脱细胞与再细胞化一体式生物反应器的制作方法

本实用新型涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种脱细胞与再细胞化一体式生物反应器。

背景技术：

脱细胞技术可以使细胞与组织有效分离，从而获取我们需要的材料，包括维持原有组织或器官形态并用于再细胞化的支架、组织贴片如颗粒型或粉末型、可注射凝胶、细胞培养液成分等。理想的肾脱细胞支架应当具备复杂的成分、血管网络和独特的组织特异性结构、以及天然组织相同的机械强度等特征，并能提供微观和宏观的组织框架结构，利于细胞增殖分化，最终完成工程化的器官构建。

目前现有的脱细胞和再细胞化灌注装置，主要是实验人员自行组装而成，主要由玻璃瓶、瓶盖、软管以及各种转换接头组成，软管主要是通过在瓶盖上的开孔深入瓶内，根据用途不同，软管可分为灌注管、废弃液回收管以及负压吸引管等。上述装置在使用过程中主要存在以下缺陷：

1、实验人员自行组装的反应瓶，主要采用成品化的玻璃瓶，瓶盖直径主要为 45mm，而常有2根或4根软管从瓶盖经过，被灌注的器官较小，如大鼠肾脏直径为 15mm～25mm，因此不可避免地会接触到旁边的软管，可导致器官受挤压，造成脱细胞化和再细胞化不完全。

2、反应瓶的出口全部在瓶体上方，因此负压吸引的角度只能在上方，而在灌注的过程中，因重力存在，导致负压吸引的角度和重力有相抵作用，不完全符合生理情况。

3、玻璃瓶盖设有若干通道，通常使用玻璃塞或者橡胶塞密封，可在塞上开孔以通过灌注所需的软管，但是，在进行器官脱细胞化和再细胞化的过程中，由于操作时反复拔塞，很容易将外界的细菌真菌等带入瓶内，从而引起污染。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供一种能够解决实验过程易受污染的问题，并最大程度减少实验干扰因素的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器。

为达到上述目的，本实用新型提供了一种脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其包括：

罐体，其为上端敞开、底端封闭的中空结构，所述罐体的侧壁上连接有负压管，所述负压管与所述罐体的内部连通；

盖体，其能拆装的密封连接于所述罐体的上端，所述盖体上穿设有通气管、废液管和至少一个灌注管，所述灌注管的上端连接有三通阀，所述废液管的下端能伸入所述罐体的底部。

如上所述的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其中，所述废液管包括连接管段和伸入管段，所述连接管段与所述盖体相接，所述伸入管段的上端与所述连接管段的下端相接，所述伸入管段的下端能伸入所述罐体的底部。

如上所述的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其中，所述灌注管和所述连接管段均向下延伸出所述盖体的底面，且所述灌注管和所述连接管段伸出所述盖体的底面的长度均大于或等于1cm，且小于或等于2.5cm。

如上所述的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其中，所述盖体上还穿设有进出液管，所述进出液管的上端旋接有密封盖。

如上所述的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其中，所述进出液管、所述灌注管和所述废液管与所述盖体为一体式结构，所述负压管与所述罐体为一体式结构。

如上所述的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其中，所述盖体上穿设有三根间隔且平行设置的所述灌注管，且三根所述灌注管呈等边三角形排列。

如上所述的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其中，所述灌注管的外径与所述废液管的外径相等。

如上所述的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其中，所述罐体的上端沿周向设有罐体连接法兰，所述盖体沿周向设有盖体连接法兰，通过所述罐体连接法兰与所述盖体连接法兰相接，所述盖体与所述罐体相接。

如上所述的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其中，所述罐体连接法兰上设有环形凹槽，所述环形凹槽内设有密封圈，所述密封圈能夹设于所述罐体连接法兰与所述盖体连接法兰之间。

如上所述的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其中，所述罐体的底部设有支腿。

与现有技术相比，本实用新型的优点如下：

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，在进行脱细胞和在细胞化时，无需进行反复拔塞操作，外界的细菌真菌等不会被带入瓶内，从而基本解决了易受污染的问题；

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，灌注管和废液管的设计符合灌注需要，且能够避免器官触到软管，最大程度地减少了实验干扰因素；

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，将负压管设置在罐体上，解决了负压吸引的角度和重力相抵的问题；

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，使得脱细胞与再细胞化过程无需移动被灌注的器官，实现了两个过程连续、一体化；

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，通过在盖体上设置进出液管，使得对器官进行消毒灭菌的操作简单方便。

附图说明

以下附图仅旨在于对本实用新型做示意性说明和解释，并不限定本实用新型的范围。其中：

图1是本实用新型的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器的立体结构示意图；

图2是图1所示的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器的俯视结构示意图；

图3是图1所示的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器的侧视结构示意图；

图4是图1所示的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器中盖体的立体结构示意图；

图5是图4所示的盖体的俯视结构示意图；

图6是沿图5中A-A线的剖视图；

图7是图1所示的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器中罐体的立体结构示意图；

图8是图7所示的罐体的俯视结构示意图；

图9是沿图8中B-B线的剖视图；

图10是图1所示的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器的使用状态图；

图11是图1所示的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器的另一使用状态图。

附图标号说明：

1、罐体；11、负压管；12、罐体连接法兰；13、支腿；2、盖体；21、通气管； 22、废液管；221、连接管段；22、伸入管段；23、灌注管；231、三通阀；24、进出液管；25、盖体连接法兰；3、蠕动泵；4、容器；5、器官；6、废液杯。

具体实施方式

为了对本实用新型的技术方案、目的和效果有更清楚的理解，现结合附图说明本实用新型的具体实施方式。

如图1、图2和图3所示，本实用新型提供了一种脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，其包括罐体1和盖体2，其中，罐体1为上端敞开、底端封闭的中空结构，盖体2能拆装的密封连接于罐体1的上端，盖体2与罐体1之间形成能容置器官5 和溶液的容置空间，如图7、图8和图9所示，罐体1的侧壁上连接有负压管11，优选的，负压管11为外径为10mm的螺纹管，负压管11与罐体1的内部连通，负压管 11能与真空泵相接，通过真空泵将容置空间内的空气抽出，使得容置空间内形成负压，以使初始状态时，液体能够顺畅的进入容置空间；如图4、图5和图6所示，盖体2上穿设有通气管21、废液管22和至少一个灌注管23，且通气管21的轴线、废液管22的轴线、灌注管23的轴线和盖体2的轴线均相互平行设置，使用时，通气管 21与空气过滤器相接，外界的空气通过空气过滤器过滤后进入容置空间，以使得容置空间内外压力平衡，从而使得液体能够顺畅的进出容置空间，如图10所示，灌注管23的上端连接有三通阀231，使用时，三通阀231的两个端口分别与盛放有灌注液体的容器4和盛放有细胞悬浮液的注射器(图中未示出)相连通，废液管22的下端能伸入罐体1的底部，以使得器官5滴落的液体能够通过废液管22导出容置空间。

具体的，如图10所示，进行脱细胞时，先将三通阀231的第一端口通过软管与灌液硅胶管的一端相连通，灌液硅胶管的另一端通过软管与盛放有灌注液体的容器4 相连通，三通阀231的第二端口与盛放有细胞悬浮液的注射器相连通，需要说明的是，脱细胞试验时，三通阀231的第二端口始终处于关闭状态，将废液管22与排液硅胶管的一端相连通，排液硅胶管的另一端通过软管与盛放有灌注液体的容器4相连通，再将灌液硅胶管和排液硅胶管安装到蠕动泵3上，安装时需要注意确保废液管22的液体流动方向与灌注管23的液体流动方向相反，再将盖体2密封盖合在罐体1上，由于灌液管与废液管22通过罐体1相连通，使得灌注硅胶管、灌液管、废液管22 和排液硅胶管依次导通形成灌注回路，打开蠕动泵3，使容器4内的灌注液体通过灌注回路流回容器4内，以确保灌注回路内无气泡，不会影响实验结果，然后，打开盖体2，通过留置针将需要进行试验的器官5与灌注管23相接，再次将盖体2密封盖合在罐体1上，将蠕动泵3调节至5ml/min，然后启动蠕动泵3，通过观察从器官5 底部滴下的溶液，确认每个肾脏正在灌注，最后根据实验方案使用不同的脱细胞剂，直到整个肾脏颜色变白，可确认脱细胞完成；

需要说明的是，在图10中，箭头的指向为液体的流动方向。

进行再细胞化时，将脱细胞与再细胞化一体式生物反应器转移到生物安全柜中，关闭三通阀231的第一端口，连通三通阀231的第二端口，即连接蠕动泵3的通道关闭，连接注射器的通道打开，细胞悬浮液缓慢注入器官5，将整个细胞悬浮液从注射器灌注进器官5内后，关闭三通阀231的第二端口，连通三通阀231的第一端口，即连接蠕动泵3的通道打开，连接注射器的通道关闭，以1ml/min的速度启动泵1，然后第二天及之后每两天更换全新的培养基。

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，在进行脱细胞和在细胞化时，无需进行反复拔塞操作，外界的细菌真菌等不会被带入瓶内，从而基本解决了易受污染的问题；灌注管和废液管的设计符合灌注需要，且能够避免器官触到软管，最大程度地减少了实验干扰因素；负压管设置在罐体上，解决了负压吸引的角度和重力相抵的问题；脱细胞与再细胞化过程无需移动被灌注的器官，实现了两个过程连续、一体化。

在本实用新型的一个优选的实施方式中，考虑到由于灌注器官5通常选用动脉和静脉，这两条血管结构距离很近，而生物反应器的管道常常距离较远，操作起来很不方便，且器官5与软管连接处易松动脱落，同时也可能会一定程度拉扯损伤灌注的器官5；如图1、图2和图3所示，盖体2上穿设有三根间隔且平行设置的灌注管23，且三根灌注管23呈等边三角形排列，即三根灌注管23两两相邻，且相邻的两根灌注管23之间的距离相等，也就是，三根灌注管23相邻设置，以贴合器官5生理结构，不仅使得灌注管23与器官5之间的连接操作简单方便，还解决了拉扯损伤灌注的器官5的问题，且器官5与软管连接处不易松动脱落，此外，还可以根据实际使用需求，将三根灌注管23分别与器官5的动脉、静脉和输尿管相接，或者将其中的两个分别与器官5的动脉和静脉相接。

进一步，优选采用外径为4mm的灌注管23。

优选的，为了便于加工制作，灌注管23的外径与废液管22的外径相等，灌注管 23的内径与废液管22的内径也相等。

当然，灌注管23的外径与废液管22的外径也可以不相等。

进一步，如图7和图9所示，在罐体1的底部设有支腿13，罐体1通过支腿13 放置在试验台上，从而确保了罐体1在试验过程中的稳定性，此外，支腿13的设置，使得罐体1的底面可以为弧面或者斜面或者锥面等形状。

进一步，如图1和图3所示，罐体1的上端沿周向设有罐体连接法兰12，盖体2 沿周向设有盖体连接法兰25，通过罐体连接法兰12与盖体连接法兰25相接，盖体2 与罐体1相接，其中，罐体连接法兰12与盖体连接法兰25之间的连接方式有多种，例如：通过卡勾与卡槽的卡接配合相接，或者通过螺栓连接，或者通过夹子相接等，在此不在赘述，但只要能够实现罐体连接法兰12与盖体连接法兰25能拆装的连接的任何现有结构或其简单替换，均应在本实用新型的保护范围之内。

再进一步，罐体连接法兰12上设有环形凹槽(图中未示出)，环形凹槽内设有密封圈(图中未示出)，密封圈能夹设于罐体连接法兰12与盖体连接法兰25之间，通过密封圈对罐体1与盖体2的连接处进行密封，有效保证了盖体2与罐体1之间形成的容置空间的密封性，并在一定程度上避免了外界的细菌真菌等进入容置空间内。

当然，也可以在盖体连接法兰25上设置环形凹槽，并在环形凹槽内设置密封圈。

在本实用新型的一种实施方式中，为了避免废液管22过长，影响盖体2的放置，如图10所示，废液管22包括连接管段221和伸入管段222，连接管段221与盖体2 相接，伸入管段222的上端与连接管段221的下端相接，伸入管段222的下端能伸入罐体1的底部，即废液管22为分体式结构，从而减小了盖体2的整体尺寸，便于盖体2的回收放置，此外，由于伸入管段222较长，优选，连接管段221与灌注管23 的内径、外径和长度均相同，伸入管段222采用软管制成，以便于放置。

需要说明的是，为了能够清楚的看出连接管段221和伸入管段222和位置，在图10中，连接管段221和伸入管段222位于罐体1内的部分采用虚线绘出。

当然，废液管22也可以为一体式结构，即连接管段221和伸入管段222一体制成。

进一步，由于灌注管23与器官5之间会使用留置针帽连接，为了便于留帽针与灌注管23之间的连接，以及连接管段221与伸入管段222之间的连接，如图4、图5 和图6所示，灌注管23和连接管段221均向下延伸出盖体2的底面，且灌注管23 和连接管段221伸出盖体2的底面的长度均大于或等于1cm，且小于或等于2.5cm，这样的尺寸既能够避免灌注管23和连接管段221的伸出长度过短，导致连接操作不便的情况，又能够避免灌注管23和连接管段221的伸出长度过长，在存放盖体2时，导致灌注管23和连接管段221折断的情况。

在本实用新型的一种实施方式中，为了便于对器官5进行消毒灭菌，如图4、图 5和图6所示，盖体2上还穿设有进出液管24，进出液管24的轴线与灌注管23的轴线相互平行设置，进出液管24的上端旋接有密封盖，当需要进行消毒灭菌时，旋开密封盖，通过进出液管24向盖体2与罐体1之间形成的容置空间内灌注消毒挤，完成消毒灭菌，通过进出液管24将消毒剂从容置空间吸出即可，然后再将密封盖旋接在进出液管24的上端，以确保容置空间的密封性，进出液管24的设置，使得对器官 5进行消毒灭菌的操作简单方便。

优选的，为了便于对消毒挤的注射和吸出，进出液管24采用内径为15mm的螺纹管。

进一步，考虑到现有技术中，瓶盖上开孔虽能使软管通过，但因软管有弹性，因此在实验过程中，软管和瓶盖之间的缝隙随软管的移动而时大时小，被污染的风险大大增加，如图3、图4和图5所示，进出液管24、灌注管23和废液管22与盖体2 为一体式结构，负压管11与罐体1为一体式结构，优选，进出液管24、灌注管23 和废液管22与盖体2采用玻璃一体制成，负压管11与罐体1采用玻璃一体制成，一体制成的结构，不会出现缝隙，从而解决了外界的细菌真菌等自盖体2与各管体之间的缝隙处进入盖体2与罐体1之间形成的容置空间内，引起污染的问题，有效保证了容置空间的密封性。

下面结合附图，以大鼠肾脏脱细胞和在细胞化为例，具体说明本实用新型的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器的具体使用过程：

如图10所示，大鼠肾脏脱细胞过程：

步骤一、在超净工作台中组装去细胞灌注系统，具体来说，先罐体1通过支腿 13制成在超净工作台上，再将盖体2密封盖合在罐体1上，之后将三根灌液管中的一个的三通阀231的第一端口通过软管与灌液硅胶管的一端相连通，灌液硅胶管的另一端通过软管与盛放有灌注液体的容器4相连通，将该三通阀231的第二端口与盛放有细胞悬浮液的注射器相连通，需要说明的是，脱细胞试验时，三通阀231的第二端口始终处于关闭状态，将废液管22与排液硅胶管的一端相连通，排液硅胶管的另一端通过软管与盛放有灌注液体的容器4相连通，然后将灌液硅胶管和排液硅胶管安装到蠕动泵3上，安装时需要注意确保废液管22的液体流动方向与灌注管23的液体流动方向相反，使得灌注硅胶管、灌液管、废液管22和排液硅胶管依次导通形成灌注回路，其中，各软管与其他管连接时可采用鲁尔转换接头连接；

需要说明的是，如图11所示，灌液硅胶管和排液硅胶管可以分别安装到两个蠕动泵3上，并使排液硅胶管的的另一端通过软管与废液杯6相连通，以避免废液污染灌注液体，此时，灌注硅胶管和灌液管相连通形成灌注管路，废液管22和排液硅胶管相连通形成排液管路。在图11中，箭头的指向为液体的流动方向；

步骤二、消除灌注回路内的气泡，具体来说，打开蠕动泵3，使容器4内的灌注液体依次通过灌注回路流回容器4内，以确保灌注回路内无气泡，不会影响实验结果；

步骤三、在室温下脱细胞，具体来说，打开盖体2，通过留置针将需要进行试验的器官5与灌注管23相接，再次将盖体2密封盖合在罐体1上，将蠕动泵3调节至 5ml/min，然后启动蠕动泵3，通过观察从器官5底部滴下的溶液，确认每个肾脏正在灌注，根据实验方案使用不同的脱细胞剂，直到整个肾脏颜色变白，可确认脱细胞完成；

步骤四、对已脱细胞的肾脏消毒杀菌，具体来说，旋开密封盖，通过进出液管 24向盖体2与罐体1之间形成的容置空间内灌注消毒剂，完成消毒灭菌，通过进出液管24将消毒剂从容置空间吸出即可，然后再将密封盖旋接在进出液管24的上端，以确保容置空间的密封性；

其中，灌注管23的外径与废液管22的外径均为4mm，废液管22采用分体式结构，进出液管24、灌注管23和废液管22与盖体2采用玻璃一体制成，且灌注管23 和连接管段221伸出盖体2的底面的长度均大于或等于1cm，且小于或等于2.5cm。

大鼠肾脏再细胞化过程：

步骤一、制备细胞悬浮液，具体的，先温热足量的DMEM/F12(杜氏改良Eagle 培养基，其补充有10％FBS(胎牛血清)和1％Pen-Strep(青链霉素混合溶液))以及细胞解离酶，用于将细胞提升至37℃；再收集足够数量的细胞以获得所需的接种浓度；之后，使用细胞解离酶提取细胞；然后，取出解离的细胞悬浮液样品，离心后，用适当体积的培养基稀释沉淀，得到最终浓度；最后，使用无菌5ml注射器吸入悬浮液。

步骤二、灌注细胞悬浮液，具体来说，先将脱细胞与再细胞化一体式生物反应器转移到37℃，5％CO2培养箱中；再使上述三通阀231连接蠕动泵3的通道关闭，连接注射器的通道打开；之后，将细胞悬液缓慢注入肾脏，确保将整个悬浮液从注射器灌注进肾脏内；然后，使上述三通阀231连接蠕动泵3的通道打开，连接注射器的通道关闭，以1ml/min的速度启动泵，同时打开真空泵，通过真空泵将容置空间内的空气抽出，使得容置空间内形成负压，第二天及之后每两天更换全新的培养基。

综上所述，本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，在进行脱细胞和在细胞化时，无需进行反复拔塞操作，外界的细菌真菌等不会被带入瓶内，从而基本解决了易受污染的问题；

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，灌注管和废液管的设计符合灌注需要，且能够避免器官触到软管，最大程度地减少了实验干扰因素；

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，将负压管设置在罐体上，解决了负压吸引的角度和重力相抵的问题；

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，使得脱细胞与再细胞化过程无需移动被灌注的器官，实现了两个过程连续、一体化；

本实用新型提供的脱细胞与再细胞化一体式生物反应器，通过在盖体上设置进出液管，使得对器官进行消毒灭菌的操作简单方便。

以上所述仅为本实用新型示意性的具体实施方式，并非用以限定本实用新型的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本实用新型的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本实用新型保护的范围。而且需要说明的是，本实用新型的各组成部分并不仅限于上述整体应用，本实用新型的说明书中描述的各技术特征可以根据实际需要选择一项单独采用或选择多项组合起来使用，因此，本实用新型理所当然地涵盖了与本案发明点有关的其它组合及具体应用。