一种猪伪狂犬病病毒检测试剂盒的制作方法

本实用新型属于生物技术领域，涉及一种病毒的快速检测器具，具体是猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的检测试剂盒。

背景技术：

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒 (Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一种重要的传染病。到目前为止，该病的发生已给世界上许多国家和地区的经济发展带来了巨大的损失，我国已有20多个省市报道了该病的发生，给我国的养猪业造成了极大的威胁。快速的临床诊断是防治猪伪狂犬病的一项重要措施。目前对PRV的各种诊断方法均有其优缺点，有的程序太复杂，有的耗时太长，无法达到到实验室检测准确、迅速的要求，在发生急性动物疫情或混合性感染、隐性感染时往往不能获得满意的检测效果，无法满足猪场的需要。基于PRV的序列应用PC R方法检测伪狂犬病由于操作简单，容易为基层畜牧防疫工作人员掌握，已经成为PRV检测的首选方法而具有重要的推广前景。现有技术中如需对PRV进行准确的检测，需使用多种药剂，得到多组检测结果，需使用多个试剂容器分装，携带和储存都不方便。同时现有技术中的检测试剂盒内各试剂的盛放装置排布杂乱，不能满足高效检测的要求。因此研制开发以gG和gE基因设计的猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒为遗传手段快速判断畜牧场所的猪疫病流行情况提供了重要的检测工具，可以实现有效、灵敏、快捷、简便的检测伪狂犬病毒 PRV，对PR的有效预防和控制具有重要意义。基于此，有必要提供一种能够快速检测出待测样本中是否含有PRV的伪狂犬病毒检测试剂盒。有鉴于此，特提出本实用新型。

技术实现要素：

本实用新型的目的是为了解决目前缺乏检测PRV的有效器具的问题，而提供一基于PRV的gG和gE基因设计的猪伪狂犬病病毒 PCR检测试剂盒，可快速、方便有效地检测出大规模猪饲养场所中的猪受试者是否感染PRV。

本实用新型实现上述目的的技术方案是:

一种猪伪狂犬病病毒(PRV)检测试剂盒，其特征在于，包括：盒体；与所述盒体转动连接的盒盖；设置在所述盒体内的软性衬垫体，所述软性衬垫体远离所述盒体底部的一侧设有第一凹槽区、第二凹槽区、第三凹槽区和第四凹槽区，所述第一凹槽区、第二凹槽区、第三凹槽区分别为预分装PCR反应液区、RT-PCR酶区和质控品区，所述第四凹槽区用于使用所述猪伪狂犬病毒(PRV) 检测试剂盒进行诊断检测时配制反应体系操作。

在一些实施方式中所述第一凹槽区、第二凹槽区、第三凹槽区放射状分布在第四凹槽区的圆周，

在一些实施方式中所述第一凹槽区、第二凹槽区、第三凹槽区和第四凹槽区呈一字型排列

在一些实施方式中，所述第二凹槽区、第三凹槽区大小相同，所述第一凹槽区的直径与所述第二凹槽区的直径的比例为2：1～3：1，或所述第一凹槽区的直径与所述第二凹槽区的直径的比例为2：1，。

在一些实施方式中，所述第一凹槽区分为凹槽A,B、C和D，所述凹槽A,B、C和D分别用于安放猪伪狂犬病毒正向引物、猪伪狂犬病毒反向引物、TaqMan探针以及dNTPs试剂瓶，所述第二凹槽区分为凹槽E和F,所述凹槽E和F用于安放承载M-MLV逆转录酶和热启动 Taq DNA聚合酶的试剂瓶，所述第三凹槽区分为凹槽G和H，，所述凹槽G和H用于安放承载阳性指控品和承载阴性指控品的试剂瓶。

在一些实施方式中，所述软性衬垫体为泡沫板

在一些实施方式中，所述第一凹槽区内为圆柱状凹槽、椭圆柱状凹槽或长方体柱状凹槽；所述第二凹槽区内为圆柱状凹槽、椭圆柱状凹槽或长方体柱状凹槽；所述第三凹槽内为圆柱状凹槽、椭圆柱状凹槽或长方体柱状凹槽。

在一实施例中，所述第一凹槽区、所述第二凹槽区、所述第三凹槽区内均为圆柱状凹槽.

在一实施例中所述凹槽G安放用于承载DEPC水的试剂瓶。

这种猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的检测试剂盒检测操作简单、实用性强，能够快速检测出待测样本中是否含有猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的检测试剂盒。

附图说明

图1.本申请实施例的猪伪狂犬病毒(PRV)检测试剂盒侧视图、

图2本申请实施例的猪伪狂犬病毒(PRV)检测试剂盒开盖示意图

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对猪伪狂犬病病毒检测试剂盒及其制备方法作进一步详细的说明。

如图1所示的猪伪狂犬病病毒检测试剂盒，包括：盒体10、盒盖20、软性垫板30、软性垫板30远离盒体10底部的一侧设有第一凹槽区4、第二凹槽区5、第三凹槽区6以及第四凹槽区7，分别为预分装PCR 反应液区、RT-PCR酶区和质控品区，第四凹槽区7用于使用所述人猪伪狂犬病毒(PRV)检测试剂盒进行诊断检测时配制反应体系操作。

第一凹槽区、第二凹槽区、第三凹槽区放射状分布在第四凹槽区的圆周，

盒体10为长方体、正方体或圆柱体。盒体10与盒盖20转动连接。

盒盖20包括主体22和侧板24，主体22与盒体10转动连接，侧板24与主体22转动连接。

软性垫板30设置在盒体10内。

优选的，软性衬垫板30为泡沫板、软性塑料板或橡胶板。

所述第一凹槽区分为凹槽A,B、C和D，所述凹槽A,B、C和D分别用于安放猪伪狂犬病毒正向引物、猪伪狂犬病毒反向引物、TaqMa n探针以及dNTPs试剂瓶，所述第二凹槽区分为凹槽E和F,所述凹槽 E和F用于安放承载M-MLV逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶的试剂瓶，所述第三凹槽区分为凹槽G和H，，所述凹槽G和H用于安放承载阳性指控品和承载阴性指控品的试剂瓶与第三凹槽36相匹配，第四试剂管与第四凹槽38相匹配。

第一凹槽区32为圆柱状凹槽、椭圆柱状凹槽或长方体柱状凹槽。

第二凹槽34为圆柱状凹槽、椭圆柱状凹槽或长方体柱状凹槽。

第三凹槽36为圆柱状凹槽、椭圆柱状凹槽或长方体柱状凹槽。

第四凹槽38为圆柱状凹槽、椭圆柱状凹槽或长方体柱状凹槽。

本实施方式中，第一凹槽区4中的凹槽为为长方体柱状凹槽，第二凹槽区5中的凹槽为圆柱状凹槽，第三凹槽区6中的凹槽为长方体柱状凹槽，第四凹槽区7中的凹槽为圆柱状凹槽。

在另一个实施例中，第一凹槽区4、第二凹槽区5中的凹槽为圆柱状凹槽，第三凹槽区6和第四凹槽区7中的凹槽为圆柱状凹槽。

在一实施方式中，第一凹槽4的直径与第二凹槽5的直径的比例为1.5～3：1(优选为2：1)，第二凹槽5和第三凹槽6和第四凹槽7 的大小相同。

结合图1，盒体10还包括句型扣眼12，盒盖20还包括扣舌26。扣眼和扣舌26互相配合，将试剂盒盖紧。

PCR反应液包括猪伪狂犬病毒正向引物、猪伪狂犬病毒反向引物、 TaqMan探针以及dNTPs。第一凹槽区用于安放承装猪伪狂犬病毒正向引物、猪伪狂犬病毒反向引物、TaqMan探针以及dNTPs的试剂瓶。

应用Primer Premier 5.0或Beacon Designer 8在猪伪狂犬病毒的gD和gE基因保守区内设计特异的TaqMan探针，在针对TaqMan探针设计相应的猪伪狂犬病毒正向引物和猪伪狂犬病毒反向引物，其扩增子大小应为bp，根据序列的比对的结果可以在引物上引入简并碱基。

1)设计依据：在猪伪狂犬病毒正向引物、猪伪狂犬病毒反向引物和TaqMan探针设计阶段首先要遵循设计的基本原则是猪伪狂犬病毒正向引物和猪伪狂犬病毒反向引物的Tm值相差小于2℃，TaqMan探针的 Tm要比猪伪狂犬病毒正向引物和猪伪狂犬病毒反向引物的Tm值高 7～10℃，且猪伪狂犬病毒正向引物、人博卡病毒反向引物和TaqMan 探针之间不能有明显的二聚体结构。

2)应用Primer Premier 5.0、Beacon Designer 8或DNASTAR评估设计的猪伪狂犬病毒正向引物、猪伪狂犬病毒反向引物和TaqMan探针序列，分析人博卡病毒猪伪狂犬病毒正向引物、猪伪狂犬病毒反向引物和TaqMan探针之间或内部可能形成的所有二聚体结构，其稳定性不能超过软件给出的范围，若超过则视为不合格序列，需要重新设计，一般要求形成的Dimer的ΔG绝对值小于4.5kcal/mol为佳；

3)BLAST分析设计的人博卡病毒正向引物、人博卡病毒反向引物和T aqMan探针序列，确保其特异性，且不能与人基因组高度同源；

RT-PCR酶包括M-MLV逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶。第二凹槽区中的凹槽用于安放承装RT-PCR酶包括M-MLV逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶的试剂瓶。

阳性指控品通过如下方法制备得到：分别以猪伪狂犬病毒的核酸为模板，以设计的猪伪狂犬病毒正向引物和猪伪狂犬病毒反向引物进行PCR扩增，得到扩增产物，再分别将扩增产物回收并纯化后克隆至 pMD18-T载体，得到质粒DNA，再通过统一稀释，使其Ct值在一定范围，得到阳性质控品。

阴性指控品为DEPC水。第四凹槽区用于安放承装DEPC水的试剂瓶。

这种猪伪狂犬病毒检测试剂盒操作简单、实用性强，能够快速检测出待测样本中是否含有猪伪狂犬病毒。

以上所述实施例仅表达了本实用新型的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型专利的保护范围应以所附权利要求为准。