选择性CDK4/6抑制剂及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种选择性cdk4/6抑制剂及其应用。

背景技术：

肿瘤的发生与多种癌基因和抑癌基因的失衡有关。几乎所有癌基因、抑癌基因的功能效应，最终都会汇聚到细胞周期上来。因此，可以说肿瘤是一类细胞周期性疾病(cellcycledisease，ccd)，调节或阻断细胞周期是治疗肿瘤的途径之一。目前，已发现的与细胞周期调控有关的分子很多，其中细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent-kinases,cdks)是细胞周期调控网络的核心分子。cdks为催化亚单位，是一类丝氨酸(ser)/苏氨酸(thr)激酶，作为细胞内重要的信号传导分子，参与细胞周期的不同时期。研究表明，以cdks为中心的细胞周期调控网络，任何环节的异常都将引起细胞周期异常，最终导致肿瘤的发生。cdk家族目前有21个亚型，通过与其调节性亚单元cyclins(细胞周期蛋白)结合发挥作用。cdk各种亚型的功能，除了作用于细胞周期之外，还包括对转录、dna修复、分化和细胞程序性死亡的调节。基于cdks在调控肿瘤细胞的增殖和死亡中所起的关键作用，cdks激酶家族为抗肿瘤药物的发现与研制提供了机会和新的领域。

在参与细胞周期的cdk亚型中，cdk4/6发挥着不可替代的作用。与癌症有关的细胞周期突变主要存在于g1期和g1/s期转化过程中，cdk4/6与cyclind结合形成有激酶活性的复合物，通过抑癌基因rb产物prb磷酸化，释放结合的转录因子e2f，启动与s期有关的基因转录，促使细胞通过检验点，并从g1期向s期转移。cdk4/6特异性的激活与一些肿瘤的增殖密切相关，大约80％的人类肿瘤中有cyclind-cdk4/6-ink4-rb通路的异常。这条通路的改变，加速了g1期进程，使得肿瘤细胞增殖加快而获得生存优势。因此，对该通路的干预成为一种治疗策略，cdk4/6成为一种新的抗肿瘤靶点。cdk4/6作为抗肿瘤靶点的优势在于：(1)大多数增殖的细胞依赖cdk2或者cdk4/6增殖，但cdk4/6的抑制剂不表现出“pan-cdk抑制剂”的细胞毒性，如骨髓抑制和肠道反应。(2)临床前实验表明，如果细胞cyclind水平升高或者p16ink4a失活，能够增加细胞对药物的敏感性，由于肿瘤细胞相对于正常细胞存在上述现象，所以一定程度上增加了药物的靶向性。

目前为止已被fda批准上市的cdk抑制剂药物包括：pfizer的palbociclib在2015年2月3日经fda批准上市、novartis的ribociclib在2017年3月13日经fda批准上市，elililly的abemaciclib在2017年9月28日经fda批准上市，这3个药物的适应症均是用于治疗转移性乳腺癌，这对cdk4/6抑制剂的开发起着非常正面的作用。另外，还有一些如astex、tolero、g1等医药公司陆续报道一系列选择性较好的cdk4/6抑制剂，用于治疗骨髓疾病、血液肿瘤、乳腺肿瘤、肺癌等等疾病，目前均正处于不同阶段的临床试验阶段。

为了达到更好的肿瘤治疗效果，以更好的满足临床与市场的需求，我们希望能够开发出新一代的高效低毒的选择性cdk4/6抑制剂，期望能提高治疗的选择性以及防止正常细胞受到一些副作用的损害。因而，开发出更安全、高效的新型cdk4/6抑制剂药物具有巨大的社会价值和经济效益。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的cdk4/6药物的缺陷，而提供了一种新型的选择性cdk4/6抑制剂及其应用，该化合物结构新颖、可用于癌症的治疗和/或预防。

本发明提供了一种如式ia所示的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物、立体异构体、互变异构体或前药，

其中，r1选自氢、c1-c3烷基、或c1-c3卤代烷基；

r2和r3分别独立地选自未被取代的c1-c3烷基、或r2和r3分别独立地选自被-oh、f、cl或br取代的c1-c3烷基；r2和r3也可相互连接成含有三到六个原子的环状结构；

r4选自被取代的或未被取代的环己基、羟基四氢呋喃基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、羟基苯基、吡啶基、或嘧啶基。

根据本发明的具体实施例，优选r1选自氢、或c1-c3烷基；

根据本发明的具体实施例，优选r2和r3分别独立地选自h,-ch3,-c2h5,-c3h7,-ch2oh,-c2h4oh,-c3h6oh,-chf2,-ch2f,-ch3cf3,-c3h6cl,-ch2-ch2-,-(ch2)3-,-(ch2)4-,-(ch2)5-,或-ch(ch3)2。

根据本发明的具体实施例，优选r4选自

由此，在本说明书通篇中，本领域技术人员可对式ia所示化合物中所述r1～r4的基团及其取代基进行选择，以提供本发明的实施例中所述的、稳定的式ia所示化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物、立体异构体、互变异构体或前药。

本领域技术人员可以理解，根据本领域中使用的惯例，在本申请的结构式中，用于描绘化学键，所述化学键为部分或取代基、核心结构或骨架结构相连的点。

根据本发明的实施例，本发明所述的式ia所示化合物，为如下任一化合物：

本发明所述式ia化合物可按照本领域常规的化学合成方法制备得到，其步骤和条件可参考本领域类似反应的步骤和条件。

本发明化合物可按照本领域技术人员熟知的标准技术来分离和纯化。在纯化化合物时一种特别有用的技术是制备型液相色谱，它采用质谱作为检测从色谱柱中流出的纯化合物的手段。

制备型lc-ms是用于纯化小的有机分子、如本文所述化合物的标准有效方法。可以改变液相色谱(lc)和质谱(ms)的方法，以使粗品更好地分离和提高ms对样品的检测。制备型梯度lc法的优化涉及改变柱子、挥发性洗脱剂及调节剂和梯度。这些方法在优化制备型lc-ms法领域中是众所周知的，采用它们来纯化化合物。这类方法在下述文献中有描述：rosentreteru，huberu.；optimalfractioncollectinginpreparativelc/ms；jcombchem.；2004；6(2)，159-64和leisterw，straussk，wisnoskid，zhaoz，lindsleyc.，developmentofacustomhigh-throughputpreparativeliquidchromatography/massspectrometerplatformforthepreparativepurificationandanalyticalanalysisofcompoundlibraries；jcombchem.；2003；5(3)；322-9。

本发明所述的各反应步骤所使用的反应溶剂没有特别限制，任何在一定程度上能溶解起始原料并且不抑制反应的溶剂均包含在本发明中。另外，本领域的许多类似改动，等同替换，或等同于本发明所描述的溶剂，溶剂组合，及溶剂组合的不同比例，均视为本发明的包含范围。

本发明所述式ia化合物可存在大量不同的几何异构和互变异构形式，对式ia化合物的称谓包括所有这类形式。为了避免有疑问，当化合物可以以多种几何异构或互变异构形式之一存在且仅具体描述或给出了其中一种时，所有其它形式仍然被式ia所涵盖。

当式ia化合物含有一个或多个手性中心并且可以存在两种或多种旋光异构体形式时，对式ia化合物的称谓包括其所有的旋光异构形式(例如对映异构体、差向异构体和非对映异构体)，其为单一旋光异构体或者两种或多种旋光异构体的混合物(如外消旋混合物)，上下文另有要求除外。

旋光异构体可以通过它们的旋光活性来表征和鉴定(即+和-异构体，或者d和l异构体)，或者它们可采用cahn、ingold和prelog开发的“r与s”命名法根据它们的绝对立体化学来表征，参见advancedorganicchemistry，jerrymarch，第4版，johnwiley&sons，纽约，1992，第109-114页，另见cahn，ingold&prelog，angew.chem.int.ed.engl.，1966，5，385-415。旋光异构体可以通过大量技术分离，包括手性色谱法(在手性载体上的色谱法)，这类技术是本领域技术人员所熟知的。

当式ia化合物存在两种或多种旋光异构形式时，一对对映异构体中的一种对映异构体可表现优于另一种对映异构体的优点，例如就生物活性而言。因而在某些情形下，可能需要仅使用一对对映异构体中的一种或者大量非对映异构体中的一种作为治疗剂。因此，本发明提供了含有具有一个或多个手性中心的式ia化合物的组合物，其中至少55％(例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)的式ia化合物作为单一旋光异构体(例如对映异构体或非对映异构体)存在。在一个一般实施方案中，占式ia化合物总量99％或以上(例如基本上全部)的式ia化合物可作为单一旋光异构体(例如对映异构体或非对映异构体)存在。

药物制剂：

本发明还提供了一种药物组合物，其包括所述式ia化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物、立体异构体、互变异构体或前药，和药用辅料。

虽然本发明所述式ia化合物可能单独施用活性化合物，但是优选作为药物组合物(例如制剂)的形式给出，所述组合物包含至少一种本发明的活性化合物和一种或多种可药用载体、助剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或者本领域技术人员熟知的其它材料以及任选的其它治疗或预防剂。因而，本发明还提供了如上所定义的药物组合物和制备药物组合物的方法，该方法包括将至少一种如上所定义的活性化合物与一种或多种可药用载体、赋形剂、缓冲剂、助剂、稳定剂或如本文所述的其它材料混和。

在所述的药物组合物中，所述式ia化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物、立体异构体、互变异构体或前药的用量，可为治疗有效量。

所述的药用辅料可为药物生产领域中广泛采用的那些辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物，还可以提供方法，使受试者接受给药后活性成分以所期望速率溶出，或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体ph值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可以包括下列辅料中的一种或多种：粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂、填充剂、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。

本发明的药物组合物可根据公开的内容使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋或冻干工艺。

本发明所述的药物组合物可以任何形式给药，包括注射(静脉内)、粘膜、口服(固体和液体制剂)、吸入、眼部、直肠、局部或胃肠外(输注、注射、植入、皮下、静脉内、动脉内、肌内)给药。本发明的药物组合物还可以是控释或延迟释放剂型(例如脂质体或微球)。固体口服制剂的实例包括但不限于粉末、胶囊、囊片、软胶囊剂和片剂。口服或粘膜给药的液体制剂实例包括但不限于悬浮液、乳液、酏剂和溶液。局部用制剂的实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药的制剂实例包括但不限于注射用溶液、可以溶解或悬浮在药学上可接受载体中的干制剂、注射用悬浮液和注射用乳剂。所述的药物组合物的其它合适制剂的实例包括但不限于滴眼液和其他眼科制剂；气雾剂：如鼻腔喷雾剂或吸入剂；适于胃肠外给药的液体剂型；栓剂以及锭剂。

优选口服施用本发明化合物。还优选静脉内施用本发明化合物。取决于情况，可以应用或甚至优选其它施用途经。例如，对于健忘或对口服药物易发怒的患者，经皮施用可能非常需要。在特别的情况下，本发明化合物还可以通过透皮、肌内、鼻内或直肠内途径施用。施用途经可以以任何方式变化，其受药物的物理性质、患者和看护者的便利以及其它相关情况的限制(remington’spharmaceuticalsciences(雷明顿药物学)，第18版，mackpublishingco.(1990))。

生物活性：

本发明式ia所述化合物是cdk的抑制剂。优选的化合物是抑制一种或多种cdk激酶的化合物，所述激酶选自cdk1、cdk2、cdk4、cdk6，例如cdk4和/或cdk6。

作为它们调节或抑制cdk激酶的活性的结果，预期它们可用于提供对异常分化细胞的细胞周期阻止性或恢复性控制的手段。因此，可以预见，这些化合物将证实可用于治疗或预防增殖紊乱，例如癌症。

cdk在细胞周期、细胞凋亡、转录、分化和cns功能的调节中起作用。因此，cdk抑制剂可用于治疗其中存在增殖、细胞凋亡或分化紊乱的疾病，例如癌症。具体而言，rb+ve肿瘤对cdk抑制剂特别敏感。rb-ve肿瘤同样对cdk抑制剂敏感。

可被抑制的癌症实例包括但不限于癌，例如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌(例如结肠直肠癌，例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、肾癌、表皮癌，肝癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌(例如外分泌性胰腺癌)、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌或皮肤癌(例如鳞状细胞癌)；淋巴谱系造血肿瘤，例如白血病、急性淋巴细胞性白血病、b-细胞淋巴瘤、t-细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、burkett氏淋巴瘤、骨髓谱系造血肿瘤、急性与慢性髓性白血病、急性与慢性粒细胞白血病、脊髓发育不良综合征、前髓细胞性白血病、甲状腺滤泡癌、间质来源肿瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、中枢或外周神经系统肿瘤、星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、神经鞘瘤、黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮病、keratoctanthoma、甲状腺滤泡癌、或者卡波西肉瘤。

癌症可以是对任意一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制敏感的癌症，所述激酶选自cdk1、cdk2、cdk4、和cdk6，例如一种或多种选自cdk1、cdk2、cdk4和cdk6，例如cdk4和/或cdk6。

本发明的化合物作为cdk抑制剂的活性可以利用下文实施例中所述的测定法来测量，给定化合物所表现的活性水平可通过ic50值来限定。

本发明还提供了所述式ia化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物、立体异构体、互变异构体或前药，在制备cdk4/6抑制剂中的应用。

所述的cdk4/6抑制剂可用于生物体内；也可用于生物体外，主要作为实验用途，例如：作为标准样或对照样提供比对，或按照本领域常规方法制成试剂盒，为cdk4/6的抑制效果提供快速检测。

本发明还提供了所述式ia化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物、立体异构体、互变异构体或前药，在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。

除非另有规定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有要求保护主题所属领域的标准含义。倘若对于某术语存在多个定义，则以本文定义为准。当参考url或其他标识或地址，应该理解这样的标识符可以改变，互联网上的特定信息可以发生变化，但通过搜索互联网可以找到同等的信息。所述参考证明了此类信息可获得并且公开传播。

应该理解，上述的一般性说明和下面的详细说明仅是举例说明，对本发明并不受此限制。在本发明中使用的单数形式，如“一种”或“一个”，包括复数指代，除非另有规定。此外，术语“包括”是开放性限定并非封闭式。

除非另有说明，本发明采用质谱、nmr、hplc、蛋白化学、生物化学、重组dna技术或药理检测的传统方法，各步骤和条件可参照本领域常规的操作步骤和条件。除非另有指明，本发明采用分析化学、有机合成化学和医药化学的标准命名及标准实验室步骤和技术。在某些情况下，标准技术被用于化学合成、化学分析、药物制备、配方和药物递送以及患者的治疗。

在本发明中所使用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氢根、磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐(参见bergeetal.,“pharmaceuticalsalts”,journalofpharmaceuticalscience66:1-19(1977))。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。

本发明所用的“药学上可接受的盐”属于本发明化合物的衍生物，其中，通过与酸成盐或与碱成盐的方式修饰所述母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：碱基比如胺的无机酸或有机酸盐、酸根比如羧酸的碱金属或有机盐等等。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐或母体化合物的季铵盐，例如无毒的无机酸或有机酸所形成的盐。常规的无毒性的盐包括但不限于那些衍生自无机酸和有机酸的盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氢根、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸盐、羟萘、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁、酒石酸和对甲苯磺酸。

本发明的“药学上可接受的盐”可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。

除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。可在体内转化以提供生物活性物质(即式ia所示化合物)的任何化合物是在本发明的范围和主旨内的前药。例如，含有羧基的化合物可形成生理上可水解的酯，其通过在体内水解以得到式ia所示化合物本身而充当前药。所述前药优选口服给药，这是因为水解在许多情况下主要在消化酶的影响下发生。当酯本身具有活性或水解发生在血液中时，可使用肠胃外给药。此外，前体药物可以在体内环境中通过化学或生化方法被转换到本发明的化合物。

本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式或溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。本发明的某些化合物可以以多晶或无定形形式存在。

本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(³h)，碘-125(¹²⁵i)或c-14(¹⁴c)。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。

针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。

术语“活性成分”、“治疗剂”、“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。

术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

本发明所述的cdk抑制剂可以用作单剂，或与其他治疗剂联用，以增强这些治疗剂的效果。已经发现，某些细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂可以与其它抗癌剂组合使用。例如，细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂alvocidib已经与其它抗癌剂一起用在组合疗法中。

本发明所述的式ia所示化合物，其具有良好的溶解性，该化合物在肝微粒体和血浆中是稳定的，具有良好的药代动力学特性和良好的稳定性。相对于目前已上市的cdk4/6抑制剂palbociclib，本发明所述的化合物显示了更好的体内药效学特征，以及更高效低毒，具有更好的肿瘤治疗效果。

本发明所述的式ia所示化合物为新型cdk抑制剂提供了新的商业选择，可用于治疗和/或预防肿瘤和其他不受控制的细胞增殖疾病。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明所述的作为选择性cdk4/6抑制剂的新型化合物，其结构新颖，其具有更好的生物活性(其对cdk4的激酶活性的ic50均在16nm以内，其对cdk6的激酶活性的ic50均在18nm以内)。进一步通过测试表明本发明所述的化合物对cdk1和cdk2没有抑制活性，本发明所述的式ia-1～ia-6化合物对cdk4和cdk6均具有良好的激酶抑制活性，本发明制备得到的化合物，可有效地作为选择性cdk4/6抑制剂。

(2)相对于目前已上市的cdk4/6抑制剂palbociclib，本发明所述的化合物在人乳腺癌和白血病细胞系的体内药效学模型试验中，显示了更好的体内药效学特征，以及更高效低毒，具有更好的肿瘤治疗效果。

(3)本发明制备方便、生产成本较低。

附图说明

图1为本发明化合物对人乳腺癌细胞(mda-mb-231)体内药效学模型的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的实施例提供了式ia所示化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物、立体异构体、互变异构体或前药，制备式ι所示化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或前药的方法和中间体，药物组合物，以及本发明的化合物在制备药物中的用途。

实施例1化合物ia-1的制备

将叔戊醇(160毫升)加入第一反应器中，然后加入化合物ia-1a(22.9g，0.1mol)、化合物ia-1b(21.2g，0.1mol)、碳酸钾(41.5g，0.3mol)。在第一反应器中加入4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基占吨(1.3g)，加入氮气进行保护，然后搅拌第一反应器。将三(二亚苄基丙酮)二钯(1.0g)加入上述混合物中并加热至90℃至95℃。搅拌反应，并用hplc监测反应直至完成。将其冷却至室温，加入100毫升二氯甲烷，充分搅拌，过滤除去固体。将滤液用盐水洗涤三次。将合并的有机层用无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，通过硅胶色谱法纯化，得到式ia-1所示化合物(22.6g)，收率55.9％，hplc纯度98.9％。

m/z:405(m+h)⁺.

实施例2化合物ia-2的制备

化合物ia-2的制备方法，按照类似于实施例1的方式进行实验，化合物ia-2a(23.1g，0.1mol)和化合物ia-2b(24.0g，0.1mol)。通过硅胶色谱法纯化，得到式ia-2所示化合物(29.2g)，收率67.2％，hplc纯度99.3％。

m/z:435(m+h)⁺.

实施例3化合物ia-3的制备

化合物ia-3的制备方法，按照类似于实施例1的方式进行实验，化合物ia-3a(24.3g，0.1mol)和化合物ia-1b(21.1g，0.1mol)。通过硅胶色谱法纯化，得到式ia-3所示化合物(33.9g)，收率81.0％，hplc纯度97.7％。

m/z:419(m+h)⁺.

实施例4化合物ia-4的制备

化合物ia-4的制备方法，按照类似于实施例1的方式进行实验，化合物ia-4a(27.1g，0.1mol)和化合物ia-1b(21.1g，0.1mol)。通过硅胶色谱法纯化，得到式ia-4所示化合物(29.2g)，收率67.2％，hplc纯度99.3％。

m/z:447(m+h)⁺.

实施例5化合物ia-5的制备

化合物ia-5的制备方法，按照类似于实施例1的方式进行实验，化合物ia-5a(26.7g，0.1mol)和化合物ia-5b(19.9g，0.1mol)。通过硅胶色谱法纯化，得到式ia-5所示化合物(15.7g)，收率36.6％，hplc纯度97.0％。

m/z:430(m+h)⁺.

实施例6化合物ia-6的制备

化合物ia-6的制备方法，按照类似于实施例1的方式进行实验，化合物ia-6a(24.5g，0.1mol)和化合物ia-5b(19.9g，0.1mol)。通过硅胶色谱法纯化，得到式ia-6所示化合物(28.6g)，收率70.3％，hplc纯度98.2％。

m/z:408(m+h)⁺.

效果实施例1生物学测定——本发明化合物对cdk4的抑制分析

以下分析的结果证实本文列举的化合物用作特别的cdk4/6抑制剂以及用作抗癌药。本文所用的“ic50”表示产生活性剂可能的最大抑制响应的50％时的活性剂的浓度，并且“ec50”表示产生活性剂可能的最大响应的50％时的活性剂的浓度。

为了证实本发明包含的化合物显示出对cdk4激酶的亲和力，进行cdk4分析。功能分析提供了支持：本发明所述的式i所示化合物，均显示出良好的抑制cdk4激酶活性的能力。以下分析中所用的所有配体、放射标记、溶剂和试剂是易于从商业来源获得的，或者可以易于由本领域技术人员合成。

将10μl在20％dmso中的试验化合物、20μl腺苷5’-三磷酸(atp)和c-端视网膜母细胞瘤片段(ctrf)(upstatecat#12-439)溶液以及10μl酶溶液在96孔板中混合。atp和crtf溶液是由稀释在68mm4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)ph7.4、6.72mmmgcl2、6.72mm二硫苏糖醇(dtt)和0.013％triton^tmx-100的激酶缓冲液中的40μmatp、0.16μci[³³p]-atp和1μmctrf的混合物制备的。酶溶液是由稀释在上述激酶缓冲液中的8ngcdk4酶(proqinasecat#0142-0373-1)制备的。将试验化合物以1∶3系列稀释在20％dmso中，产生10个点的曲线，起始浓度为20μm。不添加试验化合物的单独20％dmso缓冲液用作对照，500mm乙二胺四乙酸(edta)用于测量不存在酶活性时背景³³p的水平。将试剂混合并且在20℃下温育90分钟。通过加入80μl10％(v/v)h3po4终止反应，并且将物质沉淀在玻璃纤维过滤器板(millipore，mafcn0b50)上。将孔用0.5％h3po4洗涤4次，并且用微孔板闪烁计数器(microbetatrilux，wallac)测量掺入的放射性。

高对照和低对照的中位值之间的差异被认为100％活性。应用activitybase^tm软件(idbs，alamedaca)获得的4参数逻辑曲线拟合用于产生ic50值。本发明所述的式ia-1～ia-6化合物，在上述分析中均显示出ic50＜16nm。具体见表1.

效果实施例2生物学测定——本发明化合物对cdk6的抑制分析

将10μl在20％dmso中的试验化合物、20μlatp和ctrf(upstatecat#12-439)溶液以及10μl酶溶液在96孔板中混合。制备atp和crtf溶液，得到稀释在68mmhepesph7.4、6.72mmmgcl2、2.64mmdtt和0.004％triton^tmx-100的激酶缓冲液中的终浓度为100μmatp、0.5μci[³³p]-atp和0.8μmctrf。制备酶溶液，获得稀释在cdk4抑制分析中的上述激酶缓冲液中的终浓度为1.7ng/μlcdk6酶(proqinasecat#7533)。将试验化合物以1：3系列稀释在20％dmso中，产生10个点的曲线，起始浓度为20μm。不添加试验化合物的单独20％dmso缓冲液用作对照，500mmedta用于测量不存在酶活性时背景³³p的水平。将试剂混合并且在20℃下温育90分钟。通过加入80μl10％(v/v)h3po4终止反应，将物质沉淀在玻璃纤维过滤器板(millipore，mafcn0b50)上。将孔用0.5％h3po4洗涤4次，并且用微孔板闪烁计数器(microbetatrilux，wallac)测量掺入的放射性。

数据是与cdk4相同的方式分析的。本发明所述的式ia-1～ia-6化合物，在上述分析中大部分化合物显示出其对cdk6的ic50＜18nm。具体见表1.

效果实施例3生物学测定——本发明化合物对cdk1的抑制分析

cdk1/细胞周期蛋白b激酶活性测定

将384孔微孔板map-fptm(moleculardevicestrademarktechnology)终点测定用于cdk1/细胞周期蛋白b激酶活性测定。相同的测定用于测定本发明所述的式ia-1～ia-6化合物的ic50。通常，激酶反应在20μl体积的含有以下组分的反应溶液中进行：2μl化合物(在20％dmso中)，8μlcdk1/细胞周期蛋白b在1x反应缓冲液中(moleculardevices)，在1x反应缓冲液中加入10μltamra组蛋白-h1底物混合物(moleculardevices)和atp，新鲜加入1mmdtt。最终的反应混合物含有0.005-10μm化合物(抑制剂)，2％dmso，0.25nmcdk1/细胞周期蛋白b，100nmtamra组蛋白-h1肽和20μmatp。所有反应均在室温下在黑色384孔平板costar板(corning)中进行120分钟，然后加入60μl400倍稀释的1x渐进结合缓冲液a(moleculardevices)以终止反应。在室温下孵育2小时后，在evisionmultilabel读数器上读取荧光偏振信号。

效果实施例4生物学测定——本发明化合物对cdk2的抑制分析

cdk2/细胞周期蛋白a激酶活性测定

在与cdk1/细胞周期蛋白b相同的条件下进行细胞周期蛋白a激酶活性。

效果实施例1-4的结果均显示在下表1中。

表1：

结果表明：本发明所述的式ia-1～ia-6化合物，在上述cdk4活性分析中均显示出了ic50＜16nm，其中式ia-1化合物、式ia-2化合物、式ia-5化合物、式ia-6化合物均显示出了ic50＜10nm。这证实本发明所述的化合物具有良好的cdk4激酶抑制活性，是有效的cdk4抑制剂。

本发明所述的式ia-1～ia-6化合物，在上述cdk6活性分析中大部分化合物显示出了ic50＜18nm，其中式ia-1化合物、式ia-2化合物、式ia-5化合物、式ia-6化合物均显示出了ic50＜18nm。这证实本发明所述的化合物具有良好的cdk6激酶抑制活性，是有效的cdk6抑制剂。

本发明所述的式ia-1～ia-6化合物，在上述cdk1和cdk2活性分析中均显示出了ic50＞10μm。这证实本发明所述的化合物对cdk1和cdk2没有抑制活性。本发明所述的式ia-1～ia-6化合物对cdk4和cdk6均具有良好的激酶抑制活性，而且本发明所述的化合物，其对cdk4和cdk6的激酶抑制活性优于对照品palbociclib。本发明制备得到的化合物，可有效地作为选择性cdk4/6抑制剂。

效果实施例5本发明化合物对人乳腺癌细胞(mda-mb-231)体内药效学模型的影响

将人乳腺癌细胞(mda-mb-231)(mda-mb-231细胞培养于l-15培养基，含10％胎牛血清fbs，在5％co2的37℃培养箱中进行培养。经传代生长至合适浓度且肿瘤细胞在对数生长期进行收集肿瘤细胞，计数重悬于l-15培养基，调整细胞悬液浓度至5×10⁷/ml(1:1withmatrigel)用于接种)。

mda-mb-231肿瘤细胞接种后21天，肿瘤平均体积为170mm^3左右，进行分组，每组10只动物。分组当天视为day0，分组当天进行给药。实验期间每周两次测定动物的体重和肿瘤大小，同时每天观察和记录动物的临床症状，每次给药均参考最近一次称量的动物体重。实验进行到28天，动物处以安乐死，动物处死后对荷瘤动物按组别进行拍照，然后收集肿瘤进行称重和记录肿瘤重量，最后对肿瘤按组别进行拍照。实验结束后的动物尸体与肿瘤样品进行无公害处理。

以时间点为x轴，肿瘤体积为y轴绘制肿瘤生长曲线；以时间点为x轴，动物体重为y轴绘制体重增长变化曲线。组间比较采用t-检验，p<0.05为显著性差异，p<0.01为极显著性差异。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增值率t/c(％)，t/c(％)>40％为无效，t/c(％)≤40％，并经统计学处理p<0.05为有效，t/c(％)的计算公式为：t/c(％)＝(trtv/crtv)×100％。trtv为治疗组的相对肿瘤体积，crtv为阴性对照组的相对肿瘤体积；tgi抑瘤率(％)＝(阴性对照组平均肿瘤体积或重量-给药组平均肿瘤体积或重量)/阴性对照组平均肿瘤体积或重量×100％。

本研究中，人乳腺癌mda-mb-231异种移植瘤雌性裸鼠各组分别用药后动物均能耐受，到第28天动物体重变化率(bwc％)分别为：6.6％、2.7％、-1.0％、-5.1％、-3.5％、和-2.6％，没发现与药物毒性相关的毒性死亡。

实验结果表明，相对于现有已上市的对照药cdk4/6抑制剂palbociclib，本发明实施例1、2、5、6所述的化合物在人乳腺癌mda-mb-231异种移植瘤模型中证实比palbociclib具有更优的抑瘤效果，更好的抗肿瘤活性，且均达到t/c％<40％有效的判定标准。具体见附图1.

另外，进行急性粒细胞白血病(aml)细胞(mv4-11)的体内药效学研究，其中mv4-11是在含有l-谷氨酰胺、25mmhepes、10％fbs的iscove’s修饰的dulbecco’s培养基中生长的。在amlmv4-11异种移植中，应用本发明实施例1、6所述的化合物，在剂量为100mg/kg(mpk)时观察到肿瘤消退，表明本发明实施例1、6所述的化合物具有良好的抗肿瘤活性，可用做人急性粒细胞白血病的治疗药物。

故而，本发明所述化合物可作为cdk4/6抑制剂，用于治疗由cdk引起的增殖性疾病。例如通过抑制cdk4/6激酶，本发明化合物可用于治疗和/或预防癌症疾病。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。