酰化GLP-1化合物及其修饰基团的合成的制作方法

本发明涉及一种酰化glp-1化合物及其修饰基团的合成，属于化学合成领域。
背景技术：
：索玛鲁肽(semaglutide)是诺和诺德(novonordisk)公司研发的一种可以每周一次皮下注射的长效glp-1类似物。从结构上看，索玛鲁肽是glp-1(7-37)链上8位的aib取代了ala，34为的arg取代了lys，26位的lys接上十八烷酸脂肪链。与利拉鲁肽相比，索玛鲁肽的脂肪链更长，疏水性增加。通过短链的聚乙二醇(peg)修饰，大大增强了索玛鲁肽的亲水性。peg修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖dpp-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长循环的效果。peg是最常用的一种修饰剂，无毒、无致畸性、无免疫原性、具有非常好的水溶性和生物相容性，且生物相容性已获fda认可。根据报道，单用索玛鲁肽没有发生严重的低血糖，低血糖发生率跟安慰剂相当，与磺脲类药物或胰岛素合用时低血糖风险会增加，可能需要降低磺脲类药物或胰岛素的剂量。此外，索玛鲁肽与利拉鲁肽类似，在心血管方面也有获益，通过两年治疗，跟安慰剂组相比，心血管高风险2型糖尿病患者主要不良心血管事件减少了26％。目前已报道的索玛鲁肽的制备方法大致可以分为三种：第一种为片段法合成索玛鲁肽。该方法浪费原料，所得反应中间体的需要纯化，并且建立一定的质量标准，由于步骤增多、纯化和检测繁琐等原因，导致最终合成成本增加；第二种为将修饰后的赖氨酸接入索玛鲁肽主链，该方法缺陷在于反应不完全、活性差、生产成本高，需多步纯化等；第三种为完成索玛鲁肽主链合成后进一步完成侧链修饰，该方法很容易产生消旋的组氨酸，作为索玛鲁肽末端结构的组氨酸在后期多步侧链缩合过程中不断消旋，导致最终产品中消旋杂质越来越多，不利于放大和工业生产。因此，现在急需一种操作简便，能够高纯度、高收率、合成成本低的索玛鲁肽及其侧链的合成方法。技术实现要素：本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种酰化glp-1化合物及其修饰基团的合成，通过控制ph值酰化glp-1(9-37)进行制备索玛鲁肽的合成方法，以解决现有技术中存在的问题。一种酰化glp-1化合物及其修饰基团的合成，包括如下步骤：(1)制备化合物2：将glp-1(9-37)为起始原料，用化合物1在相对序列glp-1(9-37)的位置26的lys上进行peg化修饰，并控制反应ph，进行酰化偶联反应得到化合物2；(2)制备化合物4：以化合物2为起始原料，用化合物3进行glp-1(9-37)端位氨基的修饰，并与反应缩合剂、碱进行液相酰化偶联反应得到化合物4；(3)制备semaglutide：以化合物4为起始原料，进行脱保护到最终的索玛鲁肽；作为本发明的一种改进，所述化合物1的合成方法包括以下步骤：以2-氯三苯基氯树脂、fmoc-aeea-oh以及碱为起始原料，进行偶联和脱保护；再与fmoc-aeea-oh进行偶联和脱保护；再与fmoc-glu(oh)-otbu进行偶联和脱保护；最后与十八烷二酸单叔丁酯进行偶联至固相合成结束；用对2-氯三苯基氯树脂进行裂解得到化合物5，将化合物5进行活化得到化合物6，然后水解酯得到修饰glp-1(9-37)的位置26的脂肪酸链，即可得到化合物1，作为本发明的一种改进，所述化合物3的合成方法包括以下步骤：以保护过的his和aib以及碱的酯为起始原料，进行液相偶联，然后水解酯得到修饰glp-1(9-37)端位氨基的寡肽，即可得到化合物3，作为本发明的一种改进，所述步骤(1)中反应的ph值为7-13。作为本发明的一种改进，所述步骤(1)中控制ph值所用的试剂为三乙胺/水体系、n，n’-二异丙基乙胺/水体系、磷酸/三乙胺/水体系、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠水体系或磷酸氢二钾/磷酸二氢钾水体系。作为本发明的一种改进，所述偶联试剂为dcc、edci、cdi、hatu、hbtu、tbtu、pybop、dic、dcc/hobt、edci/hobt或dic/hobt。作为本发明的一种改进，所述碱为有机碱或无机碱，所述有机碱为三乙胺、n，n’-二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、4-二甲氨基吡啶、2，6-二甲吡啶、四甲基乙二胺、1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯、吡啶、哌啶、苯胺或三异丙胺；所述无机碱为碳酸钾、甲醇钠、氢氧化钠、氢氧化锂、碳酸铯、氢氧化钾、叔丁醇钾、氢化钠或氟化钾。作为本发明的一种改进，所述脱保护试剂为三氟乙酸、三氟乙醇、苯甲硫醚、苯甲醚、苯酚、1，2-乙二硫醇、水以及三异丙基硅烷中任意一种及以上的组合。作为本发明的一种改进，所述水解酯为三氟乙酸、盐酸、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾或叔丁醇钾。作为本发明的一种改进，所述反应温度为-10℃-50℃。本发明提供了通过控制ph值酰化glp-1(9-37)进行制备索玛鲁肽的合成方法。本发明以glp-1(9-37)为起始原料，用化合物1进行修饰26位lys，并控制反应ph值进行酰化偶联反应，大大提高了合成效率，降低了反应副产物。本发明还以化合物1修饰过的glp-1(9-37)为起始原料，用化合物3进行端位氨基的修饰，通过控制反应碱的用量进行液相酰化偶联反应，然后再进行脱保护得到最终的索玛鲁肽。该操作过程简便，副反应减少，大大降低了氨基酸化合物发生消旋的风险，具有广泛的应用前景，便于用于大规模生产。本发明所用术语氨基酸和等同表达是指通常在天然存在的蛋白质中发现的l-氨基酸以及部分非天然氨基酸。天然氨基酸的实例包括但不限于丙氨酸(ala)，半胱氨酸(cys)，天冬氨酸(asp)，谷氨酸(glu)，苯丙氨酸(phe)，甘氨酸(gly)，组氨酸(his)，异亮氨酸(ile)，赖氨酸(lys)，亮氨酸(leu)，甲硫氨酸(met)，天冬酰胺(asn)，脯氨酸(pro)，谷氨酰胺(gln)，精氨酸(arg)，丝氨酸(ser)，苏氨酸(thr)，色氨酸(trp)，酪氨酸(tyr)，缬氨酸(val)。非天然氨基酸的实例包括但不限于2-氨基异丁酸(aib)等。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现，包括如下步骤：步骤1：取fmoc-aeea-oh采用固相合成法与2-氯三苯基氯树脂，获得aeea-树脂，采用顺序偶联的方法合成化合物5，再进行脱保护偶联直至固相合成结束，然后进行裂解、纯化。步骤2：取步骤1制得的化合物5进行活化得到化合物6然后水解得到修饰glp-1(9-37)的位置26的脂肪酸链----化合物1。步骤3：取步骤2制得的化合物1对glp-1(9-37)进行26位lys的修饰，并控制反应ph值，进行酰化偶联反应得到化合物2。步骤4：取保护过的his和aib的酯为起始原料，进行液相偶联，重结晶得到二肽的酯。步骤5：取步骤4制得的二肽的酯进行水解，得到修饰glp-1(9-37)端位氨基的寡肽----化合物3。步骤6：取步骤3制得的化合物2与步骤5制得的化合物3，通过控制反应缩合剂的选择及其碱的用量进行液相酰化偶联反应得到化合物4。步骤7：取步骤6制得的化合物4，进行脱保护得到最终的索玛鲁肽。缩写及英文对应的含义见表1。表1：缩写及英文对应的含义dcc二环己基碳二亚胺edci1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺cdin，n’-羰基二咪唑hatu0-(7-氮杂苯并三氮唑-1-氧)-n，n，n′，n′-四甲基脲六氟磷酸酯hbtu2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯tbtu0-苯并三氮唑-n，n，n’，n’-四甲基脲四氟硼酸pybop六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基dicn，n’-二异丙基碳二亚胺hobt1-羟基苯并三唑boc叔丁氧羰基trt三苯甲基fmoc9-芴甲氧羰基nsc2-(4-硝基苯磺酰基)乙氧羰基dden-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环亚己基)乙基bsmoc1，1-二氧苯基(邻)2-噻吩甲氧羰基mspoc2-(甲磺酰基)-3-苯基-2-丙烯氧羰基poc环戊烷氧羰基tcp3，5，6-三氯吡啶-2-醇mmt4-甲氧基三苯甲基mtt4-甲基三苯甲基alloc烯丙氧羰基dipean，n-二异丙基乙胺edt1，2-乙二硫醇tis三异丙基硅烷tfa三氟乙酸phsme苯甲基硫醚phome苯甲醚dmfn，n-二甲基甲酰胺nmpn-甲基吡咯烷酮dcm二氯甲烷mtbe甲基叔丁基醚附图说明图1是修饰glp-1(9-37)的位置26的脂肪酸链(化合物1)的合成路线；图2是修饰glp-1(9-37)端位氨基的寡肽(化合物3)的合成路线；图3是以dipea为碱制备化合物2过程的检测结果；图4是化合物2的ms谱图；图5是实施例6至12酰化glp-1(9-37)第26位lys过程的液相检测图谱；图6是edci/hobt为缩合剂制备boc-his(trt)-aib-ome的检测结果；图7是hatu为缩合剂制备boc-his(trt)-aib-ome的检测结果；图8是boc-his(trt)-aib-ome的ms检测结果；图9是boc-his(trt)-aib-oh的检测结果；图10是n-羟基丁二酰亚胺活化化合物3制备化合物4的液相图谱；图11是对硝基苯酚活化化合物3制备化合物4的液相图谱；图12是pybop活化化合物3制备化合物4的液相图谱；图13是pybop活化化合物3制备化合物4的反应混合物ms；图14是hatu活化化合物3制备化合物4的液相图谱；图15是tfa/phsme/phome/edt裂解合成索玛鲁肽的液相图谱；图16是索玛鲁肽的ms图谱；图17是tfa/tis/h2o裂解合成索玛鲁肽的液相图谱。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。实施例1化合物5的合成：称取15.97g的2-氯三苯基氯树脂(sub＝0.939mmol/g)，加至固相合成柱中，使用fmoc-aeea-oh(1.5eq)，dipea(4.5eq)，溶剂dcm，反应1.5h获得fmoc-aeea-树脂，合成后使用20％哌啶/dmf脱保护，时间：5+15min；缩合第二aeea时，使用2-氯三苯基氯树脂/fmoc-aeea-oh/hatu/dipea的摩尔比为1∶2∶2∶2.4的反应体系，反应1.5h获得fmoc-aeea-aeea-树脂，合成后使用20％哌啶/dmf脱保护，脱保护时间为：5+15min；缩合γ-glu时，使用2-氯三苯基氯树脂/fmoc-glu(oh)-otbu/hatu/dipea的摩尔比为1∶2∶2∶2.4的反应体系，反应1.5h获得fmoc-γ-glu-aeea-aeea-树脂，合成后使用20％哌啶/dmf脱保护，脱保护时间为：5+15min；缩合十八烷二酸单叔丁酯时，使用2-氯三苯基氯树脂/十八烷二酸单叔丁酯/hatu/dipea的摩尔比为1∶1.3∶1.3∶1.56的反应体系，反应1.5h获得26.63goctadecanedioicacidmono-t-butylester-γ-glu-aeea-aeea-树脂，合成收率：96.1％。配制三氟乙醇/dcm＝1∶4的裂解液(266ml)，室温裂解2h，过滤，滤液旋干，得到棕色油状物10.85g，裂解收率：97.7％。实施例2化合物6的合成：称取13.96g化合物5(1.0eq)和2.28gn-羟基丁二酰亚胺(1.2eq)，加入250ml二氯甲烷搅拌溶解，冰浴下滴加4.09gdcc(1.2eq)的60mldcm溶液，滴毕，移至室温搅拌反应。反应15h后，过滤，滤液旋干，得无色透明油状物，加入430ml乙腈搅拌，有少量白色固体析出，过滤，滤液旋干得无色油状物化合物6为16.50g，收率：100％。实施例3化合物1的合成：将83mltfa加入53mldcm中混匀，并且冷却至3-5摄氏度，冰浴下下加至16.50g化合物6的粗产品中，之后转移至室温下搅拌反应1.5h后，旋干，加入甲苯旋蒸(100ml*3)，得棕色油状物。冰浴下加入300ml乙醚搅拌打浆，析出大量白色固体，离心，再加入乙醚洗涤(400ml*3)，干燥得13.96g白色固体化合物1，收率：100％。实施例4glp-1(9-37)进行26位lys的修饰(dipea水溶液)：将dipea加入水中，调节ph＝11.5，然后在冰水浴中将31.8mgglp-1(9-37)加入6ml的此溶液中，之后将24.9mg化合物1的dmf溶液(0.25ml)逐滴滴入反应液中，在冰水浴中反应1小时后，液相图谱显示原料glp-1(9-37)含量：1.87％，目标产物含量：67.5％，端位和26位都被化合物1修饰的副产物含量：5.42％，如图3所示。目标产物的ms如图4所示。实施例5glp-1(9-37)进行26位lys的修饰(三乙胺水溶液)：按照实施例4进行glp-1(9-37)第26位lys的修饰，由三乙胺取代dipea，ph＝12.0，进行酰化偶联反应得到化合物2。实施例6glp-1(9-37)进行26位lys的修饰(ph＝7)：按照实施例4进行glp-1(9-37)第26位lys的修饰，由磷酸/三乙胺水溶液(ph＝7)取代dipea水溶液，进行酰化偶联反应得到化合物2。实施例7glp-1(9-37)进行26位lys的修饰(ph＝8.5)：按照实施例4进行glp-1(9-37)第26位lys的修饰，由磷酸/三乙胺水溶液(ph＝8.5)取代dipea水溶液，进行酰化偶联反应得到化合物2。实施例8glp-1(9-37)进行26位lys的修饰(ph＝9.5)：按照实施例4进行glp-1(9-37)第26位lys的修饰，由磷酸/三乙胺水溶液(ph＝9.5)取代dipea水溶液，进行酰化偶联反应得到化合物2。实施例9glp-1(9-37)进行26位lys的修饰(ph＝10)：按照实施例4进行glp-1(9-37)第26位lys的修饰，由磷酸/三乙胺水溶液(ph＝10)取代dipea水溶液，进行酰化偶联反应得到化合物2。实施例10：glp-1(9-37)进行26位lys的修饰(ph＝10.5)：按照实施例4进行glp-1(9-37)第26位lys的修饰，由磷酸/三乙胺水溶液(ph＝10.5)取代dipea水溶液，进行酰化偶联反应得到化合物2。实施例11glp-1(9-37)进行26位lys的修饰(ph＝11)：按照实施例4进行glp-1(9-37)第26位lys的修饰，由磷酸/三乙胺水溶液(ph＝11)取代dipea水溶液，进行酰化偶联反应得到化合物2。实施例12glp-1(9-37)进行26位lys的修饰(ph＝11.5)：按照实施例4进行glp-1(9-37)第26位lys的修饰，由磷酸/三乙胺水溶液(ph＝11.5)取代dipea水溶液，进行酰化偶联反应得到化合物2。实施例6至12酰化glp-1(9-37)第26位lys过程的液相检测图谱显示ph值越小，优先进行端位氨基的修饰，如图5所示。实施例13edci/hobt为缩合剂进行boc-his(trt)-aib-ome的合成：boc-his(trt)-oh(2487.9mg，5mmol，1.0eq.)，edci(854mg，5.5mmol，1.1eq.)和hobt(743mg，5.5mmol，1.1eq.)加入50ml的二氯甲烷中，并且搅拌15分钟，h2n-aib-ome的盐酸盐(768mg，5mmol，1eq.)和dipea(2.8ml，2197.1mg，17mmol，3.4eq.)加入到反应混合液中，并在室温搅拌16h.反应进程由tlc板进行监测(ea/pe＝1∶1，rf＝0.29，由磷钼酸显色)。有新化合物产生并且反应原料消耗了。加入水进行萃取(50ml*2)，然后饱和食盐水(50ml)进行萃取，有机相干燥后进行旋干，用二氯甲烷/正庚烷重结晶得到白色固体boc-his(trt)-aib-ome(2.743g，y：91.9％)，液相图谱显示主峰含量：99.44％，如图6所示。实施例14hatu为缩合剂进行boc-his(trt)-aib-ome的合成：boc-his(trt)-oh(2487.9mg，5mmol，1.0eq.)，hatu(2091.3mg，5.5mmol，1.1eq.)加入50ml的二氯甲烷中，并且搅拌15分钟，h2n-aib-ome的盐酸盐(768mg，5mmol，1eq.)和dipea(2.8ml，2197.1mg，17mmol，3.4eq.)加入到反应混合液中，并在室温搅拌16h.反应进程由tlc板进行监测(ea/pe＝1∶1，rf＝0.29，由磷钼酸显色)。有新化合物产生并且反应原料消耗了。加入水进行萃取(50ml*2)，然后饱和食盐水(50ml)进行萃取，有机相干燥后进行旋干，用二氯甲烷/正庚烷重结晶得到白色固体boc-his(trt)-aib-ome(2.895g，y97.0％)，液相图谱显示主峰含量：96.83％，如图7所示。ms图谱显示正确的分子量，如图8所示。实施例15boc-his(trt)-aib-oh的合成：将boc-his(trt)-aib-ome(27.7g)溶解于meoh/h2o(875ml，4∶1)，然后再将lioh.h2o(5.843g)加入到该反应液中，并在室温搅拌16h.反应进程由tlc板进行监测，由磷钼酸显色，反应原料完全消耗。将甲醇旋蒸后，在低温下用1n盐酸调节ph＝4-5，过滤得白色固体boc-his(trt)-aib-oh(25g，y：92.4％)，液相图谱显示主峰含量：99.3％，如图9所示。实施例16glp-1(9-37)进行端位氨基的修饰：将boc-his(trt)-aib-oh(1.89g，3.25mmol，1.0eq.)和n-羟基丁二酰亚胺(0.56g，4.88mmol，1.5eq.)溶解于dcm(20ml)。然后将dcc(1.00g，4.88mmol，1.5eq.)的二氯甲烷(10ml)溶液，滴加至反应液中。反应16小时后，将白色固体过滤掉，滤液旋蒸至干，再用乙腈(30ml)打浆，将白色固体过滤掉，滤液再次旋蒸至干，粗产品直接用于下一步反应。将4.2mg上述粗产品与7.8mg化合物2溶解于dmf(0.64ml)中，12uldipea加入到此混合物中，并室温搅拌过夜，得到目标产物化合物4，反应监测液相图谱如图10所示。实施例17glp-1(9-37)进行端位氨基的修饰：将boc-his(trt)-aib-oh(1.89g，3.25mmol，1.0eq.)和对硝基苯酚(0.68g，4.88mmol，1.5eq.)溶解于dcm(20ml)。然后将dcc(1.00g，4.88mmol，1.5eq.)的二氯甲烷(10ml)溶液，滴加至反应液中。反应16小时后，将白色固体过滤掉，滤液旋蒸至干，再用乙腈(30ml)打浆，将白色固体过滤掉，滤液再次旋蒸至干，粗产品直接用于下一步反应。将4.2mg上述粗产品与7.8mg化合物2溶解于dmf(0.64ml)中，12uldipea加入到此混合物中，并室温搅拌过夜，得到目标产物化合物4，反应监测液相图谱如图11所示。实施例18glp-1(9-37)进行端位氨基的修饰：将1.8mgboc-his(trt)-aib-oh和1.6mgpybop溶解于dmf(0.64ml)，之后加入4.5uldipea，并室温反应1小时后，加入7.8mg化合物2，并室温搅拌过夜，得到目标产物化合物4，反应监测液相图谱如图12所示，反应混合物的ms如图13所示，主ms为目标产物化合物4，含有少量副产物来源于端位氨基也被化合物1修饰了的副产物。实施例19glp-1(9-37)进行端位氨基的修饰：将1.8mgboc-his(trt)-aib-oh和1.2mghatu溶解于dmf(0.64ml)，之后加入4.5uldipea，并室温反应1小时后，加入7.8mg化合物2，并室温搅拌过夜，得到目标产物化合物4，反应监测液相图谱如图14所示。实施例20glp-1(9-37)进行端位氨基的修饰：按照实施例17进行glp-1(9-37)端位氨基的修饰，由nmp取代dmf。实施例21glp-1(9-37)进行端位氨基的修饰：按照实施例18进行glp-1(9-37)端位氨基的修饰，由nmp取代dmf。实施例22：索玛鲁肽的合成：将8mg约70％的纯度的化合物4在低温下中加入到新鲜配置的90ul裂解液(tfa/phsme/phome/edt＝90∶5∶2∶3)中。并室温反应1.5小时后，加入5ml乙醚，析出白色固体，离心，再加入乙醚洗涤(5ml*3)，干燥得到5mg没索玛鲁肽(纯度82.3％)，液相图谱如图15所示。索玛鲁肽的ms图谱如图16所示。实施例23：索玛鲁肽的合成：将80.2mg约70％的纯度的化合物4在低温下中加入到新鲜配置的1ml裂解液(tfa/tis/h2o＝92∶5∶3)中。并室温反应2小时后，加入20ml乙醚，析出白色固体，离心，再加入mtbe洗涤(20ml*2)，之后用乙酸乙酯洗涤(20ml*2)，干燥得到46mg索玛鲁肽(纯度97.2％)，液相图谱如图17所示。上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。当前第1页12