细胞模型(如hek293-oatp1a2、hek293-oatp1b1、hek293-oct等)。这些细胞模型的建立为阐明药物代谢机制、研究代谢酶和转运体间的相互作用提供了可能。

近年来，通过建立细胞培养模型来研究药物处置机制是药物研发进程中取得的重要突破与成就。应用细胞模型可以研究候选化合物或者临床用药的转运机制、代谢、药物药物相互作用、毒性以及安全性评估等。细胞模型方法具有所需的药物量少、实验方法简单、分析迅速、环境条件可控(温度、ph等)等优势，能够快速获得药物透膜的转运机制，可以达到体外高通量筛选的目的。

在药物处置及相互作用机制研究中，稳定转染的细胞株是重要的研究技术。目前，缺乏一种oat1-mrp2-ugt2b7稳定转染细胞株。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种人源oat1-mrp2-ugt2b7三重稳定转染细胞株及其构建方法，为后续药物的跨膜转运机制研究工作提供技术平台。

本发明的第一个目的是提供一种人源oat1-mrp2-ugt2b7三重稳定转染细胞株的构建方法，包括以下步骤：

(1)将hoat1的目的基因与pcdna3.1/hygro(+)表达载体组装，hmrp2的目的基因与pcdna3.1/g418(+)表达载体组装，hugt2b7的目的基因与pcdna3.1/puromycin(+)表达载体组装，构建pcdna3.1/hygro(+)-hoat1质粒、pcdna3.1/g418(+)-hmrp2质粒和pcdna3.1/puromycin(+)-hugt2b7质粒；其中，hoat1、hmrp2和hugt2b7目的基因的核苷酸序列分别如seqidno.1-3所示；

(2)采用脂质体法将步骤(1)构建的三种质粒依次转染至mdckii细胞、caco2细胞或hek293细胞，细胞转染24h后，分别使用特异性抗生素筛选出阳性克隆，并通过使用阳性化合物进行转运或代谢功能验证，确认细胞株同时稳定表达oat1、mrp2和ugt2b7基因及其蛋白，即构建出所述人源oat1-mrp2-ugt2b7三重稳定转染细胞株，其中，所述抗生素为g418抗生素、hygromycinb抗生素和puromycin抗生素。

进一步地，在步骤(1)中，采用合成生物学方法，合成hoat1、hmrp2和hugt2b7目的基因。与传统的基因克隆技术相比，合成生物学具有快速、准确、高效等特点，在构建基因表达体系时更具有优势。

进一步地，在步骤(1)中，构建质粒时所采用的内切酶为nhei和kpni限制性内切酶或nhei和hindiii限制性内切酶。

在步骤(2)中，相比于物理转染法费时费力、效率不高，化学转染法中人工脂质体法具有较高的转染效率，可以转染其他方法不易转染的细胞系，dna质粒、干扰小rna(microrna、shrna等)甚至是蛋白都可以通过脂质体法进行转染。此外，脂质体转染法同时适用于瞬时表达和稳定表达，前者具有快速、灵活的特点，后者具有稳定、重现性强等优势。

进一步地，在步骤(2)中，质粒转染时，三种质粒的浓度为0.001μg/μl。

进一步地，在步骤(2)中，g418抗生素的浓度为800μg/ml，hygromycinb(潮霉素b)抗生素的浓度为400μg/ml，puromycin(嘌呤霉素)抗生素的浓度为5μg/ml。以上浓度下，不含相应抗性的细胞2天左右死亡60％，而含相关抗性的细胞原则上不会死亡。浓度过高会杀死含抗性细胞，且长期培养细胞形态易改变。

进一步地，在步骤(2)中，取对数生长期的细胞进行细胞转染。

进一步地，在步骤(2)中，抗生素筛选时，细胞融合度超过25％时，立即传代，每3-4天更换含特定浓度抗生素的培养液进行培养，重复以上步骤，直至传代至3-4代，挑选出阳性单克隆继续培养至长成细胞株。

进一步地，在步骤(2)中，质粒转染所用培养基为无血清的deme培养基。

进一步地，在步骤(2)中，采用polyjet转染试剂进行质粒转染。

进一步地，在步骤(2)中，从mrna、蛋白表达以及功能三方面进行验证，以筛选出稳定表达hoat1、hmrp2、hugt2b7三个基因，且具有活性的阳性克隆细胞株。

进一步地，在步骤(2)中，转染细胞优选为mdckii细胞。mdckii为犬肾上皮细胞，与人正常细胞的生理特征接近。培养后可分化成极性的柱状上皮并形成刷状缘，相邻细胞间紧密连接，形成完整的细胞单层，对物质的通透性低。生化特性检查发现mdckii中缺乏大部分的代谢酶、摄取转运体和外排转运体。因此，mdckii细胞具有培养周期短、背景较低、易于培养等优点，稳定转染的mdckii细胞株是药物代谢转运研究的有效手段。

进一步地，转染试剂的用量为40μl每100μl培养基。

本发明的第二个目的是要求保护一种采用上述方法所构建的人源oat1-mrp2-ugt2b7三重稳定转染细胞株，该细胞株可同时稳定表达oat1、mrp2和ugt2b7基因及其蛋白，并具有相对应的转运与代谢功能。

本发明描述的三重稳定转染细胞株可用于模拟肝内oat1介导的摄取、mrp2介导的外排及ugt2b7介导的二相代谢功能，是评价药物处置机制的重要体外研究手段。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明通过目的基因合成技术，成功完成了hoat1-hmrp2-hugt2b7三重稳定转染细胞株构建，为后续药物的跨膜转运及代谢机制研究工作奠定基础。本发明快速、准确、高效的构建基因表达体系，转染方法稳定、重现性强。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明hmrp2在mrna水平上的表达情况测试结果；

图2是本发明ugt2b介导的steviol代谢物sv-g在单克隆细胞株的外排率测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1质粒的构建

利用合成生物学方法，通过基因合成得到hoat1、hmrp2、hugt2b7目的基因，其中，hoat1、hmrp2和hugt2b7目的基因的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3所示。将上述三种基因分别与pcdna3.1/hygro(+)、pcdna3.1/g418(+)、pcdna3.1/puromycin(+)表达载体连接，转化扩增后，提取纯化质粒pcdna3.1/hygro(+)-hoat1、pcdna3.1/g418(+)-hmrp2、pcdna3.1/puromycin(+)-hugt2b7重组质粒。对重组质粒进行电泳鉴定，得到相应的目的条带，以nhei和kpni为限制性内切酶酶切位点(或nheⅰ和hindⅲ)，对重组质粒进行双酶切鉴定，均得到相应的载体条带和目的基因条带，结果表明三个质粒构建成功，可用于后续实验。

实施例2质粒的转染

(1)细胞的来源与培养：

转染细胞为mdckii细胞，犬肾上皮细胞(mdckii)从ecacc(欧洲细胞株/微生物保藏中心)购买。细胞生长于100mm细胞培养皿中，每三天按1：50传代一次，培养基为含10％fbs的dmem(100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，在含5％二氧化碳，95％湿度，37℃的培养箱中培养。

(2)抗生素浓度筛选：

取对数生长期的mdckii细胞进行抗生素(g418、hygromycinb、puromycin)浓度筛选，抗生素浓度从100μg/ml到1000μg/ml不等，培养2-3周，选择所有细胞被全部杀死的最低抗生素浓度作为构建稳转细胞株时采用的抗生素浓度。结果表明，mdckii细胞细胞筛选浓度g418为800μg/ml，hygromycinb为400μg/ml，puromycin为5μg/ml。

(3)质粒转染：

a)取对数生长期的mdckii细胞，按10万/孔mdckii铺6孔板，24h后进行转染实验。

b)根据polyjet转染试剂说明书，将质粒pcdna3.1空载体、pcdna3.1/g418(+)-hmrp2转染mdckii细胞。使用g418抗生素筛选出mdckii-hmrp2阳性单克隆，然后向mdckii-hmrp2阳性单克隆中转入pcdna3.1/hygro(+)-hoat1质粒，筛选出mdckii--hoat1-hmrp2阳性单克隆，再在该阳性单克隆中转入pcdna3.1/puromycin(+)-hugt2b7质粒，并通过代谢功能验证，确认细胞株同时稳定表达oat1、mrp2和ugt2b7基因及其蛋白。

其中，质粒转染具体步骤如下：

取2μg上述质粒，加入到含100μl无血清的dmem中，随后加入100μl含80μl脂质体转染试剂polyjet的无血清dmem，混合均匀，静置15min后滴入相应细胞系6孔板中，进行转染。

c)细胞转染后24hr，更换含有一定浓度的选择性抗生素(g418为800μg/ml，hygromycinb为400μg/ml，puromycin为5μg/ml)的dmem细胞培液进行筛选。细胞融合度一旦超过25％，立即传代，每3-4天更换含特定浓度抗生素的培养液如此循环往复2-3周后，直至传代至3-4代，挑选单克隆(约50个以上)至96孔板继续培养，期间每隔三天换一次培养液直到单克隆细胞株长成，2天后传代至24孔板让细胞扩增，用于mrna表达验证、功能表达验证及保种。选取其中表达量较高的细胞株连续四周每周进行功能验证实验，根据结果挑选mrna表达量最高，功能最稳定的细胞株，即构建成人源oat1-mrp2-ugt2b7三重稳定转染细胞株，将其作为稳定过表达的细胞模型。

三重稳定转染细胞株构建及验证：在步骤b)和c)中，首先将pcdna3.1/g418(+)-hmrp2转染至mdckii细胞中，做多组平行实验，将其分别编号为1-119，筛选出多个mdckii-hmrp2阳性单克隆。对平行实验获得的阳性单克隆进行mrna鉴定(荧光定量pcr)和蛋白表达(westernblot分析)。利用rnaisoplus提取挑选的细胞克隆总rna，并用q5000uv-vis分光光度计(quawell)测定rna的浓度及纯度。按照primerscripttm(takara)试剂盒方法将rna逆转录成cdna，选取gapdh为内参基因，使用iq^tmsybrgreensupermix(bio-rad)试剂以及cfx96real-time荧光定量pcr仪(bio-rad)对hoat1、hmrp2、hugt2b7进行定量。pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次，72℃延伸10min。反应结束后，取5μlpcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，确认pcr反应产物。检测hmrp2在mrna水平上的表达情况。结果如图1所示，图中，m指的是100bp长度的dna标记，wt指的是mdckii野生型细胞，图中数字代表mdckii-hmrp2阳性单克隆。

mdckii-hmrp2阳性单克隆的转运功能使用mrp2转运体底物长春碱(vinblastine)进行试验，评价每株单克隆细胞转运体的功能。经筛选后的阳性克隆细胞，按1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种于12孔transwell板上，培养5天后，测量mdckii单层细胞的跨膜电阻(teer)，均在180-200ω/cm²的范围内，细胞单层完整，即满足实验要求。以10μm长春碱为底物，37℃水浴孵育3hr进行跨膜转运实验，考察长春碱在各阳性单克隆细胞株中的外排率，结果如表1所示。

表1长春碱在各阳性单克隆细胞株中的外排比

在上述挑选出的mdckii-hmrp2阳性单克隆的基础上，重新进行编号，再将pcdna3.1/hygro(+)-hoat1质粒转染到阳性单克隆细胞中，按照步骤b)和c)的方法进行细胞转染，做多组平行实验，筛选出多个mdckii--hoat1-hmrp2阳性单克隆，用oat1底物替诺福韦(tenofovir)进行试验，评价转运体的功能。经筛选后的阳性克隆细胞，按5.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种于24孔板上，培养3天后，以10μm替诺福韦为底物进行摄取实验(37℃，10min)，考察替诺福韦在各单克隆细胞中的摄取率，结果如表2所示。

表2替诺福韦在各阳性单克隆细胞株中的摄取率

在上述挑选出的mdckii--hoat1-hmrp2阳性单克隆的基础上，重新进行编号，再将pcdna3.1/puromycin(+)-hugt2b7质粒转染到阳性单克隆细胞中，按照步骤b)和c)的方法进行细胞转染，做多组平行实验，筛选出多个阳性单克隆mdckii-hoat1-hmrp2-hugt2b7，用ugt2b7底物甜菊醇(steviol)进行试验，评价ugt2b7介导的甜菊醇葡萄糖酸结合物生成。经筛选后的阳性克隆细胞，按5.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种于24孔板上，培养3天后，以10μmsteviol为底物进行细胞代谢实验(37℃，10min)，考察steviol在各单克隆细胞中的代谢速率，结果如表3所示。

表3steviol在各阳性单克隆细胞株中的代谢速率

将筛选出的阳性单克隆mdckii--hoat1-hmrp2-hugt2b7，按1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种于12孔transwell板上，培养5天后，测量mdckii单层细胞的跨膜电阻(teer)，均在180-200ω/cm²的范围内，细胞单层完整，即满足实验要求。上述细胞株具有mrp2、oat1及ugt2b7功能，可以对肝代谢转运进行合理的体外模拟。以10μmsteviol为底物，37℃水浴孵育，首先考察steviol在ugt2b7介导下生成的代谢产物sv-g的速率及在各单克隆细胞株的外排率。steviol的代谢产物sv-g是oat1的底物，同时mrp2参与其外排转运，因此总外排率(细胞培养介质中sv-g浓度)是mrp2介导的外派和oat1介导的摄取的综合结果，结果如图2所示。

本发明通过目的基因合成技术，成功完成了hoat1-hmrp2-hugt2b7三重稳定转染细胞株构建，为后续药物的跨膜转运及代谢机制研究工作奠定基础。本发明快速、准确、高效的构建基因表达体系，转染方法稳定、重现性强。本发明构建的三重稳定转染细胞株可用于模拟肝内oat1介导的摄取、mrp2介导的外排及ugt2b7介导的二相代谢功能，是评价药物处置机制的重要体外研究手段。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>苏州大学

<120>人源oat1-mrp2-ugt2b7三重稳定转染细胞株及其构建方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

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<211>1692

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