程序性细胞死亡(PD-1)的单结构域抗体的制作方法

本发明涉及pd-1结合剂，特别是pd-1结合vh单结构域抗体(sdab)，以及这种结合剂在疾病的治疗、预防和检测中的应用。导论基于抗体的疗法已经成为肿瘤学、炎症和传染病等领域越来越多的人类疾病的治疗方法中重要组成部分。事实上，抗体是当今最畅销的药物之一；十大最畅销药物中有五种是抗体。程序性死亡1(pd-1)蛋白由pdcd1基因编码，且表达为55kdai型跨膜蛋白(agata1996intimmunol8(5)：765-72)。pd-1是免疫球蛋白超家族成员(ishida1992embo11(11)：3887-95)，且它是t细胞调控者延伸的cd28/ctla-4家族的抑制成员。该家族的其他成员包括cd28、ctla-4、icos和btla。pd-1作为单体存在，缺乏其他cd28家族成员特有的未配对半胱氨酸残基(zhang2004immunity20：337-47)。其细胞质结构域含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)和基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，其在信号转导期间被磷酸化(riley2009immunolrev229(1)：114-25)。pd-1在b细胞、t细胞和单核细胞中表达(agata1996)。pd-1在维持免疫自身耐受中的作用在pdcd1-/-小鼠中得到证实，其发展为自身免疫性疾病(nishimura1999immunity11：141-51，nishimura2001science291(5502)：319-22)。因此，pd-1途径调节抗原反应，平衡自身免疫和耐受。pd-1有两种配体介导其调节功能。pd-l1(b7-h1)通常在树突细胞、巨噬细胞、静息b细胞、骨髓衍生的肥大细胞和t细胞以及非造血细胞谱系中表达(综述于francisco2010immunolrev236：219-42)。pd-l2(b7-dc)主要在树突细胞和巨噬细胞中表达(tseng2001jexpmed193(7)：839-45)。配体表达受局部介质的影响，并可被炎性细胞因子上调。已知pd-1是负调节tcr信号的免疫抑制蛋白。pd-1和pd-l1之间的相互作用可充当免疫限制点，其可以导致例如肿瘤浸润淋巴细胞的减少，t细胞受体介导的扩散减少，和/或癌细胞的免疫逃避。通过抑制pd-1与pd-l1或pd-l2的局部相互作用可以逆转免疫抑制；当pd-1与pd-l1和pd-l2的相互作用被阻断时，该效果是累积的。随着t细胞被抗原呈递细胞(apc)激活和共刺激，诱导了pd-1的t细胞表达。pd-1与apc上的配体的结合使pd-1交联并将其聚集成免疫突触内的t细胞受体(tcr)复合物(yokosuka2012jexpmed209(9)：1201-17)。在t细胞细胞质内，pd-1信号结构域itim和itsm被磷酸化。这诱导含有酪氨酸磷酸酶(shp1/2)的src-同源性-2结构域减弱t细胞受体(tcr)信号通路的各种组分。t细胞活化受到抑制，导致细胞因子反应、扩散和细胞溶解活性降低。这种t细胞功能的下调有助于防止过度刺激使细胞免于抵抗弱免疫原性自身抗原。pd-1通路可在癌症或感染中被利用，由此肿瘤或病毒可逃避有效的免疫识别，并且t细胞表现出“疲惫的”表型。pd-l1也表明在许多肿瘤类型中表达，包括尿路上皮肿瘤、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌(综述于callahan2014jleukocbiol94(1)：41-53)。由癌基质细胞产生的细胞因子可以进一步上调肿瘤微环境中的pd-l1(he2015naturescientificreports5：13110)。结果，肿瘤特异性t细胞通过pd-1信号传导变得无反应，因此不能消除它们的靶标。t调节细胞(tregs)也已表明表达高水平的pd-1，并且它们进一步抑制抗肿瘤反应(lowther2016jciinsight1(5)：85935)。pd-1：pd-l1相互作用的破坏增强t细胞活性。抗pd-1单克隆抗体证实阻断pd-1与其配体之间的相互作用(wang2014cancerimmunolres2(9)：846-56)。通过阻断pd-1可以增强体外t细胞功能，如通过t细胞和树突细胞的混合淋巴细胞反应中增加的扩散和细胞因子反应所证实的。来自黑素瘤患者的细胞毒性淋巴细胞(ctl)也已表明可通过使用抗体opdivo(nivolumab)体外阻断pd-1以增强，并且可以对treg抑制产生抗性(wang2009intimmunol21(9)：1065-1077)。已经在黑素瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、肾细胞癌(rcc)和其他癌症的临床剂量增加研究中测试了该抗体。与nsclc患者的化学疗法相比，它显示出增加的总体存活率。另一种pd-1阻断抗体(pembrolizumab)证实了对ctla-4阻断无效的nsclc患者的反应。和在功能上阻断人pd-1与其配体的相互作用。可以通过抗pd-1和抗cd3抗体的组合在膜上与它交联来诱导pd-1信号传导(bennett2003jimmunol170：711-18，keir2005jimmunol175：7372-7379)。该功能在抗肿瘤反应期间可能是有害的，因为t细胞活性将被抑制。如果需要抑制t细胞应答，则可以使用对抗的抗pd-1抗体或那些具有效应功能的抗体来治疗免疫相关疾病，例如类风湿性关节炎。本发明的目的是解决用于治疗疾病，特别是用于治疗癌症的替代的基于抗体的治疗的需求。发明概述本发明涉及分离的人可变单结构域抗体或分离的人仅有重链的抗体，其结合人pd-1和治疗疾病的相关方法。发明人惊奇地鉴定出在转基因小鼠体内产生的结合人pd-1的人可变单结构域抗体，但不阻断人pd-1与其配体之间的功能性相互作用。因此，本发明的抗pd-1vh单结构域抗体结合下述表位，所述表位远离pd-1蛋白与其配体pd-l1和pd-l2相互作用的部分，并因此在已知靶向pd-1的治疗剂的结合区域之外。如下文进一步描述的，这使得本发明的人可变单结构域抗体在与其他结合结构域组合使用时特别可用于将结合分子锚定至人pd-1。例如，人可变单结构域抗体可以与使用结合人pd-1并阻断pd-1与其配体pd-l1和pdl-2的相互作用的抗体或抗体片段的疗法组合使用。此外，人可变单结构域抗体还可以与靶向其他免疫限制点(checkpoint)抑制剂的抗体或抗体片段一起用于组合疗法中。vh结构域的小尺寸使得可以将vh结构域的形式制备为多价形式，例如通过将如本文所述的vh单结构域抗体与另一种结合剂(例如另一种vh单结构域抗体)连接。第二结合剂，例如另一种vh单结构域抗体，可以结合pd-1上的另一表位，并且可以阻断pd-1和pd-l1和/或pd-l2的功能性相互作用。或者，第二结合剂，例如另一种vh单结构域抗体，可结合pd-1上的另一表位而不阻断功能性配体相互作用，可交联或聚集多种pd-1单体以实现pd-1信号传导和功能。如本文所证实，以二价的形式提供结合人pd-1但不阻断人pd-1与人pd-l1和/或pd-l2的相互作用的分离的单结构域抗体以及阻断人pd-1与人pd-l1和/或pd-l2的相互作用的抑制剂单结构域抗体是有利的。以这种形式，与单价形式的阻断剂相比，抑制作用增加10至25倍。在一方面，本发明涉及分离的单结构域抗体，其结合人pd-1但不阻断人pd-1与人pd-l1和/或pd-l2的相互作用。在一方面，本发明涉及分离的vh单结构域抗体，其结合包含一个或更多个选自人pd-1的r104、d105、f106、h107、m108、s109和v110残基的表位。在一方面，本发明涉及分离的结合人pd-1的单个vh结构域抗体，其包含如下表1或2所示的cdr3序列或与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同一性的序列。在一方面，本发明涉及分离的单结构域抗体，其包含选自seqidno.4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、254、258、262、266、270、274、278、282、286、290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、334、338、342、346、350、354、358、362、366、370、374、378、382、386、390、394、398、402、406、410、414、418、422、426、430、434、438、442、446、450、454、458或462的序列或与其具有至少60％、70％、80％或90％同源性的序列。在优选的实施方案中，单结构域是人重链可变结构域。人重链可变结构域通常认定为vh。在一个实施方案中，分离的单结构域抗体中，所述单结构域抗体与毒素、酶、放射性同位素、延长半衰期的结构部分、标记、治疗性分子或其他化学结构部分缀合。另一方面，本发明涉及分离的单结构域抗体，其不与阻断pd-1与pd-l1的功能性相互作用和/或pd-1与pd-l2的相互作用的抗体竞争。另一方面，本发明涉及与本文所述的单结构域抗体结合基本相同的表位的结合剂。另一方面，本发明涉及分离的结合剂，其与本文所述的单结构域抗体竞争结合人pd-1。另一方面，本发明涉及分离的结合剂，其包含如本文所述的单结构域抗体。在一个实施方案中，所述单结构域抗体与不结合pd-1的第二结合分子连接。在一个实施方案中，所述第二单结构域抗体与免疫肿瘤学靶标结合。在一个实施方案中，所述单结构域抗体与结合pd-1的第二结合分子连接。在一个实施方案中，所述结合分子阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2的相互作用。在一个实施方案中，分离的结合剂与毒素、酶、放射性同位素、延长半衰期的结构部分、治疗性分子或其他化学结构部分缀合。另一方面，本发明涉及本文所述的单结构域抗体在多特异性或多价结合剂中的应用。另一方面，本发明涉及免疫缀合物，其包含如本文所述的单结构域抗体或与治疗剂连接的如本文所述的结合分子。另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含如本文所述的单结构域抗体、结合剂或免疫缀合物和药物载体。另一方面，本发明涉及治疗癌症、免疫病症、神经疾病、炎性病症、变态反应、移植排斥、病毒感染、免疫缺陷或其他免疫系统相关病症的方法，其包括给予治疗有效量的包含如本文所述的单结构域抗体、结合剂、免疫缀合物或药物组合物。另一方面，本发明涉及如本文所述的单结构域、结合剂、免疫缀合物或药物组合物在制备用于治疗癌症、免疫病症、神经疾病、炎性病症、变态反应、移植排斥、病毒感染、免疫缺陷或其他免疫系统相关病症的药物中的应用。另一方面，本发明涉及本文所述的单结构域抗体、结合剂、免疫缀合物或药物组合物，其用作药物。另一方面，本发明涉及如本文所述的单结构域抗体，结合剂，免疫缀合物或药物组合物，其用于治疗癌症、免疫病症、神经疾病、炎性病症、变态反应、移植排斥、病毒感染、免疫缺陷和其他免疫系统相关病症。另一方面，本发明涉及调节免疫应答的方法，包括给予如本文所述的单结构域抗体、结合剂、免疫缀合物或药物组合物。另一方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含选自seqidno.81至100、221至250或463至515的核苷酸序列。另一方面，本发明涉及包含选自seqidno.81至100、221至250或463至515的核酸序列的载体。另一方面，本发明涉及包含载体的宿主细胞，所述载体包含选自seqidno.81至100、221至250或463至515的核酸序列。另一方面，本发明涉及生产如本文所述的单结构域抗体的方法，包括在宿主细胞中表达编码所述结合分子的核酸并从宿主细胞中分离结合分子。另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含如本文所述的单结构域抗体、结合剂、免疫缀合物或药物组合物。另一方面，本发明涉及检测测试样品中人pd-1存在的方法，包括使所述样品与如本文所述的单结构域抗体和至少一种可检测标记接触，并检测所述单结构域抗体与人pd-1的结合。另一方面，本发明涉及生产结合人pd-1但不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2的相互作用的vh单结构域抗体的方法，所述方法包括：a)免疫表达包括人重链v基因核酸构建体并且不能用pd-1抗原产生功能性内源轻链或重链的转基因动物；b)从所述动物产生文库；c)从所述文库中分离vh单结构域抗体；d)鉴定结合人pd-1但不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2的相互作用的vh单结构域抗体，和e)分离所述抗体。另一方面，本发明涉及通过上述方法获得或可得到的vh单结构域抗体。另一方面，本发明涉及表现出一种或多种下列特性的人vh单结构域抗体：(a)以如实施例中所示kd与人pd-1结合；(b)不阻断pd-1与其配体的功能相互作用；(c)与人pd-1和食蟹猴pd-1结合；(d)不与小鼠pd-1结合；(e)当与这种抗体连接时，能够增强拮抗性人vh单结构域抗体的拮抗作用；(f)不增强t细胞活化；(g)具有如实施例中所示ec50或ic50值。另一方面，本发明涉及分离的仅有重链的抗体，其包含结合人pd-1但不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2相互作用的vh结构域。另一方面，本发明涉及产生如本文所述的仅有重链的抗体的转基因啮齿动物。另一方面，本发明涉及仅含重链的抗体，其包含与人pd-1结合但不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2相互作用的vh结构域，所述抗体从表达人v、d和j基因位点，且不产生功能性内源λ和κ轻链和重链的转基因小鼠中获得或可得到。另一方面涉及分离的仅有重链的抗体，其包含结合人pd-1但不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2相互作用的vh结构域，其用作激动剂。附图在以下非限制性附图中进一步描述本发明。图1.a)结合试验和b)抑制试验。图2.a)vh单结构域抗体1.2和1.1与人重组pd-1蛋白结合；b)vh单结构域抗体1.2和1.1与食蟹猴pd-1重组蛋白结合；c)vh单结构域抗体1.2和1.1不与小鼠pd-1结合。图3.在htrf试验中使用vh结构域抗体1.2和1.1抑制人pd-l1(3a)和pd-l2(3b)与重组人pd-1蛋白的结合。图4.vh结合到cho人pd-1细胞上并测试该结合是否抑制pd-l1相互作用，a)cho-pd-1结合；b)cho-pd-1pd-l1抑制。图5.功能报告基因试验。在功能性报告试验中，与对照vh一起测试不同的单结构域抗体以及双互补位形式。图6.vh单结构域抗体1.1在40℃下0-14天的稳定性。图7.vh单结构域抗体1.1对源自同种异体树突细胞/t细胞共培养的il-2的分泌没有影响。阳性对照(pos)是可功能性阻断pd-1：pd-l1相互作用的vh。阴性对照(neg)与vh不相关。通过均相时间分辨荧光试验(htrf)在2天后测定il-2水平。图8.a)基于pepscan分析的人pd-1(pdb编号：4zqk)上的1.1和2.1共同表位残基。1.1和2.1表位共同的残基以黑色显示。b)参与vh单结构域抗体1.1与pd-1小鼠序列结合的人pd-1残基的比对。图9.vh单结构域抗体2.12的小鼠血清稳定性和b)vh单结构域抗体2.12的人血清稳定性。详述现在将进一步描述各个方面和实施例。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非有明确的相反说明，如此定义的每个方面可以与任何其他方面组合。特别地，任何表明为优选或有利的特征可以与表明为优选或有利的任何其他特征组合。通常，与本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语及技术是本领域公知和常用的。除非另有说明，本公开的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述。参见，例如green和sambrook等，分子克隆：alaboratorymanual，第四版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，n.y.(2012)；therapeuticmonoclonalantibodies：frombenchtoclinic，zhiqiangan(编辑)，wiley，(2009)；和抗体工程，第2版，第1卷和第2卷，ontermann和dubel，编辑，springer-verlag，heidelberg(2010)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学相关的术语和实验步骤和技术是本领域公知和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。如实施例中的功能性试验所证明的(也参见附图5和7)，本发明人惊奇地鉴定出与人pd-1结合但不阻断人pd-1与其配体之间的功能性相互作用的人vh单结构域抗体。发明人进一步表明，本发明的人vh单结构域抗体结合不同于人pd-1与pdl-1或pdl-2的结合位点的表位。因此，本发明提供了结合人pd-1，但不阻断pd-1与pd-l1的相互作用和/或pd-1与pd-l2的相互作用的分离的单结构域抗体、包含这种结合分子的药物组合物，以及用于制备这种结合蛋白的分离的核酸、分离的重组表达载体和分离的宿主细胞。还提供了利用本文公开的单结构域抗体检测人pd-1的方法和治疗疾病的方法。另一方面，本发明提供结合分子，其包含如本文所述的结合人pd-1但不阻断pd-1与pd-l1的相互作用和/或pd-1与pd-l2的相互作用的单结构域抗体。另一方面，本发明提供结合分子，其包含结合到如本文所定义的人pd-1表位的单结构域抗体。在优选的实施方案中，单结构域抗体是其中结构域是人可变重链(vh)结构域的单结构域抗体。因此，在某些实施方案中，我们提供结合人pd-1的分离的单结构域抗体，其中所述结构域是可变重链结构域，优选vh结构域，并且其中所述单结构域抗体结合人pd-1并且不阻断pd-1与pd-l1的相互作用和/或pd-1与pd-l2的相互作用。如本文所用，术语“不阻断或不抑制人pd-1与其配体的相互作用”是指人pd-1与其配体的功能性相互作用。换句话说，本发明的单结构域抗体的结合不会消除或降低人pd-1与其配体的功能性相互作用。这可在例如pd-1信号传导试验中测定，并且不定义为阻断配体结合。因此，本发明的单结构域抗体与人pd-1的结合不影响人pd-1与其配体相互作用的生物学功能。在一个实施方案中，配体是pd-l1。在一个实施方案中，配体是pd-l2。本发明的单结构域抗体以高亲和力和特异性结合pd-1。如上所述的本发明的单结构域抗体的性质可用于治疗方法和用途。本发明的化合物特别可用于将治疗分子锚定，结合或接近人pd-1，例如在靶向治疗中将治疗化合物招募到感兴趣的细胞或组织或与pd-1定位相关的细胞区域。这使得本发明的化合物特别适合与其他化合物一起递送，例如阻断pd-1与其配体相互作用的化合物或其他免疫调节剂。例如，本发明的单结构域抗体可以例如使用肽接头与拮抗人pd-1与其配体pd-l1和/或pd-l2结合的化合物连接，从而上调免疫应答。这种化合物可选自抗体或其片段，包括vh单结构域抗体。因此，一方面涉及如本文所公开的单结构域抗体在多价结合剂中的应用，例如与阻断pd-1与其配体pd-l1和/或pd-l2的结合的vh单结构域抗体组合。在一个实施方案中，所述单结构域抗体可与mab或抗体的fc区组合，例如，mab融合。这可以获得更长的半衰期和/或fc效应功能，以耗尽pd-1阳性细胞，用于治疗自身免疫疾病。在一个实施方案中，多价分子可用作拮抗剂。在一个实施方案中，多价分子可用作激动剂。在另一个实施方案中，单结构域抗体可以与阻断pd-1与其配体相互作用的化合物或其他免疫调节剂一起共同施用。这可以在相同的药物中完成，或通过单独的组合物有序施用来完成。在另一方面，单结构域还可以与下调免疫应答的另一种化合物组合。本发明的单结构域抗体可进一步用作耗尽抗体，例如通过nk细胞或通过递送毒性负载用于损耗靶向细胞。此外，本发明的单结构域抗体可用作成像剂，例如用于诊断癌症或其他生物标记物相关方法的方法中。应用包括预测受癌症影响的患者对治疗(例如用免疫检查点途径抑制剂的治疗)的临床反应的方法。特别地，如下所述，本发明的单结构域抗体可以以多价或多特异性形式使用。因此，本发明还涉及包含如本文所述的单结构域抗体的多功能结合剂。本发明的分子特异性结合野生型人pd-1(uniprot登录号q15116，genbank登录号u64863，seqidno.518)。残基1-20相当于前肽序列，残基171及其之后构成pd-1的跨膜螺旋和细胞内结构域。除非另有说明，本文所用的术语pd-1是指人pd-1。术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白质pd-1”、“pd-1”、“pd1”、“pdcd1”、“hpd-1”和“hpd-1”可互换使用，并包括人pd-1的变体、同种型、物种同源物。术语“pd-1结合分子/蛋白质/多肽/试剂”、“pd-1抗原结合分子蛋白/多肽/试剂”、“抗pd-1单结构域抗体”、“抗pd-1单免疫球蛋白可变结构域”、“仅有抗pd1重链的抗体”或“抗pd-1抗体”均指能够特异性结合人pd-1抗原的分子。结合反应可以通过标准方法说明，例如参考使用非相关特异性抗体的阴性对照试验。术语“pd-1结合分子/试剂”包括pd-1结合蛋白。本发明的抗体或结合分子，包括本文所述的单结构域抗体和多价或多特异性结合剂，其“结合”或“能够结合”目标抗原，例如，pd-1，其是以足够的亲和力结合抗原，使得抗体可用作靶向表达抗原的细胞或组织的治疗剂的抗体或结合分子。本发明的结合分子，包括本文所述的单结构域抗体和多价或多特异性结合剂，特异性结合人pd-1。换句话说，其与pd-1抗原的结合与非特异性相互作用相比具有可测量到的不同。如实施例中所证明的，本发明的单结构域抗体不与小鼠pd-1交叉反应。优选地，本发明的单结构域抗体与人pd-1结合并且还与食蟹猴pd-1结合。如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合到”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可表现为例如具有针对其的靶标的至少约10-4m，或者至少约10-5m，或者至少约10-6m，或者至少约10-7m，或者至少约10-8m，或者至少约10-9m，或者至少约10-10m，或者至少约10-11m，或者至少约10-12m，或更大kd的分子。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指分子结合特定多肽或特定多肽的表位而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位的结合。术语“抗体”广泛地指任何免疫球蛋白(ig)分子或其抗原结合部分，其由四条多肽链，两条重(h)链和两条轻(l)链构成，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物，其保留ig分子的必需表位结合特征。此种突变体、变体或衍生物抗体形式是本领域已知的。在全长抗体中，每条重链由重链可变区或结构域(本文中缩写为hcvr)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3构成。每条轻链由轻链可变区或结构域(本文中缩写为lcvr)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域cl构成。重链和轻链可变区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，穿插有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个重链和轻链可变区由三个cdr和四个fr组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)，类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。术语“cdr”指抗体可变序列内的互补决定区。对于每个可变区，在重链和轻链的每个可变区中有三个cdr，其被称为cdr1、cdr2和cdr3。术语“cdr组”指在能够结合抗原的单个可变区中存在的三个cdr的组。可根据本领域已知的不同系统不同地定义这些cdr的确切边界。kabat互补决定区(cdr)基于序列可变性并且是最常用的(kabat等，(1971)ann.nyacad.sci.190：382-391和kabat等，(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第五版，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nih出版号：91-3242)。chothia指的是结构环的位置(chothia和leskj，mol.biol.196：901-917(1987)).当提及可变结构域中的残基时(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)，通常使用kabat编号系统。除非另有说明，本文使用由kabat描述的系统。术语“kabat编号”、“kabat定义”和“kabat标记”在本文中可互换使用。这些术语在本领域中是公认的，是指编码氨基酸残基的系统，其比抗体的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基或抗原结合部分更可变(即高变的)。嵌合抗体是包含可变结构域的重组蛋白，所述可变结构域包括衍生自一个物种的抗体，优选啮齿动物抗体的互补决定区(cdr)，而抗体分子的恒定结构域衍生自人抗体的恒定结构域。对于兽医应用，嵌合抗体的恒定结构域可以衍生自其他物种，例如猫或狗的恒定结构域。人源化抗体是重组蛋白质，其中来自一个物种的抗体的cdr；例如，啮齿动物抗体从啮齿动物抗体的重链和轻链的可变链转移到人重链和轻链可变结构域(例如，框架区序列)中。抗体分子的恒定结构域衍生自人抗体的恒定结构域。在某些实施方案中，来自亲本(啮齿动物)抗体的有限数量的框架区氨基酸残基可以被取代到人抗体框架区序列中。术语“抗原结合位点”是指抗体或抗体片段的一部分，其包含特异性结合抗原的区域。抗原结合位点可以由一个或多个抗体可变结构域提供。优选地，抗原结合位点包含在抗体或抗体片段的相关vh和vl内。抗体片段是抗体的一部分，例如f(ab′)2、fab、fv、sfv等。全长抗体的功能片段保留全长抗体的靶特异性。因此，重组功能性抗体片段，例如fab(片段，抗体)、scfv(单链可变链片段)和单结构域抗体(dab)已被用于开发治疗剂，作为基于mab的治疗剂的替代物。scfv片段(～25kda)由两个可变结构域vh和vl组成。在天然状态下，vh和vl结构域通过疏水相互作用非共价结合并倾向于解离。然而，可以通过将结构域与亲水性柔性接头连接以产生单链fv(scfv)来改造稳定片段。最小的抗原结合片段是单可变片段，即vh或vl结构域。靶向结合不需要分别与轻链/重链配偶体结合。此种片段用于单结构域抗体。因此，单结构域抗体(～12至15kda)由vh或vl结构域组成或包含vh或vl结构域。一方面，本发明涉及分离的单结构域抗体，分离的可变单结构域或分离的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述分离的单结构域抗体，分离的可变单结构域或分离的免疫球蛋白单可变结构域与人pd-1结合，但不阻断pd-1和pd-l1或pd-l2的相互作用。术语“单结构域抗体，可变单结构域或免疫球蛋白单可变结构域(isv)”都是本领域熟知的，并描述与靶抗原结合的抗体的单可变片段。这些术语在本文中可互换使用。如下所述，一些实施方案涉及单个重链可变结构域抗体/免疫球蛋白重链单可变结构域，其在不存在轻链的情况下结合pd-1抗原。一些实施方案涉及人重链可变结构域抗体。此种结合分子在本文中也称为是crescendobiologiesltd.的注册商标。因此，在一些实施方案中，本发明的分离的结合剂/分子包含或由至少一种单结构域抗体组成，其中所述结构域是人重链可变结构域。因此，在一方面，本发明的结合剂包含或由至少一个具有vh结构域，并且没有vl结构域的免疫球蛋白单可变重链结构域组成。术语“分离的”单结构域抗体是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他单结构域抗体、抗体或抗体片段的单结构域抗体。此外，分离的单结构域抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。每个单个vh结构域抗体包含三个cdr和四个fr，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。因此，在本发明的一个实施方案中，结构域是具有下式fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的人可变重链(vh)结构域。可以对本发明的单结构域抗体进行c或n-末端vh框架序列的修饰以改善其性质。例如，vh结构域可以包含c或n末端延伸或缺失。可以将c末端延伸添加至以残基vtvss(seqidno.516)终止的vh结构域的c末端。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体包含1至50个或更多个残基的c末端延伸或缺失，例如1至25个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个另外的氨基酸。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体包含人ch1结构域的另外的氨基酸，因此c末端延伸到ch1结构域。在一个实施方案中，所述延伸包含至少1个丙氨酸残基，例如单个丙氨酸残基，一对丙氨酸残基或丙氨酸残基的三联体。另外的c或n-末端残基可以是用于将本发明的单结构域抗体与另一结构部分或有助于检测分子的标签缀合的接头。此种标签在本领域中是公知的，并且包括例如接头his标签，例如hexa-his(hhhhhh，seqidno.517)或myc标签。如本文所用，术语“同源性”通常是指序列中的氨基酸残基与比较序列的参考多肽的残基相同的百分比，在比对序列后和在一些实施方案中在引入缺口后，如果必要，以达到最大的同源性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。因此，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。n-或c-末端延伸、标签或插入均不应被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是众所周知的。可以使用众所周知的数学算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。根据本发明的各个方面和实施方案，本发明的单结构域抗体的可变结构域优选是人可变结构域(vh)。如本文所用，人vh结构域包括完全的人或大体上完全的人vh结构域。如本文所用，术语人vh结构域还包括由表达完全人免疫球蛋白重链基因座的转基因小鼠制备的仅有重链的抗体中分离的vh结构域，特别是响应于用目标抗原免疫的转基因小鼠，例如如wo2016/062990和实施例中所述的。在一个实施方案中，人vh结构域还可以包括衍生自或基于人vh结构域氨基酸或编码这种vh结构域的核酸序列的vh结构域。因此，该术语包括衍生自人种系免疫球蛋白序列或由其编码的可变重链区。衍生自或基于人vh结构域的基本的人vh结构域或vh结构域可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，体外引入的突变，例如通过随机或位点特异性诱变引入的突变，或通过体内体细胞突变引入的突变)。因此，术语“人vh结构域”还包括基本的人vh结构域，其中一个或更多个氨基酸残基被修饰。例如，与完全的人序列相比，基本的人vh结构域可包括最多10个，例如1、2、3、4或5个或最多20个氨基酸修饰。然而，如本文所用，术语“人vh结构域”或“基本的人vh结构域”不旨在包括其中衍生自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的cdr序列已经移植到人框架序列上的抗体。优选地，如本文所用，术语“人vh结构域”也不旨在包括骆驼化vh结构域，即已被特异性修饰的人vh结构域，例如在体外通过常规诱变方法选择vh结构域序列中预定位置，并在预定位置处引入一个或更多个点突变以将一个或更多个预定残基改变为可在骆驼科动物vhh结构域中发现的特定残基。如实施例中所示，发明人已经鉴定了在pd-1的共同的残基处与pd-1结合的vh结构域，即人pd-1的r104、d105、f106、h107、m108、s109和v110。在一个实施方案中，本发明因此涉及分离的单结构域抗体，其结合包含选自人pd-1的r104、d105、f106、h107、m108、s109和v110的一个或更多个或全部残基的人pd-1的表位、表位部分、结构域、亚基或构象。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象还包含g103、v111、r112和a113中的一个或更多个或全部。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含g103。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含r104。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含s109。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含v110。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含v111。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含r112。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含a113。如实施例中所示，本文所述的单结构域抗体确实与这些残基共同结合。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含人pd-1的g103、r104、s109、v110、v111、r112和a113的全部。在一个实施方案中，上述所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象还包含人pd-1的残基n102、d105、f106、h107、m108、r114和r115中的一个或更多个或全部。所述表位还包含选自n33、p34、p35、t36、f37、s38、c54、f55、s56、n57、t58、s59、e60、s61、f62、v63、l64、n65、w66、p101和g103中的一个或更多个或全部的残基。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含n102。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含d105。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含f106。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含h107。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象还包含m108。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含r114。在一个实施方案中，所述表位、表位部分、结构域、亚基或构象包含r115。在另一个实施方案中，单结构域抗体结合包含选自人pd-1的r104、d105、f106、h107、m108、s109和v110中的一个或更多个或所有残基的表位，以及进一步结合s60、e61、s62、f63、v64、l65、n66、w67、y68、r69、m70、s71、g90、q91、d92、c93、r94、f95、r96、v97、t98、v111、r112、a113和r11中的一个或更多个或所有残基。如实施例中所示，家族2的vh结合这些残基。术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原(例如pd-1)表面上的包括vh单结构域抗体的免疫球蛋白、抗体或抗体片段特异性结合的位点。通常，抗原具有几个或许多不同的表位并与许多不同的抗体反应。该术语具体包括线性表位和构象表位。蛋白抗原内的表位可以由的连续的氨基酸(通常是线性表位)或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸(通常是构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常，但不总是保存在暴露于变性溶剂中，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时损失。表位通常包含独特空间构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。用于确定哪些表位与给定抗体或抗体片段结合的方法(即表位作图)是本领域公知的，包括例如免疫印迹和免疫沉淀试验，其中测试重叠或连续的肽与给定抗体或抗体片段的反应性。当两种抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否与相同或空间重叠的表位结合的最广泛使用和快速的方法是竞争试验，其可以使用标记的抗原或标记的抗体以不同的形式配置。在一个实施方案中，本发明涉及与人pd-1结合的分离的单vh结构域抗体，所述分离的单vh结构域抗体包含如下表1所示的cdr3序列或与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述序列同源性为至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中、所述序列同源性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，vh单结构域抗体具有包含seqidno.3的cdr3序列或与seqidno.3具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述序列同源性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，vh单结构域抗体具有如seqidno.1或具有1或2个氨基酸替换的seqidno.1所示的cdr1，如seqidno.2或具有1至5个氨基酸替换的seqidno.2所示的cdr2和如seqidno.3或具有1至5个氨基酸替换的seqidno.3所示的cdr3。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含选自表1中的cdr1、2和3序列或其组合的cdr1、2和3序列的组合。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含一组cdr1、2和3序列，其选自如表1中任何克隆所示的cdr1、2和3序列的组。因此，在一个方面，分离的单结构域抗体包含选自全长序列seqidno：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216或220的cdr1-3中的cdr1、cdr2和cdr3。因此，在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含具有seqidno.1的cdr1，具有seqidno.2的cdr2和具有seqidno.3的cdr3(seqidno.4的cdr)，具有seqidno.5的cdr1，具有seqidno.6的cdr2和具有seqidno.7的cdr3(seqidno.8的cdr)等等。因此，vh单结构域抗体包含以下cdr组合之一：seqidno.1、2、3；seqidno.5、6、7；seqidno.9、10、11；seqidno.1314、15；seqidno.17、18、19；seqidno.21、22、23；seqidno.25、26、27；seqidno.29、30、31；seqidno.33、34、35；seqidno.37、38、39；seqidno.41、42、43；seqidno.45、46、47；seqidno.49、50、51；seqidno.53、54、55；seqidno.57、58、59；seqidno.61、62、63；seqidno.65、66、67；seqidno.69、70、71；seqidno.73、74、75；seqidno.77、78、79；seqidno.101、102、103；seqidno.105、106、107；seqidno.109、110、111；seqidno.113、114、115；seqidno.117、118、119；seqidno.121、122、123；seqidno.125、126、127；seqidno.129、130、131；seqidno.133、134、15；seqidno.137、18、139；seqidno.141、142、143；seqidno.145、146、147；seqidno.149、150、151；seqidno.153、154、155；seqidno.157、158、159；seqidno.161、162、163；seqidno.165、166、167；seqidno.169、170、171；seqidno.173、174、175；seqidno.177、178、179；seqidno.181、182、183；seqidno.185、186、187；seqidno.189、190、191；seqidno.193、194、195；seqidno.197、198、199；seqidno.201、202、203；seqidno.205、206、207；seqidno.209、210、211；seqidno.213、214、215；seqidno.217、218、219。在另一个实施方案中，所述cdr1包含或由氨基酸序列seqidno.1或与其至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的序列组成。在一个实施方案中，所述cdr2包含或由氨基酸序列seqidno.2或与其至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的序列组成。在一个实施方案中，所述cdr3包含或由氨基酸序列seqidno.3或与其至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的序列组成。在另一个实施方案中，vh单结构域抗体包含或由如表1中所示的vh单结构域抗体1.1至1.50中的任一种所示的多肽序列或与其至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同源性的序列组成。因此，vh单结构域抗体包含或由选自seqidno.4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216或220的氨基酸序列或与其至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同源性的序列组成。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含或由seqidno.104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216或220或与其至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同源性的序列组成。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含或由seqidno.4或seqidno.176或与其至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同源性的序列组成。在一个实施方案中，所述序列同源性为至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。表1vh单结构域抗体的全长序列和cdr序列在一个实施方案中，本发明涉及分离的单vh结构域抗体，其结合人pd-1，所述单vh结构域抗体包含如下表2所示的cdr3序列或与其至少60％、70％、80％、90％、95％的或更高的序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述序列同源性为至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，所述序列同源性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，vh单结构域抗体具有cdr3序列，所述cdr3序列包含seqidno.253或与seqidno.253具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述序列同源性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，vh单结构域抗体具有如seqidno.251或具有1或2个氨基酸替换的seqidno.251所示的cdr1，具有如seqidno.252或具有1至5个氨基酸替换的seqidno.252所示的cdr2和如seqidno.253或具有1至5个氨基酸替换的seqidno.253所示的cdr3。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含选自表2中的cdr1、2和3序列或其组合的cdr1、2和3序列的组合。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含一组cdr1、2和3序列，其选自如表2中任何克隆所示的cdr1、2和3序列的组。因此，在一个方面，分离的单结构域抗体包含选自全长序列seqidno：254、258、262、266、270、274、278、282、286、290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、334、338、342、346、350、354、358、362、366、370、374、378、382、386、390、394、398、402、406、410、414、418、422、426、430、434、438、442、446、450、454、458或462的cdr1-3中的cdr1、cdr2和cdr3。于是，在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含具有seqidno.251的cdr1，具有seqidno.252的cdr2和具有seqidno.253的cdr3(seqidno.254的cdr)等等。因此，vh单结构域抗体包含以下cdr组合之一：seqidno.251、252、253；seqidno.255、256、257；seqidno.259、260、261；seqidno.263、264、265；seqidno.267、268、269；seqidno.271、272、273；seqidno.275、276、277；seqidno.279、280、281；seqidno.283、284、285；seqidno.287、288、289；seqidno.291、292、293；seqidno.295、296、297；seqidno.299、300、301；seqidno.303、304、305；seqidno.307、308、309；seqidno.311、312、313；seqidno.315、316、317；seqidno.319、320、321；seqidno.323、324、325；seqidno.327、328、329；seqidno.331、332、333；seqidno.335、336、337；seqidno.339、340、341；seqidno.343、344、345；seqidno.347、348、349；seqidno.351、352、353；seqidno.355、356、357；seqidno.359、360、361；seqidno.363、364、365；seqidno.367、368、369；seqidno.371、372、373；seqidno.375、376、377；seqidno.379、380、381；seqidno.383、384、385；seqidno.387、388、389；seqidno.391、392、393；seqidno.395、396、397；seqidno.399、400、401；seqidno.403、404、405；seqidno.407、408、409；seqidno.41l、412、413；seqidno.415、416、417；seqidno.419、420、421；seqidno.423、424、425；seqidno.427、428、429；seqidno.431、432、433；seqidno.435、436、437；seqidno.439、440、441；seq1dno.443、444、445；seqidno.447、448、449；seqidno.451、452、453；seqidno.455、456、457或seqidno.459、460、461。在另一个实施方案中，所述cdrl包含或由氨基酸序列seqidno.251或与其至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的序列组成。在一个实施方案中，所述cdr2包含或由氨基酸序列seqidno.252或与其至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的序列组成。在一个实施方案中，所述cdr3包含或由氨基酸序列seqidno.253或与其至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的序列组成。在另一个实施方案中，vh单结构域抗体包含或由如表2中所示的vh单结构域抗体2.1至2.53中的任一种所示的多肽序列或与其至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同源性的序列组成。因此，vh单结构域抗体包含或由选自seqidno.254、258、262、266、270、274、278、282、286、290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、334、338、342、346、350、354、358、362、366、370、374、378、382、386、390、394、398、402、406、410、414、418、422、426、430、434、438、442、446、450、454、458或462的氨基酸序列或与其至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同源性的序列组成。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含或由seqidno.298、302、306、310、314、318、322、326、330、334、338、342、346、350、354、358、362、366、370、374、378、382、386、390、394、398、402、406、410、414、418、422、426、430、434、438、442、446、450、454、458或462或与其至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同源性的序列组成。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含或由254或298或与其至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同源性的序列组成。在一个实施方案中，所述序列同源性为至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。表2vh单结构域抗体的全长序列和cdr序列在一些实施方案中，本发明提供vh单结构域抗体，其是具有一个或更多个氨基酸替换、缺失、插入或其他修饰的任意上述的单vh结构域抗体的变体，并且保留单结构域抗体的生物学功能。因此，变体vh单结构域抗体可以是设计的序列。修饰包括编码单结构域抗体或多肽的一个或更多个密码子的至少一个替换、缺失或插入，其导致与天然序列的vh单结构域抗体或多肽相比氨基酸序列的变化。氨基酸替换可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸的结果，例如用丝氨酸取代亮氨酸，即保守氨基酸取代。插入或缺失可任选地在约1至10个的范围内，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸或1至20个氨基酸。允许的变化可以通过系统地进行序列中氨基酸的插入、缺失或替换并测定所得变体的全长或成熟天然序列所展现的活性来确定。本文所述的vh单域抗体的变体与非变体分子具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性，优选至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。在一个实施方案中，修饰是保守序列的修饰。如本文所用，术语“保守序列修饰”意指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入本发明的抗体中，例如定点突变和pcr介导的突变。保守氨基酸替换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸替换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的单结构域抗体的cdr区内的一个或更多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能试验测定改变的抗体的保留功能(即上述(c)至(i)中所述的功能)。在一些实施方案中，本发明提供vh单结构域抗体，其是选自表1或2中所示的单结构域抗体的变体，其包含一个或更多个序列修饰，并且与未修饰的单结构域抗体相比，具有一种或更多种性质的改善，例如结合亲和力、特异性、热稳定性、表达水平、效应功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解度。在一个实施方案中，可以进行修饰以降低单结构域抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基恢复为相应的人种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的单结构域抗体可含有不同于衍生单结构域抗体的种系序列的框架残基。可以通过将单结构域抗体框架序列与衍生单结构域抗体的种系序列进行比较来鉴定这些残基。为了使框架区序列中的一个或多个氨基酸残基返回其种系构型，可以通过例如定点突变或pcr介导的突变将体细胞突变“回复突变”至种系序列。另一种类型的框架修饰涉及突变框架区内，或甚至一个或更多个cdr区内的一个或更多个残基，以去除t细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。在另一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。这种糖类修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或更多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或更多个氨基酸替换，其导致消除一个或更多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。技术人员将知道存在不同方式来鉴定、获得和优化如本文所述的抗原结合分子，包括体外和体内表达文库。这在实施例中进一步描述。可以使用本领域已知的优化技术，例如展示(例如核糖体和/或噬菌体展示)和/或突变(例如易错突变)。因此，本发明还包括本文所述的单结构域抗体的序列优化变体。在一个实施方案中，变体vh单结构域抗体选自seqidno.4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220或254、258、262、266、270、274、278、282、286、290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、334、338、342、346、350、354、358、362、366、370、374、378、382、386、390、394、398、402、406、410、414、418、422、426、430、434、438、442、446、450、454、458或462中的任一个，但与这些序列相比，包含一个或更多个氨基酸替换，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替换。在一个实施方案中，一个或更多个氨基酸替换在一个或更多个框架区中。在另一个实施方案中，一个或多个氨基酸替换在一个或更多个cdr中。在一个实施方案中，氨基酸替换在框架和cdr序列中。在一个实施方案中，单结构域抗体包含或由seqidno.4或136或包含一个或更多个氨基酸替换的序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替换的序列组成。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含seqidno.4，所述seqidno.4在一个或更多个或所有下列位置具有氨基酸替换：5l、32h、44g、55s、66d、77s和/或105t。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含seqidno.4，所述seqidno.4的氨基酸替换选自以下之一：a)5l→v、11s→l、32h→y、44g→d、55s→g、62d→a、66d→g和77s→n或b)5l→v、11s→l、32h→y、44g→d、55s→g、66d→g和77s→n或c)1e→q、5l→v、11s→l、32h→y、44g→d、55s→g、66d→g、77s→n、98r→k、99e→d、105t→i和102m→t。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含seqidno.136，所述seqidno.136在一个或更多个或所有下列位置具有氨基酸替换：m34、m58、v102、v116。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含seqidno.136，所述seqidno.136的氨基酸替换选自以下之一：a)m34→l、m58→y、v116a(1.39)；b)m34→f、g54→a、m58→q、v102a(1.50)；c)v116a(1.26)；d)m34→l、m58→q、v116a(1.40)。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含seqidno.254，所述seqidno.254在一个或更多个或所有下列位置具有氨基酸替换：g109、d66、g55。在一个实施方案中，vh单结构域抗体包含seqidno.254，所述seqidno.254的氨基酸替换选自以下之一：a)g109→d、d66→g、g55→a(2.12)；b)g109→d、g55→a(2.27)；c)g109→d(2.53)；d)g109→d、d66→g(2.29)；e)g109→v、d66→g(2.28)。在一个实施方案中，当在位置1处发现q时，将q改变为e或另一残基。上面使用的编号基于分子中残基的实际位置。因此，通常可以在不改变多肽的生物活性、功能或其他所需性质(例如亲和力或其对抗原的特异性)的情况下进行这些氨基酸改变。通常，多肽的非必需区域中的单个氨基酸替换基本上不改变生物活性。此外，在结构或功能上相似的氨基酸的替换不太可能破坏多肽的生物活性。包含本文所述多肽和肽的氨基酸残基的缩写，以及这些氨基酸残基的保守取代展示在下表中。氨基酸残基和保守氨基酸替换的实例本发明的vh单结构域抗体展现优异的稳定性。此外，本发明的vh单结构域抗体还显示出对人pd-1的高特异性和快速结合率(参见实施例)。如本文进一步描述的和实施例中所示，本发明的vh单结构域抗体优选具有kd和ec50值。在一个实施方案中，vh单结构域抗体以结合亲和力kd10-8至10-10特异性结合人pd-1。在另一个实施方案中，单结构域抗体具有亚纳摩尔范围的ec50值，如在结合cho-pd-1细胞系中所测定的。术语“kd”是指“平衡解离常数”，并且是指在平衡状态的滴定测量中获得的值或通过解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)获得的值。“ka”指亲和常数。结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示抗体与抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法是本领域熟知的。使用基于荧光技术提供高灵敏度和在平衡状态下检验生理缓冲液中样品的能力。可以使用其他实验方法和仪器，例如(生物分子相互作用分析)试验。在一个实施方案中，单结构域抗体具有纳摩尔或亚纳摩尔(subnanomaolar)范围的kd值。本发明进一步提供编码本发明的单结构域抗体的分离的核酸。核酸可包括dna和/或rna。在一个方面，本发明提供编码如表1或2中所示的本发明的cdr，例如cdr3，一组两个或三个cdr或vh单结构域抗体的核酸。在一个方面，本发明因此还涉及包含或由选自seqidno.81至100或221至250的序列的核酸序列组成。这些编码vh单结构域抗体，如表1所示。在一个方面，本发明因此还涉及包含或由选自seqidno.463至515的序列的核酸序列组成。这些编码vh单结构域抗体，如表2所示。在一个实施方案中，核酸序列与选自表2的上述核酸序列之一具有至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同源性。在一个实施方案中，所述序列同源性为至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％。根据本发明的核酸可包含dna或rna，并且可以全部或部分合成或重组产生。除非上下文另有要求，提及本文所述的核苷酸序列包括具有指定序列的dna分子，并且包括具有指定序列的其中u取代t的rna分子。此外，本发明涉及包含至少一种如上定义的核酸的核酸构建体。构建体可以是质粒、载体、转录或表达盒的形式。本发明还涉及分离的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含一种或多种如上所述的核酸构建体。宿主细胞可以是细菌、病毒、昆虫、植物、哺乳动物或其他合适的宿主细胞。在一个实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞。在另一个实施方案中，细胞是酵母细胞。在另一个实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一个实施方案中，提供了制备如本文所述的抗pd-1单结构域抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达编码单结构域抗体的多核苷酸的条件下培养宿主细胞，并分离单结构域抗体。另一方面，本发明提供与本发明的任意pd-1单域抗体相同的人pd-1表位结合的抗体或其片段(即具有与本发明的任何单结构域抗体交叉竞争结合pd-1的能力的抗体)。在优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参考抗体可以是单结构域抗体1.1(seqidno.4)或2.1(seqidno.254)。在标准的pd-1结合试验中，这种相互竞争的抗体可以根据其与任意单域抗体1.1至1.50或2.1至2.53的交叉竞争能力来鉴定。例如，biacore分析，elisa试验或流式细胞术可用于证明与本发明的单结构域抗体的交叉竞争。在一个实施方案中，本发明提供了能够结合人pd-1的结合剂，其中上述任何一种单结构域抗体在竞争性试验中取代结合剂。在一个实施方案中，所述是单结构域抗体seqidno.4。在一些实施方案中，结合剂是抗体，其功能片段，例如单结构域抗体或抗体模拟蛋白。另一方面，本发明提供了能够结合人pd-1的结合剂，其中结合剂在竞争性试验中取代上述任何一种单结构域抗体。在一个实施方案中，所述单结构域抗体包含seqidno.4、176、254或298。另一方面，本发明提供能够结合人pd-1的结合剂，其中结合剂与本发明的单结构域抗体结合基本上相同的表位。另一方面，本发明提供分离的仅有重链的抗体，所述分离的仅有重链的抗体包含如本文所述的vh结构域，并列于表1或2中。在一个方面，本发明涉及包含根据本发明的单结构域抗体的结合剂和至少第二结构部分。因此，本发明提供了多功能分子。在一个实施方案中，所述至少第二结构部分是结合分子，例如选自抗体或抗体片段(例如fab、f(ab′)2、fv、单链fv片段(scfv)或单结构域抗体，例如vh结构域)或抗体模拟蛋白。在一个实施方案中，至少第二结构部分是vh结构域。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体可以与抗体fc区或其片段连接，所述抗体fc区或其片段包含ch2和ch3结构域中的一个或两个，以及任选的铰链区。结合剂可以是多价的，例如二价的或多互补位的，例如双互补的。因此，结合分子可包含第一vh单结构域抗体和vh(a)和第二vh单结构域抗体和vh(b)，因此具有下式：vh(a)-vh(b)。每个vh包括cdr和fr区。因此，结合分子可具有下式：fr1(a)-cdr1(a)-fr2(a)-cdr2(a)-fr3(a)-cdr3(a)-fr4(a)-fr1(b)-cdr1(b)-fr2(b)-cdr2(ba)-fr3(b)-cdr3(b)-fr4(b)。免疫球蛋白单可变结构域a和b的顺序没有特别限制，因此，在本发明的多肽内，免疫球蛋白单可变结构域a可位于n末端，免疫球蛋白单可变结构域b可位于c末端，或相反亦然。vh结构域抗体通常通过接头连接。在一个实施方案中，结合分子是双互补位的。在一个实施方案中，结合分子是双特异性的。因此，在一个方面，本发明涉及双特异性分子，所述双特异性分子包含与第二功能结构部分连接的本文所述的单结构域抗体，所述第二功能结构部分具有与所述单结构域抗体不同的结合特异性。在一个实施方案中，提供了双互补位结合分子，所述双互补位结合分子包含结合靶蛋白pd-1但在不同或重叠位点的第一和第二结合分子。在表位分组研究中可以看到完全或部分阻断。第一结合分子是根据本发明的单结构域抗体。在一个实施方案中，第二结合分子是阻断人pd-1与其配体之一的相互作用的pd-1抑制剂。在一个实施方案中，第二结合分子阻断pd-1与pd-l1的相互作用。在一个实施方案中，第二结合分子阻断pd-1与pd-l2的相互作用。在一个实施方案中，第二结合分子阻断pd-1与pd-l1和pd-l2的相互作用。第一和第二的顺序是结合分子，没有特别限制且可以颠倒。在一个实施方案中，pd-1抑制剂是选自或的抗pd-1抗体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是的替代名称包括mdx-1106、mdx-1106-04，ono-4538、或bms-936558。在其他实施方案中，抗pd-1抗体是(商品名以前称为又称为merck3745、mk-3475或sch-900475)是与pd-1结合的人源化igg4单克隆抗体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是(ct-011；curetech)是与pd-1结合的人源化igg1k单克隆抗体。在一个实施方案中，pd-1抑制剂是vh单结构域抗体。因此，另一方面涉及具有下式的结合分子：vh(a)-l-vh(b)或vh(b)-l-vh(a)，其中vh(a)-是如本文所公开的vh单结构域抗体，并且其中vh(b)是阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2结合的vh单结构域抗体。l是接头。合适的接头包括例如具有gs残基的接头，例如(gly4ser)n，其中n＝从1至20，如1至10，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，接头是(gly4ser)n，其中n＝4或更大。如实施例中所示，我们惊奇地展示结合分子具有下式：vh(a)-l-vh(b)，如上所述，与阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2结合并且不与非阻断性vh单结构域抗体连接的vh单结构域抗体相比，所述结合分子提供增强的抑制效果。因此，本文所述的vh单结构域抗体特别用于与阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2的结合或结合双互补位分子中的另一表位的vh单结构域抗体组合。在另一个实施方案中，方向是vh(b)-l-vh(a)。在一个实施方案中，l是(gly4ser)n，其中n是4或更大。在一个实施方案中，结合分子是多价的，例如二价的。二价结合分子包含两个结合相同靶蛋白的vh单结构域抗体；例如人pd-1，在相同位点。在一个实施方案中，此种分子可包含相同的vh。在另一个实施方案中，此种分子可能包含两个属于相同家族的vh单结构域抗体，即选自表1或2中所示的序列。在另一个实施方案中，此种分子可能包含两个不属于相同家族，但结合人pd-1上的相同位点的vh单结构域抗体，例如，表1中所示的vh单结构域抗体与表2中所示的vh单结构域抗体连接。可以使用本领域已知的方法构建本发明的双特异性和二价结合分子。在某些实施方案中，结合剂是多特异性的形式，例如双特异性，结合剂提供多种功能。此种多特异性试剂包含具有对pd-1的第一结合特异性的根据本发明的单结构域抗体和至少一种具有第二结合特异性的其他结合分子。所述其他结合分子可选自抗体、抗体片段或抗体模拟物。在一个实施方案中，所述抗体片段选自f(ab′)2、fab、fv、sfv或结构域抗体。在一个实施方案中，所述抗体片段是vh单结构域抗体。在一个实施方案中，结合剂是双特异性的并且包含具有对pd-1的第一结合特异性的根据本发明的单结构域抗体和第二结合特异性的第二结合分子。在一个实施方案中，第二结合分子结合免疫调节剂、限制点调节剂、参与t细胞活化的试剂、肿瘤微环境改性剂(tme)或肿瘤特异性靶标。例如，免疫调节剂可以是免疫限制点分子的抑制剂，所述抑制剂为选自pd-l1、pd-l2、ctla-4、tim-3、lag-3、ceacam、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4或tgfrβ中的一种或更多种的抑制剂。在另一个实施方案中，免疫调节剂可以是共刺激分子的活化剂，其选自il-2、il-12、ox40、ox40l、cd2、cd3、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3、b7-h4或cd83配体、cd3、cd8、cd28、cd4或icam-1中的一种或更多种的激动剂。在一个实施方案中，上述结合剂包含其他结合分子。因此，结合剂可以是三特异性的或四特异性的。还预想了其他的特异性。上述分子的任何组合可以在多特异性结合剂中制备，例如，包含本发明的单结构域抗体和第二和第三结合特异性的三特异性结合剂。在另一个实施方案中，至少第二结构部分可用于延长结合分子的半衰期。第二结构部分可包含结合血清白蛋白的蛋白质，所述蛋白例如抗体或其部分，所述血清白蛋白例如人血清白蛋白(hsa)或小鼠血清白蛋白(msa)。第二结构部分可包含结合血清白蛋白的vh结构域，所述血清白蛋白例如人血清白蛋白(hsa)或小鼠血清白蛋白(msa)。第二结构部分可包含血清白蛋白，例如血清白蛋白。人血清白蛋白(hsa)或其变体如hsac34s。进一步提供如本文所述的包含vh结构域和fc结构域的结合分子，例如，其中vh结构域与fc结构域融合。还提供了包含特异性结合第二抗原的第二可变结构域的结合分子，其中第二抗原是除人pd-1之外的抗原。第二抗原可以是分化簇(cd)分子或主要组织相容性复合物(mhc)ii类分子。在一个实施方案中，本发明的抗pd-1单结构域抗体或多价结合剂用可检测或功能性标记来标记。标记可以是产生或可以被诱导产生信号的任何分子，包括但不限于荧光基团、荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂、核磁共振活性标记或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或光吸收来检测和/或测定结合。在其他实施方案中，本发明的抗pd-1单结构域抗体或多价结合剂与至少一种治疗结构部分偶联，例如药物、酶或毒素。在一个实施方案中，治疗结构部分是毒素，例如细胞毒性放射性核素、化学毒素或蛋白质毒素。另一方面，本发明的抗pd-1单结构域抗体或多价结合剂被修饰以增加半衰期，例如通过化学修饰，尤其是通过peg化，或通过掺入脂质体或使用血清白蛋白。半衰期可以比本发明相应的vh单结构域抗体的半衰期增加至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍或更长。例如，与本发明相应的vh单结构域抗体相比，增加的半衰期可以超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，例如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时。为了产生如上所述的多价结合剂，两个结合分子通过接头连接，例如多肽接头。合适的接头包括例如具有gs残基的接头，例如(gly4ser)n，其中n＝从1至20，如1至10，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，抗pd1单结构域抗体也可以被格式化以诱导pd-1激动，例如以二价或双互补位形式。pd-1信号传导由pd-l1诱导并导致t细胞活性的下调。可以说诱导pd-1信号传导的是“pd1激动剂”，其与t细胞激动剂具有相对效果。我们提供能够在缺乏cd3或t细胞受体聚集抗体的情况下引起pd-1激动的pd-1参与者的证据。测定pd-1激动作用的示例性系统是展示pd-1信号传导发生时的响应的报告细胞系。配体(pd-l1)驱动此响应。能够进行轻度激动和双互补位形式的多价vh增强了这一点。因此，选自表1的vh单结构域抗体可以与选自表1的另一种vh单结构域抗体组合以提供激动功能。在另一个实施方案中，选自表2的vh单结构域抗体可以与选自表2的另一种vh单结构域抗体组合以提供激动功能。在另一个实施方案中，选自表1的vh单结构域抗体可以与选自表2的另一种vh单结构域抗体组合以提供激动功能。双互补位形式具有式：vh(a)-l-vh(b)或vh(b)-l-vh(a)，其中vh(a)-是如本文所公开的vh单结构域抗体(即选自表1或2)，并且其中vh(b)是阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2结合的vh单结构域抗体。在另一个实施方案中，方向是vh(b)-l-vh(a)。l是接头。合适的接头包括例如具有gs残基的接头，例如(gly4ser)n，其中n＝从1至10，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，接头是(gly4ser)n，其中n＝小于4，例如1、2或3。双互补位分子可以增强受体交联。双互补位分子结合单个pd1单体上的两个表位。或者，它可以使一个臂与一个pd1分子接合而另一个臂与第二个分子接合。第二分子仍然具有用于其他双互补位接合的可利用的表位，因此pd1分子的“链”可以聚集在一起。比(gly4ser)4更短的接头可以防止与单个分子结合并且可以促进交联，从而允许pd1激动。该功能的优选实施方案是多价分子，理想地具有非拮抗功能，通过少于(gly4ser)4的接头连接，优选具有至少2个表位。在一个实施方案中，l(gly4ser)n中n为1、2、3或4。我们的数据展示了含有拮抗剂和锚点的双原位形式。尽管这可以诱导pd1信号传导，但是对配体结合表位进行足够的掩蔽以使其阻断配体诱导的信号传导并具有拮抗功能。如上所述的pd-1激动剂可用于治疗自身免疫和/或炎症和/或感染性疾病。因此，另一方面涉及如上所述的pd-1激动剂用于治疗自身免疫和/或炎性和/或感染性疾病，以及包括给予如上所述的pd-1激动剂用于治疗自身免疫和/或炎性和/或感染性疾病的方法。因此，另一方面涉及激动多价或多互补分子，其包含本文所述的单结构域抗体与本文所述的另一单结构域抗体的组合(例如表1的一种单结构域抗体与表1的另一单结构域抗体组合)或与pd-1阻断剂组合。本文所述的单结构域抗体可以从转基因啮齿动物获得，所述转基因啮齿动物在用pd-1抗原刺激后表达仅有重链的抗体。转基因啮齿动物，例如小鼠，优选具有降低的表达内源抗体基因的能力。因此，在一个实施方案中，啮齿动物具有降低的表达内源性轻链和/或重链抗体基因的能力。因此，啮齿动物可以包含破坏内源性κ和λ轻链和/或重链抗体基因表达的修饰，从而不产生功能性轻链和/或重链，例如如下面进一步解释的。本发明还涉及产生能够结合人pd-1的仅有人重链的抗体的方法，所述抗体不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2的相互作用，所述方法包括：a)用pd-1抗原免疫转基因啮齿动物，其中所述啮齿动物表达包含未重排的人重链v基因并且不能产生功能性内源性轻链或重链的核酸构建体；b)分离人仅有重链的抗体；c)鉴定与人pd-1结合但不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2相互作用的仅有重链的抗体。进一步的步骤可包括从所述人仅有重链的抗体分离vh结构域或产生包含来自所述小鼠的vh结构域序列的序列文库和包含来自所述文库的vh结构域序列的分离序列。本发明还涉及产生能够结合人pd-1的单个vh结构域抗体的方法，所述方法包括：a)用pd-1抗原免疫转基因啮齿动物，其中所述啮齿动物表达包含未重排的人重链v基因并且不能产生功能性内源性轻链或重链的核酸构建体；b)产生包含来自所述小鼠的vh结构域序列的序列文库；c)分离包含来自所述文库的vh结构域序列的序列；d)鉴定与人pd-1结合但不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2相互作用的vh结构域。例如，如实施例中所示的功能试验可用于评估仅有重链的抗体或vh结构域是否与pd-1结合但不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2的相互作用。利用体外表达文库制备或产生本文所述多肽、核酸、宿主细胞、产物和组合物的方法可包括步骤：a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；b)筛选可结合pd-1/具有对pd-1的亲和力，并且不阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2的相互作用的所述氨基酸序列的组、集合或文库；c)分离可与pd-1结合/具有对pd-1的亲和力的氨基酸序列。在上述方法中，氨基酸序列的组、集合或文库可在噬菌体、噬菌粒、核糖体或合适的微生物(例如酵母)中展示，以便于筛选。用于展示和筛选氨基酸序列的(组、集合或文库)的合适方法，技术和宿主生物对于本领域技术人员而言是清楚的(参见例如phagedisplayofpeptidesandproteins：alaboratorymanual，academicpress；第一版(1996年10月28日)briank.kay，jillwinter，johnmccafferty)。通过分离表达抗原特异性仅有重链的抗体的细胞或组织，从分离的细胞或组织衍生的mrna克隆编码vh结构域的序列，产生文库，例如噬菌体文库，并利用文库展示编码蛋白。vh结构域可以在细菌、酵母、昆虫、植物、哺乳动物或其他表达系统中表达。本发明还涉及分离的vh单结构域抗体或分离的仅有重链的抗体，所述vh单结构域抗体或仅有重链的抗体包含与pd-1结合的vh结构域，其包含人vh种系序列的氨基酸产物或衍生自人vh种系序列。仅有重链的抗体可以是完全的人的或包含小鼠的序列。在本文中的本发明的各个方面和实施方案中，术语啮齿动物可以涉及小鼠或大鼠。在一个实施方案中，啮齿动物是小鼠。小鼠可包含非功能性内源λ轻链基因座。因此，小鼠不能产生功能性内源λ轻链。在一个实施方案中，通过插入、倒位、重组事件、基因编辑或基因沉默，λ轻链基因座部分或完全缺失或使其失去功能。例如，至少恒定区基因c1、c2和c3可以通过如上所述的插入或其他修饰而缺失或变得无功能。在一个实施方案中，基因座功能性沉默，使得小鼠不产生功能性λ轻链。此外，小鼠可包含非功能性内源κ轻链基因座。因此，小鼠不能产生功能性内源κ轻链。在一个实施方案中，通过插入、倒位、重组事件、基因编辑或基因沉默，κ轻链基因座部分或完全缺失或使其失去功能。在一个实施方案中，基因座功能性沉默，使得小鼠不产生功能性κ轻链。具有功能性沉默的内源性λ和κl链基因座的小鼠可以，例如，如wo2003/000737中所公开的那样制备，其通过引用整体并入本文。此外，小鼠可包含非功能性内源重链基因座。因此，小鼠不能产生功能性内源重链。在一个实施方案中，通过插入、倒位、重组事件、基因编辑或基因沉默，重链基因座部分或完全缺失或使其失去功能。在一个实施方案中，基因座功能性沉默，使得小鼠不产生功能性重链。例如，如wo2004/076618(通过引用整体并入本文)中所述，所有8个内源重链恒定区免疫球蛋白基因(μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε和α)在小鼠中缺失或部分缺失到它们无功能的程度，或基因δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b和ε缺失，侧翼基因μ和α部分缺失到它们变得无功能的程度，或基因μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b和ε缺失，α部分缺失到使其变得无功能的程度，或δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε和α缺失，μ部分缺失到使其变得无功能的程度。部分缺失是指内源基因座基因序列已被删除或破坏，例如通过插入，在某种程度上非功能性内源基因产物被基因座编码，即非功能性产物从基因座表达。在另一个实施方案中，基因座是功能性沉默的。在一个实施方案中，小鼠包含非功能性内源性重链基因座、非功能性内源λ轻链基因座和非功能性内源κ轻链基因座。因此，小鼠不产生任何功能性内源轻链或重链。因此，小鼠是三重敲除(tko)小鼠。转基因小鼠可包含载体，例如用于表达异源，优选人重链基因座的酵母人工染色体(yac)。yac是可用于在酵母中克隆非常大的dna插入的载体。以及表现为像天然酵母染色体的包含必需的所有三种顺式作用结构元件(自主复制序列(ars)、着丝粒(cen)和两个端粒(tel))，它们能够接受大dna插入，使它们能够达到染色体样稳定性和酵母细胞传递保真度所需的最小尺寸(150kb)。yac的构建和使用在本领域中是众所周知的(例如，bruschi，c.v.和gjuracic，k.yeastartificialchromosomes，encyclopediaoflifesciences，2002macmillanpublishersltd，naturepublishinggroup)。例如，yac可包含大量的未重排的人vh、d和j基因与缺乏ch1结构域、小鼠增强子和调节区的小鼠免疫球蛋白恒定区基因的组合。人vh、d和j基因是人vh、d和j基因座，它们是完全的人的未重排基因。在实施例部分提供了这种yac的示例。本领域已知的替代方法可用于内源性小鼠或大鼠免疫球蛋白基因的缺失或失活，以及人vh、d和j基因与缺乏ch1结构域、小鼠增强子和调节区的小鼠免疫球蛋白恒定区基因的组合的引入。可以根据实施例中所示的标准技术产生转基因小鼠。用于产生转基因小鼠的两种最具特征的途径是通过原核显微注射遗传物质到新鲜受精的卵母细胞中或通过将稳定转染的胚胎干细胞引入桑椹胚或胚泡期胚胎中。无论遗传物质是如何被引入的，被操纵的胚胎都被转移到假孕的雌性受体，其中怀孕继续并且候选转基因幼崽出生。这些广泛方法之间的主要区别在于es克隆可以在用于产生转基因动物之前进行广泛筛选。相反，原核显微注射依赖于在引入后整合到宿主基因组的遗传物质，并且一般而言，直到幼仔出生后才能确认转基因的成功并入。本领域已知有许多方法可以辅助和确定是否发生转基因的成功整合。转基因动物可以通过多种方式产生，包括将构建体随机整合到基因组中、位点特异性整合或同源重组。有各种工具和技术可用于驱动和选择转基因整合和随后的修饰，包括使用抗药性标记(阳性选择)、重组酶、重组介导的盒交换、阴性选择技术和核酸酶来改善重组效率。大多数这些方法通常用于es细胞的修饰。然而，一些技术可用于增强通过原核注射介导的转基因。进一步的改进可用于在所需背景内更有效地产生转基因系。如上所述，在优选的实施方案中，内源性小鼠免疫球蛋白表达被沉默以允许单独使用引入的转基因来表达可用于药物发现的仅有重链的组库(repertoire)。可以如上所述使用遗传操作的小鼠，例如对所有内源免疫球蛋白基因座(小鼠重链、小鼠κ链和小鼠λ链)沉默的tko小鼠。任何引入的转基因向该tko背景的转移可以通过繁殖来实现，或者通过常规方法或通过包含ivf步骤来实现该过程的有效扩展。然而，也可能的在转基因过程中包括tko背景。例如，对于显微注射，卵母细胞可以源自tko供体。类似地，衍生自tko胚胎的es细胞可用于转基因。其中已引入转基因以表达免疫球蛋白基因座的三重敲除小鼠在本文中称为tko/tg。在一个实施方案中，小鼠如wo2016/062990中所述。本发明还涉及啮齿动物，优选小鼠，其表达人重链基因座并且已用pd-1抗原免疫。本发明还涉及如上所述的啮齿动物，优选地是表达仅有重链的抗体的小鼠，所述抗体包含结合人pd-1的人vh结构域。优选地，所述啮齿动物不能产生功能性内源κ和λ轻链和/或重链。人重链基因座位于转基因上，可如上所述。本发明还涉及仅含抗人pd-1重链的抗体，所述仅含抗人pd-1重链的抗体包含人vh结构域或抗人pd-1单vh结构域抗体，所述人vh结构域或抗人pd-1单vh结构域抗体获自或可从用人pd-1抗原免疫且表达人重链基因座的啮齿动物，优选小鼠获得。优选地，所述啮齿动物不能产生功能性内源κ和λ轻链和/或重链。人重链基因座位于可如上所述转基因上。在本发明的另一个方面，提供了一种包括根据本发明的单结构域抗体和可选的药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的单结构域抗体或发明的药物组合物可通过任何方便的施用方式，包括但不限于口服、外用、肠外、舌下、直肠、阴道、眼、鼻、肺、皮内注射、intravitrial、肌内、腹腔内、静脉注射、皮下、颅内、皮肤、转化粘液质，通过吸入，或外部，尤其是耳朵、鼻子、眼睛、或皮肤或通过吸入。肠胃外给药包括，例如，静脉内、肌肉内、动脉内、腹腔内、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下给药。优选地，该组合物为胃肠外施用。药学上可接受的载体或媒介物可以是颗粒状的，因此组合物为例如片剂或粉末形式。术语“载体”指稀释剂、佐剂或赋形剂，与本发明的药物抗体偶联物一起施用。这种药学载体可以是液体，如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成原料的液体，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是生理盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、硅胶、尿素等。此外，还可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施例中，当给动物施用时，本发明的单结构域抗体或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当静脉注射本发明的药物抗体偶联物时，水是优选的载体。盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可作为液体载体，特别用于注射溶液。适宜的药物载体还包括辅料，如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明组合物还可以包含少量润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。本发明的药物组合物可以是液体的形式，例如溶液、乳液或悬浮液。该液体可用于注射、输液(如静脉输液)或皮下注射。当用于口服给药时，该组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文所述的固体或液体形式中。作为口服给药的固体组合物，可将组合物配制成粉末、颗粒、压片、药丸、胶囊、口香糖、威化片或类似形式。这种固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂。此外，可以存在以下一种或多种粘合剂：如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；淀粉、乳糖、糊精等赋形剂，海藻酸、海藻酸钠、玉米淀粉等崩解剂；润滑剂，如硬脂酸镁；胶质二氧化硅等助流剂；甜味剂，如蔗糖或糖精；一种调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂；还有着色剂。当该组合物以胶囊(例如明胶胶囊)的形式时，除上述类型的材料外，还可含有液体载体，如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。该组合物可以是液体的形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。该液体可用于口服或注射给药。当用于口服给药时，组合物可以包括一种或更多种甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂。在通过注射给药组合物中，还可包括一种或更多种表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂。组合物可以采用一个或多个剂量单位的形式。在具体的实施方案中，可能需要将组合物局部施用于需要治疗的区域，或通过静脉内注射或输注。在治疗特定疾病或病症中本发明的单结构域抗体的有效/起效的量将取决于疾病或病症的性质，并可通过标准临床技术确定。此外，可任选地采用体外或体内试验来帮助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量还取决于给药途径和疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。应考虑年龄、体重、性别、饮食、给药时间、排泄率、宿主情况、药物组合、反应敏感性和病情严重程度等因素。通常，该量占组合物的重量的至少约0.01％的本发明的单结构域抗体。当用于口服给药时，这个量可以变化至组合物重量的约0.1％至约80％。优选的口服组合物可包含组合物重量的约4％至约50％的本发明的单结构域抗体。制备本发明的优选组合物，使得肠胃外剂量单位含有约0.01％至约2％重量的本发明的单结构域抗体。对于通过注射给药，组合物可通常包含约0.1mg/kg至约250mg/kg的动物体重，优选约0.1mg/kg至约20mg/kg动物体重，优选约1mg/kg至约10mg/kg动物体重。在一个实施方案中，组合物以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg，约10至20mg/kg，约1至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。剂量方案可以从例如每周一次到每2、3或4周一次变化。本发明提供了治疗哺乳动物(例如人类患者)中pd-1介导的疾病或病症的方法，包括将有效量的本发明的抗体施用给有需要的哺乳动物。特别地，本发明还涉及预防和/或治疗选自癌症、免疫病症、神经疾病、炎性病症、变态反应、移植排斥、病毒感染、免疫缺陷和其他免疫系统相关病症的病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用药学活性量的本发明的单结构域抗体或药物组合物，或本发明的药物组合物。如本文所用，“进行治疗”、“治疗中”或“治疗”意指抑制或缓解疾病或病症。例如，治疗可以包括延迟与疾病或病症相关的症状的发展，和/或降低将要或预期所述疾病发展的这些症状的严重性。这些术语包括改善现有症状，预防其他症状，以及改善或预防这些症状的根本原因。因此，该术语表示对正在治疗的至少一些哺乳动物(例如人类患者)赋予有益结果。许多医学治疗对于接受治疗的一些但不是所有患者是有效的。术语“受试者”或“患者”是指治疗、观察或实验对象的动物。仅举例来说，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，例如非人灵长类动物，鼠、牛、马、犬、绵羊或猫科动物。如本文所用，术语“有效量”是指，当单独或与其他的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，在给药条件下有效实现所需的治疗或预防效果的抗pd-1抗体的量。本发明还涉及用于治疗或预防疾病的本发明的单结构域抗体或药物组合物。另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症、免疫病症、神经疾病、炎性病症、变态反应、移植排斥、病毒感染、免疫缺陷和其他免疫系统相关病症的本发明的单结构域抗体或药物组合物。另一方面，本发明涉及本发明的单结构域抗体或药物组合物在治疗或预防疾病中的应用。另一方面，本发明涉及本发明的单结构域抗体或药物组合物在制备用于治疗或预防癌症、免疫病症、神经疾病、炎性病症、变态反应、移植排斥、病毒感染、免疫缺陷或其他免疫系统相关病症中的应用。癌症可选自实体或非实体肿瘤。例如，癌症可选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、乳腺癌、脑癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌，内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿道癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、胸腺瘤、尿路上皮癌白血病、前列腺癌、间皮瘤、肾上腺皮质癌、淋巴瘤，如霍奇金病，非霍奇金病、胃癌和多发性骨髓瘤。在一个实施方案中，肿瘤是实体瘤。可相应治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌，神经胶质瘤和淋巴瘤。此类肿瘤的一些实例包括表皮样肿瘤、鳞状肿瘤，例如头部或颈部肿瘤，结肠直肠肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、包括小细胞和非小细胞肺肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝脏肿瘤。其他实例包括卡波西肉瘤、cns、肿瘤、神经母细胞瘤、毛细血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑色素瘤、胃肠和肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤，优选多形性胶质母细胞瘤和平滑肌肉瘤。本发明的拮抗剂有效的血管化皮肤癌的实例包括鳞状细胞癌、基底细胞癌和可通过抑制恶性角质形成细胞，如人恶性角质形成细胞的生长来治疗的皮肤癌。在一个实施方案中，肿瘤是非实体瘤。非实体肿瘤的实例包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。在一个方面，癌症被鉴定为pd-l1阳性癌症。在一个方面，癌症是局部晚期不可切除的、转移性或复发性的癌症。可以使用本发明的抗体抑制其生长的优选癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。在一个实施方案中，癌症在另一种治疗(例如化疗)后已进展。本发明的单结构域抗体和药物组合物特别可用于治疗与表达异常高水平pd-1的细胞(例如，耗尽t细胞、b细胞、单核细胞等)相关的癌症。其他优选的癌症包括以pd-1和/或其配体pd-l1和/或pd-l2的表达升高为特征的癌症。在一个实施方案中，癌症选自具有高水平的癌症相关基因突变和/或高水平肿瘤抗原表达的癌症。在另一个实施方案中，癌症选自已知具有免疫原性或在用其他癌症疗法治疗后能够变得具有免疫原性的癌症。免疫疾病可选自自身免疫疾病、移植物抗宿主病、关节炎、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、贝赫切特病(behcet′sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻性皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(cfids)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、丘-施综合征(churg-strausssyndrome)、瘢痕性类天疱疮、crest综合征、冷凝集素病、克罗恩病(crohn′sdisease)、盘状狼疮、基本混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病(graves′disease)，吉兰-巴雷(guillain-barre)，桥本甲状腺炎(hashimoto′sthyroiditis)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga神经病变、青少年关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、梅尼埃病(meniere′sdisease)、混合性结缔组织病、多发性硬化、视神经脊髓炎(nmo)、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性软骨炎、多发性综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象(raynauld′sphenomenon)、莱特尔综合征(reiter′ssyndrome)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征(sjogren′ssyndrome)、僵人综合征，系统性红斑狼疮、红斑狼疮、高安动脉炎(takayasuarteritis)、颞动脉/巨细胞动脉炎、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎、血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿(wegener′sgranulomatosis)。神经疾病可选自阿尔茨海默病、癫痫、帕金森病、痴呆、多发性硬化、周围神经病或带状疱疹后神经痛。本发明的单结构域抗体或药物组合物可以作为单独的活性成分施用或与一种或更多种其他治疗剂组合施用。治疗剂是可用于治疗疾病的化合物或分子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光活性剂或染料和放射性同位素。抗体分子包括完整抗体或其片段(例如，fab、f(ab′)2、fv、单链fv片段(scfv)或单结构域抗体，例如vh结构域)或抗体模拟蛋白。在一个实施方案中，单结构域抗体与现有疗法或治疗剂组合使用，例如抗癌疗法。因此，另一方面，本发明还涉及组合疗法，其包括施用本发明的单结构域抗体或药物组合物和抗癌疗法。抗癌疗法可包括治疗剂或放射疗法，并且包括基因疗法、病毒疗法、rna疗法骨髓移植、纳米疗法，靶向抗癌疗法或溶瘤药物。其他治疗剂的实例包括其他限制点抑制剂、抗肿瘤剂、免疫原性剂、减毒癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞如用肿瘤衍生的抗原或核酸脉冲的树突细胞、免疫刺激细胞因子(例如il-2、ifna2、gm-csf)，靶向小分子和生物分子(例如信号转导途径的组分，例如酪氨酸激酶的调节剂和受体酪氨酸激酶的抑制剂，以及结合肿瘤特异性抗原的试剂，包括egfr拮抗剂)、抗炎剂、细胞毒性剂、放射性毒剂或免疫抑制剂和用编码免疫刺激细胞因子(例如gm-csf)、化学疗法的基因转染的细胞。在一个实施方案中，单结构域抗体与外科手术组合使用。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体或药物组合物与免疫调节剂，限制点调节剂、参与t细胞活化的试剂、肿瘤微环境改性剂(tme)或肿瘤特异性靶标一起施用。例如，免疫调节剂可以是免疫限制点分子的抑制剂，选自pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、tim-3、lag-3、ceacam、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4或tgfrβ中的一种或多种的抑制剂。在另一实施方案中，免疫调节剂可以是共刺激分子的激活剂，其选自ox40、ox40l、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3orcd83配体、cd3、cd8、cd28、cd4或icam-1中的一种或多种的激动剂。在一个实施方案中，pd-1抑制剂是选自或的抗pd-1抗体。在本发明的一个具体实施方案中，组合物与化学治疗剂或放射疗法同时施用。在另一具体实施方案中，化学治疗剂或放射疗法在本发明组合物给药之前或之后施用，优选在本发明组合物给药之前或之后至少1小时、5小时、12小时、1天、1周、1个月、更优选数月(例如长达三个月)。在一些实施方案中，本发明的单结构域抗体可以与两种或更多种治疗剂一起施用。在一些实施方案中，本发明的结合剂可以与两种或更多种治疗剂一起施用。本发明的单结构域抗体或药物组合物可以与其他疗法或治疗化合物或疗法同时或在不同时间施用，例如同时、分别或依次。另一方面，本发明涉及免疫缀合物，其包含与至少一种治疗和/或诊断剂偶联的本发明的单结构域抗体。另一方面，本发明提供用于治疗或预防疾病或免疫应答和/或用于检测pd-1用于诊断、预后或监测疾病的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的单结构域抗体。这样的试剂盒可以包含其他组分、包装、说明书或材料以帮助检测pd-1蛋白。试剂盒可包括如上所述的本发明的标记的单结构域抗体和一种或多种用于检测标记的化合物。另一方面，本发明提供以冻干形式包装或包装在水性介质中的本发明的单结构域抗体。本发明还涉及如本文中所述的参考附图、实施例和/或表1和2单结构域抗体。另一方面，本发明的抗体用于非治疗目的，例如诊断测试和试验。用于检测测试样品中人pd-1的存在的方法包括使所述样品与根据本发明的单结构域抗体和至少一种可检测标记接触，并检测所述单结构域抗体与人pd-1的结合。在一个实施方案中，本发明涉及诊断患有癌症的患者中pd-1介导的适应性免疫抗性的方法。该方法包括使样品与本文公开的化合物接触，所述化合物已用可检测结构部分标记；检测免疫细胞(例如cd8+t细胞、b细胞和巨噬细胞)上pd-1的表达。样品可以是肿瘤组织。用于诊断目的的抗体修饰是本领域熟知的。例如，可以用配体基团如生物素或可检测的标记基团如荧光基团、放射性同位素或酶修饰抗体。可以使用常规技术标记本发明的化合物。合适的可检测标记包括但不限于荧光素，发色团、放射性原子、高电子密度试剂、酶和具有特异性结合配偶体的配体。除非本文另有定义，结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。虽然前述公开内容提供了包括在本发明范围内的主题的一般描述，包括制备和使用本发明的方法及其最佳模式，但提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实施本发明并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应理解为对本发明的限制，本发明的范围应当从权利要求及其附加于本公开的等同物中理解。鉴于本公开，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的。本说明书中提及的所有文献均通过引用整体并入本文，包括对基因登录号的引用和对专利出版物的引用。“和/或”在此使用时，将被视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组分中的每一个的具体公开。例如，“a和/或b”将被视为(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开内容，就像每个在本文中单独列出一样。除非上下文另有规定，上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。在非限制性实施例中进一步描述本发明。实施例实施例1.tg/tko小鼠的构建如前所述(wo2004/076618，wo2003/000737，ren等，genomics，84，686，2004；zou等，j.immunol.，170，1354，2003和wo2016/062990)创建了在背景内携带种系构型的人重链抗体转基因座的小鼠，所述基因座沉默用于内源性重链和轻链抗体表达(三重敲除或tko)。简而言之，转基因小鼠是在用酵母人工染色体(yac)原核显微注射新鲜受精的卵母细胞后得到的，所述酵母人工染色体包含大量的人vh、d和j基因与缺乏ch1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因，小鼠增强子和调节区的组合。酵母人工染色体(yac)是可用于在酵母中克隆非常大的dna插入的载体。以及表现为像天然酵母染色体的包含必需的所有三种顺式作用结构元件(自主复制序列(ars)、着丝粒(cen)和两个端粒(tel))，它们能够接受大dna插入，使它们能够达到染色体样稳定性和酵母细胞传递保真度所需的最小尺寸(150kb)。yac的构建和使用在本领域中是众所周知的(例如，bruschi，c.v.和gjuracic，k.yeastartificialchromosomes，encyclopediaoflifesciences，2002，macmillanpublishersltd，naturepublishinggroup/www.els.net)。使用的yac包含多个人重链v基因、多个人重链d和j基因、鼠ch1基因和鼠3′增强子基因。它缺乏ch1外显子。将转基因建立者小鼠与缺乏内源性免疫球蛋白表达的动物回交以产生用于所述免疫研究的tg/tko系。实施例2.用于免疫的抗原免疫使用购自r&d，目录号1086-pd，批号fvq081502b的重组人pd-1fc嵌合体。实施例3.免疫试验方案年龄为8-12周龄的tg/tko小鼠各自接受初始剂量50ug或10ug的重组纯化的人pd-1蛋白，所述人pd-1蛋白在完全弗氏佐剂中乳化并皮下递送，然后加入三个提高10μg的重组蛋白，在不完全弗氏佐剂中乳化，也在皮下给药，在初始引发后以不同的间隔给予。在不存在佐剂的情况下，在磷酸盐缓冲盐水中，腹腔内施用最终剂量的10μg重组纯化的人pd-1蛋白抗原。实施例4.血清elisa在免疫之前和之后从小鼠收集血清，并且通过elisa检测响应pd-1/fc免疫的血清pd-1/fc反应性重链抗体的存在，使用nuncmaxisorp板(nunc目录号443404)在pbs中用重组hupd-1-fc溶液包被过夜。用pbs洗涤平板。为了阻断非特异性蛋白质相互作用，将3％(w/v)脱脂奶粉的pbs溶液加入孔中，将板在室温下孵育至少1小时，然后弃去。将全血样品以13000rpm离心5分钟以将血液与血清分开。在聚丙烯管或板中的3％marveltm/pbs中制备血清稀释液，在室温下预孵育至少1小时，然后转移至封闭的elisa板中并孵育至少1小时。通过用pbs/tween20，然后用pbs重复洗涤除去未结合的蛋白质。将1∶10000结合生物素溶液、山羊抗小鼠igg、fcgamma亚类1特异性抗体(jackson目录号115-065-205)准备在pbs/3％marvel中，加入到每个孔中并在室温下孵育温度至少一小时。通过使用pbs/tween20和pbs重复洗涤除去未结合的检测抗体。将neutravidin-hrp的3％marvel/pbs溶液(pierce目录号31030)加入elisa板中并使其结合30分钟，然后如上洗涤。通过elisa检查小鼠血清中抗体的存在。所有小鼠均表现出强烈的免疫反应。实施例5.从免疫小鼠中产生文库来自上述免疫小鼠的文库的产生遵循如下概述的文库产生的标准试验方案。组织收集和均质化根据标准试验方案使用总脾，腹股沟和肱淋巴结。rna提取和rt-pcr脾：400μl上清液用于制备总rna。使用qiagen试剂盒(目录号74104)按照制造商的试验方案从总脾中提取rna。淋巴结：在kingfisher上通过基本相同的过程制备。根据制造商的试验方案，使用superscriptiiirt-pcr高保真试剂盒(invitrogen目录号12574-035)从rna样品中获取vh序列。对于每个脾和lnrna样品，使用单个jh引物与vh1、vh2、vh3、vh4或vh6家族的引物组合进行rt-pcr反应。通过凝胶电泳确认370bp范围内的产物。混合rt-pcr产物，以便将来自淋巴结和脾的产物组合。根据制造商的试验方案，使用genejettm纯化试剂盒(cat#k0702)纯化扩增的物质。克隆到噬菌粒载体在这些研究中使用噬菌粒载体pucg3。使用常规的基于pcr的方法从扩增的vh序列构建vh噬菌粒文库。纯化的vhrt-pcr产物用于从线性化的pucg3引发pcr反应，导致异质性vh克隆到pucg3中。在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分析pcr产物。生成噬菌粒文库通过动物源汇集vh/噬菌粒pcr产物，并根据制造商的说明使用fermentaspcr纯化试剂盒(cat.no.k0702)纯化。使用bio-radgenepulserxcell通过电穿孔将洗脱的dna用于转化tg1e.coli(lucigen，cat.no.60502-2)。电穿孔的细胞汇集。将10倍稀释系列的转化物涂布在含有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xty琼脂培养皿上。在这些培养皿上产生的菌落用于评估文库大小。将剩余的转化物涂布在补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的大型2xty琼脂生物测定皿上。所有琼脂平板在30℃孵育过夜。通过向大型生物测定皿中加入10ml2xty液体培养基来收获文库。轻轻刮擦细菌菌落并记录od600。在加入等体积的50％(v/v)甘油溶液后，将等分试样在-80℃下储存在冷冻管中，或直接用于噬菌体选择过程。实施例6.用于分离pd-1结合vh的选择策略根据公开的方法(antibodyengineering，由bennylo编辑，第8章，161-176，2004)进行文库噬菌体库存和噬菌体展示选择的制备。在大多数情况下，噬菌体展示结合淘选方法用于分离结合vh结构域。然而，本领域中充分描述了各种不同的选择方法，包括可溶性选择和在胁迫下(例如加热)进行选择。实施例7.筛选用于结合cho人pd-1细胞和抑制pd-l1结合pd-1的周质提取物选择文库后，通过细菌周质提取物的单点筛选鉴定出与表达人pd-1的cho细胞结合并且部分抑制或不抑制重组人pd-1蛋白与重组人pd-l1蛋白之间相互作用的特异性vh。从1ml培养物制备小规模细菌周质提取物，在深孔板中生长。将起始培养物用于接种96孔深孔板(fisher，cat.no.mpa-600-030x)含有2xty液体培养基(melfordcat.no.m2130)，补充0.1％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素，在37℃，250rpm振荡。当od600达到0.6-1时，通过添加100μl补充有0.5mmiptg和氨苄青霉素的2xty诱导vh产生，并使培养物在30℃下以220rpm振荡生长过夜。通过在3200rpm离心10分钟沉淀e.coli，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于120μl经冰冷的提取缓冲液(50mmmop，0.5mmedta，0.5m蔗糖)中，然后加入180μl1∶5稀释的经冰冷的提取缓冲液。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃以4500rpm离心15分钟。将上清液转移到聚丙烯板中用于试验中测定。使用荧光微体积测定技术(fmat)评估上清液中his标记的vh与cho细胞表达的人pd-1的结合，所述荧光微体积测定技术是检测定位于微孔底部的珠子或细胞的荧光的基于荧光的平台(dietz等人，cytometry23：177-186(1996)，miraglia等，j.biomol.screening4：193-204(1999)。通过标准程序使用全长人pd-1序列在内部产生chotrex人pd1细胞系。所有试剂均在含有pbs，0.1％牛血清白蛋白，0.01％叠氮化钠的fmat测定缓冲液(ph7.4)中准备。将peripreps转移到384孔黑色透明底试验平板(costarcat.no.3655)中并与1.5nm抗his(milliporecat.no.05-949)/3nm山羊抗小鼠alexafluor-488(jacksonimmunolabscat.no.115-545-071)及用draq5(thermoscientificcat.no.62251)预染色的2000cho人pd-1细胞在室温下孵育至少2小时。在488nm和640nm激发后，在ttpmirrorball盘式分析仪上的fl2(502nm-537nm)和fl5(677-800nm)通道中读平板。数据在fl5视野门控，并且门控数据的峰值强度以及fl2中值平均荧光强度用于测定vh结合。与chopd-1结合试验平行，在htrf抑制试验中通过单点筛选测试周质提取物对pd-l1蛋白与pd-1蛋白相互作用的抑制。所有样品和试剂均在含有pbs、0.1％(w/v)bsa和0.4m氟化钾的htrf试验缓冲液中准备。将周质提取物与25nm链霉素标记的人pd-l1(acrobiosystemscatno.pd1-h5282)，1.5nm抗人-fccryptatepab(cisbiocat.no.61hfcklb)，10nmstrepmab-oyster645缀合物在黑色384-浅孔板(costarcat.no.3676)中在室温下孵育至少3小时。在每个平板上设置含有周质提取物样品缓冲液总结合对照和含有过量未标记竞争剂的非特异性结合对照，以用于数据标准化。bmgpherastar盘式分析仪上在337nm激发后测量620nm和665nm的时间分辨荧光发射。数据表示为减去从非特异性结合对照孔确定的背景信号后总结合对照(％对照)的％。vh被鉴定为与fl2荧光＞1000的cho人pd-1细胞结合，并且显示pd-1与pd-l1结合的部分抑制或无抑制(图1a和b)。实施例8.测序如上鉴定的来自噬菌粒及基于vh种系和cdr3氨基酸相似性分组的每个单独的vh克隆被测序进一步表征代表性的克隆。通过序列优化克隆1.1或2.1，产生其他克隆。标准方法用于优化。如上分离的表1中所示的克隆1.1至1.18，并将其分组为单个家族。克隆1.19-1.50是克隆1.1的序列优化克隆。如上分离的表2中所示的克隆2.1至2.11，并将其分组为单个家族。克隆2.12-2.53是克隆2.1的序列优化克隆。实施例9.纯化的vh单结构域抗体的制备和表征a)纯化的vh的制备通过使用vhc-末端6xhis标签获得纯化的vh，用于周质提取物的镍-琼脂糖亲和层析纯化。将每种vh的起始培养物在2xty培养基(2xty液体培养基(melfordcat.no.m2103)补充2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素，在30℃下以250rpm振荡。然后将该过夜培养物用于接种50ml-200ml2xty培养基中，并在37℃下以250rpm振荡孵育约6-8小时(直至od600＝0.6-1.0)。将培养物以3200rpm离心10分钟，并将细胞沉淀重悬于含有100μg/ml氨苄青霉素/1mmiptg的新鲜2xty液体培养基中。将摇瓶在30℃和250rpm孵育过夜。将培养物再次以3200rpm离心10分钟并弃去上清液。通过轻轻吹打将细胞沉淀重悬于经冰冷的提取缓冲液中(20％(w/v)蔗糖，1mmedta，50mmtris-hclph8.0或50mmmops)，然后用1：5稀释的经冰冷的提取缓冲液进一步稀释。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃下以4500rpm离心15分钟。将上清液转移到含有10mm咪唑和预平衡的镍琼脂糖珠子(qiagen，ni-nta50％soln，cat.no.30210)的试管(sigmacat.no.i2399)中。vh结合在4℃下进行2小时，同时轻轻摇动。将珠子转移到polyprep柱(bioradcat.no.731-1550)并通过重力流动弃去上清液。用pbs/0.05％洗涤柱3次，然后用5mlpbs/20mm咪唑洗涤3次。使用pbs/250mm咪唑从柱上洗脱vh。通过与nap-5柱(gehealthcare，17-0853-01)的缓冲液交换从纯化的vh准备物中除去咪唑，并用pbs洗脱。用分光光度法估计纯化的vh的产率，并使用sdspage评估纯度。或者，用pjexpress载体从w3110ecoli的上清液中纯化vh。对于该程序，在37℃下tb培养基中振荡250rpm，培养多达400ml培养物，然后用1mmiptg诱导过夜。收获所得上清液，并使用ni-sepharoseexcel柱(hiscale16，gehealthcare)在aktapure上进行vh纯化。用分光光度法估计纯化的vh的产率，并使用sdspage评估纯度。b)物种交叉反应性测试以htrf结合试验形式，测试纯化的vh与人pd-1(r&dsystemscatno.1086-pd)结合的能力，食蟹猴pd-1(acrobiosystemscatno.pd1-c5254)和小鼠pd1(r&dsystemscatno.1021-pd)。在含有pbs，0.1％bsa和0.4m氟化钾的试验缓冲液中准备所有试剂和连续稀释的vh。将样品或试验缓冲液(非特异性结合)与2nm人/食蟹猴或小鼠pd-1，1nm抗人fccryptatepab(cisbiocat.no.61hfcklb)和30nm抗his-d2(cisbiocatno61hisdla)在黑色384-浅孔试验平板中在室温下孵育至少3小时。bmgpherastar盘式分析仪上在337nm激发后测量620nm和665nm的时间分辨荧光发射。计算htrf比((665nm发射/620nm发射)×10000)并校正(非特异性结合)数据以得到特异性结合信号。如上所述产生的vh单结构域抗体显示与人(图2a)和食蟹猴pd-1(图2b)重组蛋白结合，但不与小鼠pd-1蛋白(图2c)结合。表3展示获得的ec50值。c)抑制人pd-l1和pd-l2与重组人pd-1蛋白的结合将纯化的vh在htrf试验缓冲液中连续稀释，并如上所述在htrfpd-1：pd-l1抑制试验中进行测定。对于pd-l2抑制试验，根据制造商的实验方案，重组人pd-1蛋白带有铕trisbipyridinecryptate(cisbiocatno.62euspea)标签，并且根据ez-link试剂盒试验方案(thermo21327)，pd-l2-fc(acrobiosystemscatno.pd2-h882r)生物素化。将连续稀释的vh与10nm链霉亲和素alexafluor-647(lifetechnologiescatno.s32357)、3nm生物素化的pd-l2-fc和铕cryptate标记的pd-1-fc(167倍稀释)在室温下孵育至少3小时。在pd-l1抑制试验中，vh展示部分抑制模式，但不抑制pd-l2与人pd-1蛋白的结合(图3展示vh单结构域抗体1.1和1.2)。d)人pd-l1和人pd-l2对cho人pd-1细胞的抑制将纯化的vh在fmat试验缓冲液中连续稀释，并如上所述测试与cho人pd-1细胞的结合，以及抑制人pd-l1/pd-l2与cho人pd-1细胞的结合。对于抑制试验，所有试剂均在fmat试验缓冲液中准备。将vh、缓冲液(总结合对照)或过量竞争物(非特异性结合对照)与400pm人fc标记的人pdl-1(或100pm人fc标记的人pd-l2)、4nm抗人fc-alexafluor-488和每孔2000cho人pd1draq5染色细胞在384孔黑色透明底试验平板中孵育。将平板在室温下孵育2小时，然后在488nm和640nm激发后，在mirrorball盘式分析仪(ttp)上的fl2(502nm-537nm)和fl5(677-800nm)通道中测量荧光。数据表示为减去从非特异性结合对照孔确定的背景信号后总结合对照(即％对照)的％。结合cho-人pd-1细胞和抑制人pdl-1与cho人pd-1细胞结合的实例数据分别展示在图4a和4b中。1.1和1.20与cho人pd1细胞的结合展示出浓度依赖性(图4a)，但不抑制pd-l1(图4b)和pd-l2与cho人pd-1细胞的结合(表4)。表4e)报告基因试验使用nfat-荧光素酶报告基因试验评估vh单结构域抗体抑制转染的jurkat细胞中作为pd-1：pd-l1阻断的结果的功能性反应的能力。受到具有nfat反应元件的启动子的控制的表达人pd-1和荧光素酶报告基因的jurkat报告细胞系和表达t细胞受体活化剂的cho细胞系以及受到四环素诱导的启动子控制的人pd-l1通过标准方法产生。大量制备细胞，然后冷冻并储存在液氮中。将cho人pd-l1/tcr活化剂细胞在37℃水浴中解冻，用pbs洗涤一次，重悬于(hamsf12/10％fbs/1μg/ml四环素)中并以10000个细胞/孔接种于96孔白色tc处理的试验平板。将平板在co2培养箱中于37℃孵育过夜。将样品在试验培养基(rpmi+2％fbs)中连续稀释。将jurkatpd-1报告细胞在37℃水浴中解冻，用培养基洗涤一次，然后以5e5细胞/ml稀释到试验培养基中。从cho细胞中移除培养基，并将50μl稀释的样品或试验培养基(背景对照)加入平板中，然后加入50μl稀释的jurkat报告细胞。将平板在37℃下在co2培养箱中孵育6小时过夜，然后从培养箱中取出并平衡至室温20分钟。在测量发光信号(rlu)前，加入nanoglo底物(在nanglo缓冲液中以1∶50稀释的100μl底物(promegacatno.n1120)，并将平板在室温下孵育20分钟。数据表示为折叠/背景信号。vh1.39、2.12、2.1和1.1与对照pd-1单阻断vhvh(a)(seqidno.528)和双互补位(阻断vh(a)-4gs-1.39，阻断vh(a)-4gs-2.12)(pd-1拮抗剂)一起测定。在报告试验中vh活性的实例数据展示在图5a、b和c中。经测定的vh在试验中未显示出活性，证明vh1.39、2.12和1.1不阻断pd-1：pd-l1功能性相互作用。双特异性分子展示出增加的阻断活性(与单价阻断剂相比为10至25倍)。f)使用octet测量结合动力学在基于实时生物层干涉仪(real-timebio-layerinterferometer)的生物传感器octet(fortebio)的中测量克隆到人pd-1-hufc的结合动力学。通过标准胺偶联将重组人pd-1-hufc固定在ph5.0的10mm乙酸钠中的胺反应性生物传感器上或通过蛋白g生物传感器(fortebio)捕获。所有结合研究均在hbs-etoctet动力学缓冲液中进行。生物传感器总是在octet动力学缓冲液中在不同步骤之间洗涤。制备每种vh的七点，两倍稀释系列，其最高浓度范围为100-30nm。每个关联步骤的接触时间在180-300秒之间变化，解离步骤在400-600秒之间变化。通过使用fortebio分析软件处理和拟合数据至1∶1结合模型来确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。计算的亲和力和动力学常数展示在表5中，并且kd在纳摩尔范围内。表5g)使用表面等离子体共振对人pd-1结合动力学使用biacoret200仪器(gehealthcare)通过表面等离共振(spr)技术测量结合人pd-1-hufc的某些vh单结构域抗体的结合动力学。使用ph5.5的10mm乙酸钠中的0.01mg/ml抗原溶液，通过标准胺偶联将重组人pd-1-hufc固定至cm5传感器芯片(gehealthcare)。对于参考流动池，进行空白固定。使用单循环动力学试验来研究相互作用，制备每种的五点，三倍稀释系列，其最高浓度为30nm。通过使humabody以30μl/min的流速在hbsep+缓冲液中的芯片表面上流动来跟踪结合动力学。每个关联步骤的接触时间为180秒，解离步骤在1200-3600秒之间变化。使用biacoret200评估软件在双参考减法后将数据拟合至1∶1结合模型。计算的亲和力和动力学常数展示在下表6中。表6h)血清稳定性在人和小鼠血清(sigmam5905)中孵育0、1、4或7天后，通过测量vh活性来评估其血清稳定性。将预孵育的样品连续稀释并在2.1表位竞争试验中测定。在小鼠或人血清存在下于37℃孵育时，未观察到活性的显着变化(表7)。实例结合曲线数据展示在图9a和9b中。表7i)vh单结构域抗体表现出良好的稳定性将纯化的vh进行尺寸排阻色谱。简而言之，将纯化的vh以1或5mg/ml储存在pbs缓冲液中，在4℃或40℃下保存0-14天，然后使用含有pda检测器(在280nm处检测)的watersh-classbiouplc在不同时间点进行分析，在watersacquitybeh125asec柱上分离。将样品以10μl体积注射，并在含有200mmnacl、100mm磷酸钠、ph7.4+5％丙-1-醇的流动相中以0.4ml/min的流速运行。收集数据6分钟，并计算与开始时(t＝0)存在的单体峰面积相比，存储后剩余的单体峰面积。在图6和表8中示出了在40℃下孵育14天的抗pd-1vh单结构域抗体1.1的实例。在4℃下孵育14天后，未观察到显著变化。表8：vh单结构域抗体的稳定性。这展示在0、1、3、7和14天后存在的单体百分数。名称0天1天4天7天14天1.110090.1987.0494.93100.101.110095.0191.7992.5590.461.21100.00100.44104.46106.95111.951.29100.0099.20101.18108.35115.061.39100.00102.25101.71104.4196.612.12100.0099.2699.1093.9490.352.1100.0099.20100.15100.40100.782.29100.0099.99101.0393.9696.032.52100.00100.80100.7996.7099.582.28100.00101.41101.0499.40100.462.53100.0099.79101.12100.00101.06j)1.1和2.1表位竞争测定在fmat表位竞争试验中，具有比亲本(未优化的)单结构域抗体提高的活性和/或表达水平的序列优化的单结构域抗体最初通过测定能够竞争亲本克隆1.1或2.1与cho人pd-1细胞结合的细菌周质提取物进行鉴定。通过pcr扩增1.1或2.1vh序列，并亚克隆到能够用c末端融合的strep标签表达的载体中。培养用表达载体转化的tg1细菌培养物，使用提取缓冲液(20％w/v蔗糖，1mmedta，50mmtris-hclph8.0)制备周质提取物，然后使用strep-tactin亲和树脂(qiagen30002)从周质中纯化strep标记的vh。在fmat试验缓冲液中准备用于表位竞争试验的试剂。将细菌周质提取物，缓冲液(总结合对照)或过量his标记的vh竞争物(非特异性结合对照)与2nm1.1-strep标记的蛋白质或2nm2.1-strep标记的蛋白质、1.5nmii单克隆抗体(millipore71590)、2.5nm山羊抗小鼠fc-alexafluor488和2000cho人pd-1draq5染色细胞在384孔黑色透明底测定平板中的每孔中一起孵育。将平板在室温下孵育1.5小时，然后在488nm和640nm激发后，在mirrorball盘式分析仪(ttp)上的fl2(502nm-537nm)和fl5(677-800nm)通道中测量荧光。数据表示为减去从非特异性结合对照孔确定的背景信号后总结合对照(即％对照)的％。与亲本vh相比，显示出改善的活性的克隆在表位竞争测定中纯化并测试多点以进行ic50测定，或者直接在下述报告基因试验中测定(数据展示在表10中)。表10名称1.1ecic50(m)2.1ecic50(m)1.398.9e-099.7e-091.346.5e-091.268e-091.332.5e-091.377.5e-092.279e-091.3e-082.537e-091.4e-082.526.5e-092.1e-081.13.5e-093.6e-092.19.2e-099.4e-09k)pd-1特异性vh单结构域抗体对混合淋巴细胞反应中人t细胞活化的影响pd-1特异性vh单结构域抗体vh1.1不阻断pd-1与pd-l1的功能性相互作用，因此不影响混合淋巴细胞反应中的t细胞活化。从人外周血单核细胞(pbmc)分离单核细胞，并使用gm-csf和il-4分化成树突细胞7天。用同种异体cd4+t细胞培养树突细胞，通过磁分离从pbmc中分离。在pd-1特异性vh单结构域抗体或对照存在下将共培养物孵育2-7天。通过来自细胞上清液的增殖试验或细胞因子定量测量t细胞刺激。通过均相时间分辨荧光试验(htrf，cisbio)在3天后测定il-2水平。vh单结构域抗体1.1不增强t细胞活化(图7)。实施例10.vh单结构域抗体的表位图谱使用肽扫描分析(pepscan)测定vh单结构域抗体1.1和2.1的pd-1上的结合表位。针对pd-1线性肽阵列和限制为模拟环和β-链的pd-1肽，1.1以单价形式被筛选肽，每组中肽之间有一个残基偏移。并且针对组合不连续肽的阵列筛选了二价形式的1.1和2.1。肽的合成：为了重建hupd-1细胞外结构域的连续表位，合成了肽文库。通过用专有亲水聚合物制剂接枝，然后使用二环己基碳二亚胺(dcc)与n-羟基苯并三唑(hobt)，与叔丁氧基羰基-六亚甲基二胺(bochhmda)反应，随后利用三氟乙酸(tfa)裂解boc-基团，得到氨基官能化聚丙烯载体。标准的fmoc-肽合成用于通过定制改良的janus液体处理站(perkinelmer)在氨基官能化的载体上合成肽。使用pepscan专有的化学连接肽支架(clips)技术完成结构模拟物的合成。clips技术允许将肽构建成单环、双环、三环、片状折叠、螺旋状折叠及其组合。clips模板与半胱氨酸残基偶联。肽中多个半胱氨酸的侧链与一个或两个clips模板偶联。例如，将0.5mm的p2clips溶液(2，6-双(溴甲基)吡啶)溶解在碳酸氢铵(20mm，ph7.8)/乙腈(1∶3(v/v))中。将该溶液添加到肽阵列上。clips模板将结合存在于肽阵列的固相结合肽中的两个半胱氨酸的侧链(455孔板，具有3μl孔)。将肽阵列在溶液中轻轻摇动30至60分钟，同时完全覆盖溶液。最后，用过量的h2o彻底洗涤肽阵列，并在含有1％sds/0.1％β-巯基乙醇的pbs(ph7.2)的破碎缓冲液中于70℃超声处理30分钟，然后在h2o中超声处理另外45分钟。携带t3clips的肽以类似的方式制备，但现在具有三个半胱氨酸。elisa筛选：在基于pepscan的elisa中测定抗体与每种合成肽的结合。将肽阵列与抗his标签单克隆抗体(r&d)一起孵育(4℃过夜)。洗涤后，将肽阵列与1/1000稀释的兔抗小鼠igg(h+l)hrp偶联物(southernbiotech)在25℃孵育1小时。洗涤后，加入过氧化物酶底物2，2′-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(abts)和20μl/ml的3％h2o2。一小时后，测量显色。用电荷耦合器件(ccd)-相机和图像处理系统量化显色。数据处理：从ccd相机获得的值范围为0至3000mau，类似于标准96孔板elisa读取器。结果被量化并存储到peplab数据库中。有时，孔中包含气泡，导致假阳性值，手动检查卡片，并且由气泡引起的任何值都被评为0。合成质量控制：为了验证合成肽的质量，并行合成一组单独的阳性和阴性对照肽。用抗体57.9(posthumus等，j.virology，1990，64：3304-3309)筛选这些。当针对线性肽和限制为模拟环和β-链肽的肽进行筛选时，1.1展示与包含基序102-ngrdfhmsvvrarr-115(seqidno.519)的肽子集的一致结合。在所有测定的肽组上观察到与该表位的结合，并且不依赖于对肽施加的结构限制。针对不连续肽筛选，1.1展示与包含基序33-npptfs-38(seqidno.520)、54-csfsntsesfvlnw-67(seqidno.521)和101-pngrdfhmsv-110(seqidno.522)的肽子集结合。该数据与结合线性肽中鉴定的表位一致，并且还鉴定了与三级结构中的线性表位相邻的另外的残基。2.1展示对包含基序60-sesfvlnwyrms-71(seqidno.523)、90-gqdcrfrvt-98(seqidno.524)和104-rdfhmsvvrar-114(seqidno.525)的不连续肽组的亲和力。鉴定的序列在三级结构中是相邻的，与不连续的表位一致。对hupd-1结构(pdbcode：4zqk)的分析表明，鉴定的1.1和2.1的表位位于与pd-l1结合界面的hupd-1细胞外结构域的相对面上，与hupd-1结合一致而不中断天然配体结合(参见图8a)。序列104-rdfhmsv-110(seqidno.526)(参见图8a)在针对两种vh鉴定的表位内是一致的。表位的部分重叠与展示竞争性结合的两种vh一致。实施例11.pd-1刺激使用discoverxpathhuntercheckpoint试验进行实验，测定pd-1信号传导。细胞表达的pd-1连接到胞内酶片段，并且含有sh2-结构域的磷酸酶连接到另一个酶片段。在受体二聚化时，发生酶的互补。添加底物导致化学发光信号。pd-1二聚化响应于pd-l1+细胞系而发生。在没有配体的情况下，这种二聚化可以由抗体诱导。在加入检测试剂前，将pd-1+细胞与稀释系列的vh孵育3小时。化学发光读数为相对光单位，ec50由曲线拟合计算。最大响应计算为高于基础响应的rlu百分比增加。表11双互补位humabody(1gs)增强pd-1信号传导。二价1.1诱导低水平pd-1信号传导，当格式化为双互补位时，它能够产生pd1激动作用。较短的接头进一步增加这种作用，这可能是由增强的交联引起的。vh(b)是阻断配体结合的阻断单vh结构域(seqidno.529)。当在该试验中测量时，使用2.1的二价分子显示没有激动作用。表11当前第1页12