使用PS靶向抗体与免疫肿瘤学药剂治疗癌症的方法与流程

背景技术：

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3.发明领域

本发明涉及人类治疗领域，尤其涉及ps靶向抗体如巴维昔单抗(bavituximab)用于治疗患者，特别是癌症患者的用途，其与免疫肿瘤学(io)药剂如检查点抑制剂抗体有效组合，优选地与结合ctla-4、pd-1或pd-l1的封闭性抗体或结合任何检查点抑制剂的双特异性封闭性抗体组合。

4.背景技术

在对抗所有疾病，包括癌症和病毒感染时，功能正常的免疫系统是治疗应答的一个重要部分。因此，大量研究往往致力于免疫疗法，包括免疫肿瘤学(io)领域，其现在被认为是治疗癌症的策略所在。近年来，研究人员和临床医生研究了操纵免疫应答的新靶标和化合物。例如，靶向程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)和程序性死亡配体1(pd-l1)的io剂已获得批准用于治疗某些晚期恶性肿瘤，而与其它io靶标相互作用的化合物也正在研发当中。

尽管如此，即使有这些新型免疫疗法，也仅对某些患者有效。事实上，尽管对io药剂的关注，许多患者的应答和延长的生存仍然很差。因此，鉴于对长期疗法和新型免疫疗法的应答的可变性以及最大化临床益处的期望，仍然需要改进的治疗选项，包括与io治疗的更有效的组合。

最近，膜磷脂，磷脂酰丝氨酸(ps)已被鉴别为独特并且高度免疫抑制的分子，其充当调节宿主免疫应答的上游免疫检查点。这意味着ps在各种疾病中发挥重要作用，包括癌症和病毒感染，以阻断ps的ps靶向抗体的形式开辟了免疫治疗的新领域。

先导ps靶向抗体是巴维昔单抗，一种源自称为3g4的鼠mab的小鼠-人嵌合单克隆抗体(mab)(ran等人，2005；huang等人，2005；美国专利第7,247,303号)。3g4和巴维昔单抗是鼠嵌合和完全人类抗体家族的一部分，其以β2-糖蛋白1(β2gpi)依赖性方式靶向ps。也就是说，巴维昔单抗和相关的ps靶向抗体在β2gpi存在下与ps结合，以使得其形成高亲和力抗体-β2gpi-ps复合物(luster等人，2006)。在操作上，这些ps靶向抗体在体内对ps具有特异性，正如许多成像研究中最特别显示的那样(jennewein等人，2008；marconescu&thorpe，2008；saha等人，2010；stafford&thorpe，2011；zhao等人，2011；zhang等人，2014；和zhou等人，2014；美国专利第7,790,860号)，包括测量和预测对治疗的应答(gong等人，2013；stafford等人，2013)。

巴维昔单抗在临床前模型中具有经证明的对抗各种其中ps是标志物的疾病的活性，特别是癌症和病毒感染，还有细胞内寄生虫感染，如寄生原虫，亚马逊利什曼原虫(leishmaniaamazonensis)(wanderley等人，2013)和细胞内细菌病原体，如鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)和土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)，其分别引起鼠疫和土拉菌病(lonsdale等人，2011)。关于病毒感染，已经显示ps靶向抗体，如巴维昔单抗会抑制病毒复制，降低器官中的病毒载量并增加存活期(soares等人，2008；moody等人，2010；美国专利第7,906,115号)。巴维昔单抗和相关的ps靶向抗体的抗癌活性已经在大量的临床前研究和某些临床试验中得到证实，其中的作用是介导肿瘤血管以及阻断ps的免疫抑制信号传导(ran等人，2005；美国专利第7,572,448号；derose等人，2011)。

当抗体与增加ps在肿瘤微环境中的暴露的试剂或条件一起使用时，如通过使用放射和/或共同给予化学疗法，可以增强ps靶向抗体，如巴维昔单抗的抗肿瘤作用(美国专利第7,422,738号；美国专利第8,486,391号；美国专利第7,572,448号)。例如，当使用巴维昔单抗家族的ps靶向抗体与多西他赛(docetaxel)组合治疗乳腺肿瘤(huang等人，2005)；与吉西他滨(gemcitabine)组合治疗胰腺肿瘤(beck等人，2006)；与辐射组合治疗肺癌(he等人，2007)和脑癌、成胶质细胞瘤(he等人，2009)；与多西他赛组合治疗前列腺癌并再激活抗肿瘤免疫力(yin等人，2013)；以及与索拉非尼(sorafenib)组合治疗肝细胞癌(cheng等人，2016)时，临床前证明了改善的抗肿瘤作用。当ps靶向抗体，如巴维昔单抗与其它io药剂组合使用，如针对黑素瘤(freimark等人，2016)和三阴性乳腺癌(gray等人，2016a)的治疗，与呈ctla-4或pd-1抗体形式的检查点抑制剂组合临床前所示，在临床前已经观察到增强的抗肿瘤作用。

还在800多名患者的完整临床研究中对巴维昔单抗进行了评估，其中大多数患者进行了组合治疗，但不是与io药剂或检查点抑制剂的组合治疗。这些临床试验包括患有病毒感染，如慢性c型肝炎病毒(hcv)和人类免疫缺陷病毒(hiv)的患者，以及患有多种肿瘤类型，包括肺癌、乳腺癌、肝癌(肝细胞癌(hcc))、胰腺癌、结肠直肠癌和肾癌(肾细胞癌(rcc))的患者。已由使用巴维昔单抗与以下组合的临床试验报道有前景的抗肿瘤作用：在her2阴性转移性乳腺癌患者中，与多西他赛(chalasani等人，2015)；在晚期非小细胞肺癌(nsclc)中，与太平洋紫杉醇-卡铂(digumarti等人，2014)；在肝细胞癌中，与索拉非尼(cheng等人，2016)；在先前治疗过的晚期非鳞状nsclc中，与多西他赛(gerber等人，2016)，所有这些药剂都是化学治疗剂。

总体而言，i期和ii期临床研究的结果证明了巴维昔单抗具有临床意义的治疗作用。尽管如此，巴维昔单抗疗法还不得不批准，并且因此仍然需要有效的方法来优化用ps靶向抗体，如巴维昔单抗进行的治疗。同时，由于需要预先存在的抗肿瘤免疫应答，对此许多癌症患者遗憾地缺乏，因此最大化io药剂和检查点抑制剂的治疗益处的尝试受到阻碍。因此，需要改进的患者治疗方法，包括用检查点抑制剂进行更广泛和/或优化的治疗。鉴定一种或多种检查点抑制剂与巴维昔单抗在患者治疗中的有效组合将是一项重要的进步，克服了许多患者免疫“冷”状态相关的困难。

技术实现要素：

本发明通过提供新的方法、组合物和试剂盒解决了现有技术的上述和其他需要，所述方法、组合物和试剂盒用于改善用磷脂酰丝氨酸(ps)靶向抗体如巴维昔单抗与免疫肿瘤学(io)剂如检查点抑制剂抗体的组合治疗。本发明特别涉及结合ps(例如，巴维昔单抗)的抗体与一种或多种免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂抗体)组合治疗患有癌症的人患者的用途，优选地与结合ctla-4、pd-1或pd-l1的封闭性抗体或结合任何免疫检查点抑制剂的多特异性(例如，双特异性)封闭性抗体组合。

合适的io药剂是免疫检查点抗体，包括与激活免疫检查点、受体或分子(例如cd28、ox40和/或gitr)结合的激动(激活)抗体，并且优选地结合免疫检查点调节剂(例如，抑制性或刺激性受体或分子)的拮抗(封闭性)抗体，例如pd-1、pd-l1、ctla-4、tim-3、lag-3、ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和/或tgf-β。结合于抑制性免疫检查点、受体或分子的拮抗(封闭性)抗体在本文中也被称为“免疫检查点抑制剂”或“ici”。免疫检查点抗体(或免疫检查点抑制剂)的实例是ctla-4、pd-1或pd-l1的封闭性抗体，例如avelumab、伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、pidilizumab、xmab20717、cemiplimab(regn2810)、cbt-501、cx-072、cx-188和ly3300054，优选地avelumab、曲美木单抗、纳武单抗、德瓦鲁单抗或阿特珠单抗、cemiplimab(regn2810)、cbt-501、cx-072或ly3300054，最优选cemiplimab(regn2810)、cbt-501、cx-072或ly3300054。

列举的实施方案

1.一种ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)，其用于治疗受试者(例如人类患者)中的癌症的方法中，其中所述方法包括将ps靶向抗体分子与免疫检查点抗体分子例如结合ctla-4、pd-1或pd-l1的封闭性抗体组合施用于受试者。

2.包含ps靶向抗体(例如巴维昔单抗)和能够改变免疫检查点调节剂(例如免疫检查点抗体分子)的活性的药剂的组合物，其用于治疗受试者的癌症例如人患者的方法中。

3.包含ps靶向抗体(例如巴维昔单抗)和能够改变免疫检查点调节剂(例如免疫检查点抗体分子)活性的药剂的组合物，其用于本文所述的方法。

4.一种用于治疗受试者(例如人类患者)中的癌症的方法，所述方法包括以有效治疗所述受试者的癌症的组合量向所述受试者施用磷脂酰丝氨酸(ps)靶向抗体分子(例如，如本文所述的)和能够改变免疫检测点调节剂(例如免疫检查点抗体分子)的活性的药剂，其中所述免疫检查点抗体分子结合免疫检查点调节剂，例如免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激剂。

5.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述受试者具有或被鉴定为具有等于或大于约200μg/ml的功能性β2-糖蛋白1(β2gpi)的治疗前血液浓度(例如约50、100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300或400μg/ml)；并且其中所述功能性β2gpi与磷脂酰丝氨酸(ps)和巴维昔单抗结合。

6.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述受试者具有或被鉴定为具有低的治疗前血清干扰素-γ浓度，例如其中所述低治疗前血清干扰素-γ浓度是小于约0.093pg/ml(例如小于约0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.0091、0.0092、0.0093、0.0094、0.0095、0.0096、0.0097、0.0098、0.0099或0.01pg/ml)的干扰素-γ血清浓度。

7.实施方案6的组合物或方法，其中所述干扰素-γ的血清浓度通过simoa免疫测定法测量。

8.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述受试者具有或被鉴定为具有阴性治疗前pd-l1状态，例如，其中所述阴性治疗前pd-l1状态定义为tc0，其中小于约1％(例如小于约0.01％、0.1％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、2％、3％、4％或5％)的治疗前肿瘤细胞表达pd-l1，如通过opal免疫组织化学测定所测量的。

9.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括：

(i)任选地确定患有癌症的受试者中功能性β2-糖蛋白1(β2gpi)的血液浓度，和

(ii)响应于功能性β2gpi的血液浓度等于或大于约200μg/ml(例如约50、100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300或400μg/ml)，向受试者施用免疫检查点抗体分子和ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)。

10.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括：

(i)任选地确定患有癌症的受试者中的血清干扰素-γ浓度，例如通过simoa免疫测定，和

(ii)响应于血清干扰素-γ浓度小于约0.093pg/ml(例如小于约0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.0091、0.0092、0.0093、0.0094、0.0095、0.0096、0.0097、0.0098、0.0099或0.01pg/ml)，向受试者施用免疫检查点抗体分子和ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)。

11.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括：

(i)任选地确定患有癌症的受试者中的血清干扰素-γ浓度，例如通过simoa免疫测定，和

(ii)响应于血清干扰素-γ浓度小于约0.093pg/ml(例如小于约0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.0091、0.0092、0.0093、0.0094、0.0095、0.0096、0.0097、0.0098、0.0099或0.01pg/ml)，向受试者施用免疫检查点抗体分子；

其中所述受试者先前已经施用过ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)。

12.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括：

(i)任选地确定患有癌症的受试者中的pd-l1状态，和

(ii)响应于阴性pd-l1状态(例如，其中所述阴性治疗前pd-l1状态被定义为tc0，其中小于约1％(例如小于约0.01％、0.1％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、2％、3％、4％或5％)的治疗前肿瘤细胞表达pd-l1，如通过opal免疫组织化学测定所测量的，向受试者施用免疫检查点抗体分子和ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)。

13.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括：

(i)任选地确定患有癌症的受试者中的pd-l1状态，和

(ii)响应于阴性pd-l1状态(例如，其中所述阴性治疗前pd-l1状态被定义为tc0，其中小于约1％(例如小于约0.01％、0.1％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、2％、3％、4％或5％)的治疗前肿瘤细胞表达pd-l1，如通过opal免疫组织化学测定所测量的，向受试者施用免疫检查点抗体分子；

其中所述受试者先前已经施用过ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)。

14.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用ps靶向抗体分子和免疫检查点抗体分子，

其中所述受试者被鉴定或被确定具有等于或大于约200μg/ml(例如约50、100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300或400μg/ml)的功能性β2-糖蛋白1(β2gpi)的血液浓度。

15.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用免疫检查点抗体分子，

其中所述受试者先前已经施用过ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)，和

其中所述受试者被鉴定或被确定具有等于或大于约200μg/ml(例如约50、100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300或400μg/ml)的功能性β2-糖蛋白1(β2gpi)的血液浓度。

16.任何前述实施方案的组合物或方法，其中在施用ps靶向抗体分子之前，所述受试者被鉴定或被确定具有等于或大于约200μg/ml(例如约50、100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300或400μg/ml)的功能性β2-糖蛋白1(β2gpi)的血液浓度。

17.任何前述实施方案的组合物或方法，其中在施用ps靶向抗体分子之后，所述受试者被鉴定或被确定具有等于或大于约200μg/ml(例如约50、100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300或400μg/ml)的功能性β2-糖蛋白1(β2gpi)的血液浓度。

18.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用ps靶向抗体分子和免疫检查点抗体分子，

其中所述受试者被鉴定或被确定具有低血清干扰素-γ浓度，例如干扰素-γ的血清浓度小于约0.093pg/ml(例如小于约0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.0091、0.0092、0.0093、0.0094、0.0095、0.0096、0.0097、0.0098、0.0099或0.01pg/ml)，例如通过simoa免疫测定法测量的。

19.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用免疫检查点抗体分子，

其中所述受试者先前已经施用过ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)，和

其中所述受试者被鉴定或被确定具有低血清干扰素-γ浓度，例如干扰素-γ的血清浓度小于约0.093pg/ml(例如小于约0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.0091、0.0092、0.0093、0.0094、0.0095、0.0096、0.0097、0.0098、0.0099或0.01pg/ml)，例如通过simoa免疫测定法测量的。

20.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中在施用ps-靶向抗体分子之前鉴定或确定受试者具有低血清干扰素-γ浓度。

21.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中在施用ps-靶向抗体分子之后鉴定或确定受试者具有低血清干扰素-γ浓度。

22.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用ps靶向抗体分子和免疫检查点抗体分子，

其中所述受试者被鉴定或被确定具有阴性治疗前pd-l1状态(例如，其中所述阴性治疗前pd-l1状态被定义为tc0，其中小于约1％(例如小于约0.01％、0.1％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、2％、3％、4％或5％)的治疗前肿瘤细胞表达pd-l1，如通过opal免疫组织化学测定所测量的。

23.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用免疫检查点抗体分子，

其中所述受试者先前已经施用过ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)，和

其中所述受试者被鉴定或被确定具有阴性治疗前pd-l1状态(例如，其中所述阴性治疗前pd-l1状态被定义为tc0，其中小于约1％(例如小于约0.01％、0.1％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、2％、3％、4％或5％)的治疗前肿瘤细胞表达pd-l1，如通过opal免疫组织化学测定所测量的。

24.任何前述实施方案的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子是巴维昔单抗或其抗原结合片段。

25.任何前述实施方案的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子是如表a中所述的抗体，或其抗原结合片段。

26.实施方案25的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含重链可变区序列，其包含seqidno：3的氨基酸序列。

27.实施方案25或26的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含重链可变区序列，其包含由seqidno：1的核酸序列编码的氨基酸序列。

28.实施方案25-27中任一项的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含轻链可变区序列，其包含seqidno：4或32的氨基酸序列。

29.实施方案25-28中任一项的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含轻链可变区序列，其包含由seqidno：2或31的核酸序列编码的氨基酸序列。

30.实施方案25-29中任一项的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含选自seqidno：5-10和24-26的一个、两个、三个、四个、五个或六个cdr序列。

31.实施方案30的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含一个或多个框架区，所述框架区包含选自seqidno：11-18和27-30的氨基酸序列。

32.实施方案25的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含seqidno：21或34的氨基酸序列。

33.实施方案25的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含由seqidno：20或33的核酸序列编码的氨基酸序列。

34.实施方案25的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含含有seqidno：22的氨基酸序列的重链。

35.实施方案25或34的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含含有seqidno：23的氨基酸序列的轻链。

36.任何前述实施方案的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子是1n11或1g15，或其抗原结合片段。

37.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点调节剂包含抑制性免疫检查点分子例如pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、tim-3、lag-3、btla、tigit、vista、lair1、cd160、2b4和/或tgf-β的抑制剂。

38.实施方案37的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子是阻断性抗体和/或抑制性免疫检查点分子的拮抗剂。

39.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子包含结合pd-1的封闭性抗体或其抗原结合片段。

40.实施方案39的组合物或方法，其中所述与pd-1结合的封闭性抗体是cbt-501或cemiplimab。

41.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子包含结合pd-l1的封闭性抗体或其抗原结合片段。

42.实施方案41的组合物或方法，其中所述与pd-l1结合的封闭性抗体是德瓦鲁单抗、avelumab、cx-072、ly3300054或阿特珠单抗。

43.实施方案42的组合物或方法，其中所述与pd-l1结合的封闭性抗体是cx-072。

44.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子包含结合ctla-4的封闭性抗体或其抗原结合片段。

45.实施方案44的组合物或方法，其中所述与ctla-4结合的封闭性抗体是伊匹单抗或曲美木单抗。

46.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点调节剂包含刺激性免疫检查点分子例如gitr、ox40、4-1bb(cd137)、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80和/或cd160的激动剂。

47.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子包含免疫治疗剂，例如，如表d或e中所列。

48.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子包含表f中列出的抗体。

49.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子选自下组：avelumab、伊匹单抗、曲美木单抗、纳武单抗、派姆单抗、德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、pidilizumab、xmab20717、cemiplimab(regn2810)、cbt-501、cx-072、cx-188和ly3300054。

50.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中向所述受试者施用至少第一和第二免疫检查点抗体分子。

51.任何前述实施方案的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子是单特异性抗体分子。

52.任何前述实施方案的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子是多特异性抗体分子，例如双特异性抗体分子。

53.实施方案52的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子包含能够结合ps的可变区和能够结合免疫检查点调节剂的可变区，例如免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激剂。

54.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子是单特异性抗体分子。

55.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子是多特异性抗体分子(例如，双特异性抗体分子或三特异性抗体分子)，例如，其中抗体特异性结合另外两种免疫检查点调节剂(例如，两种或多种免疫检查点抑制剂或两种或多种免疫检查点刺激剂)。

56.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)和免疫检查点抗体分子通过静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、肠胃外、局部、口服、肠内、皮内或鞘内施用给所述受试者。

57.实施方案56的组合物或方法，其中将ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)和免疫检查点抗体分子静脉内施用于所述受试者。

58.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中将ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)和免疫检查点抗体分子依次或同时施用于所述受试者。

59.实施方案58的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)在免疫检查点抗体分子之前施用，例如，其中在免疫检查点抗体分子之前施用ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)约1、2、4、5或6周或更多。

60.实施方案59的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子的施用增加了受试者对免疫检查点抗体分子的敏感性，例如，其中受试者是免疫抑制的。

61.实施方案58的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)在免疫检查点抗体分子之后施用，例如，其中在免疫检查点抗体分子之后施用ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)约1、2、4、5或6周或更多。

62.实施方案58的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)与免疫检查点抗体分子同时(例如，在相同的访问时)施用。

63.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)每周施用或比每周施用更少，例如约每1、2、3、4、5、6或更多周施用。

64.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子每周施用或比每周施用更少，例如约每1、2、3、4、5、6或更多周施用。

65.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述受试者患有卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、食道癌(例如，转移性胃食道癌)、恶性神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、merkel细胞癌、黑素瘤、头颈癌(例如，复发/转移性鳞状细胞头颈癌(hnscc))、肾细胞癌、膀胱癌、肝癌或肺癌。

66.实施方案65的组合物或方法，其中所述受试者患有非小细胞肺癌(nsclc)。

67.实施方案66的组合物或方法，其中所述受试者患有非鳞状、非小细胞肺癌。

68.实施方案66或67的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子是巴维昔单抗和/或免疫检查点抗体分子是抗pd-1抗体分子或抗pd-l1抗体分子。

69.实施方案68的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子是cbt-501。

70.实施方案65的组合物或方法，其中所述受试者患有乳腺癌。

71.实施方案65的组合物或方法，其中所述受试者患有肝癌。

72.实施方案65的组合物或方法，其中所述受试者患有胰腺癌。

73.实施方案65的组合物或方法，其中所述受试者患有转移性胃食道癌。

74.实施方案73的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子是巴维昔单抗和/或免疫检查点抗体分子是抗pd-1抗体分子或抗pd-l1抗体分子。

75.实施方案74的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子是cbt-501。

76.实施方案65的组合物或方法，其中所述受试者患有hnscc。

77.实施方案76的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子是巴维昔单抗和/或免疫检查点抗体分子是抗pd-1抗体分子或抗pd-l1抗体分子。

78.实施方案77的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子是cbt-501。

79.实施方案65的组合物或方法，其中所述受试者患有肝细胞癌。

80.实施方案79的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子是巴维昔单抗和/或免疫检查点抗体分子是抗pd-1抗体分子。

81.实施方案80的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子是派姆单抗。

82.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述受试者不患有乳腺癌。

83.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述受试者不患有黑素瘤。

84.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述受试者是免疫抑制的。

85.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中将ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约3mg/kg(例如约0.1、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg)的量施用于所述受试者。

86.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中将免疫检查点抗体分子以约3mg/kg(例如约0.1、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg)的量施用于所述受试者。

87.前述实施方案中任一项的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约100-500mg(例如，约150-400mg、180-360mg或200-300mg)的剂量施用。

88.任何前述实施方案的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子以约100-500mg(例如，约150-400mg、180-360mg或200-300mg)的剂量施用。

89.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg、310mg、320mg、330mg、340mg、350mg、360mg或更多的平剂量(flatdose)施用。

90.实施方案89的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约180mg的平剂量施用。

91.实施方案89的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如巴维昔单抗)以约190mg的平剂量施用。

92.实施方案89的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约200mg的平剂量施用。

93.实施方案89的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约210mg的平剂量施用。

94.实施方案89的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约220mg的平剂量施用。

95.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述免疫检查点抗体分子以约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg、310mg、320mg、330mg、340mg、350mg、360mg或更多的平剂量施用。

96.实施方案95的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约180mg的平剂量施用。

97.实施方案95的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约190mg的平剂量施用。

98.实施方案95的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约200mg的平剂量施用。

99.实施方案95的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约210mg的平剂量施用。

100.实施方案95的组合物或方法，其中免疫检查点抗体分子(例如，巴维昔单抗)以约220mg的平剂量施用。

101.任何前述实施方案的组合物或方法，其中所述受试者是人。

102.任何前述实施方案的组合物或方法，进一步包括向受试者施用另外的治疗剂。

103.实施方案102的组合物或方法，其中另外的治疗剂是抗癌剂，例如tgfβr1激酶抑制剂iily3200882。

104.实施方案102的组合物或方法，其中另外的治疗剂是化学治疗剂，例如表c中列出的化学治疗剂。

105.实施方案104的组合物或方法，其中化学治疗剂是多西他赛、紫杉醇、卡铂、索拉非尼、吉西他滨、乐伐替尼、merestinib或其任何组合。

106.任何前述实施方案的组合物或方法，其中ps靶向抗体分子和/或免疫检查点抗体分子包含在相同或不同的组合物(例如，药物组合物)中。

107.根据任何前述实施方案的方法使用的ps靶向抗体分子(例如，巴维昔单抗)。

108.包含前述实施方案中任一项的组合物的药物组合物。

109.包含前述实施方案中任一项的组合物的试剂盒。

定义

如本文所用，术语“抗体分子”是指包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体分子”包括例如单克隆抗体(例如，包括具有免疫球蛋白fc区的全长抗体)。在实施方案中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链。在实施方案中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能片段，例如scfv、fab、fab'、f(ab')2、fc、fd、fd'、fv、单链抗体(例如scfv)或双抗体。在实施方案中，抗体分子是单特异性的，例如，结合单个表位。在实施方案中，抗体分子是多特异性的，例如双特异性的。在实施方案中，抗体分子是多价的(例如，二价的)。抗体和抗体片段可以来自任何类别的抗体，包括但不限于igg、iga、igm、igd和ige，以及抗体的任何亚类(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)。抗体可具有选自例如igg1、igg2、igg3或igg4的重链恒定区。抗体还可以具有选自例如κ或λ的轻链。

如本文所用，术语“免疫检查点调节剂”是指能够调节例如抑制或刺激免疫应答的分子(例如，蛋白质)。免疫检查点调节剂可以是由细胞表达的蛋白质，例如细胞表面受体，其具有抑制或刺激免疫应答的活性。抑制性免疫检查点分子的例子(在本文中也称为“免疫检查点抑制剂”)包括但不限于pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、tim-3、lag-3、btla、tigit、vista、lair1、cd160、2b4和tgf-β。刺激免疫检查点分子(本文中也称为“免疫检查点刺激剂”或“免疫检查点活化剂”)的实例包括但不限于gitr、ox40、4-1bb(cd137)、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80和/或cd160。

如本文所用，“免疫检查点抗体分子”是指能够改变免疫检查点调节剂(例如免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激剂)活性的抗体分子。“免疫检查点抗体”是指能够改变免疫检查点调节剂(例如，免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激剂)的活性的抗体。通常，免疫检查点抗体分子能够结合免疫检查点调节剂，并且这种结合活性导致免疫检查点调节剂活性的改变。免疫检查点抗体分子可包含一个或多个有助于结合免疫检查点调节剂的可变区。免疫检查点抗体分子可以能够刺激免疫应答，例如通过抑制(例如拮抗)免疫检查点抑制剂的活性(例如，如本文所述)，和/或通过促进活性(例如激动)免疫检查点激活剂。在一些实施方案中，免疫检查点抗体分子对于特定免疫检查点调节剂是单特异性的。在一些实施方案中，免疫检查点抗体分子是多特异性的，例如，能够结合多种免疫检查点调节剂。例如，免疫检查点抗体分子可以是双特异性的，例如，能够同时结合两种不同的免疫检查点调节剂。

术语“程序性死亡1”或“pd-1”是指免疫球蛋白基因超家族的成员，其作为具有pd-l1和pd-l2作为已知配体的共抑制剂受体起作用。先前使用基于扣除克隆的方法鉴定pd-1以选择参与凋亡细胞死亡的蛋白质。pd-1基于其结合pd-l1的能力是cd28/ctla-4分子家族的成员。与ctla-4一样，响应于抗cd3，在t细胞表面上快速诱导pd-1(agata等人，25(1996)int.immunol.8：765)。然而，与ctla-4相反，pd-1也在b细胞表面诱导(响应抗igm)。pd-1也在胸腺细胞和骨髓细胞的子集上表达(agata等人(1996)同上；nishimura等人(1996)int.immunol.8：773)。考虑术语“pd-1”可包括哺乳动物的同种型，例如人pd-1、人pd-1的物种同源物和包含至少一个与pd-1的共同表位的类似物。pd-1的氨基酸序列，例如人pd-1，是已知的，例如shinoharat等(1994)genomics23(3)：704-6；fingerlr等人gene(1997)197(1-2)：177-87。

pd-1多肽是抑制性受体，其能够向免疫细胞传递抑制信号从而抑制免疫细胞效应子功能，或者能够促进免疫细胞的共刺激(例如，通过竞争性抑制)，例如，当存在于可溶性单体形式中时。优选的pd-1家族成员与pd-1共享序列同一性，并与抗原呈递细胞上的一个或多个b7家族成员结合，例如b7-1、b7-2、pd-1配体和/或其他多肽。

术语“pd-1活性”包括pd-1多肽调节活化的免疫细胞中的抑制信号的能力，例如通过使天然pd-1配体与抗原呈递细胞接合。pd-1以类似于ctla4的方式向免疫细胞传递抑制信号。免疫细胞中抑制信号的调节导致免疫细胞的增殖和/或细胞因子分泌的调节。因此，术语“pd-1活性”包括pd-1多肽结合其天然配体的能力、调节免疫细胞共刺激或抑制信号的能力、以及调节免疫应答的能力。

术语“pd-1配体”是指pd-1受体的结合配偶体，包括pd-l1(freeman等人(2000)j.exp.med.192：1027)和pd-l2(latchman等人)(2001)nat.immunol.2：261)。存在至少两种类型的人pd-1配体多肽。pd-1配体蛋白包含信号序列，以及igv结构域、igc结构域、跨膜结构域和短的细胞质尾。pd-l1(参见freeman等人(2000)j.exp.med.192：1027的序列数据)和pd-l2(参见latchman等人(2001)nat.immunol.2：261的序列数据)都是b7多肽家族的成员。pd-l1和pd-l2均在胎盘、脾、淋巴结、胸腺和心脏中表达。只有pd-l2在胰腺、肺和肝脏中表达，而只有pd-l1在胎肝中表达。尽管pd-l1表达更广泛，但pd-1配体均在活化的单核细胞和树突细胞上被上调。例如，已知pd-l1在小鼠造血细胞(例如，t细胞、b细胞、巨噬细胞、树突细胞(dc)和骨髓衍生的肥大细胞)和非造血细胞(例如，内皮细胞、上皮细胞和肌细胞)上组成型表达并上调至更高水平，而pd-l2在dc、巨噬细胞和骨髓衍生的肥大细胞上诱导表达(参见butte等人(2007)immunity27：111)。

pd-1配体包含具有某些保守结构和功能特征的多肽家族。当用于指蛋白质或核酸分子时，术语“家族”意指两种或更多种具有共同结构域或基序且具有足够氨基酸或核苷酸序列同源性的蛋白质或核酸分子，如本文所定义。这些家族成员可以是天然的或非天然的，并且可以来自相同或不同的物种。例如，家族可以含有人源的第一种蛋白质，以及人源的其他不同的蛋白质，或者可以含有非人源的同源物。家族成员也可能具有共同的功能特征。pd-1配体是b7多肽家族的成员。本文所用的术语“b7家族”或“b7多肽”包括与b7多肽具有序列同源性的共刺激多肽，例如与b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、诱导型共刺激配体(icos-l)、b7-h3、b7-h4、vista、b7-h6、b7h(swallow等人(1999)immunity11：423)，和/或pd-1配体(例如，pd-l1或pd-l2)。例如，当在ncbi使用blast程序与默认参数(存在11和扩展1时设置缺口罚分的blosum62矩阵)进行比较时，人b7-1和b7-2共享大约26％的氨基酸序列同一性(参见ncbi网站)。术语b7家族还包括能够调节免疫细胞功能的这些多肽的变体。b7家族的分子共享许多保守区域，包括信号结构域、igv结构域和igc结构域。igv结构域和igc结构域是本领域公认的ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有称为ig折叠的不同折叠模式的结构单元。ig折叠由两个β薄片的夹层组成，每个β薄片由5-10个氨基酸的反平行β链组成，在大多数但不是全部的ig、tcr和mhc分子的igc结构域中，两个薄片之间具有保守的二硫键，mhc分子具有相同类型的序列模式，在ig超家族中称为c1-组。其他igc结构域属于其他组。igv结构域也共享序列模式，称为v组结构域。igv结构域比igc结构域长，并含有另外一对β链。

如本文所用，“ctla-4”是指通过对鼠细胞溶解性t细胞cdna文库进行差异筛选而鉴定的t细胞表面分子，brunet等(1987)nature328：267-270。例如，在linsley等人(1991)j.exp.med.174:561-569中讨论了ctla-4作为b7的第二受体的作用。freeman等人(1993)science262:907-909讨论了b7缺陷小鼠中的ctla-4。lenschow等人(1993)p.n.a.s.90:11054-11058描述了ctla-4的配体。linsley等人(1992)science257:792-795描述了可溶形式的ctla-4在体内的免疫抑制。lenschow等(1992)science257:789-792讨论了由ctla-4ig诱导的胰岛移植物的长期存活。walunas等人(1994)immunity1:405-413表明ctla-4可以作为t细胞活化的负调节剂起作用。ctla-4(例如，人ctla-4)的氨基酸和核苷酸序列是已知的(例如，如us5,811,097和us5,434,131中所述，通过引用并入本文)。

附加术语在下面和整个申请中定义。

如本文所用，冠词“一”和“一个”指的是冠词的一个或多于一个(例如至少一个)语法对象。

除非上下文另有明确说明，否则术语“或”在本文中用于表示术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。

“约”和“近似”通常表示在给定测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差度。示例性误差度在给定值或值范围的百分之20(％)内，通常在10％内，更通常在5％内。

短语“与......组合”或“以组合的量”并不意味着治疗或治疗剂必须同时施用和/或配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本文所述的范围内。抗ps抗体分子可以与一种或多种其他另外的疗法或治疗剂同时、之前或之后施用。抗ps抗体分子和其他药剂或治疗方案可以以任何顺序施用。通常，每种药剂将以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。还应理解，该组合中使用的另外的治疗剂可以在单一组合物中一起施用或在不同组合物中单独施用。通常，预期组合使用的其它治疗剂的使用水平不超过单独使用它们的水平。在一些实施方案中，组合使用的水平将低于单独使用的水平。

术语“功能变体”是指与天然存在的序列具有基本相同的氨基酸序列、或由基本相同的核苷酸序列编码并且能够具有天然存在的序列的一种或多种活性的多肽。

如本文所用，术语“分离的”是指从其原始或天然环境(例如天然存在时的天然环境)中除去的材料。例如，不分离存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽，而是分离通过人为干预从天然系统中的一些或所有共存材料分离的相同多核苷酸或多肽。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是天然存在的环境的一部分。

鉴于本文提供的详细描述，可以参考权利要求找到本发明的进一步概述。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。美国专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有彩色附图的这一美国专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。

图1a和图1b。3g4抗体可变区的dna和氨基酸序列。呈现了3g4抗体的重链(图1a；seqidno：35和seqidno：36)和轻链(图1b；seqidno：37和seqidno：38)的dna和氨基酸序列并显示了dna序列中的限制性位点。前导序列与成熟蛋白质不同，后者如图1a和图1b中的每一个中的第一个箭头所示开始。阐述了用人恒定区移植每个可变序列的示例性方法，其中各个人恒定区序列的第一部分(seqidno：39和seqidno：40)由图1a和图1b中每个的第二个箭头显示。

图2a和图2b。1n11(pgn635)抗体的序列和ps结合。图2a，1n11抗体的scfv形式的重(vh)和轻(vl)链可变区的核苷酸和氨基酸序列。通过nco/noti位点将scfv克隆到phog21(3.7kb)中。用于初始克隆的限制性位点(ncoi、hindiii、mlui和noti)用斜体标出并加下划线。vh和vl之间的接头序列是斜体的。图2b，1n11抗体以血清依赖性方式结合于ps。通过elisa针对经涂铺的ps和磷脂酰胆碱(pc)和鞘磷脂(sm)的混合物(pc/sm)测试1n11的scfv形式的结合。用10μg/mlps或相同量的pc/sm混合物(各自溶于己烷中)涂布聚苯乙烯板。蒸发掉己烷后，添加pbs中的10％人类血清(+10％血清)或1％卵白蛋白(+1％ov)并培育一小时。将处于10％人类血清(+10％血清)或1％卵白蛋白(+1％ov)中的20μg/ml纯化的1n11scfv添加到针对每个抗原的六个孔中的第一个孔中，并用3倍稀释液滴定。用hrp缀合的抗c-myc标签小鼠单克隆抗体(invitrogen)检测剩余的结合的scfv。

图3。来自iii期试验的kaplan-meier存活曲线显示，当用巴维昔单抗和多西他赛(黑色上部线)处理时，功能性β2gpi水平等于或大于200μg/ml的nsclc患者相对于用安慰剂和多西他赛(“安慰剂”；灰色，底部线)处理具有相同β2gpi水平(200μg/ml或以上)的患者具有存活期延长(mos)趋势。

图4。来自iii期试验的kaplan-meier存活曲线显示，当用巴维昔单抗和多西他赛(黑色上部线)处理时，功能性β2gpi水平在200μg/ml至240μg/ml范围的nsclc患者相对于用安慰剂和多西他赛(“安慰剂”；灰色，底部线)处理具有相同β2gpi水平(200-240μg/ml)的患者具有统计学上显著的更好的mos。

图5。临床前研究中的支持3g4抗体的ps结合、功能性和抗肿瘤活性的β2gpi水平与iii期中的患者中的β2gpi水平的比较.iii期试验中的592名可评估患者中的治疗前功能性β2gpi水平的分布在实施例xiii中描述。功能性β2gpi水平等于或大于200μg/ml(水平条纹条和指向右下方的对角条纹条)提供了用巴维昔单抗治疗的患者的延长存活的趋势(图3)。功能性β2gpi水平在200μg/ml和240μg/ml之间(水平条纹条)对于使用巴维昔单抗治疗的患者提供统计学上显著更好的mos(图4)。在临床前研究(实施例i、e)中，约10μg/ml或更高(→，长箭头)或约60μg/ml或更高(>，短箭头)的功能性β2gpi水平对于巴维昔单抗的ps结合、功能性和抗肿瘤活性为足够的。

图6。kaplan-meier存活曲线显示，与使用单独多西他赛处理，随后进行免疫疗法的患者(灰色实线)相反，用巴维昔单抗和多西他赛处理，随后进行免疫疗法(“sact-io”)的患者(黑色实线)具有统计学上显著更好的mos。针对这些存活曲线，处理组、mos和统计分析列于表11(实施例xvi)中。

图7a和图7b。kaplan-meier存活曲线显示，当用巴维昔单抗处理，随后进行免疫疗法(“sact-io”)时，功能性β2gpi水平等于或大于200μg/ml的nsclc患者具有统计学上显著更好的mos。图7a，在功能性β2gpi≥200μg/ml的患者中，用多西他赛和巴维昔单抗处理的患者(黑线)具有延长的存活期，其与用多西他赛和安慰剂处理的对照患者(灰线)相反，包括接受sact-io的患者(“伴随sactio”，实线)和不存在sact-io的患者(“无sactio”，虚线)。图7b显示相同的治疗组，但其中所有患者具有功能性β2gpi＜200μg/ml。

图8a和图8b。kaplan-meier生存曲线显示，用巴维昔单抗治疗的nsclc患者在治疗前pd-l1表达阴性时具有统计学上显著更好的mos(tc0，<1％)。图8a，在用多西他赛和巴维昔单抗治疗的患者中，与具有阳性pd-l1表达tc1/2/3，≥1％(“ck+>＝1％”；黑线)的患者相比，具有阴性治疗前pd-l1表达tc0<1％(“ck+<1％”，灰线)的患者具有延长的存活期。图8b显示相同的pd-l1阴性(“ck+<1％”，灰线)和阳性组(“ck+>＝1％”；黑线)，但其中患者用多西他赛和安慰剂治疗。

具体实施方式

在当今时代，越来越强调基于如疾病风险和/或预测应答等因素对个体患者进行定制治疗。这一概念通常可以描述为“个性化医疗”。对有助于特定疗法有效性的不同成分的更深入理解可以为对患者进行分级提供基础，从而改善连续患者群体的治疗结果。本发明通过提供新型生物标志物体现按照这样的思路作出的进步，通过所述生物标志物，使用ps靶向抗体如巴维昔单抗或其抗原结合片段的免疫疗法得到优化。

抗体分子

本发明的特征在于能够结合例如ps或免疫检查点调节剂的抗体分子。如本文所用，术语“抗体分子”通常是指蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段，其包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列，例如抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链。在一个实施方案中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能片段。

在一个实施方案中，抗体分子是单特异性抗体分子并结合单个表位。例如，具有多个免疫球蛋白可变结构域序列的单特异性抗体分子，每个免疫球蛋白可变结构域序列结合相同的表位。

在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性和所述多个的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)。在一个实施方案中，多特异性抗体分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子，

在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scfv或其片段，并且对第二表位具有结合特异性的scfv或其片段。在一个实施方案中，第一表位位于pd-1上，第二表位位于tim-3、lag-3、pd-l1或pd-l2上。

在一个实施方案中，抗体分子包含双抗体和单链分子，以及抗体的抗原结合片段(例如fab、f(ab')2和fv)。例如，抗体分子可包括重(h)链可变结构域序列(本文中缩写为vh)和轻(l)链可变结构域序列(本文中缩写为vl)。在一个实施方案中，抗体分子包含重链和轻链或由重链和轻链组成(在本文中称为半抗体)。在另一个实例中，抗体分子包括两个重(h)链可变结构域序列和两个轻(l)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合位点，例如fab、fab'、f(ab')2、fc、fd、fd'、fv、单链抗体(例如scfv)、单可变结构域抗体、双抗体(dab)(二价和双特异性)和嵌合(例如人源化)抗体，其可通过整体抗体的修饰产生或是使用重组dna技术从头合成的抗体。这些功能性抗体片段保留了与其各自的抗原或受体选择性结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何类别的抗体，包括但不限于igg、iga、igm、igd和ige，以及抗体的任何亚类(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)。抗体分子的制剂可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗体分子也可以是人、人源化、cdr移植或体外产生的抗体。抗体可具有选自例如igg1、igg2、igg3或igg4的重链恒定区。抗体还可以具有选自例如κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白”(ig)与本文的术语“抗体”可互换使用。

抗体分子的抗原结合片段的实例包括：(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含两个fab片段的二价片段，所述两个fab片段在铰链区通过二硫键连接；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)双抗体(dab)片段，其由vh结构域组成；(vi)骆驼科或骆驼化可变区；(vii)单链fv(scfv)，参见例如bird等人(1988)science242:423-426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883)；(viii)单结构域抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。

术语“抗体”包括完整分子及其功能片段。可以改变(例如突变)抗体的恒定区以修饰抗体的性质(例如，增加或减少以下一种或多种：fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能、或补体功能)。

抗体分子也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、衍生自常规4-链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除抗体衍生的那些之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是本领域的任一种，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。根据本发明的另一方面，单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称为缺乏轻链的重链抗体。例如，这种单结构域抗体公开在wo9404678中。出于清楚的原因，这种衍生自天然缺乏轻链的重链抗体的可变结构域在本文中称为vhh或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规vh区分开。这种vhh分子可以衍生自骆驼科物种中产生的抗体，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和骆驼科动物。除骆驼科外的其他物种可能产生天然缺乏轻链的重链抗体；这些vhh属于本发明的范围。

vh和vl区可以细分为高变区，称为“互补决定区”(cdr)，其散布有更保守的区域，称为“框架区”(fr或fw)。

框架区和cdr的程度已经通过许多方法精确定义(参见kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第五版，美国卫生与公众服务部，nih出版物编号91-3242；chothia，c.等人(1987)j.mol.biol.196：901-917；以及oxfordmolecular的abm抗体建模软件使用的abm定义。通常参见例如proteinsequenceandstructureanalysisofantibodyvariabledomains.in:antibodyengineeringlabmanual(ed.:duebel,s.和kontermann,r.,springer-verlag,heidelberg)。

如本文所用的术语“互补决定区”和“cdr”是指抗体可变区内的氨基酸序列，其赋予抗原特异性和结合亲和力。通常，每个重链可变区(hcdr1、hcdr2、hcdr3)中有三个cdr，每个轻链可变区(lcdr1、lcdr2、lcdr3)中有三个cdr。

给定cdr的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任何一种来确定，包括kabat等人(1991)“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda描述的方案md(“kabat”编号方案)，al-lazikani等人(1997)jmb273,927-948(“chothia”编号方案)。如本文所用，根据“chothia”编号方案定义的cdr有时也称为“高变环”。

例如，在kabat下，重链可变结构域(vh)中的cdr氨基酸残基编号为31-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)；轻链可变区(vl)中的cdr氨基酸残基编号为24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)。在chothia下，vh中的cdr氨基酸编号为26-32(hcdr1)、52-56(hcdr2)和95-102(hcdr3)；vl中的氨基酸残基编号为26-32(lcdr1)、50-52(lcdr2)和91-96(lcdr3)。通过结合kabat和chothia的cdr定义，cdr由人vh中的氨基酸残基26-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)和人vl中氨基酸残基24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)组成。

通常，除非特别指出，否则抗pd-1抗体分子可包括一种或多种kabatcdr和/或chothia高变环的任何组合，例如，如表1中所述。在一个实施方案中，使用以下定义用于在表1中描述的抗pd-1抗体分子：根据kabat和chothia二者的组合cdr定义的hcdr1和根据kabat的cdr定义的hccdrs2-3和lccdrs1-3。在所有定义中，每个vh和vl通常包括三个cdr和四个fr，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。

如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指可以形成免疫球蛋白可变结构域的结构的氨基酸序列。例如，序列可包括天然存在的可变结构域的全部或部分氨基酸序列。例如，序列可以包括或不包括一个、两个或更多个n-或c-末端氨基酸，或者可以包括与蛋白质结构的形成相容的其他改变。

术语“抗原结合位点”是指抗体分子的一部分，其包含形成与pd-1多肽或其表位结合的界面的决定簇。关于蛋白质(或蛋白质模拟物)，抗原结合位点通常包括(至少四个氨基酸或氨基酸模拟物的)一个或多个环，其形成结合pd-1多肽的界面。通常，抗体分子的抗原结合位点包括至少一个或两个cdr和/或高变环，或更通常至少三个、四个、五个或六个cdr和/或高变环。

术语“竞争”或“交叉竞争”在本文中可互换使用，指抗体分子干扰抗pd-1抗体分子(例如本文提供的抗pd-1抗体分子)与靶标例如人pd-1的结合的能力。结合的干扰可以是直接的或间接的(例如，通过抗体分子或靶标的变构调节)。抗体分子能够干扰另一抗体分子与靶标的结合的程度，以及因此是否可以说是竞争，可以使用竞争结合测定来确定，例如facs测定、elisa或biacore测定。在一些实施方案中，竞争结合测定是定量竞争测定。在一些实施方案中，当在竞争结合测定(例如本文所述的竞争测定)中第一抗体分子与靶标的结合降低10％或更多例如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、98％或更多、99％或更多时，就说第一抗pd-1抗体分子与第二抗pd-1抗体分子竞争结合靶标。

本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体可以通过杂交瘤技术或不使用杂交瘤技术的方法(例如重组方法)制备。

“有效人”蛋白质是不会引起中和抗体反应例如人抗鼠抗体(hama)反应的蛋白质。hama在许多情况下可能是有问题的，例如，如果抗体分子被重复施用，例如在治疗慢性或复发性疾病中。hama反应可使重复的抗体施用潜在无效，这是由于来自血清的抗体清除增加(参见例如saleh等人，cancerimmunol.immunother.,32:180-190(1990))并且还因为潜在的过敏反应(参见例如lobuglio等人hybridoma，5：5117-5123(1986))。

抗体分子可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在其他实施方案中，可以重组产生抗体，例如通过噬菌体展示或通过组合方法产生。

用于产生抗体的噬菌体展示和组合方法是本领域已知的(例如在ladner等人，美国专利号5,223,409；kang等人，国际公开号wo92/18619；dower等人，国际公布号wo91/17271；winter等人，国际公开wo92/20791；markland等人，国际公开号wo92/15679；breitling等人，国际公开号wo93/01288；mccafferty等人，国际公开号wo92/01047；garrard等人，国际公开号wo92/09690；ladner等人，国际公开号wo90/02809；fuchs等人(1991)bio/technology9：1370-1372；hay等人(1992)humantibodhybridomas3：81-85；huse等人(1989)science246：1275-1281；griffths等(1993)emboj12：725-734；hawkins等(1992)jmolbiol226：889-896；clackson等人(1991)nature352：624-628；gram等人(1992)pnas89：3576-3580；garrad等人(1991)bio/technology9：1373-1377；hoogenboom等人(1991)nucacidres19：4133-4137；和barbas等人(1991)pnas88：7978-7982中所述，其全部内容通过引用并入本文)。

在一个实施方案中，抗体是完全人抗体(例如在小鼠中制备的抗体，其已被基因工程化以产生来自人免疫球蛋白序列的抗体)，或非人抗体，例如啮齿动物(小鼠或者大鼠)、山羊、灵长类动物(例如猴子)、骆驼抗体。优选地，非人抗体是啮齿动物(小鼠或大鼠抗体)。产生啮齿动物抗体的方法是本领域已知的。

可以使用携带人免疫球蛋白基因而不是小鼠系统的转基因小鼠产生人单克隆抗体。来自用目标抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞用于产生分泌人mab的杂交瘤，所述人mab对来自人蛋白质的表位具有特异性亲和力(参见，例如wood等人，国际申请wo91/00906，kucherlapati等人pct公开wo91/10741；lonberg等人国际申请wo92/03918；kay等人国际申请92/03917；lonberg，n.等人1994nature368：856-859；green，l.l.等人1994naturegenet.7：13-21；morrison，s.l.等人1994proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855；bruggeman等人1993yearimmunol7:33-40；tuaillon等人1993pnas90：3720-3724；bruggeman等人1991eurjimmunol21：1323-1326)。

抗体可以是其中可变区或其部分(例如cdr)在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生的抗体。嵌合、cdr移植和人源化抗体在本发明范围内。在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生，然后在例如可变框架或恒定区中修饰以降低人的抗原性的抗体在本发明范围内。

嵌合抗体可以通过本领域已知的重组dna技术产生(参见robinson等人国际专利公开pct/us86/02269；akira等人欧洲专利申请184,187；taniguchi，m.欧洲专利申请171,496；morrison等人欧洲专利申请173,494；neuberger等人国际申请wo86/01533；cabilly等人美国专利号4,816,567；cabilly等人欧洲专利申请125,023；better等人(1988science240:1041-1043)；liu等人(1987)pnas84：3439-3443；liu等人，1987，j.immunol.139：3521-3526；sun等人(1987)pnas84：214-218；nishimura等人，1987，canc.res.47：999-1005；wood等人(1985)nature314：446-449；和shaw等，1988，j.natlcancerinst.80：1553-1559)。

人源化或cdr-移植的抗体将具有(重和/或轻的免疫球蛋白链的)至少一个或两个但通常所有三个受体cdr被供体cdr替换。抗体可以用至少一部分非人cdr替换，或者仅一些cdr可以用非人cdr替换。仅需要替换人源化抗体与pd-1结合所需的cdr数量。优选地，供体是啮齿动物抗体，例如大鼠或小鼠抗体，并且受体将是人框架或人共有框架。通常，提供cdr的免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白是非人(例如啮齿动物)。受体框架是天然存在的(例如人)框架或共有框架，或与其具有约85％或更高，优选90％、95％、99％或更高的同一性的序列。

如本文所用，术语“共有序列”是指由相关序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如winnaker，fromgenestoclones(verlagsgesellschaft，weinheim，德国1987)。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位置被最常发生在该家族中该位置的氨基酸占据。如果两个氨基酸同样频繁出现，则任一个都可以包括在共有序列中。“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。

抗体可以通过本领域已知的方法人源化(参见例如morrison,s.l.,1985,science229:1202-1207,oi等人，1986,biotechniques4:214,和queen等人us5,585,089、us5,693,761和us5,693,762，其全部内容在此引入作为参考)。

可以通过cdr-移植或cdr取代产生人源化或cdr-移植的抗体，其中可以替换免疫球蛋白链的一个、两个或所有cdr。参见例如美国专利5,225,539；jones等人1986nature321：552-525；verhoeyan等人1988science239：1534；beidler等人1988j.immunol.141：4053-4060；winterus5,225,539，其全部内容通过引用明确并入本文。winter描述了可用于制备本发明的人源化抗体的cdr-移植方法(英国专利申请gb2188638a，1987年3月26日提交；winterus5,225,539)，其内容明确地通过引用并入。

人源化抗体也在本发明的范围内，其中特定氨基酸已被取代、缺失或添加。从供体中选择氨基酸的标准描述于us5,585,089，例如us5,585,089的第12-16栏，例如us5,585,089的第12-16栏，其内容通过引用并入本文。padlan等人1992年12月23日公开的ep519596a1中描述了用于人源化抗体的其他技术。

抗体分子可以是单链抗体。可以改造单链抗体(scfv)(参见，例如，colcher，d.等人(1999)annnyacadsci880：263-80；和reiter，y.(1996)clincancerres2：245-52)。单链抗体可以二聚化或多聚化以产生对同一靶蛋白的不同表位具有特异性的多价抗体。

在其他实施方案中，抗体分子具有重链恒定区，其选自例如igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd和ige的重链恒定区；特别地，选自例如igg1、igg2、igg3和igg4的(例如人)重链恒定区。在另一个实施方案中，抗体分子具有选自例如κ或λ的(例如人)轻链恒定区。可以改变(例如突变)恒定区以修饰抗体的性质(例如，增加或减少以下一种或多种：fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能、和/或补体功能)。在一个实施方案中，抗体具有：效应子功能；并且可以修复补体。在其他实施方案中，抗体不招募效应细胞；或修复补体。在另一个实施方案中，抗体具有降低的结合fc受体的能力或没有结合fc受体的能力。例如，它是同种型或亚型，片段或其他突变体，其不支持与fc受体的结合，例如它具有诱变或缺失的fc受体结合区。

改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。通过用不同的残基取代抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基，可以产生功能改变的抗体，例如对效应配体(例如细胞上的fcr)或补体的c1组分的亲和力改变(参见例如ep388,151a1、us5,624,821和us5,648,260，其全部内容通过引用结合到本文)。可以描述类似类型的改变，如果应用于鼠，或其他物种免疫球蛋白将减少或消除这些功能。

在某些实施方案中，抗体分子是多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子的方案是本领域已知的；包括但不限于，例如，美国专利5731168中描述的“臼中杵(knobinahole)”的方法；如wo09/089004、wo06/106905和wo2010/129304中所述的静电导向fc配对；例如wo07/110205中所述的链交换工程化结构域(strandexchangeengineereddomains，seed)异二聚体形成；例如wo08/119353、wo2011/131746和wo2013/060867中所述的fab臂交换。

磷脂酰丝氨酸靶向抗体

a.磷脂酰丝氨酸作为治疗靶标

磷脂酰丝氨酸(ps)是一种高度免疫抑制分子，其充当上游免疫检查点并调节宿主免疫应答。因此，ps涉及各种疾病，包括癌症和病毒感染。因此，ps靶向抗体形式的免疫治疗剂为包括癌症在内的那些疾病提供了新的治疗选择。

更详细地，在正常细胞中，ps被分离到质膜的内小叶，但是在各种疾病状态的患病和异常细胞中，特别是在癌症和病毒感染中，会外化到质膜的外小叶。在癌症情形下，引起ps外化的一些环境压力因素是缺氧/复氧、氧化应激和暴露于某些细胞因子。ps外化也发生在细胞死亡和免疫吞噬细胞清除的条件下(birge等人，2016)。随后，ps被免疫细胞上的ps受体(例如，tim3和tim4、bai1、稳定蛋白2和rage)识别并结合，任选地通过一种或多种桥接蛋白，使得ps诱导并维持免疫抑制。在肿瘤微环境中，ps暴露于肿瘤血管内皮细胞、肿瘤细胞和源于肿瘤的外泌体的表面，并且复制免疫抑制过程，从而防止发生抗肿瘤和炎症反应。

暴露的ps是促进识别和清除死亡细胞的吞噬信号，其触发免疫抑制性细胞因子(例如tgf-β和il-10)的释放并抑制促炎细胞因子(例如tnf-α和il-12)的产生。ps还使巨噬细胞偏向免疫抑制性m2表型，抑制树突细胞(dc)成熟和dc呈递抗原的能力，同时刺激dc分泌促进t细胞耐受的免疫抑制性介质。总之，ps是诱导和维持免疫抑制的肿瘤微环境的核心因素。

b.ps靶向抗体

由于ps暴露在肿瘤微环境中有促进肿瘤进展的倾向，ps靶向抗体可用于阻断ps与免疫细胞上特异性受体的结合，从而提供有效的癌症疗法(yin等人，2013)。已研发出多种此类ps靶向抗体作为治疗剂，如下所示。

b1.巴维昔单抗

产生的用于评估ps靶向抗体的临床前潜力的早期单克隆抗体是称为3g4的抗体，其为小鼠igg3单克隆抗体(实例i；ran等人，2005；huang等人，2005)。将分泌3g4抗体的杂交瘤细胞系样品保藏在美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection；atcc)，并给定atcc保藏号pta4545。保藏的杂交瘤的可用性不应被解释为违反任何政府的职权部门根据其专利法授予的权利来实施本发明的许可。

巴维昔单抗是3g4小鼠抗体的人类嵌合形式，其中鼠可变区(抗原结合区)可操作地连接于人类抗体恒定区(实施例i，c)。巴维昔单抗家族的抗体详细描述于众多美国专利，例如美国专利第7,247,303号和美国专利第7,572,448号中。巴维昔单抗当给予患者时，免疫原性较低，因为抗体的大部分来自人类。

3g4和巴维昔单抗抗体有力结合于阴离子磷脂，特别是ps，在血清存在下，还结合于磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酸(pa)、磷脂酰甘油(pg)和心磷脂(cl)(ran等人，2005)。在这些阴离子磷脂中，ps在生理学和病理学上是最相关的。无论是否存在血清，3g4和巴维昔单抗均未展现出可检测的与中性磷脂、磷脂酰胆碱(pc)、鞘磷脂(sm)或磷脂酰乙醇胺(pe)的结合。

尽管起初认为，3g4和巴维昔单抗抗体直接结合于ps，但后来据测定，所述ps结合是由血清蛋白(其被鉴别为β2糖蛋白1(β2gpi))介导(实施例i；luster等人，2006)。事实上，3g4和巴维昔单抗在β2gpi(包括纯化的β2gpi以及通过存在于通常用于elisa中的10％血清中简单提供的β2gpi)存在下进行的酶联免疫吸附测定(elisa)中有力结合ps。

β2gpi，也称为载脂蛋白h，具有五个域，i、ii、iii、iv和v，并且域结构在哺乳动物中是保守的。β2gpi以三级结构形式折叠成所述五个可辨别域，并且可以具有封闭的圆形结构或开放的j形或钩形结构。β2gpi通过其c末端域，域v中的带正电荷区域与阴离子磷脂，特别是ps结合，只要如通过用纤溶酶在lys317/thr318裂解位点处裂解，域v没有“切口”(其破坏ps结合)(hunt等人，1993；hunt&krilis，1994)。3g4和巴维昔单抗抗体结合于β2gpi的域ii。这增强了3g4和巴维昔单抗作为治疗性抗体的安全性，因为与β2gpi结合的某些其它抗体与病理学相关，但这些抗体与β2gpi的域i结合。

3g4和巴维昔单抗抗体与ps的高亲和力结合需要抗体与β2gpi的二价相互作用(实施例i；luster等人，2006)。在不存在此类抗体的情况下，β2gpi仅以低亲和力结合于阴离子磷脂，特别是ps。这已经在显示3g4和巴维昔单抗与ps在β2gpi存在下以高亲和力复合物形式结合，调整1μm至1nm下β2gpi与ps结合的研究中得到量化。

3g4和巴维昔单抗抗体与ps的β2gpi依赖性结合依赖于结合至β2gpi的结构域ii的抗体。如上所述，由于巴维昔单抗与β2gpi的域ii结合，所以其与副作用无关，如其中存在与β2gpi的域i结合的抗体的与抗磷脂综合征相关的副作用(delaat等人，2005；delaat等人，2006；ioannou等人，2007)。抗体与β2gpi的高亲和力二价相互作用协调所得与ps的高亲和力结合，包括当ps在细胞表面和膜上外化时。

尽管3g4和巴维昔单抗抗体与β2gpi结合，但将其称为“ps靶向抗体”，因为它们特异性定位并结合体内疾病状态下暴露的ps。由于ps维持在健康正常细胞的内部，并且仅暴露于疾病状态下的细胞表面，因此体内抗体定位不仅对ps具有特异性，而且对于其中ps是标记物的疾病，特别是癌症，以及病毒感染和某些其它病理学具有特异性。

与ps结合的β2gpi依赖性抗体在体外与体内相同，使得elisa是用于疗法的精确模型。确切地说，在其中用ps涂布板并且在血清存在下进行elisa的所述elisa中，3g4、巴维昔单抗等抗体能够与ps形成稳定的结合复合物。因此，elisa测定模拟疗法期间的体内情况，其中ps仅在疾病环境中的细胞，如肿瘤微环境中的细胞或病毒感染的细胞上独特地暴露。与elisa一样，当3g4和巴维昔单抗抗体遇到暴露的ps时，其能够与血液中存在的β2gpi形成稳定的结合复合物。无论ps是否在elisa孔或患病细胞上，抗体-β2gpi复合物均具有比单体β2gpi，即不存在ps靶向抗体的β2gpi高多于1000倍的ps亲和力。

b2.直接ps结合抗体，如11.31

除了间接ps结合抗体，如巴维昔单抗，整个ps靶向抗体家族还包括与ps直接结合的抗体，即直接ps结合抗体。此类“直接ps结合抗体”是一种以下抗体，其不仅对ps具有功能特异性，而且在体内靶向并结合ps(间接结合抗体也是如此)，但即使在体外结合测定中，也不需要血清蛋白，如β2gpi以与ps形成紧密结合复合物。

此类抗体的一个特定实例是称为9d2的小鼠单克隆抗体(ran等人，2002)。已显示9d2抗体定位于肿瘤血管并在体内发挥抗肿瘤作用(ran等人，2002)。直接ps结合抗体的另一实例是称为11.31(pgn632)的全人类抗体。11.31抗体还显示在体内发挥抗肿瘤作用(例如，在携带mda-mb-435乳腺癌异种移植物的小鼠中)并且显示出令人印象深刻的抗病毒作用(moody等人，2010；美国专利第7,455,833号)。

因此直接ps结合抗体考虑用于治疗其中ps是标记物的各种疾病，最特别是癌症和病毒感染。用于优化使用此类直接结合ps靶向抗体的治疗的生物标志物通常将不依赖于血清蛋白，诸如β2gpi，但依赖于其他因子。用于直接结合抗体的有用的生物标志物包括用于在本文中公开的ps-靶向抗体的免疫标记及其特定的方面，如低干扰素γ(ifnγ)和“阴性”pd-l1表达，即tc0(tc0<1％)。

b3.其它β2gpi依赖性ps靶向抗体，如1n11

本发明的优选实施方案涉及ps靶向抗体家族的另一部分，即间接ps结合抗体。如本文所用，“间接ps结合抗体”是一种以下抗体，其对ps具有功能特异性，并且体内靶向和结合于ps，但需要血清蛋白以与ps形成紧密结合复合物。本发明特别涉及间接ps结合抗体的子组，即β2gpi依赖性ps结合抗体。如本文所用，“β2gpi依赖性ps结合抗体”是一种以下抗体，其对ps具有功能特异性，并且体内靶向和结合于ps，但需要血清蛋白β2gpi以与ps形成紧密结合复合物。如上所述，此类抗体的实例包括小鼠抗体、3g4和嵌合抗体、巴维昔单抗。

β2gpi依赖性ps结合抗体的其它目前优选的实例是称为1n11(pgn635)和1g15的完全人类抗体，优选1n11抗体。已描述使用1n11抗体及其鼠嵌合形式的若干研究，包括成像和治疗(gong等人，2013；freimark等人，2016年；gray等人，2016a)。1n11抗体的序列和ps结合特性示于图2a和图2b。此外，在表a中并且在(1n11)seqidno：22和(1n11)seqidno：23中提供了1n11和1g15抗体的进一步的序列信息，其中每个“seqidno”唯一地是指1n11抗体序列，并且与图1a和图1b(实施例i)的3g4或巴维昔单抗抗体序列无关。

igg抗体的完整重链和轻链的氨基酸序列如下所示：

1n11igg重链(氨基酸序列)

恒定区以粗体/斜体显示。

(1n11)seqidno:22

1n11igg轻链(氨基酸序列)

恒定区以粗体/斜体显示。

(1n11)seqidno:23

c.治疗用途

正如上文论述的ps生物学所预测，来自ps的信号抑制免疫细胞识别和对抗肿瘤的能力。巴维昔单抗和相关抗体通过阻断ps与其受体的结合以及通过发送替代的免疫激活信号来超越所述ps介导的免疫抑制信号传导。因此已显示ps靶向抗体会改变肿瘤中免疫细胞的功能，导致免疫激活和抗肿瘤免疫应答的多种征象。

ps靶向抗体，如巴维昔单抗通过在肿瘤微环境中对免疫细胞进行多焦点重编程以支持免疫激活来实现ps介导的免疫抑制的这一阻挡(yin等人，2013)。巴维昔单抗和相关抗体因此打破了肿瘤微环境中的免疫耐受性。抗体介导的ps阻断降低髓源性抑制细胞(mdsc)、转化生长因子-β(tgfβ)和白细胞介素-10(il-10)的水平，并增加促炎细胞因子，如干扰素γ(ifnγ)、肿瘤坏死因子α(tnfα)和白细胞介素-12(il-12)的水平。所述ps阻断还将mdsc和肿瘤相关巨噬细胞(tam)从主要的m2再极化到主要的m1表型，促进树突细胞(dc)的成熟，激活细胞毒性t细胞并诱导有效的适应性抗肿瘤t细胞免疫(yin等人，2013)。

巴维昔单抗和相关抗体还激活先天免疫，即nk细胞以及m1巨噬细胞。重要的是，这些抗体还引起预先存在的独特地暴露ps的肿瘤血管的选择性关闭(ran等人，2005；美国专利第7,572,448号)，并且所述活性包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，其经肿瘤浸润m1巨噬细胞和nk细胞介导。以这种方式破坏肿瘤血管引起肿瘤细胞破坏。免疫疗法和血管靶向的这些双重机制，特别是adcc作用，意指巴维昔单抗可以有效对抗对免疫激活或常规的抗增生化疗有抗性的肿瘤。

与其它免疫治疗剂一样，当用于联合治疗时，ps靶向抗体的抗肿瘤作用增加。与ps靶向课题(如巴维昔单抗和相关抗体)一起使用的一组药剂是增加ps在肿瘤微环境中的暴露的药剂和/或条件，如放射和/或化疗剂(美国专利第7,422,738号；美国专利第8,486,391号；美国专利第7,572,448号)。因此，已临床前证明与多西他赛联合治疗乳腺肿瘤(huang等人，2005)和前列腺癌(yin等人，2013)；与吉西他滨联合治疗胰腺肿瘤(beck等人，2006)；与辐射联合治疗肺癌(he等人，2007)和成胶质细胞瘤(he等人，2009)；与重新激活突变肿瘤抑制因子p53的prima-1联合治疗晚期乳腺肿瘤(liang等人，2011)；与腺病毒载体联合用于将腺病毒重新靶向肿瘤血管系统(hogg等人，2011)；与顺铂组合治疗肺癌术后复发(judy等人，2012)；与索拉非尼联合治疗肝细胞癌(cheng等人，2016)的增强的抗肿瘤作用。

另一组与ps靶向抗体(如巴维昔单抗)一起使用的药剂是其它io药剂。从临床前研究看，据信巴维昔单抗的作用机制与可用治疗剂互补，因为ps是上游免疫检查点。临床前，已显示巴维昔单抗家族抗体与呈ctla-4、pd-1和pd-l1抗体形式的其它检查点抑制剂联合的令人印象深刻的联合疗法(freimark等人，2016年；gray等人，2016a)。与单独的pd-1阻断相比，此类包括增加的存活率的抗肿瘤活性与肿瘤内活化的cd8t细胞的增加、与pd-l1表达偶联的m2巨噬细胞和mdsc的减少相关，并增加脾脏中的肿瘤反应性t细胞。因此，诸如这些的临床前结果表明，巴维昔单抗家族的ps靶向抗体的逆转ps介导的免疫抑制并启动治疗有效的适应性抗肿瘤免疫。

鉴于ps靶向抗体，如巴维昔单抗的有利安全性，这些抗体也可以在三联疗法中有效地联合，包括与放射、化疗和/或免疫治疗剂的三重组合，以及与两种免疫治疗剂的三重组合。最近已显示使用针对ps、pd-1和lag-3的抗体的三重组合的令人印象深刻的临床前结果(gray等人，2016b)。那些技术也描述于2016年9月23日提交的美国临时专利申请序列号62/398,695和2016年10月31日提交的序列号62/414,834中(各通过引用并入本文)。

基于此类临床前数据，已在大多数与其它适应症批准的治疗剂组合的800多名患者的临床研究中对巴维昔单抗进行评估，但没有与io药剂或检查点抑制剂组合治疗。一系列抗病毒和抗肿瘤研究显示出治疗活性。基于广泛的临床前研究和在人类中的药代动力学特征(实施例ii；还参见gerber等人，2011；digumarti等人，2014)，确定静脉内(iv)给予的3mg/kg巴维昔单抗的剂量并选择用于大多数肿瘤学临床研究，包括在肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌和肾癌患者中。现已公布有希望的临床抗肿瘤结果，包括组合以下化疗剂的巴维昔单抗：太平洋紫杉醇，在her2阴性转移性乳腺癌患者中(chalasani等人，2015)；太平洋紫杉醇-卡铂，在晚期非小细胞肺癌(nsclc)中(digumarti等人，2014)；索拉非尼，在肝细胞癌中(cheng等人，2016)；以及多西他赛，在先前治疗过的晚期非鳞状nsclc中(gerber等人，2016)。

总之，i期和ii期临床研究结果证明了巴维昔单抗具有临床意义的治疗作用。虽然现有大量研究显示，使用ps靶向抗体成功治疗了一系列疾病，但到目前为止，还没有针对此类疗法批准巴维昔单抗。ps靶向抗体的临床经验主要基于巴维昔单抗与化学治疗剂的组合。除了优化巴维昔单抗治疗的生物标志物外，最需要的是有效的新组合疗法，以改善人类的治疗效果。

d.ps靶向抗体的生物标志物

在癌症疗法领域，生物标志物在鉴别影响治疗应答的特定患者特征方面发挥越来越重要的作用。历史上已伴随靶向癌症治疗，并且近年来伴随检查点抑制剂，包括pd-1和pd-l1抑制剂观察到这一现象。

本发明涉及对用ps结合抗体如巴维昔单抗治疗重要的几种生物标志物的分析。如本文所用，“巴维昔单抗生物标志物”是以下生物标志物，其单独或作为两种或更多种或多种生物标志物之一用于选择患者或患者群体以改善治疗的临床益处，所述治疗使用包含作为疗法的至少一部分的ps结合抗体，优选巴维昔单抗的疗法。此类巴维昔单抗生物标志物，包括β2gpi，因此可用于在治疗之前预测患者、患者群体或亚群是否有可能受益于包含ps结合抗体，优选巴维昔单抗的ps结合抗体，优选巴维昔单抗的组合疗法。

还提供了用于鉴别最合适的患者群体的多标记物标签，以改善含有巴维昔单抗的治疗方案的临床益处。在这些分析中鉴别的第一个生物标志物是β2gpi(章节e；章节f)。总体而言，所鉴别的生物标志物的模式是指导临床研发和治疗的巴维昔单抗“标签”。

作为巴维昔单抗免疫生物标志物的一部分，低水平的ifnγ在治疗前与巴维昔单抗治疗的更好结果相关。“阴性”治疗前pd-l1表达，即tc0(tc0<1％)也与巴维昔单抗治疗的更好的结果相关。

这些结果支持使用ps靶向抗体(如巴维昔单抗)“激发(prime)”免疫系统，即增强抗肿瘤免疫应答。在这方面，现已知晓肿瘤可放置在“热”到“冷”的层面上，这取决于其被t细胞和其它免疫细胞侵入的程度。免疫浸润水平(“热量(heat)”)反映了免疫系统是否识别并与肿瘤接触。患有“热”肿瘤的患者预后较好；而患有“冷”肿瘤，复发的可能性要高得多。重要的是，已经确定巴维昔单抗能够对冷肿瘤产生积极影响，使其更易于接受治疗，包括与其它检查点抑制剂一起。因此，巴维昔单抗免疫生物标志物不仅在选择进行巴维昔单抗疗法的患者方面，还在鉴别用巴维昔单抗和用于组合疗法的经明智选择的药剂治疗的患者方面具有额外用途。

d1.样品

对于除β2gpi(章节e)外的生物标志物，本发明可被用来测试含有或疑似含有一种或多种生物标志物的任何生物样品，包括来自动物、个体或患者的任何组织样品或活组织检查物，包括粪便。可以使用来自生物组织样品的澄清裂解物。然而，本发明优选与天然体液一起使用，由此提供可以对使用微创或无创技术获得的生物样品进行的测试，也称为“液体活组织检查”。与通常需要更长时间来提供结果并且自身可能造成健康风险的诸如活组织检查之类的更严格的技术相比，这是一个优势。

含有或疑似含有一种或多种生物标志物的生物流体(biologicalfluids/biofluid)的实例包括血液、尿液、腹水、脑和脑脊液(csf)、痰、唾液、鼻分泌物、骨髓抽吸物、关节液或滑液、房水(aqueoushumor)、羊水、卵泡液、耳垢、母乳(包括初乳)、支气管肺泡灌洗液、精液、精液(包括前列腺液)、考珀液(cowper'sfluid)或射精前液、女性射液、汗液、泪液、囊液、胸膜和腹腔液或灌洗液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、肝脏灌注液、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、粪便液、胰液、鼻窦腔灌洗液、支气管肺抽吸液或其它灌洗液。生物样品还可以包括囊胚腔、脐带血或母体循环，其可以源自胎儿或母体。

用于测试的生物流体的优选实例是血液、尿液和腹水，特别是来自患有或怀疑患有卵巢癌的动物、个体或患者的腹水。在使用尿液样品的情况下，其优选用于泌尿系统、泌尿生殖系统和生殖系统的癌症，如卵巢癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、睾丸癌、尿道癌和阴茎癌。与β2gpi一样，检测和量化一种或多种其它生物标志物优选从外周血液样品，优选血浆，并且最优选血清中进行。

d2.ps阳性外泌体

外泌体近年来因癌症而受到关注。外泌体是40-50至100纳米(nm)大小的膜衍生的囊泡，其在体内和体外由所有细胞组成性释放。外泌体是具有生物活性的分子梭，其在细胞间通讯中起重要作用并影响许多生理和病理过程。在癌症中，外泌体功能包括癌细胞和肿瘤基质之间的致癌基因的转移，所述肿瘤基质引发所谓的转移性扩散的“转移性生态位”(an等人，2015)。

由于外泌体形成中涉及的多个细胞内融合事件，细胞外释放的外泌体的腔内含物和蛋白质组谱与起源细胞的那些相反。因此，肿瘤衍生外泌体(“肿瘤外泌体”)具有反映其产生的癌细胞的特征。实际上，来自起源细胞的胞质(特别是核酸)和质膜组分的存在意味着循环外泌体是易于获得的替代物，其反映了用于生物标志物分析的亲本细胞的特性。

与来自正常细胞的外泌体相反，肿瘤外泌体的特征在于其表面上具有ps。因此，ps阳性肿瘤外泌体可用于癌症的诊断。最近报道了通过使用固相测定检测和量化生物流体样品中的ps阳性肿瘤外泌体来诊断癌症的新型和改进的方法、组合物和试剂盒。此类技术描述于各于2016年6月9日提交的美国专利申请序列号15/177,747和pct专利申请第pct/us16/036629号中(通过引用将每一篇特定合并于此)。

由于ps具有高度免疫抑制性，因此ps阳性肿瘤外泌体的释放是肿瘤促进免疫抑制环境的另一种手段。因此，已提出治疗前ps阳性肿瘤外泌体的水平用作对任何癌症治疗的疗法应答的预测标记物。显然，ps靶向抗体需要在疾病微环境中与ps结合。因此，测量治疗前ps阳性肿瘤外泌体的水平特别引人注目，其用作使用ps靶向抗体，如巴维昔单抗的疗法应答的预测生物标志物。

诸如美国序列号15/177747和pct申请第pct/us16/036629号中的那些方法因此可以用作本发明生物标志物测试的一部分。其与本发明的β2gpi的量化和/或本文公开的其它生物标志物的组合使用在某些实施方案中可为优选的，例如以提高总体预测分析的灵敏度。

d3.低治疗前ifnγ

ps靶向抗体(例如巴维昔单抗)的一种合适的免疫生物标志物是低治疗前ifnγ，优选地低治疗前血清ifnγ，其与巴维昔单抗治疗(实施例xviii)的较好存活结果相关。优选地，治疗前血清ifnγ由免疫测定法测定。如本文所用，“低治疗前血清ifnγ”定义为在对照研究中，优选在临床试验中，小于治疗前血清ifnγ中位水平的治疗前血清ifnγ水平，并且最优选地小于临床试验治疗组的中位治疗前血清ifnγ水平。低治疗前血清ifnγ水平的一个实例是0.093pg/ml，优选地如通过免疫测定法测定。

低治疗前ifnγ，优选地低治疗前血清ifnγ与巴维昔单抗治疗的总体存活提高的相关性是令人惊奇的，并且与现有技术用于其它免疫疗法形成对比。例如，用检查点抑制剂治疗的癌症患者的存活率增加，例如pd-1和pd-l1的抗体，通常与更高水平的治疗前ifnγ相关。例如，在fehrenbacher等人，2016用抗pd-l1抗体阿特珠单抗(本生物标志物分析部分地基于其)治疗nsclc的研究中，增加的总存活与递增ifnγ水平相关联，即与巴维昔单抗的本发现的趋势相反。鉴定低治疗前ifnγ作为巴维昔单抗的免疫生物标志物因此支持使用巴维昔单抗治疗最需要新治疗的“免疫冷淡(immunecold)”肿瘤患者。

d4.阴性治疗前pd-l1表达

用于ps靶向抗体(例如，巴维昔单抗)的另一种合适的免疫生物标志物是非常低的治疗前pd-l1表达，其被归类为“阴性”pd-l1表达，其与巴维昔单抗治疗(实施例xv)的更好的存活结果相关。在某些优选的实施方案中，pd-l1表达被测量作为免疫组织化学(ihc)测定(perkinelmer,waltham,ma,usa)的一部分，其使用兔抗人pd-l1抗体，称为(cellsignalingtechnology,目录#13684；mahoney等人,2015)。其他优选和进一步合适的测定是本领域技术人员已知的并且在下面举例说明。

如本文所用，“阴性”pd-l1表达优选被定义为“tc0”，其本身定义为“tc0<1％”，如根据fehrenbacher等人2016教导的方法和分类所测量的。如本领域已知的，在pd-l1表达的背景下“tc”是指肿瘤细胞，并且优选地在治疗前肿瘤细胞上测量阴性pd-l1表达。然而，也可以在治疗前免疫细胞上测量阴性pd-l1表达(fehrenbacher等人，2016)，并且这种形式的阴性pd-l1也与巴维昔单抗治疗的存活相关。

用于测量治疗前pd-l1表达的某些合适的测定和抗体是与纳武单抗一起使用的那些，特别是经验证的自动化ihc测定(北美dako)，如brahmer等人，2015中所述，其使用兔抗人pd-l1抗体，称为28-8(abcam，目录#ab205921)，其已被fda批准作为补充诊断试验。其它合适的测定和抗体是与派姆单抗相关使用的那些，特别是ihc测定，鼠garon等人2015中描述，其使用鼠抗人pd-l1抗体克隆，称为22c3(merck)，其已经被fda批准作为伴随诊断测试。此外合适的测定和抗体是与德瓦鲁单抗相关使用的那些，特别是使用自动的ventanabenchmark超平台(ventanamedicalsystems,tucson,az)的ventanaoptidabihc检测试剂盒的形式的确认试验，如在rebelatto等人，2016中所述，其使用称为sp263的ventana抗pd-l1抗体。也可以使用与avelumab一起使用的73-10抗pd-l1抗体(dako)；也可使用称为5h1、7g11、015、9a11、cd274、mab1561和sab2900365的抗pd-l1抗体。

除了在ihc中使用抗体(实施例xv)，用于测量治疗前pd-l1表达的其它优选的测定法和抗体是与阿特珠单抗结合使用的那些，特别是使用自动的ventanabenchmark超平台的ventanaoptidabihc测定的形式的确认试验，如在fehrenbacher等人，2016中所述，其使用称为sp142的ventana抗pd-l1抗体(例如专利申请us2016-0009805)。在基因工程细胞系中，使用e1l3n抗体的pd-l1表达水平与使用sp142抗体的使用显色ihc和定量免疫荧光的那些高度一致(gaule等人，2017)。这强调了实施例xv中的本研究与fehrenbacher等人2016的研究之间的技术联系(以及预测结果的出乎意料的差异)。

在“sp142”pd-l1测定中，样品应该优选具有至少约50个肿瘤细胞与相关基质；pd-l1在这些细胞中表达为膜状和颗粒状细胞质染色。sp142测定使用逐步方法进行；通过确定pd-l1阳性活肿瘤细胞覆盖的区域百分比和相关的肿瘤内和连续的肿瘤周围基质对肿瘤细胞进行评分。如果需要，可以通过确定任何强度的pd-l1阳性免疫细胞占据的肿瘤区域的比例来对免疫细胞进行评分。该试验已被fda批准作为一种辅助诊断工具，用于选择晚期尿路上皮癌和晚期nsclc的患者用于阿特珠单抗治疗。

巴维昔单抗治疗的阴性pd-l1表达与改善的存活的相关性也是令人惊讶的，并再次与本领域其他免疫疗法的状态形成对比。特别地，用检查点抑制剂治疗的癌症患者的存活率增加，例如pd-1和pd-l1的抗体，通常与更高水平的治疗前pd-l1相关。值得注意的是，在fehrenbacher等人，2016用抗pd-l1抗体阿特珠单抗(本生物标志物分析部分地基于其)治疗nsclc的研究中，增加的总存活与肿瘤细胞(以及肿瘤侵袭免疫细胞)上递增pd-l1水平相关联，即与巴维昔单抗的本发现的趋势相反。鉴定阴性pd-l1作为巴维昔单抗的免疫生物标志物也支持使用巴维昔单抗治疗患有“免疫冷淡”肿瘤的患者，所述患者目前从检查点抑制剂中获得的益处最少(如果有的话)，因此在大多数情况下需要新的治疗方法。

e.β2gpi作为生物标志物

尽管大量数据另外指出(例如，实施例i、e)，但本发明人决定研究β2gpi的治疗前水平是否可以用作生物标志物，或作为生物标志物组的一部分，以预测使用ps靶向抗体(如巴维昔单抗和相关抗体)的疗法的治疗结果。除了本公开，这种技术在2016年9月27日提交的临时申请序列号为62/400589；2016年10月11日提交的序列号62/406,727；2016年10月13日提交的序列号62/407,983中描述(各自通过引用具体地并入本文)。

β2gpi是一种丰富的血浆(血清)糖蛋白，其既可以游离也可以与脂蛋白结合。已知来自各种哺乳动物物种的β2gpi的dna和氨基酸序列，包括小鼠、大鼠、狗、牛、黑猩猩和人类(steinkasserer等人，1991)。出于示范性参考，提供呈登录号1c1za的人类β2gpi氨基酸序列。β2gpi是糖基化的并且通常报告为50kda蛋白质(实施例i；还参见mcneil等人，1990，图4；balasubramanian等人，1998，图1；luster等人，2006年，图1d)。尽管已研究β2gpi数十年，但β2gpi的准确生理作用仍然未知(prakasam&thiagarajan，2012)。实际上，缺乏β2gpi的基因敲除小鼠的表面健康生命表明β2gpi作用并不重要(sheng等人，2011)。

出人意料地，已经确定β2gpi，特别是功能性β2gpi的治疗前血液中的浓度，可有效地用作生物标志物来预测对使用ps靶向抗体，如巴维昔单抗的疗法的成功应答。实际上，“功能性”β2gpi的水平，即结合ps和ps靶向抗体，如巴维昔单抗的β2gpi，可单独用作对巴维昔单抗的应答的生物标志物。

在其中单独使用治疗前β2gpi水平作为对ps靶向抗体，如巴维昔单抗的应答的生物标志物的本发明实施例中，那些β2gpi水平在数值上受到限定并且在能够检测“功能性”β2gpi的测定中进行测量，如本文所定义。然而，在其中治疗前β2gpi水平用作对ps靶向抗体，如巴维昔单抗的应答的两种或更多种或多种生物标志物之一的本发明实施例中，β2gpi水平不需要在数值上受到严格限定，也不仅仅在功能性β2gpi的测定中进行测量。

因此，β2gpi水平作为含巴维昔单抗的疗法的双或多标记物标签的一部分可以呈“β2gpi高(β2gpihigh)”与“β2gpi低(β2gpilow)”，类似于如veri良好(verigood；vsgood)和vs不良(vspoor)，和呈“热”或“冷”的肿瘤的描述。在这种情况下，呈“β2gpi高”的β2gpi水平是等于或大于约180、190、200、210、220、230、240、250或260μg/ml，优选等于或大于约200μg/ml的β2gpi(总β2gpi或优选功能性β2gpi)的治疗前水平。“β2gpi高”因此包括等于约180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310或320μg/ml的β2gpi(总β2gpi或优选功能性β2gpi)的治疗前水平。

本发明还提供了针对某些数值上经限定的量和范围的功能性β2gpi的生物标志物，所述功能性β2gpi的量和范围在能够检测功能性β2gpi的测定中进行测量。在某些实施方案中，本发明涉及基于等于或大于200μg/ml的治疗前水平的功能性β2gpi选择和治疗患者(实施例xiii；图3；实施例xiv；实施例xvii)，即大约200μg/ml。这包括等于约200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310或320μg/ml的功能性β2gpi的治疗前水平。

目前，本发明的某些当前优选实施方案涉及基于200-240μg/ml范围内的功能性β2gpi的治疗前水平选择和治疗患者(实施例xiii；图4)，即约200-240μg/ml，特别是用于治疗nsclc。这还包括下述范围的功能性β2gpi的治疗前水平：200-210、200-220、200-230、210-220、210-230、210-240、220-230、220-240和230-240μg/ml。

在其它实施方案中，本发明涉及基于在约180、190、200、210或220μg/ml中的任一个作为下限数到约230、240、250、260、270、280、290、300、310或320μg/ml中的任一个作为上限数的范围内的功能性β2gpi的治疗前水平选择和治疗患者。这些范围包括以下所有，其中，约200-280μg/ml的范围是优选的：

约180-230、180-240、180-250、180-260、180-270、180-280、180-290、180-300、180-310和180-320；

约190-230、190-240、190-250、190-260、190-270、190-280、190-290、190-300、190-310和190-320；

约200-230、200-240、200-250、200-260、200-270、200-280、200-290、200-300、200-310和200-320；

约210-230、210-240、210-250、210-260、210-270、210-280、210-290、210-300、210-310和210-320；和

约220-230、220-240、220-250、220-260、220-270、220-280、220-290、220-320、220-310和220-320。

无论选择以上哪个数量或范围中的一个或多个，作为生物标志物或生物标志物组的一部分的β2gpi，优选功能性β2gpi的治疗前水平的使用均适用于选择患有其中ps为标记物的各种疾病，最特别是癌症和病毒感染，以及细胞内寄生虫感染的患者，以及其使用单独或优选呈任何联合疗法形式的任何ps靶向抗体，如巴维昔单抗的治疗。

f.β2gpi测定

由于β2gpi的治疗前水平是ps靶向抗体(如巴维昔单抗和相关抗体)的生物标志物，因此提供关于β2gpi测定的以下指导内容。本发明还提供了用于量化功能性β2gpi的某些优选测定(章节g)。

f1.β2gpi样品

作为血清蛋白，β2gpi对于在外周血(血浆，血清)样品中进行的检测是理想的，如下所述。然而，研究表明，在涉及ps的各种病理生理条件下，β2gpi在体内定位于内皮细胞(agostinis等人，2011)。因此，全范围的生物样品(章节d1)均可潜在地用于β2gpi检测。

然而，外周血、血浆和血清样品对于检测和量化β2gpi(无论总β2gpi或功能性β2gpi(章节g))是特别优选的。可以使用全血(红细胞、白细胞、血小板、蛋白质和血浆)。优选使用血浆，其是红细胞和白细胞沉淀后剩余的液体。血浆含有纤维蛋白原和其它凝血因子，因此在静置时往往会凝结。可利用较少易于凝结的血浆，这是优选的；也可以使用无血小板血浆。最优选地，使用血清来检测和量化β2gpi。血清是不含凝血因子的血浆，主要是不含纤维蛋白原，因此血清在静置时不会凝结。通常将动物和人类血清用于诊断目的，并且制备技术是众所周知的。本文示出用于制备供β2gpi测试用的血清样品的示范性方法(实施例xi，a)。

本发明的一个优点在于所述测试可以在生物样品，优选血液、血浆或血清上直接进行。由于灵敏度，可以在不进行任何预先富集或浓缩的情况下容易地检测β2gpi(但不排除这种情况)。测试样品，优选血清样品，其可以是新鲜的或经预先冷冻，然后加以解冻。实施例xi、实施例xii、实施例xiii和实施例xiv显示β2gpi在-70℃下长期储存是稳定的。应优选使用工业标准的冷冻、储存和/或解冻技术，如使用低温管或小瓶和/或蛋白酶抑制剂来限制总体蛋白水解。

f2.β2gpi测定范围

用于测量β2gpi而未提及其是否是“功能性”β2gpi的测定，即“总”β2gpi的测定的广度适用于其中治疗前β2gpi水平仅用作两种或更多种针对巴维昔单抗的生物标志物之一的那些本发明实施例。当单独使用β2gpi水平作为巴维昔单抗的生物标志物时，应使用“功能性”β2gpi测定，如章节g所述。

可以使用所属领域已知的许多体外结合测定和试剂盒中的任何一种或多种来检测并优选量化总β2gpi水平。合适的结合测定包括例如免疫印迹法、蛋白质印迹法(westernblot)、斑点印迹法、ria、免疫组织化学法、荧光激活细胞分选法(facs)、免疫沉淀法、亲和色谱法等。尽管通常优选固相结合测定，但是文献中已描述用于检测β2gpi的各种其它方法，可以使用其中的任何方法。例如，可以通过径向免疫扩散精确地测定β2gpi水平。实际上，从20世纪60年代后期开始到更现代，径向免疫扩散就已被用于量化β2gpi(例如，balasubramanian等人，1998)。也可使用等电聚焦(ief)，然后进行免疫印迹法来量化β2gpi(kamboh等人，1988)，也可进行西方印迹法、免疫电泳法和欧氏双免疫扩散(ouchterlonydoubleimmunodiffusion)(takeuchi等人，2000)。

f3.固相β2gpi结合测定

针对β2gpi的许多灵敏的固相结合测定是所属领域已知的，并且优选使用一种或多种此类测定来检测和量化总β2gpi。此类测定的优选实例是酶联免疫吸附测定(elisa)。在文献中已经报道了各种总β2gpi特异性elisa，包括经改进的捕获elisa(例如，mehdi等人，1999)和竞争性elisa(例如，balasubramanian等人，1998)。可获得用于测定总β2gpi的众多商购试剂盒，如市售抗β2gpi抗体，包括附接到诊断标记的那些抗体。任何此类试剂盒或抗体均可用于检测和量化总β2gpi。例如，来自usbiological的抗β2gpi抗体在本文中用于比较测定中(实施例xii，a10，b2)。

总体而言，总β2gpielisa使用一个或多个抗β2gpi抗体。尽管抗体技术非常先进，但商购试剂盒和商购抗β2gpi抗体通常使用多克隆抗β2gpi抗体，其在此类实施例中完全适用。在示范性的总β2gpi测定中，将抗β2gpi抗体吸附至固体表面，如96孔塑料板，并与疑似含有β2gpi的生物样品(在这种情况下，“抗原”)一起培育。使用直接或间接地标记有可检测剂，即产生可被检测和量化的可检测信号(如颜色或荧光)的试剂的第二结合剂来检测经结合的β2gpi(抗原)。优选地，第二结合剂是标记有可检测剂的抗β2gpi抗体。

此类总β2gpielisa在实例xii，a10，b2中加以示范，并且许多一般组分和步骤，如固体支持物和可检测剂，也在关于本发明的功能性β2gpi测定的下文(章节g)中加以更全面地描述。因此，除非特别说明试剂或步骤仅适用于功能性β2gpi测定，否则本文考虑将其用于检测总β2gpi的测定中。

g.功能性β2gpi的优选elisa

尽管可以使用各种商业测定和研究工具来分析生物标志物的临床试验结果以预测更好的结果，但已知尚未存在可以特别适用于如巴维昔单抗的ps靶向抗体的测定和研究工具。尽管广泛的临床前建模和大量先前临床经验表明低水平和/或不同水平的血清β2gpi将不会显著影响巴维昔单抗的治疗结果(实施例i,e；图5)，但仍寻求对来自iii期试验的患者中的β2gpi浓度进行分析(实施例x)。

然而，无法获得特异性检测可结合ps的β2gpi，而不是总β2gpi的可靠并且定量的β2gpi测定。此类测定对于如应用于生物标志物的最精确测量是必需的，尤其是因为众所周知，β2gpi(“总”β2gpi)的一部分将以切口β2gpi形式存在，其不能与ps结合，并且因此不能介导疾病位点处的抗体结合。此外，显著缺乏特异性检测β2gpi的任何测定，所述测定不仅可以结合ps，还可以结合ps靶向抗体，如巴维昔单抗。这对于最高保真度生物标志物测量尤其重要，例如，排除检测到具有其它有意义变化，特别是突变和/或切割；或裂解或影响域ii的β2gpi的可能性，因为任何此类β2gpi改变将减少或使抗体结合和治疗活性所需的抗体:β2gpi:ps复合物的形成无效。

因此，为了对用ps靶向抗体(如巴维昔单抗)治疗(或待用其治疗)的患者的β2gpi浓度，包括来自iii期试验的患者(实施例x)进行最佳分析，有必要首先发明一种新型检测。本申请公开了这样一种有利的测定，其特别适用于检测和量化人类血液样品(如血浆和血清)中功能性(活性)β2gpi的量，所述测定可以测定出能够结合ps和ps靶向抗体，如巴维昔单抗的β2gpi水平。

通过使用此类功能性β2gpi测定，本发明提供适用作对用巴维昔单抗和相关ps靶向抗体的治疗的应答的单一生物标志物的治疗前β2gpi的限定水平。值得注意的是，功能性β2gpi等于或大于200μg/ml(实施例xiii；图3；实施例xiv；实施例xvii)和功能性β2gpi在200-240μg/ml范围内(实施例xiii；图4)。本发明提供的功能性β2gpi的优选elisa由实施例xii中的详细教导内容进行示范，并且还在下文加以更全面地描述。

g1.测定方法

一般而言，如用于功能性β2gpi的elisa的固相测定使用ps和ps靶向抗体，如巴维昔单抗，其中至少一种与固体支持物可操作地结合和/或其中至少一种直接或间接地标记有可检测剂。可以使用所有结合形式。例如，ps靶向抗体可以吸附到固体支持物上，且用可检测剂标记ps。许多脂质，如用可检测剂标记的ps是所属领域已知的，可以使用其中的任何脂质。然而，为简单起见，目前优选的实施例是其中ps被吸附到固体表面，如96孔塑料板的那些。这意味着可以用可检测剂标记ps靶向抗体，如巴维昔单抗或1n11，所述可检测剂优选是与抗体附接的直接标记。

在进行测定步骤时，将ps包被的固体支持物(例如elisa孔)与怀疑含有β2gpi的生物样品(“抗原”)一起温育。“温育”是在条件下和有效的时间允许特异性结合。只有能够与ps结合的β2gpi才能与ps包被的固体支持物特异性结合，即不能通过常规洗涤除去。

使用呈至少一种ps靶向抗体，优选巴维昔单抗或1n11形式的第二结合剂检测经结合的β2gpi(抗原)，所述第二结合剂直接或间接地标记有可检测剂。未标记的ps靶向抗体可以与第三结合剂，优选另一种抗体结合使用，其结合ps靶向抗体并且直接标记有可检测剂。然而并且再次为简单起见，当前优选实施例是其中所述ps靶向抗体本身直接附接于可检测剂的那些。可检测剂是产生可检测信号(如颜色或荧光)的试剂，所述信号可以被检测和量化。通常，将由信号测量的结合物质的量与“参考信号”的水平，如标准曲线进行比较。

在优选的实施方案中，因此在包含以下的测定中测量β功能性β2gpi：

(a)用磷脂酰丝氨酸(ps)涂布elisa板以制备经ps涂布的elisa板；

(b)在有效的条件下，将生物液体样品，优选血液、血浆或血清样品，

加入到ps涂布的elisa板中，使β2gpi在生物液样品中结合到

ps涂层的elisa板上，制备ps和β2gpi涂布的elisa板；

(c)在有效的条件下将ps-靶向抗体，优选巴维昔单抗或1n11，最优选巴维昔单抗，加入到ps和β2gpi涂布的elisa板，以允许ps靶向抗体与ps和β2gpi涂层elisa板的结合；和

(d)检测ps靶向抗体与ps和β2gpi涂布的elisa板的结合，从而测量样品中的功能性β2gpi。

优选地，将ps靶向抗体如巴维昔单抗附接至产生可检测信号的可检测试剂，并且其中通过检测和测量所述可检测信号检测和测量ps靶向抗体与ps和β2gpi涂布的elisa板的结合。一种示范性可检测剂是辣根过氧化物酶(hrp)，其中hrp裂解底物3,3'5,5'四甲基联苯胺(tmb)，以产生在450nm下检测并测量的有色信号。

在这些测定的所有形式中，最终检测到的唯一β2gpi是能够结合ps和ps靶向抗体的β2gpi，即不会被常规洗涤整体去除的β2gpi。因此，这些测定特别适合于检测呈与临床治疗最相关的形式的治疗前β2gpi，即，“起作用”以与施用的抗体，优选巴维昔单抗以及疾病位点，优选肿瘤微环境中暴露的ps形成结合复合物的β2gpi。因此，这些测定的使用有利于选择患者以改善对巴维昔单抗疗法的治疗结果。

本发明提供的功能性β2gpi测定也是简单的、可再现的、灵敏的、成本有效的，并且适用于通过微创技术获得的生物样品，特别是血液(血清和血浆)样品。所述测定的快速性提供了重要的优点，即生物标志物测试可以快速进行并且治疗决策可以得到及时制定和实施。

g2.固体支持物

本发明的固相结合测定通常需要将结合构建体与固体支持物或衬底(其具有至少一个用于涂布或附接的表面)可操作地结合。如本文所用，“结合构建体”包括与适用于检测生物标志物的组分结合的构建体。关于β2gpi生物标志物，结合构建体包括抗β2gpi抗体、ps和ps靶向抗体，如巴维昔单抗。

此类固体支持物或衬底包括例如板、珠粒和纤维。在本发明的优选实施例中，固体支持物或衬底是多孔板，例如标准96孔板。固体支持物或衬底可由任何合适的材料制成，如琼脂糖、乳胶、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、硝化纤维素、硅、二氧化硅、聚二甲基硅氧烷(pdms)等。通过使支持物或衬底的至少一个表面与结合构建体有效接触，结合构建体与固体支持物或衬底可操作地结合。优选地，结合构建体固定在固体支持物或衬底的至少一个表面上。结合构建体也可以印刷在涂布的载玻片上并用于生物标志物阵列或微阵列。非接触和接触印刷均可用于制备此类微阵列，优选接触印刷。

g3.可检测剂

合适的可检测剂包括例如酶，如辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶和脲酶。辣根过氧化物酶检测系统可以与例如发色底物四甲基联苯胺(tmb)一起使用，其在过氧化氢存在下产生可在450nm下检测的可溶性产物。其它适宜的酶联系统包括例如碱性磷酸酶检测系统，其可以与发色底物对硝基苯基磷酸盐一起使用，以产生可在405nm下易于检测的可溶性产物。类似地，β-半乳糖苷酶检测系统可以与发色底物邻硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷(onpg)一起使用以产生可在410nm下检测的可溶性产物，或者脲酶检测系统可以与底物，如脲-溴甲酚紫一起使用。

可检测剂的其它实例包括化学发光标记和用于荧光检测的标记。适用的荧光染料包括dapi、荧光素、hoechst3325s、r-藻蓝蛋白、b-藻红蛋白、r-藻红蛋白、罗丹明(rhodamine)、德克萨斯红(texasred)和丽丝胺。可以使用荧光素或罗丹明标记的抗体或膜联蛋白，和/或荧光素或罗丹明标记的二抗。同位素也适用于检测方法，所述部分和测定是所属领域熟知的。

可检测剂产生可检测信号，然后对其加以检测并优选量化。可以分析可检测信号，例如使用分光光度计来检测来自发色底物的颜色；使用辐射计数器，如用于检测¹²⁵i的伽马计数器来检测辐射；或者使用荧光计，以在特定波长的光存在下检测荧光。在使用酶联测定的情况下，可以使用分光光度计进行可检测信号的定量分析。

g4.试剂盒

本发明还提供了一系列基于生物标志物的试剂盒，包括诊断、预后和预测治疗试剂盒。生物标志物试剂盒将通常包含一种或多种适用于检测本文所教导的生物标志物的结合构建体。与β2gpi生物标志物相关的试剂盒将通常包含至少第一β2gpi结合构建体，如抗β2gpi抗体、ps和ps靶向抗体，如巴维昔单抗。

其它试剂盒将包含用于生物标志物检测的结合构建体和至少用于治疗选定患者的第一治疗剂，例如ps靶向抗体，如巴维昔单抗或1n11，或其免疫缀合物。此类试剂盒可进一步包含至少第二种或第三种不同的治疗剂，用于与ps靶向抗体的组合治疗。例如，一种或多种化疗剂、放射治疗剂、抗血管生成剂、免疫治疗剂和/或抗病毒剂。

通常，试剂盒将在至少第一合适容器(或容器部件)中含有所述组分。容器通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器或容器部件，其中放置有所需的试剂，并且优选经适当地等分。所述试剂盒通常还将包括用于容纳独立小瓶等，呈密封递送形式的部件，如注射或吹塑模制的塑料容器，其中放置和保持有所需小瓶和另一设备。

试剂盒的组分可以含于水性介质或冻干形式。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。溶剂也可以在试剂盒内的另一个容器中提供。任何治疗组分将优选处于药学上可接受的调配物中，或原样备用于重构。所述试剂盒还可以含有用于将治疗剂给予动物或患者的部件，例如一个或多个针头或注射器、或滴管、移液管或可以将所述调配物注射到动物或施加于身体的患病区域的其它类似设备。

试剂盒将优选具有用于每种所需组分或试剂，特别是生物标志物检测和诊断组分的不同容器。然而，为了在组合疗法中使用，试剂盒可包含一个容器，其含有；呈摩尔当量组合，或一种组分超过另一种的两种或更多种预混合的治疗剂。试剂盒可以包括呈完全缀合形式的预标记抗体，或由试剂盒的用户进行缀合的单独标记部分，优选具有随附说明书。对于免疫检测，一种或多种组分，如ps，可能已经与固体支持物，如微量滴定板的孔结合。

试剂盒优选还将包括书面或电子说明书，例如用于量化、临床前、临床和/或兽医实施例，包括用于组合治疗。基于生物标志物，试剂盒优选还将包含对照剂，如标记的或未标记的，可用于制备检测测定的标准曲线的经适当等分的生物组合物。

g5.芯片和纳米分析形式

如果需要，包括针对总β2gpi和/或功能性β2gpi的固相和elisa型生物标志物测定可以自动化或机械地进行，并且可以同时检测来自多个样品的信号。尽管不在本发明的情形中，但也已经使用各种此类测定形式来检测和量化生物标志物。例如，已经描述了称为“芯片”的纳米等离子体传感器和微流体装置，并将其用于来自癌症患者的循环生物标志物的片上分离、量化和表征。因此，本发明测定可以使用此类微流体、芯片、纳米技术和其它流线型和自动化测定来完成，同时仍然保留本发明的特异性。

除了预测方法和生物标志物引导的治疗方法外，本发明还提供基于计算机的硬件和测试。本发明的基于计算机的此类实施例包括被配置用于读取一个或多个实验室生物标志物的测试(包括针对总β2gpi和/或功能β2gpi)的接口；和经编程以根据此类生物标志物的测试分析数据，并且优选地，比较分析数据以建立数据集，包括测试数据集和对照数据集的计算机。本发明的计算机实现的实施例将优选地包括存储器存储、被配置为基于输出来指导治疗的输出功能和指令。

h.免疫疗法(io)组合

对有效免疫疗法的挑战在于克服抑制先天性或适应性免疫活化的多种路径。pd-1免疫检查点已被鉴别为主要的免疫抑制路径，并且已成为毒性低于化疗的癌症免疫疗法的有希望的靶标。其作用是耗尽活化的肿瘤特异性t细胞并抑制其肿瘤杀伤活性。原生t细胞、b细胞、巨噬细胞、dc和单核细胞上不存在pd-1，但在其活化的对应物上表达很高。值得注意的是，肿瘤和相关的骨髓细胞利用pd-1路径，通过上调pd-l1表达产生先天性和适应性免疫抗性。机制研究表明，当存在从头或预先存在的抗肿瘤免疫应答时，阻断这些免疫检查点是最有效的。不幸的是，由于ps和其它通常在肿瘤微环境中占主导地位的免疫抑制因子的暴露，预先存在的肿瘤特异性免疫活性在癌症患者中受到限制。

尽管伴随具有阻断pd-1信号传导的药剂，已经在多种癌症类型中观察到持久的抗肿瘤免疫应答，但只有一部分患者有应答；因此，仍然存在显著未满足的医疗需求。特别地，在肿瘤微环境中表达低水平的pd-1和pd-l1(免疫抑制的生物标志物并缺乏t细胞活化)的患者对检查点阻断疗法的应答较少。在本文中，本申请表明，巴维昔单抗治疗可以增加可以从抗pd-1/pd-l1和其它检查点疗法中受益的患者的比例。

事实上，本文提供首次显示用巴维昔单抗和免疫疗法治疗的人类患者具有有意义的存活优势的临床数据。具体地说，实施例xvi中的结果证明，与用安慰剂(单独的多西他赛)治疗，随后进行免疫疗法的患者相比，用巴维昔单抗(和多西他赛)治疗，之后进行免疫疗法(“sact-io”)的患者的具有统计学上显著更好的总存活期。延长的存活期具有统计学意义(p＝0.006)，甚至更令人印象深刻，因为尚未达到接受后续io的巴维昔单抗患者的mos(实施例xvi；图6；表11)。因此，巴维昔单抗确实增强了人类患者中免疫治疗剂的活性。

由于其ps靶向活性，巴维昔单抗阻断tim和tam以及其他ps受体的活性，并且如其他地方所述，外部细胞膜上暴露的磷脂酰丝氨酸是癌症和细胞凋亡的标志。在肿瘤微环境中富集和活化的tim和tam有助于免疫抑制，阻止对癌细胞的适当免疫应答。耗尽或功能不良的抗肿瘤免疫应答的患者，如通过患者的低ifnγ水平例举，不太可能与针对免疫检查点抑制剂(ici)诸如pd-1和pd-l1的抑制剂有反应。低ifnγ水平和响应于巴维昔单抗之间的相关性是一个惊喜，因为迄今为止高ifnγ水平已经与免疫检查点抑制剂应答相关联。在实施例xvi中描述的临床试验中，在随后的检查点抑制剂治疗(sact-10)之前用巴维妥昔单抗治疗一段时间的患者具有好得多的反应(图6、7和8)。这些数据有力地表明，巴维昔单抗增加了患者对抗pd-1和抗pd-l1疗法的敏感性，这可能是由于巴维昔单抗已经恢复了用尽的抗肿瘤免疫反应的效力，但不完全，而是通过检查点封锁可以最佳地增强免疫细胞的点。因此，在实施例xvi中将巴维昔单抗与表12的抗pd-1和抗pd-l1治疗剂的组合疗法给予令人惊讶的益处，即当给予同一患者时恢复对检查点抑制剂的敏感性和增加对检查点抑制剂的响应。因此，当同一患者一起服用巴维昔单抗时，表f中列出的抑制剂将比单独使用这些药物提供更好的患者结果。巴维昔单抗是一种真正的免疫调节剂，可有效改变肿瘤微环境，并对检查点抑制剂产生抗肿瘤免疫反应。

因此，通过在实施例xvi中的数据所例示，本发明的重要实施方式是癌症患者的治疗与ps靶向抗体，例如与免疫治疗或免疫肿瘤学(io)剂组合单抗。用于联合治疗的示例性免疫治疗剂列于表d中。io剂的某些优选实例是批准用于临床治疗或人类临床试验，优选后期临床试验中的那些，例如表e中所述的那些。使用剂量和治疗适应症是本领域普通技术人员所熟知的，如表e中的细节所示。

特别优选的用于与ps靶向抗体，如巴维昔单抗的组合疗法的io药剂，如实施例xvi中的数据直接支持，是“检查点抑制剂”，其在本文中也称为“免疫检查点抗体”。合适的“免疫检查点抗体”包括结合于活化免疫检查点、受体或分子，如cd28，ox40和/或gitr的激动(激活)抗体，以及结合抑制免疫检查点、受体或分子，如pd-1，pd-l1，ctla-4，tim-3和/或lag-3的拮抗(封闭性)抗体。此类封闭性抗体被常规称为“免疫检查点抑制剂”，其也被用于本发明中。表e中还描述了几种这样的抗体，其被批准用于临床治疗或晚期临床试验。

免疫检查点抗体(免疫检查点抑制剂)的目前最优选的实例为“结合ctla-4、pd-1或pd-l1的封闭性抗体”。结合ctla-4、pd-1或pd-l1的数种此类封闭性抗体，以及用于其选择、制备和使用的方法，包括功能测定，是所属领域普通技术人员所熟知的，如表f中所述。这些包括阻断ctla-4的抗体，如伊匹单抗和曲美木单抗；阻断pd-1的抗体，如纳武单抗、cemiplimab(regn2810)、cbt-501、cx-072和派姆单抗；阻断pd-l1的抗体，如德瓦鲁单抗(medi4736)、avelumab、ly-3300054、cx-188和阿特珠单抗；和任何一种或多种此类抗体的组合，称为“io双联体”。

在上述封闭性抗体中，优选曲美木单抗、纳武单抗、德瓦鲁单抗和阿特珠单抗，特别优选阿特珠单抗。针对曲美木单抗、纳武单抗、德瓦鲁单抗和阿特珠单抗的主要美国专利分别是美国专利第6,682,736号、美国专利第8,008,449号、美国专利第8,779,108号和美国专利第8,217,149号。在实施例xix中详细阐述了巴维昔单抗与阿特珠单抗组合的用途。不是同一研究的一部分，但在一种或多种其他治疗方案中，阿特珠单抗可能被另一种免疫检查点抗体替代，例如另一种与ctla-4、pd-1、pd-l1结合的封闭性抗体或封闭性抗体与任何检查点抑制剂结合的双特异性封闭性抗体。在选择不同的封闭性抗体中，本领域普通技术人员将从文献知道例如合适的剂量和给药方案，如在表e中引用的文献，任选地与表f一起。

除了表f之外，抗-ctla-4抗体的其它合适的实例是美国专利6,207,156中描述的那些，其特别涉及选自来自保藏的杂交瘤的限定抗体的包含cdr(cdr3、cdr2或cdr1)的抗ctla-4抗体。

除了表f之外，抗pd-l1抗体的其它合适的实例是以下中描述的那些：美国专利第8,168,179号，其特别涉及用人类抗pd-l1抗体治疗pd-l1过表达的癌症，包括化疗组合；美国专利第9,402,899号，其特别涉及用pd-l1抗体治疗肿瘤，包括嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体；以及美国专利第9,439,962号，其特别涉及用抗pd-l1抗体和化学疗法治疗癌症。这些抗pd-l1抗体组合物和方法包括小野药品工业(onopharmaceuticals)和合作者研发的那些。

另外合适的pd-l1抗体是美国专利第7,943,743号、第9,580,505号和第9,580,507号，其试剂盒(美国专利第9,580,507号)和编码抗体的核酸(美国专利第8,383,796号)。此类抗体与pd-l1结合并与参考抗体竞争结合；由vh和vl基因定义；或由重链和轻链cdr3(美国专利第7,943,743号)或重链cdr3(美国专利第8,383,796号)定义，具有限定序列或其保守修饰；或与参考抗体具有90％或95％序列一致性。这些抗pd-l1抗体还包括具有确定的定量(包括结合亲和力)和定性特性的抗体、免疫缀合物和双特异性抗体。还包括使用此类抗体的方法，以及具有确定的定量(包括结合亲和力)和定性特性的抗体，包括单链形式的抗体和具有分离的cdr形式的抗体，以增强免疫应答(美国专利第9,102,725号)。如美国专利第9,102,725号中所述，增强免疫应答可用于治疗癌症或感染性疾病，如病、细菌、真菌或寄生虫的病原性感染。这些抗pd-l1抗体组合物和方法包括产物bms936559。

另外合适的pd-l1抗体是美国专利申请第2016/0009805号中的抗体，其涉及pd-l1上特定表位的抗体，包括具有限定的cdr序列的抗体和竞争抗体；核酸、载体、宿主细胞、免疫缀合物；检测、诊断、预后和生物标志物方法；和治疗方法。

检查点调节剂的组合

本发明的特征是能够与免疫检查点调节剂(例如，免疫检查点抑制性分子和免疫检查点刺激分子)结合的抗体分子，用于与ps靶向抗体分子结合使用，如本文所述。此类抗体分子可以组合施用，例如与ps靶向抗体分子一起施用，例如，如本文所述。示例性免疫检查点抗体分子包括结合活化免疫检查点、受体或分子的激动性(激活)抗体分子和结合免疫检查点调节剂的拮抗(封闭性)抗体分子(例如，抑制性或刺激性受体或分子)。免疫检查点调节剂的实例包括但不限于pd-1、pd-l1、ctla-4、tim-3、lag-3、ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和/或tgf-β。免疫检查点抗体分子的实例包括但不限于avelumab、伊匹单抗、曲美木单抗、纳武单抗、派姆单抗、德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、pidilizumab、xmab20717、cemiplimab(regn2810)、cbt-501、cx-072、cx-188和ly3300054。

在实施方案中，免疫检查点抗体分子能够结合pd-1(例如，抗pd-1抗体分子)。在实施方案中，抗pd-1抗体分子与共刺激分子的调节剂(例如激动剂)组合施用。在一个实施方案中，共刺激分子的激动剂选自ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80或cd160的激动剂(例如，激动剂抗体或其抗原结合片段，或可溶性融合物)。在另一个实施方案中，抗pd-1抗体分子与共刺激分子组合使用，例如，与包括cd28、cd27、icos和gitr的共刺激结构域的阳性信号相关的激动剂。

示例性gitr激动剂包括例如gitr融合蛋白和抗gitr抗体(例如，二价抗gitr抗体)，例如美国专利号：6,111,090、欧洲专利号：090505b1、美国专利号：8,586,023、pct公开号：wo2010/003118和2011/090754中描述的gitr融合蛋白，或例如美国专利号：7,025,962、欧洲专利号：1947183b1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：ep1866339、pct公开号：wo2011/028683、pct公开号：wo2013/039954、pct公开号：wo2005/007190、pct公开号：wo2007/133822、pct公开号：wo2005/055808、pct公开号：wo99/40196、pct公开号：wo2001/03720、pct公开号：wo99/20758、pct公开号：wo2006/083289、pct公开号：wo2005/115451、美国专利号：7,618,632和pct公开号：wo2011/051726中描述的抗gitr抗体。

在一个实施方案中，抗pd-1抗体分子结合免疫检查点分子的抑制分子的抑制剂施用。本领域普通技术人员将理解，术语“免疫检查点”是指cd4和cd8t细胞的细胞表面上的一组分子。这些分子可以有效地用作“制动器”以下调或抑制抗肿瘤免疫应答。免疫检查点分子包括但不限于程序性死亡1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)、b7h1、b7h4、ox-40、cd137、cd40、lag-3和tim-3，其直接抑制免疫细胞。可作为用于本发明方法的免疫检查点抑制剂的免疫治疗剂包括但不限于pd-l1、pd-l2、ctla4、tim-3、lag-3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和/或tgf-β的抑制剂。抑制性分子的抑制可以通过dna、rna或蛋白质水平的抑制来进行。在实施方案中，抑制性核酸(例如，dsrna、sirna或shrna)可用于抑制抑制性分子的表达。在其他实施方案中，抑制信号的抑制剂是与抑制性分子结合的多肽，例如可溶性配体或抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，抑制剂是可溶性配体(例如，ctla-4-ig或tim-3-ig)，或结合pd-l1、pd-l2或ctla4的抗体或抗体片段。例如，抗pd-1抗体分子可以与抗-ctla-4抗体(例如，伊匹单抗)组合施用，以治疗癌症(例如，选自以下的癌症：黑素瘤，例如，转移性黑素瘤；肺癌，例如非小细胞肺癌；或前列腺癌)。示例性的抗ctla4抗体包括曲美木单抗(可从pfizer获得的igg2单克隆抗体，以前称为ticilimumab，cp-675,206)；和伊匹单抗(ctla-4抗体，也称为mdx-010，casno.477202-00-9)。在一个实施方案中，抗-pd-1抗体分子在用或不用braf抑制剂(例如威罗菲尼(vemurafenib)或达拉非尼(dabrafenib))的抗ctla4抗体(例如伊匹单抗)治疗后例如在治疗黑素瘤后给药。可以使用的示例性剂量包括剂量约1至10mg/kg的抗pd-1抗体分子，例如3mg/kg，和剂量约3mg/kg的抗ctla-4抗体，例如伊匹单抗。

i.疾病的治疗和预防

由于本发明提供了用于选择动物和人类以及优化使用如巴维昔单抗的ps靶向抗体的治疗的生物标志物方法、组合物和试剂盒，因此以下关于动物、个体和患者(包括人类患者)的指导适用于生物标志物检测和选定人群的治疗。

i1.动物、个体和患者

本发明最直接适用于人类个体和患者，使得对人类的选择和治疗是最优选的实施例。尽管如此，跨物种的生物标志物的共性和保守意味着本发明还适用于除人类外的动物。在动物中，哺乳动物是优选的，最优选的是有价值和有用的动物，如家养宠物、赛马和用于直接生产(例如，肉)或间接生产(例如，牛奶)食物供人类食用的动物，但也包括实验动物。因此，本发明包括临床、兽医和研究用途。除人类外，本发明因此适用于狗、猫、马、牛、猪、野猪、绵羊、山羊、水牛、野牛、美洲驼、鹿、麋鹿和其它大型动物以及其幼体(包括牛犊和羔羊)，以及小鼠、大鼠、兔、豚鼠、灵长类动物(如猴子)和其它实验动物。

i2.抗体剂量

“治疗有效”量或剂量的ps靶向抗体，如巴维昔单抗是当向需要此类治疗的动物，优选人类患者给予时，包括当作为组合治疗的一部分时，发挥有益治疗作用的量或剂量。例如，治疗有效的抗癌剂量是当向患有癌症的动物，优选人类患者给予时，包括当作为组合癌症疗法的一部分给予时，发挥有益抗癌作用的量或剂量。治疗有效的抗病毒剂量是当向患有病毒感染或疾病的动物，优选人类患者给予时，包括当作为组合病毒疗法的一部分给予时,发挥有益抗病毒作用的量或剂量。

“有益抗癌作用”包括任何一致可检测的抗肿瘤和抗癌作用，包括肿瘤血管系统血栓形成和/或破坏、肿瘤坏死、肿瘤消退和肿瘤缓解，直至(并包括)治愈。有益抗癌作用的临床量度包括例如，总反应率(orr)的改善，包括完全反应(cr)、部分反应(pr)和cr+pr；肿瘤进展时间(ttp)；响应持续时间(dor或dr)；无进展存活期(pfs)、无病存活期(dfs)和总存活期(os)的改善或延长，如适用，包括个体患者、患者人群和亚群的中位总存活期(mos)。

“有益抗病毒作用”包括任何一致可检测的抗病毒作用，包括抑制病毒感染、复制、成熟、繁殖和释放和/或持续感染或扩散至其它细胞(宿主细胞)或组织。有益抗病毒作用的临床量度包括例如，早期病毒学应答、病毒载量的减少和病毒的清除，以及由病毒感染引起的症状的改善。

应理解，有益治疗作用，特别是抗癌作用，可能并非治愈性的，特别是在中期或长期，但这并不否定疗法的适用性。在这方面，但通常，“有益”治疗、抗癌和抗病毒作用还包括相当和/或适度的治疗作用，但在任何一种或多种安全措施方面都有改进。“有益”治疗作用的另一个考虑因素是以下事实，ps靶向抗体，如巴维昔单抗可使疾病或肿瘤易于进一步治疗，使得后续治疗可产生总体改善的作用。

现在可以使用广泛的数据，包括来自动物模型的数据，但特别是基于临床研究，例如本文详述，并且在文献中公开的那些，可以容易地确定ps靶向抗体，如巴维昔单抗或1n11的治疗有效剂量。通常，静脉内(iv)给予并以mg/kg给出的ps靶向抗体，如巴维昔单抗的有效剂量范围为约0.1至约13-15，优选约0.1至约6-10；优选地，在约0.3和约6之间；更优选地，在约0.5和约6之间；更优选地，在约1和约6之间；更优选地，在约0.5和约3之间或在约3和约6之间；更优选地，在约1和约3之间。iv给予并以mg/kg给出的ps靶向抗体，如巴维昔单抗的示范性有效剂量将为约1,2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和约15；优选约0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5和约6；更优选地，约2或3；最优选约3mg/kg。术语剂量的一种用途，其可以包括或不包括对重量的提及，或关于本公开的方法和剂量的“平剂量”，是指在不考虑患者的体重或体表面积(bsa)的情况下给予患者的剂量。该平剂量可因此不提供为mg/kg剂量，而是作为药剂(例如，巴维昔单抗抗体以及或免疫肿瘤学(io)剂，例如检查点抑制剂抗体)的绝对量。例如，60kg的人和100kg的人可接收抗体的相同剂量(例如约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg、310mg、320mg、330mg、340mg、350mg、360mg、或更多)。

基于广泛的临床前和临床数据，特别是人类的药代动力学特征(实施例ii)，以及广泛的安全数据，推荐目前优选的静脉内(iv)给予的用于临床治疗(特别是用于所有肿瘤适应症)的3mg/kg巴维昔单抗剂量。尽管如此，已显示出一系列剂量是有效的，包括0.3mg/kg下的临床抗病毒活性(实施例ii)。此外，巴维昔单抗已经以高于10mg/kg，高达100mg/kg的剂量安全地给予大鼠和猴。在猴中进行的100mg/kg剂量水平下，巴维昔单抗在体循环中短暂降低β2gpi，因此不建议使用超高剂量。

因此，从数据的广度来看，显然3mg/kg的剂量虽然是优选的，但并不限制本发明。因此，应理解，鉴于本文提供的参数和详细指导，有效或最佳剂量范围和剂量的进一步变化将涵盖在本发明内。因此可以理解，较低剂量可能更适合与某些药剂组合，并且仍然可以耐受高剂量，特别是在治疗通常致命的疾病时。

在给予ps靶向抗体，如巴维昔单抗时，将药学上可接受的组合物(根据fda无菌性、致热原性、纯度和一般安全性标准)全身给予动物或患者。通常优选静脉内注射，并且最优选在数小时的时间段内连续输注。

除了改变剂量本身之外，还可以调整给药方案以优化治疗策略，这是所属领域技术人员熟知的。取决于所治疗的个体的状况，剂量和治疗方案的一些变化可能是必要的。根据本公开内容，负责的医生将能够确定对个体个体的适当治疗。此类优化和调整通常在所属领域中进行，并且决不反映过多的实验。

i3.用β2gpi补充治疗

在单独或作为多生物标志物选择的一部分使用治疗前β2gpi水平作为对ps靶向抗体，如巴维昔单抗的响应的生物标志物时，并且无论是否测量总β2gpi或功能性β2gpi，所述方法将仅选择只有一子组患者进行治疗。

因此，本申请的另一个实施方案是通过将β2gpi与ps靶向抗体，如巴维昔单抗共给予任何未选定的患者，而使那些患者恢复至具备治疗资格。以这种方式，整个群体变得可用ps靶向抗体治疗。例如，在基于等于或大于200μg/ml的功能性β2gpi的治疗前水平选择患者进行治疗时，150μg/ml的功能性β2gpi的治疗前水平的患者可以通过共给予巴维昔单抗与足够的功能性β2gpi以使β2gpi水平恢复至至少约200μg/ml，而使其返回可治疗组。样品适用于生物标志物分析中使用β2gpi的治疗前水平的任何情况。

j.治疗其中ps是标记物的疾病

由于ps靶向抗体，如巴维昔单抗特异性靶向ps，治疗的第一个也是最重要的指征是癌症(章节l)，特别是实体肿瘤和其转移瘤，还有液体肿瘤，如白血病，并且优选霍奇金氏淋巴瘤。

在正常和健康的细胞中，ps保持在细胞膜内部并且不能进行结合。只有疾病中的细胞才能在细胞膜外部暴露ps，特别是肿瘤微环境中的细胞，还有垂死细胞、异常细胞、不适当活化细胞、感染细胞和病原微生物本身。在癌症中，肿瘤微环境中的ps暴露是“免疫抑制的”，这意味着身体不能充分对抗癌症。通过阻断ps，巴维昔单抗优先于经ps介导的免疫抑制，帮助身体攻击肿瘤。

在肿瘤微环境中的细胞中，特别是在肿瘤中的血管内衬的细胞(以及病毒感染的细胞和病毒)中，ps是相对稳定的标记物，这意味着其是治疗的理想靶标。在存在大量细胞死亡的疾病中，ps也暴露在细胞外，这意味着巴维昔单抗可用于诊断，特别是用于出现增加或不适当的细胞死亡的各种疾病，包括如癌症和心脏发作的病状的“成像”，即体内诊断(参见关于成像的下文)。

导致宿主细胞外化ps的突出病原体是病毒(章节k)。事实上，ps和ps受体作为包膜病毒进入和感染的增强剂的作用现已得到充分证明，并适用于多种病毒。此外，ps和病毒之间的联系不仅限于包膜病毒，而是扩展到无包膜病毒。特别地，已知的是，从病毒感染的细胞释放的“ps脂质囊泡”使得能够进行高效肠病毒整体传播。

除癌症和病毒感染外，多种疾病和致病性感染导致ps从健康细胞的内部位置翻转而暴露在细胞外，这意味着ps靶向抗体，如巴维昔单抗可以定位于那些细胞和病原体并发挥有益作用。总的来说，这些是“其中ps是标记物的疾病和病症”。

除了癌症、病毒和病原体感染，其中ps是标记物的突出疾病和病症是涉及异常血管系统(血管)的疾病，包括具有促血栓形成血管(易于凝血)的疾病和病症以及涉及异常血管生成的疾病和病症。血管生成是由预先存在的血管形成新血管的过程；新血管的发育始于内皮细胞芽的形成，其需要ps(weihua等人，2005)。异常血管生成涉及许多疾病，尤其是癌症。鉴于其异常血管系统，ps靶向抗体，如巴维昔单抗可治疗良性(与恶性相反)肿瘤，如良性前列腺增生(bph)、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、肉芽肿(包括化脓性肉芽肿和类肉瘤病(类肉瘤))、脑膜瘤、血管纤维瘤、血管瘤、肝血管瘤和肝血管瘤的全身形式、肝血管瘤病。

可用ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗的与异常血管系统直接相关的病状包括血管再狭窄(血管变窄)，包括血管成形术之后再狭窄、静脉阻塞、动脉闭塞和颈动脉阻塞性或闭塞性疾病；血管炎(通过炎症破坏血管的病症)，包括贝赛特氏病(disease)(也是一种眼病)、结节性多动脉炎(结节性全动脉炎或pan)和韦格纳氏肉芽肿病(wegener'sgranulomatosis；wg)或结节病(肉芽肿伴多血管炎，gpa)；动静脉畸形(avm)和动静脉瘘；鼻出血(流鼻血)；血管粘连；和高粘度综合征。

由于其与异常血管系统的关联，ps靶向抗体，如巴维昔单抗可以治疗临床上重要的疾病，包括关节疾病，如关节炎(包括类风湿性关节炎和骨关节炎)、滑膜炎、血友病性关节和佩吉特病(paget'sdisease)；皮肤疾病，如牛皮癣、皮炎、硬皮病(全身性硬化症或crest综合征)、弹性假黄瘤(pxe，称为格-斯二氏综合征(-strandbergsyndrome))、红斑痤疮、史-约二氏综合征(stevens-johnsonsyndrome)或疾病(pxe、红斑痤疮和史-约二氏综合征也是眼病)、类天疱疮、肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩；格雷夫病(grave'sdisease)；子宫内膜异位症；和奥斯勒-韦伯(osler-weber)(或奥斯勒-韦伯-郎迪(osler-weber-rendu)综合征)或疾病(也称为遗传性出血性毛细血管扩张症，hht)。

由ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗的涉及异常血管系统疾病的特别重要的实例是眼部新生血管疾病。这些疾病的特征在于新血管侵入眼部结构，如视网膜、脉络膜和/或角膜。其是失明的最常见原因，并且涉及大约二十种眼病。最常见的眼部新生血管疾病是(增殖性)糖尿病视网膜病变、黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性(amd))、早产儿视网膜病变(rop或特里综合征(terrysyndrome)，以前称为晶状体后纤维组织增生症，rlf)、新生血管性青光眼、角膜移植物新生血管和角膜移植排斥反应。脉络膜新生血管(cnv)占晚期amd患者的严重视力丧失病例的90％，并已用ps结合抗体，包括直接和直接ps靶向抗体有效治疗(li等人，2015)。

与可用ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗的视网膜/脉络膜新血管形成相关的其它疾病包括梅毒性、分枝杆菌和/或引起视网膜炎或脉络膜炎的其它眼部感染；葡萄膜炎(虹膜睫状体炎)，包括玻璃体炎和睫状体炎；伊尔斯氏病(ealesdisease)、假定眼组织胞浆菌病综合征(pohs)、贝斯特氏病(best'sdisease)(卵黄状黄斑营养不良)、斯塔加特氏病(stargardtdisease)、眼外伤和激光后并发症。

可用ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗的与角膜新血管形成特别相关的其它疾病包括所有形式的角膜结膜炎，包括角膜炎(仅角膜发炎)和结膜炎(仅结膜发炎)，如特应性角膜炎、上方角膜缘角结膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎和边缘性角质层分离；疱性角结膜病(phylectenulosis)；蚕蚀性溃疡(moorenulcer)；化学灼伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、疱疹感染和眼部创伤以及隐形眼镜超戴症(contactlensoverwear)。

可用ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗的其它眼部疾病包括巩膜炎、虹膜红变(虹膜新生血管形成)、角膜新生血管形成(nva)以及由纤维血管或纤维组织异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变(pvr)，无论是否与糖尿病有关。

内皮细胞芽的形成需要ps，因此新血管的发育也需要ps(weihua等人，2005)。所述过程还涉及某些正常的生理事件，特别是伤口愈合和再生，并且在受精后的排卵和囊胚植入中是至关重要的。因此，使用巴维昔单抗预防所述过程可用于诱导闭经(育龄期妇女没有月经期)、阻止排卵和/或防止囊胚植入，即作为避孕药。在伤口愈合中，过度修复或纤维组织增生可能是外科手术的有害副作用，并且粘连是手术的常见并发症，其可导致如小肠梗阻的问题。这些也可以通过ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗。

慢性炎症还涉及异常和病理性血管系统。确切来说，如溃疡性结肠炎和克罗恩病(crohn'sdisease)的慢性炎性疾病状态随着新血管向发炎组织的向内生长而显示出组织学变化。因此，这些疾病也可以通过ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗。

已知数种其它疾病和病症，其中宿主细胞暴露ps和/或其中已证实ps阳性细胞外微泡和外泌体。例如，在镰状细胞病(也称为镰状细胞性贫血)和危象中，30-40％的红细胞过早衰老并呈ps阳性(“镰状红细胞”)，而健康人类只有约1％。ps阳性镰状红细胞保持在循环中，粘附于内皮，并且其暴露的ps充当起始凝血级联的平台，所述凝血级联负责凝血蔓延(clotpropagation)(kennedy等人，2015)。

ps也在动脉粥样硬化中表达，并且ps阳性细胞外微泡从动脉粥样硬化斑块中释放(mallat等人，1999)。在血管腔内形成的对ps呈阳性的斑块也已显示具有血管生成刺激活性。有特别证据表明血管生成标记物，如vegf在人类冠状动脉粥样硬化的进展中以及阻塞性冠状动脉疾病的再通过程中具有病理生理学意义。因此，ps靶向抗体，如巴维昔单抗为动脉粥样硬化和阻塞性冠状动脉疾病提供了有效的治疗。

1型和2型糖尿病患者均具有ps阳性细胞外微泡，如膜联蛋白v阳性所示(sabatier等人，2002)。在阿尔茨海默病中，脑外泌体含有ps和淀粉样蛋白β肽(aβ)，所述疾病的致病因子(yuyama等人，2012)。ps和ps阳性细胞外微泡也参与败血症(败血症性休克)，在所述败血症中，其是败血症诱导的微血管功能障碍和免疫抑制的标记物和介质(souza等人，2015)。

抗磷脂综合征(aps)和全身性红斑狼疮(sle或狼疮)，其中针对身体自身的磷脂产生抗体的自身免疫性疾病与凝血障碍相关，包括流产和血小板减少症(低血小板计数)。因此，这些患者中的抗磷脂抗体是致病性抗体，其引起血栓形成。然而，ps靶向抗体，如巴维昔单抗靶向ps而没有表现出任何此类副作用。因此，巴维昔单抗还可以治疗抗磷脂综合征、相关疾病和其并发症。确切地说，巴维昔单抗可以拮抗aps患者中的致病抗体或与其竞争，从而从其体内的磷脂-蛋白质靶标中置换致病性抗体。

至于致病性感染，例如细胞内寄生虫，如引起利什曼病的寄生原虫，亚马逊利什曼原虫(zandbergen等人，2006；wanderley等人，2009；wanderley等人，2013)；引起疟疾的恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)(eda&sherman，2002；pattanapanyasat等人，2010)；和引起锥虫病的一种寄生原虫，克氏锥虫(trypanosomacruzi)(damatta等人，2007)，所有结果均引起ps暴露。同样地，引起血吸虫病的寄生扁虫，血吸虫，也暴露ps(范德kleij等人，2002)，引起弓形体病的刚地弓形虫同样如此(seabra等人，2004)。

在分别引起鼠疫和土拉菌病的细胞内细菌病原体，如鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗朗西斯菌感染后，外部细胞表面也显示ps暴露，(lonsdale等人，2011)。引起李斯特菌病的单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)也促进了具有外壁ps的膜衍生囊泡从感染宿主细胞释放(czuczman等人，2014)。类似地，用引起脑膜炎的病原体，奈瑟氏脑膜炎菌(neisseriameningitidis)感染的内皮细胞展现ps向细胞表面的易位(schubert-unkmeir等人，2007)。在巨噬细胞中细胞内复制并引起结核病(tb)的结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)的感染与结节病变中性粒细胞的ps外化有关(francis等人，2014)。同样，嗜肺军团菌(legionellapneumophila)(一种引起军团病(legionnaires'disease)的兼性细胞内寄生虫)诱导人类单核细胞发生ps外化(等人，1998)。

因此，上文详述的针对兼性细胞内寄生虫常见的ps外化有可能发生于其它此类病原体，如布鲁氏菌(brucella)和沙门氏菌(salmonella)，其分别引起布鲁氏菌病和如伤寒、副伤寒和食物中毒的疾病。针对专性细胞内寄生虫，如引起性传播衣原体感染的衣原体属(chlamydiaspp.)的感染也已得到证实，其中ps外化对于发病机制至关重要，并已显示在受感染的上皮细胞、内皮细胞、粒细胞和单核细胞上(goth&stephens，2001)。引起沙眼的沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)也可以得到治疗(也参见上文)。

实际上，宿主细胞上的ps外化现在是应答于一系列细菌和病原体感染的普遍公认的现象(wandler等人，2010)。这进一步包括幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)，其侵入胃上皮细胞(petersen&krogfelt，2003)并引起胃溃疡。当幽门螺旋杆菌与胃上皮细胞直接接触时，其诱导ps外化至宿主质膜的外小叶(murata-kamiya等人，2010)。ps也存在于引起梅毒的梅毒螺旋体(treponemapallidum)上。巴尔通氏体病(bartonellosis)是一种在南美洲发现的细菌感染，可以用巴维昔单抗治疗，特别是因为巴尔通氏体病会产生呈血管内皮细胞增殖特征的慢性期，而巴维昔单抗的作用机制之一，如癌症治疗中所明确显示，为破坏血管内皮细胞。

参照体内诊断，ps靶向抗体，如巴维昔单抗可用于对任何前述疾病、病症和感染进行成像，最优选对血管化肿瘤成像(jennewein等人，2008；marconescu&thorpe，2008；saha等人，2010；stafford和thorpe，2011；gong等人，2013；stafford等人，2013；美国专利第7,790,860号)。巴维昔单抗也可用于血管血栓形成，特别是在心脏内或心脏附近，如深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞、心房颤动、假体心血管材料问题、中风(脑血管意外(cva)或脑血管损伤)(cvi)等。ps靶向抗体，如巴维昔单抗也可用于例如在如脓肿、再狭窄、关节炎症和止血障碍的条件下对活化血小板(如动脉、冠状动脉、静脉和脑血栓形成等)进行成像。

因此，ps靶向抗体，如巴维昔单抗适用于治疗和/或诊断其中ps是经证明的标记物的所有上述疾病和病症。

k.治疗病毒感染

导致宿主细胞外化ps的突出病原体是病毒。如表b1和表b2所示，已经在来自多种病毒家族的病毒和病毒感染细胞的表面上证实了ps的存在。此外，表b3和表b4中提供的数据证明，病毒和病毒感染的细胞上的此类ps暴露并不仅仅是偶然的，还在病毒感染中起重要作用(还参见美国专利第7,906,115号；wo2015/131153a1)。这通过使用ps靶向抗体在体外和体内抑制来自多种病毒家族的感染来显示。

ps和病毒感染之间的联系现在也在文献中得到充分地证明(例如，美国专利第7,906,115号；soares等人，2008；mercer和helenius，2008；moody等人，2010；morizono等人，2011；meertens等人，2012；best，2013年；bhattacharyya等人，2013；jemielity等人，2013；moller-tank&maury，2014；birge等人，2016)。这包括ps和ps受体作为包膜病毒进入和感染的增强剂的作用(参见例如，moller-tank&maury，2014中的表1)。近年来，ps、病毒感染和细胞外微泡，如外泌体之间的关系也变得越来越明显(meckes&raab-traub，2011；sims等人，2014)，并且另外，适用于多种病毒(例如，walker等人，2009；meckes等人，2010；izquierdo-useros等人，2010；meckes&raab-traub，2011)。

此外，ps和病毒之间的联系不仅限于包膜病毒，而是延伸到无包膜病毒(clayson等人，1989；chen等人，2015)。确切地说，参见chen等人，2015年的文章cell的封面页上的图式，其显示“ps脂质囊泡”以及随附数据，其显示ps囊泡能够进行高效肠病毒整体传播。在不受特定机制的约束的情况下，以下基本原理解释了ps涉及包膜和非包膜病毒的感染。

所有病毒均协调成熟病毒粒子从宿主细胞中定时退出，以确保成功感染新宿主细胞。包膜病毒利用宿主细胞质膜嵌入病毒蛋白，所述病毒蛋白介导子代病毒粒子与下一个宿主细胞的有效进入。在病毒释放之前在病毒感染细胞的外部发现ps，并且包膜病毒在离开宿主细胞时将ps掺入到病毒包膜中。

不将包膜掺入其成熟病毒粒子的病毒通过其它机制离开宿主细胞。无包膜病毒用于从细胞中释放新病毒粒子的一些策略包括细胞裂解，这可由宿主对受感染细胞(t细胞或巨噬细胞)的免疫应答直接引起，或者是由于病毒直接作用于宿主细胞蛋白质合成或细胞结构的活性引起。病毒改变细胞结构以诱导细胞裂解的实例是腺病毒。腺病毒在感染后期表达数种蛋白质，通过破坏细丝网络和蛋白质合成来改变细胞的结构完整性。一些无包膜病毒能够通过非破坏性机制释放其子代病毒而没有任何细胞病变作用。虽然脊髓灰质炎病毒迅速(约8小时)诱导细胞裂解，但其也在能够感染新宿主细胞的ps脂质囊泡中从细胞释放。ps囊泡中的脊髓灰质炎病毒颗粒感染海拉(hela)细胞和原代巨噬细胞要比从ps囊泡中去除的病毒颗粒更有效，并且用膜联蛋白v阻断囊泡以剂量依赖性方式抑制感染细胞的囊泡，其表明ps脂质是脊髓灰质炎病毒感染的辅因子。除脊髓灰质炎病毒外，柯萨奇病毒(coxsackievirus)b3和鼻病毒颗粒也被释放到ps脂质囊泡中(chen等人，2015)，表明肠病毒利用选择性释放成熟颗粒而不裂解细胞的常见机制。

关于sv40，sv40也可能在上述类型的ps脂质囊泡中从细胞释放。例如，据报道，在诱导细胞病变作用之前，可以发现sv40颗粒从细胞中释放出来(clayson等人，1989)。此外，在感染后48小时已在细胞质平滑囊泡中观察到sv40病毒粒子，并且莫能菌素抑制sv40粒子的释放，所述莫能菌素是一种钠离子载体，其通过阻断跨脂质膜的阳离子转运来阻断细胞内蛋白质转运。多瘤病毒——sv40所属的病毒家族——的其他实例包括但不限于jc病毒、bk病毒和merkel细胞癌病毒(mcv)。

而且，许多病毒需要诱导宿主细胞的活化，以便创造有效复制的环境。利用病毒或非病毒活化剂的细胞活化导致细胞内钙离子(ca²⁺)升高，其激活ps易位。因此，ps靶向抗体，如巴维昔单抗的潜在作用机制包括干扰细胞活化所需的蛋白质或其介导病毒释放的能力，通过免疫清除机制逆转ps介导的免疫抑制和感染细胞或病毒的清除。

体内病毒模型证明用ps靶向抗体治疗的病毒感染动物的存活期增加。显示ps靶向抗体，如巴维昔单抗发挥此类抗病毒特性的所利用的潜在机制包括：1)与病毒颗粒的结合；2)与感染细胞结合；3)抑制病毒复制；4)通过阻断结合ps的免疫抑制细胞受体来增强免疫应答。hiv-1模型中的数据表明，由病毒感染的巨噬细胞产生的病毒粒子具有升高的ps水平，其充当hiv-1感染巨噬细胞的辅因子。用ps靶向抗体阻断hiv-1上的ps可以阻止细胞-细胞相互作用并阻断病毒-靶细胞融合。结果还表明，巴维昔单抗与皮钦德(pichinde)病毒颗粒结合，并且对经皮钦德病毒感染的豚鼠的治疗促进了抗皮钦德抗体和细胞应答的发展。

总体来说，使用ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗所有病毒感染，包括包膜和非包膜病毒教导于美国专利第7,611,704号和美国专利第7,906,115号中，均通过引用具体地并入本文以用于补充涉及此类治疗的本公开内容。确切地说，具体地并入所述专利的表h、表j和表g以举例说明了动物和人类中病毒感染和相关疾病的治疗(表h、表j)以及可用于与使用ps靶向抗体，如巴维昔单抗的疗法组合使用的常见抗病毒药物(表g)。

l.治疗癌症

本申请的大量章节涉及使用ps靶向抗体分子，如巴维昔单抗治疗肿瘤和癌症，例如与免疫检查点抗体分子结合。良性肿瘤，如听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、化脓性肉芽肿和bph的治疗包括在内。恶性肿瘤的治疗是优选的。除非另有明确说明，否则如本文所用，“肿瘤(tumor/tumors)、癌症(cancer/cancers)”通常旨在表示恶性肿瘤。

涵盖治疗血源性肿瘤，如白血病和淋巴瘤，以及骨髓的各种急性或慢性赘生性疾病。优选地，待治疗的肿瘤是实体或血管化肿瘤，包括血管生成活跃的肿瘤和具有促血栓形成血管的肿瘤。“实体”和“血管”肿瘤是具有血管组分的肿瘤，即需要肿瘤血管为肿瘤细胞提供氧和营养物的肿瘤。

包括如以下示范的所有癌症(无论是原发性还是转移性)：乳腺癌、卵巢癌、胸癌、肺癌、肝癌(肝细胞癌(hcc))、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌(神经胶质瘤和成胶质细胞瘤)、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、头颈癌、腮腺癌、食道癌、胃食管癌、喉癌、甲状腺癌、胃肠癌、胃癌、肾癌(肾细胞癌(rcc))、胆道癌、膀胱癌、睾丸癌和其它癌症，包括癌瘤(鳞状和非鳞状，小细胞和非小细胞)、腺癌和成神经细胞瘤，以及黑素瘤、梅克尔细胞癌(merkelcellcarcinoma)和血液恶性病。在某些实施例中，本发明尤其适用于非小细胞肺癌(nsclc)或乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、直肠癌或卵巢癌或黑素瘤。最特别地，本发明适用于nsclc，例如非鳞状nsclc。

除了已公布的文献之外，在许多美国专利中教导了使用ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗所有癌症。例如，美国专利第6,406,693号；第7,422,738号；第8,486,391号；第7,247,303号；和第7,572,448号，均通过引用具体并入本文以对涉及此类治疗的本公开内容进行补充。还参见关于治疗有效抗癌量的上述论述(章节i2)。由于ps靶向抗体，如巴维昔单抗的作用模式在所有实体肿瘤中基本上或完全相同，因此应理解，本发明可广泛应用于所有实体肿瘤的治疗，而不管特定的表型或肿瘤细胞自身的基因型。

m.组合疗法

本申请的相当大部分、公布的文献和许多美国专利也涉及在组合疗法中使用ps靶向抗体，如巴维昔单抗治疗癌症(例如，美国专利第7,422,738号；美国专利第8,486,391号；美国专利第7,572,448号)。

因此，治疗方法可以与通常用于治疗动物或患者表现出的特定疾病或病症，特别是癌症和病毒感染和疾病的任何其它方法组合。只要不知晓给定的治疗方法本身是否对患者的病状有害，并且不显著抵消ps靶向抗体疗法，则考虑其与本发明的组合。还设想了用于非恶性疾病的组合疗法。

关于癌症治疗，本发明可以与经典方法，如手术、化疗、放射疗法、细胞因子疗法、抗血管生成等，以及更新的方法，如免疫肿瘤学(io)剂组合使用。因此，本发明提供了组合疗法，其中ps靶向抗体，如巴维昔单抗与手术或放射治疗同时、在其之前或在其之后使用；或者与常规化疗剂或放射治疗剂、细胞因子、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、靶向治疗剂、io剂等一起、在其之前或在其之后给予患者。

就手术而言，可以结合本发明实施任何外科手术。关于放射疗法，考虑了在肿瘤细胞内局部诱导dna损伤的任何机制，例如γ照射、x射线、uv照射、微波甚至电子发射等。还考虑了将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞，并且这可以与靶向抗体或其它靶向手段一起使用。

在癌症治疗中物质组合的一般用途是众所周知的。当一种或多种药剂与ps靶向抗体，如巴维昔单抗组合使用时，不需要组合的结果是当分别进行每种治疗时观察到的效果的相加。尽管通常需要至少累加作用，但是超过单一疗法之一的任何增加的治疗作用或益处(例如，减少的副作用)都将是有价值的。而且，对于组合治疗没有特别要求显示出协同效应，尽管这是可能并且有利的。

如本文所用，本发明的“主要治疗剂”或“第一抗癌剂”是ps靶向抗体，如巴维昔单抗。本文所用的“二级治疗剂”或“至少第二抗癌剂”是不同的第二治疗剂、抗癌剂(包括免疫肿瘤学(io)剂)或抗病毒剂，即“并非”主要治疗剂的治疗剂、抗癌剂抗癌剂(包括免疫肿瘤学(io)剂)或抗病毒剂。任何二级治疗剂均可用于本发明组合疗法中。此外，根据本申请的指导内容和所属领域技术人员的知识，可以鉴于实现累加、超过累加或潜在协同作用而选择二级治疗剂、“第二抗癌剂”或“第二抗病毒剂”。

为了实施组合疗法、抗肿瘤疗法或抗病毒疗法，可以有效引起其在动物或患者体内的组合治疗、抗肿瘤或抗病毒作用的方式简单地向动物或患者给予ps靶向抗体，如巴维昔单抗，以及另一种，即不同的第二治疗剂、抗癌或抗病毒剂。因此，所述药剂将以有效的量提供，并且持续有效引起其在疾病位点，例如肿瘤、肿瘤环境或微环境中的组合存在，和/或在动物或患者中发挥其组合治疗作用，优选地，对动物或患者的免疫系统施加其组合治疗作用的时间段。为了实现所述目标，可以以单一组合物形式基本上同时给予主要治疗剂和不同的二级治疗剂，或者使用不同的给药途径以两种不同的组合物形式给予。

或者，ps靶向抗体，如巴维昔单抗可以在不同的第二治疗剂、抗癌剂或抗病毒剂之前或之后，例如间隔数分钟至数周。在主要治疗剂和不同的第二治疗剂分别施用于动物或患者的某些实施例中，可以确保在每次递送之间不存在不起作用的时间段，使得每种药剂将仍然能够发挥有利的组合效果。根据标准实践，包括迄今为止使用巴维昔单抗的临床经验，给予巴维昔单抗和不同的第二治疗剂之间的一周或两周并非不起作用的时间段。实际上，约一周的间隔可为优选的。递送巴维昔单抗和第二种不同治疗剂(例如免疫肿瘤学(io)药剂)之间的三周、四周、五周或六周递送间隔也可以发挥有利效果并且可以用于联合治疗。

可以基于特定标准，包括本文所论述和所属领域已知的标准选择用于分别定时组合疗法的二级治疗剂。然而，如果需要，优选选择一种或多种不同的第二治疗剂用于之前或之后的给药并不排除其基本上同时给药。

就癌症而言，选择用于在主要治疗剂“之前”给予并旨在实现增加的和潜在的协同作用的不同的第二抗癌剂包括在肿瘤微环境中诱导ps表达的药剂。例如，刺激局部钙产生，激活将ps移动到质膜外表面的膜转运子，损伤肿瘤内皮，引起促凋亡变化和/或诱导肿瘤内皮或肿瘤细胞凋亡的药剂通常会引起增加ps表达。此类药剂的实例是多西他赛和太平洋紫杉醇。然后可以使用ps靶向抗体，如巴维昔单抗靶向ps，从而扩增总体治疗作用，并且还通过宿主效应子(补体、adcc、抗体介导的吞噬作用、cdc)提供增加的攻击。

对血管生成、重塑或活化的内皮细胞具有选择性的药物，如存在于肿瘤血管中但不存在于正常静息血管中的药物，也可用于选择性地引起ps在肿瘤微环境中的暴露。此类药剂的实例是康普瑞汀(combretastatin)和多西他赛。这同样引起抗体结合增加和宿主效应机制的启动增强。

选择用于在主要治疗剂“之后”给予并旨在实现增加的和潜在的协同作用的不同的第二抗癌剂包括受益于主要治疗剂作用的药剂。ps靶向抗体，如巴维昔单抗引起肿瘤坏死。因此，用于后续给药的有效的不同的第二抗癌剂包括抑制转移的抗血管生成剂；靶向坏死肿瘤细胞的药剂，如对体内可从恶性细胞接近的细胞内抗原具有特异性的抗体(美国专利第5,019,368号；第4,861,581号和第5,882,626号)；和化疗剂和抗肿瘤细胞免疫缀合物，其攻击可能在外周存活的任何肿瘤细胞。

在某些情况下，可能需要延长治疗时间段，其中在各别给药之间延时数天(2、3、4、5、6或7)，数周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至数月(1、2、3、4、5、6、7或8)。这在一种治疗旨在基本上破坏肿瘤，并且另一种治疗旨在预防微转移或肿瘤再生长，如给予抗血管生成剂的情况下是有利的。然而，应在手术后的谨慎时间给予抗血管生成剂，以使伤口有效愈合。然后可以终生向患者给予抗血管生成剂。

还可以预想的是，将利用主要治疗剂或不同的第二治疗剂的多于一次给药。主要治疗剂和不同的第二治疗剂可以交替数天或数周进行互换给药；或者可以给予一定顺序的一种药剂治疗，然后是一定顺序的其它治疗。在任何情况下，为了使用组合疗法实现治疗作用，所需要的只是以有效发挥治疗作用的组合量递送两种药剂，而与给药时间无关。

m1.化疗

无论是基本上同时给予还是按顺序给予，ps靶向抗体，如巴维昔单抗可以与一种或多种化疗剂或药物组合给予。化疗药物可以杀死增殖的肿瘤细胞，促进总体治疗产生的坏死区域。因此，药物可以增强本发明的主要治疗剂的作用。

大多数癌症化疗药物对分裂氧合细胞具有选择性。这些在组合疗法中具有优势，因为化疗药物作用于与主要治疗剂不同的靶标，产生更完全的抗肿瘤作用。例如，化疗药物对肿瘤周围的快速分裂的氧合肿瘤细胞具有选择性活性。对肿瘤周围充分氧合的血管生成血管具有选择性的抗血管生成药物也可以有效地组合使用。

通过诱导肿瘤血管中血栓的形成，本发明的主要治疗剂还可以通过将药物保留或截留在肿瘤内来增强化疗药物的作用。因此，化疗剂保留在肿瘤内，而其余的药物从体内清除。因此，肿瘤细胞暴露于更高浓度的药物持续更长的时间段。这种药物在肿瘤内的截留使得可以减少药物的剂量，使得治疗更安全并且更有效。

在本发明中组合使用的其它药物是那些作用于通过主要治疗剂的作用对药物“敏感”的细胞的药物，因此需要减少剂量的第二种药物来实现其抗肿瘤作用。例如，这可能发生在第二种药物作用的主要成分施加在肿瘤血管上并且本发明的抗体或药剂使细胞对药物敏感的情况下。当本发明的主要治疗剂直接或通过刺激细胞因子释放使肿瘤细胞对第二种药物敏感时，情况也是如此。

用于组合疗法的其它合适的第二抗癌剂是例如通过选择性地抑制免疫系统的免疫抑制组分的活性来增强宿主效应细胞活性的那些。此类药剂使得本发明的主要治疗剂能够更有效地起作用，所述主要治疗剂刺激效应细胞的攻击作为其机制的一部分。这种药剂的一个例子是多西他赛。

其他优选的抗癌剂包括，例如，tgfβr1激酶抑制剂iily3200882，乐伐替尼(对vegfr1、vegfr2和vegfr3激酶具有活性)和merestinib(met的小分子抑制剂和几种其他受体酪氨酸激酶如mst1r、flt3、axl、mertk、tek、ros1、ntrk1/2/3和ddr1/2)。

虽然对于实施本发明的治疗不需要理解主要治疗剂的确切作用机制，但是可以使用关于这种机制的数据和推理推断来选择特定的第二抗癌剂在本发明中组合使用。所选择的组合疗法的有效性反过来支持原始数据和提出的作用机制，并且还产生用于实施组合疗法的第二抗癌剂的优选类别。

诱导细胞凋亡的药物优选用于联合治疗。例如，多西他赛通过与微管结合并破坏细胞有丝分裂而诱导细胞凋亡并因此诱导ps暴露(hotchkiss等人，2002)。已知在亚临床浓度下使用多西他赛治疗顺肿瘤血管排列的内皮细胞和肿瘤细胞在细胞表面诱导ps表达。

ps靶向抗体，如巴维昔单抗的抗肿瘤作用包括fc域介导的免疫效应功能的增强，如adcc、cdc、细胞因子产生的刺激，以及此类组合机制。这也与多西他赛相关，因为其它研究表明，乳腺癌患者的使用多西他赛的治疗引起血清ifnγ、il-2、il-6和gm-csf的细胞因子水平增加，在这些患者中通过增强自然杀伤(nk)和淋巴因子活化的杀伤(lak)细胞的活性增强抗肿瘤免疫应答。

因此，多西他赛将诱导ps表达和给予的抗体的结合，并且还增强介导抗肿瘤作用的免疫效应子的活性。基于前述考虑，抗体与多西他赛的组合是优选的实施方案。

因此，多西他赛和其它诱导细胞凋亡的化疗剂是优选的用于本发明组合治疗的药剂。与诱导细胞凋亡的化疗药物(如多西他赛)的组合应协同地攻击肿瘤血管系统内皮细胞和肿瘤细胞室，不仅产生显著增强的治疗功效而且还降低毒性。这些组合预期用于乳腺癌治疗，特别是使用多西他赛与本发明抗体的规律化学疗法的组合。

用于联合治疗的示例性化学治疗剂列于表c中。列出的每种药剂都是示例性的而非限制性的。可以根据所治疗的病状而进行剂量改变。治疗医师将能够确定个体的适当剂量。在使用多西他赛的某些优选实施例中时，如以60mg/m²的起始剂量给予多西他赛或以75mg/m²的量向患者给予多西他赛。

表c

用于组合疗法的示例性化学治疗剂

n.免疫疗法(io)组合

本发明的实施方案包括癌症患者的治疗与ps靶向抗体，例如与免疫治疗或免疫肿瘤学(io)剂组合单抗。用于联合治疗的示例性免疫治疗剂列于表d中。io剂的某些优选实例是批准用于临床治疗或人类临床试验，优选后期临床试验中的那些，例如表e中所述的那些。使用剂量和治疗适应症是本领域普通技术人员所熟知的，如表e中的细节所示。

特别优选的用于与ps靶向抗体，如巴维昔单抗的组合疗法的io药剂，如实施例xvi中的数据直接支持，是“检查点抑制剂”，其在本文中也称为“免疫检查点抗体”。合适的“免疫检查点抗体”包括结合于活化免疫检查点、受体或分子，如cd28，ox40和/或gitr的激动(激活)抗体，以及结合抑制免疫检查点、受体或分子，如pd-1，pd-l1，ctla-4，tim-3和/或lag-3的拮抗(封闭性)抗体。此类封闭性抗体被常规称为“免疫检查点抑制剂”，其也被用于本发明中。表e中还描述了几种这样的抗体，其被批准用于临床治疗或晚期临床试验。

免疫检查点抗体(免疫检查点抑制剂)的目前最优选的实例为“结合ctla-4、pd-1或pd-l1的封闭性抗体”。结合ctla-4、pd-1或pd-l1的数种此类封闭性抗体，以及用于其选择、制备和使用的方法，包括功能测定，是所属领域普通技术人员所熟知的，如表f中所述。这些包括阻断ctla-4的抗体，如伊匹单抗和曲美木单抗；阻断pd-1的抗体，如纳武单抗、cemiplimab(regn2810)、cbt-501、cx-072和派姆单抗；阻断pd-l1的抗体，如德瓦鲁单抗(medi4736)、avelumab、ly-3300054、cx-188和阿特珠单抗；和任何一种或多种此类抗体的组合，称为“io双联体”。

在上述封闭性抗体中，优选曲美木单抗、纳武单抗、德瓦鲁单抗和阿特珠单抗，特别优选阿特珠单抗。针对曲美木单抗、纳武单抗、德瓦鲁单抗和阿特珠单抗的主要美国专利分别是美国专利第6,682,736号、美国专利第8,008,449号、美国专利第8,779,108号和美国专利第8,217,149号。在实施例xix中详细阐述了巴维昔单抗与阿特珠单抗组合的用途。不是同一研究的一部分，但在一种或多种其他治疗方案中，阿特珠单抗可能被另一种免疫检查点抗体替代，例如另一种与ctla-4、pd-1、pd-l1结合的封闭性抗体或封闭性抗体与任何检查点抑制剂结合的双特异性封闭性抗体。在选择不同的封闭性抗体中，本领域普通技术人员将从文献知道例如合适的剂量和给药方案，如在表e中引用的文献，任选地与表f一起。

除了表f之外，抗-ctla-4抗体的其它合适的实例是美国专利no.6,207,156中描述的那些，其特别涉及选自来自保藏的杂交瘤的限定抗体的包含cdr(cdr3、cdr2或cdr1)的抗ctla-4抗体。

除了表f之外，抗pd-l1抗体的其它合适的实例是以下中描述的那些：美国专利第8,168,179号，其特别涉及用人类抗pd-l1抗体治疗pd-l1过表达的癌症，包括化疗组合；美国专利第9,402,899号，其特别涉及用pd-l1抗体治疗肿瘤，包括嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体；以及美国专利第9,439,962号，其特别涉及用抗pd-l1抗体和化学疗法治疗癌症。这些抗pd-l1抗体组合物和方法包括小野药品工业(onopharmaceuticals)和合作者研发的那些。

另外合适的pd-l1抗体是美国专利第7,943,743号、第9,580,505号和第9,580,507号，其试剂盒(美国专利第9,580,507号)和编码抗体的核酸(美国专利第8,383,796号)。此类抗体与pd-l1结合并与参考抗体竞争结合；由vh和vl基因定义；或由重链和轻链cdr3(美国专利第7,943,743号)或重链cdr3(美国专利第8,383,796号)定义，具有限定序列或其保守修饰；或与参考抗体具有90％或95％序列一致性。这些抗pd-l1抗体还包括具有确定的定量(包括结合亲和力)和定性特性的抗体、免疫缀合物和双特异性抗体。还包括使用此类抗体的方法，以及具有确定的定量(包括结合亲和力)和定性特性的抗体，包括单链形式的抗体和具有分离的cdr形式的抗体，以增强免疫应答(美国专利第9,102,725号)。如美国专利第9,102,725号中所述，增强免疫应答可用于治疗癌症或感染性疾病，如病、细菌、真菌或寄生虫的病原性感染。这些抗pd-l1抗体组合物和方法包括产物bms936559。

另外合适的pd-l1抗体是美国专利申请第2016/0009805号中的抗体，其涉及pd-l1上特定表位的抗体，包括具有限定的cdr序列的抗体和竞争抗体；核酸、载体、宿主细胞、免疫缀合物；检测、诊断、预后和生物标志物方法；和治疗方法。

***

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。所属领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可以视为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，所属领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例i

巴维昔单抗的产生和表征

本实施例总结了称为3g4的鼠ps靶向抗体的产生和初始表征，以及3g4抗体的嵌合形式的产生，包括小鼠-人嵌合抗体(ch3g4)，现在称为巴维昔单抗。

a.生成3g4抗体

如ran等人，2005中报道的，通过用自体ps阳性内皮细胞免疫小鼠来产生3g4抗体。在存在和不存在血清的情况下，在标准elisa中测试3g4抗体与ps的结合，并且最初表征为“血清非依赖性”，即在不存在血清下结合ps的抗体。确定3g4抗体与ps、cl、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酸(pa)和磷脂酰甘油(pg)结合。与靶向在肿瘤中差异表达的ps的模型一致，3g4抗体不与中性磷脂，pc和sm反应。

使用标准蛋白a程序从培养的杂交瘤的上清液中纯化3g4抗体至表观均质性。早期临床前体验显示3g4抗体在同基因和异种肿瘤模型中的一些抗肿瘤作用，再次在ran等人，2005中报道(例如参见ran等人，2005中的图4)。3g4抗体引起肿瘤血管损伤、局部血栓形成、肿瘤坏死和延迟的肿瘤生长，没有毒性迹象。

确定了3g4抗体的重链和轻链可变区的完整序列，其总共包括六个互补决定区(cdr)，随后是3g4抗体的嵌合形式，包括小鼠-人类嵌合抗体(ch3g4)(现称为巴维昔单抗)的生成。3g4抗体的重链可变区(vh)的核酸和氨基酸序列分别由seqidno：35和seqidno：36表示。重链可变区序列在kabat可预测的位置包括vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3(kabat等人，1991)。

seqidno：35和seqidno：36包括部分小鼠前导序列和恒定链序列，如图1a所示。前导序列由seqidno：36的氨基酸1至19表示，并且成熟蛋白质如图1a中的箭头所示开始。成熟蛋白质的序列包括足够的可变区和cdr序列信息直至结束vss的序列部分，之后氨基酸对于抗原结合不是必需的。因此，核酸序列中的bsteii位点可以用作制备功能性小鼠可变区，例如用于移植到人类恒定区上的适宜位点(图1a)。

实际上，使用lonzapee载体将3g4-2bvh序列移植到bsteii位点的人类γ1恒定区上。所得产物含有小鼠前导序列，并且其vh以图1a中所示的方式与人类ch1序列连接，其中astlgpsvfplapsskstsg(seqidno:39)表示人类ch1序列的第一部分。

3g4抗体的轻链可变区(vκ)的核酸和氨基酸序列分别由seqidno：37和seqidno：38表示。轻链可变区序列在kabat可预测的位置包括vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3(kabat等人，1991)。

seqidno：37和seqidno：38再次包括部分小鼠前导序列和恒定链序列，如图1b所示。前导序列是seqidno：38的氨基酸1至22，并且成熟蛋白质如图1b中的箭头所示开始。成熟蛋白质的序列包括足够的可变区和cdr序列信息直至结束tvf的序列部分，之后氨基酸对于抗原结合不是必需的。因此，核酸序列中的bbsi位点可以用作制备功能性小鼠可变区，例如用于移植到人类恒定区上的适宜位点(图1b)。

实际上，使用lonzapee载体将3g4-2bvl序列移植到bbsi位点的人类κ恒定区上。所得产物含有小鼠前导序列，并且其vl以图1b中所示的方式在人类cl1序列内连接，其中ifppsdeqlksgtas(seqidno:40)表示人κ恒定区序列的第一部分。

b.生成小鼠嵌合抗体2ag4

如下直接描述，鼠3g4抗体的人类嵌合体(ch3g4)是人类igg1同种型(higg1)。ch3g4的鼠igg同源物对应于小鼠igg2a同种型(migg2a)。制备并测试所述构建体，并显示其表现与原始小鼠igg3抗体基本相同。

简单地说，通过rt-pcr从3g4杂交瘤细胞系分离的总rna扩增3g4轻链编码序列。设计rt-pcr引物以使得扩增的片段在扩增产物的任一末端含有xmai和ecori限制酶位点，用于克隆到lonza表达载体，pee12.4载体中。通过rt-pcr从3g4杂交瘤细胞系分离的总rna扩增3g4重链的可变区。设计引物以使得扩增的片段在扩增产物的任一末端含有hindiii和xmai限制酶位点，用于克隆到lonza表达载体，pee6.4载体中。

通过pcr从shozoizui博士提供的质粒载体扩增小鼠igg2a恒定区。设计pcr引物，在扩增产物的任一端具有bstii和ecori限制酶位点，用于克隆到pee6.4+3g4vh载体中。bsteii位点设计为与上游的3g4vh可变区序列符合读框。通过用sali和noti切割两种载体，将重链和轻链构建体组合成单个双基因载体(12.43g4igg2a)。通过测序验证重链和轻链编码区。

通过电穿孔将12.43g4igg2a载体转染到ns0细胞中。转染后，将ns0细胞稀释并涂铺于缺少谷氨酰胺的培养基中的96孔板中。只有用构建体转染的细胞(含有用于阳性选择的谷氨酰胺合成酶基因)才能在不存在谷氨酰胺下生长。使用与原始用于测试3g4抗体相同的标准elisa鉴别转染子并筛选抗体分泌，并且在大培养物中培养分泌最高量抗体的那些转染子以产生纯化抗体。

将所得2ag4抗体纯化至表观同质性并且显示，其具有与3g4抗体基本相同的亲和力和结合分布。

c.生成人类嵌合抗体ch3g4(巴维昔单抗)

已经产生了含有鼠可变区和人类恒定区的嵌合构建体(ch3g4)，并显示出与原始鼠抗体具有基本相同的特征。

将鼠3g4抗体转化为人类-鼠嵌合抗体。克隆鼠vh并移植到lonza2bvh载体的bsteⅱ位点的人类γ1恒定区。克隆鼠vk并移植到lonza2bvl载体的bbsi位点的人类k恒定区。验证序列。在cho细胞(中国仓鼠卵巢)中表达整个构建体，并纯化抗体。这是现称为巴维昔单抗的抗体。

使用与最初用于测试3g4抗体相同的标准elisa，所得的ch3g4至少与鼠3g4结合至磷脂涂布的elisa板。嵌合3g4与磷脂组ps、pa、cl、pi和pg的体外结合特征显示与3g4相同。结合是抗原特异性的，因为没有观察到与不相关特异性的对照抗体的结合。在体内，还显示ch3g4定位于肿瘤血管内皮并在广泛的研究中发挥抗肿瘤作用和抗病毒作用。

d.3g4抗体和巴维昔单抗以β2gpi依赖性方式靶向ps

当嵌合3g4构建体在无血清条件下在cho细胞中表达，并且在不存在血清下在elisa中测试纯化的抗体与ps的结合时，丧失与ps的结合。生成了数据以解决来自原始杂交瘤的3g4抗体和cho细胞中表达的嵌合抗体的ps结合分布的明显差异。为此，证明了3g4抗体和ps之间的相互作用依赖于血浆蛋白，β2-糖蛋白i(β2gpi)。

数据证明了3g4(和巴维昔单抗)抗体和ps之间的相互作用依赖于血浆蛋白β2gpi。3g4在域ii显示与β2gpi结合，这与从抗磷脂综合征(aps)患者分离的致病抗体无关，后者通常识别β2gpi域i。数据显示需要二价3g4/β2gpi复合物用于增强ps结合，包括ps阳性细胞，因为3g4fab'片段不具有这种活性。在细胞结合测定中，显示ch3g4抗体和hβ2gpi必须同时存在以与暴露的ps结合abae细胞，表明ch3g4抗体增强β2gpi对ps的亲和力(luster等人，2006)。

总之，显示3g4抗体在域ii与β2gpi结合，并且β2gpi域v的脂质结合区对于3g4(和ch3g4)以及β2gpi与细胞上暴露的ps的共结合是必需的。另外，显示3g4(和ch3g4)以及β2gpi与暴露的ps的此类共结合需要抗体二价性。因此，如在活化内皮细胞、肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞以及病毒感染的细胞上进行的，抗体和β2gpi共结合于暴露在膜的外表面上的ps。

e.巴维昔单抗和β2gpi之间的相互作用的临床前模型

涉及抗体的巴维昔单抗家族β2gpi和ps之间相互作用的临床前数据显示相对较低水平的β2gpi(显著低于人群中的典型量)足以有效结合巴维昔单抗与ps。

在小鼠的早期研究中，计算出β2gpi与抗体的摩尔比在0.12和0.25之间对抗肿瘤活性是有效的，因此表明高水平的β2gpi对于抗肿瘤活性不是必需的。

在分析3g4-β2gpi复合物与细胞上ps结合所需的β2gpi水平时，第一项研究中的最大相对结合发生在抗体浓度为80nm，这是β2gpi与抗体的比率仅0.5。结论是，最佳抗体结合出现0.125、0.5和2之间的β2gpi与抗体摩尔比下。因此第一体外研究也表明低水平的β2gpi有效地支持巴维昔单抗与具有暴露ps的细胞的结合。

在后续研究中，在不同浓度的人类β2gpi存在下，在elisa中测试2ag4抗体与ps的结合。这项研究表明，2ag4抗体与ps的结合在呈约1的β2gpi与抗体摩尔比下开始稳定。更精确地，β2gpi与抗体的摩尔比0.93被证明在支持抗体结合到ps涂布的板方面是有效的。

在卵白蛋白中存在不同浓度的人类β2gpi的情况下，在elisa中进行了一系列测试巴维昔单抗与ps的结合的相关研究。进行巴维昔单抗和β2gpi滴定。这些研究还表明，低水平的β2gpi，包括低至0.5μg/ml的浓度，在支持一系列抗体浓度与经ps涂布的板结合方面是有效的。

进行另一系列研究以测试不同稀释度的人类血清中巴维昔单抗与ps的结合和功能。这些包括在elisa、facs分析中使用ps阳性细胞，和nfat替代性adcc生物测定形式的功能测定中的ps结合(larson等人，2013)。

从elisa测定的示例性结果表明，巴维昔单抗结合到ps在β2gpi在1％人血清中的浓度已经处于饱和状态，该浓度是2.86的β2gpi与抗体的摩尔比。即使在0.5％人类血清下，巴维昔单抗与ps的结合仍接近稳定，并且这对应于呈1.43的β2gpi与抗体摩尔比。nfat替代性adcc生物测定的结果还表明，在这一一般范围内的β2gpi与抗体摩尔比有效地支持巴维昔单抗功能。例如，虽然本研究并非设计用来鉴别针对巴维昔单抗活性的最佳比率，但显示，呈1.9的(牛)β2gpi与抗体摩尔比有效地支持nfat测定中的巴维昔单抗活性。

总之，显示低至0.12至2.86的β2gpi与抗体摩尔比支持抗体与ps和ps阳性细胞的结合，促进功能测定中的活性并允许有效治疗患有肿瘤的小鼠。鉴于所有上述数据，并采取预防方法，可以推断出，为了最大化单抗结合和功能，β2gpi与抗体摩尔比应为约2.86，但其不需要高于约3。

实施例ii

巴维昔单抗在临床研究中的药代动力学

所述实例涉及当给予患有其中ps是标记物的疾病，特别是癌症和病毒感染的人类个体时的巴维昔单抗的药代动力学。如上所述，临床经验显示与临床前建模一致。

a.初始i期研究

进行i期、多中心、开放标记、剂量递增研究以评估当向26名患有难治性晚期实体肿瘤的患者静脉内给予(巴维昔单抗单一疗法)时，巴维昔单抗的安全性、耐受性和药代动力学(pk)。患者参与四个连续的剂量递增组(每周0.1、0.3、1或3mg/kg巴维昔单抗)和两个给药方案。在0.1mg/kg和0.3mg/kg组中，患者在第0、28、35和42天接受巴维昔单抗；在1mg/kg和3mg/kg组群中，在第0、7、14和21天向患者给予巴维昔单抗。

基于临床前模型(实施例i，e)和其它患者群体的经验选择每周3mg/kg的较高剂量。在实施例i和ran等人，2005的模型研究之后的广泛动物模型研究中，在每周3次的0.5mg/kg抗体剂量下实现最大功效，得到半衰期为48小时的5.5μg/ml的c最大，并且治疗过程中模拟的平均血液浓度为2μg/ml。超过此类剂量，基于巴维昔单抗与ps阳性细胞的体外结合变得饱和的浓度的观察结果(实施例i，e)，巴维昔单抗的ps结合可能是饱和的。

在研究之前，在第0天、第1天、第2天、第4天、第7天、第10天、第14天以及第21天至第70天每7天从0.1和0.3mg/kg剂量组中的患者收集样品。在研究之前，在第0天、第1天、第2天、第4天、第7天、第14天、第21天、第22天、第23天、第25天以及第28天至第56天每7天从1和3mg/kg剂量组中的患者收集样品。通过验证的elisa确定巴维昔单抗血液水平。

表1展现所述i期试验中单剂量给药(第0天)和多剂量给药(第21天)后巴维昔单抗的平均值(变差系数，cv)pk参数，包括最大浓度(c最大)、清除率(cl)、半衰期(t1/2)和从零到无限大的血浆浓度-时间曲线下面积(aucinf)。

表1

巴维昔单抗在i期试验中的药代动力学参数

如表1所示，在单剂量给药后，确定巴维昔单抗的平均半衰期为37.2至43.9小时。在第0天，当达到最大血清浓度(t最大)(介于2.04至3.73小时的值)时，平均最大血清浓度(c最大)在给药后的中值时间的范围为2.11至56.4μg/ml(取决于剂量)。对于以3mg/kg给药的巴维昔单抗，最大血清浓度为56.4μg/ml。对于整个研究，巴维昔单抗半衰期为37至47小时。本研究未达到最大耐受剂量。

巴维昔单抗展现出线性单剂量(第0天)和多剂量(第21或42天)pk特征。在多剂量给药后，巴维昔单抗没有展现出明显的积累或时间依赖性pk差异。总之，所述研究表明，巴维昔单抗在每周高达3mg/kg的剂量范围内具有良好的耐受性，并且药代动力学支持每周给药方案。确切地说，据测定，在1mg/kg的剂量下，巴维昔单抗浓度保持高于2μg/ml(基于临床前模型所预测的治疗阈值)持续6天；并且在3mg/kg的剂量下，巴维昔单抗浓度保持高于这一2μg/ml持续7天。因此，选择每周3mg/kg的剂量用于肿瘤学的未来使用。

b.其它药代动力学研究

除了上述i期试验外，现已在癌症或病毒感染患者的其它几项临床研究中在120多名患者中评估以单剂量、每周一次或每周两次输注(60-90分钟)给定的巴维昔单抗的pk。经证实，巴维昔单抗在剂量范围为0.1至6mg/kg时展现出线性单剂量和多剂量pk特征，并且没有明显的巴维昔单抗累积或时间依赖性pk差异的迹象。显示中值t最大在输注结束后的前2至3小时内发生。血清巴维昔单抗浓度以明显的单指数或双指数一阶方式下降。观察到的更快的分布阶段在6小时内基本完成，并且终末消除半衰期为约1至2天(21.9至46.8小时)。

1.病毒感染的pk

巴维昔单抗pk特征在患有癌症和慢性病毒感染的患者中通常是相似的，如在患有和不患有hiv的慢性hcv感染的患者中所测试。

i期、开放标记、单中心、剂量递增研究评估了在慢性感染hcv的患者中单次静脉内输注巴维昔单抗(实施例iii，a)。如表2所示，发现观察到的巴维昔单抗浓度与pk建模数据的预测结果非常一致。

表2

预测和测量的巴维昔单抗浓度

在慢性hcv患者的相应的ib期、多中心、开放标记、非随机、逐步递增的重复剂量研究中，pk数据分析显示第0天的线性单剂量pk特征和第10天的所有剂量水平下的线性多剂量特征，而且在给药2周后没有巴维昔单抗积累或时间依赖性pk差异的迹象。

在共同感染慢性hcv和hiv的患者的ib期研究(实施例iii，c)中，巴维昔单抗在第0天展现出线性单剂量pk特征，并且在0.3到6mg/kg的剂量范围内的每周一次给药后第49天展现线性多剂量pk特征。巴维昔单抗在每周一次多剂量给药8周后没有展现出时间依赖性pk差异或累积。

2.组合疗法中的pk

重要的是，当组合给予巴维昔单抗和其它药物(特别是化疗剂)时，似乎没有任何药物的任何临床相关的药代动力学相互作用。这包括组合给予巴维昔单抗和多西他赛时。

在这方面，ib期、多中心、开放标记、非随机研究首先评估当在难治性晚期实体肿瘤患者中与吉西他滨、太平洋紫杉醇加卡铂或多西他赛组合使用时，3mg/kg的巴维昔单抗的每周一次静脉内给药的安全性、耐受性和pk。经测定，在单剂量(第0天)或多剂量给予巴维昔单抗(第21天)后三个处理组之间的任何可测量参数方面没有显著差异。c最大和auc的评估结果表明，在每周一次多剂量给药八周后没有积累巴维昔单抗。

在评估先前处理的局部晚期或转移性非鳞状nsclc患者中的巴维昔单抗加多西他赛的ii期、随机、双盲、安慰剂对照研究(实施例ix)中，整个研究人群的一个子集(每组6名患者)还参与了pk子研究，以调查巴维昔单抗和多西他赛之间的任何药物-药物相互作用。在周期1和2期间的特定时间点对这些患者进行额外的抽血。对伴随多西他赛的巴维昔单抗没有观察到临床相关的药代动力学药物-药物相互作用。此外，多西他赛在给予或不给予巴维昔单抗时展现出相似的药代动力学特征。因此，在这些患者中没有观察到伴随多西他赛的巴维昔单抗的临床相关的药代动力学药物-药物相互作用。

实施例iii

使用巴维昔单抗治疗患者的病毒感染

在所述实例中，提供数据以举例说明使用巴维昔单抗处理患者的病毒感染的一些临床经验，包括巴维昔单抗与利巴韦林(ribavirin)的组合。还提供数据以显示，在选定的临床剂量下，给予巴维昔单抗不会明显降低人类个体中的β2gpi水平。

a.hcv患者的i期研究

巴维昔单抗首先在慢性感染丙型肝炎病毒(hcv)的患者的i期、开放标记、剂量递增研究和ib期、开放标记、逐步增加的重复剂量研究中进行评估。这些研究涉及巴维昔单抗的安全性、耐受性、pk曲线、病毒动力学、最大耐受剂量(mtd)和最大有效剂量(med)。在i期给予0.1、0.3、1、3和6mg/kg的剂量(30名患者；6名患者的连续组)，并且在ib期给予0.3、1、3和6mg/kg的剂量(24患者；4个6名患者的组)。

在hcv患者的i期和ib期研究中，所有剂量水平的巴维昔单抗都耐受良好。在i期中，在所有剂量水平下均观察到病毒载量的短暂降低，其表明抗病毒活性。在ib期中，用0.3、1和6mg/kg剂量的巴维昔单抗处理后病毒载量小幅下降；这些下降通常是短暂的，但每个组中至少有一名患者的病毒载量持续下降。值得注意的是，在3mg/kg的巴维昔单抗剂量下，在整个研究处理和随访中证实了hcv的持续降低。

b.巴维昔单抗不会消耗β2gpi

上述ib期研究还测量了患者中β2gpi的水平，以确定给予巴维昔单抗是否改变了这些人类个体中的β2gpi水平。在接受1mg/kg巴维昔单抗的患者中，β2gpi水平几乎没有变化。在接受3mg/kg巴维昔单抗的患者中观察到血清β2gpi水平的短暂降低(20至25％)。然而，这种降低在剂量前水平上没有统计学上的显著变化。实际上，在3mg/kg巴维昔单抗剂量下，β2gpi水平保持在正常范围内并在24小时内恢复到治疗前水平。相比之下，在接受6mg/kg巴维昔单抗的患者中，β2gpi水平显著降低(p<0.02)。在6mg/kg剂量下，β2gpi水平相对于治疗前水平下降40％，大约为正常范围的下限。尽管如此，即使在用6mg/kg的巴维昔单抗处理的人类个体中，β2gpi在3天内恢复至基线水平。

因此，这些数据验证了用于人类的3mg/kg剂量的巴维昔单抗的选择。所述剂量被测定为巴维昔单抗和β2gpi一起存在的最大剂量，其中浓度有效地使巴维昔单抗-β2gpi复合物形成并结合暴露于疾病位点中的细胞上的ps而不消耗血浆β2gpi水平。然而，数据还显示，在巴维昔单抗处理期间β2gpi的任何减少仅是暂时的，并且β2gpi水平会在3天内恢复。

c.hcv-hiv患者的i期研究

进行单独的ib期、多中心、开放标签、非随机、剂量递增、重复剂量研究，以评估共同感染慢性hcv(大多数hcv基因型1)和人类免疫缺陷病毒(hiv)的患者中的巴维昔单抗。主要目标是确定安全性、耐受性、pk曲线、病毒动力学、mtd和/或med。所述研究涉及大约16周的16次预定访问。将巴维昔单抗以下列剂量给予连续患者组：0.3mg/kg，6名患者；1mg/kg，6名患者；3mg/kg，9名患者；和6mg/kg，6名患者。患者每周静脉内注射巴维昔单抗持续8周。在所述组中的所有患者完成前4周给药并且没有出现被分类为严重不良事件(sae)的血栓形成事件之后，进行剂量递增。

中值基线hcv病毒载量为6.76log10，并且hiv的中值基线为3.99log10。在研究期间的特定时间点测量hcv和hiv的血浆病毒载量。当用巴维昔单抗以所有剂量水平处理时，每个处理组中有数名患者展现出短暂的抗病毒活性(≥0.5log10的hcv和/或hiv病毒载量自基线最大减少)。

d.hcv患者的ii期研究

进行ii期、多中心、随机、主动对照研究，以评估巴维昔单抗与利巴韦林组合用于慢性hcv(基因型1)感染的初始处理。主要终点是在研究第12周显示早期病毒学应答(evr)的患者比例，evr定义为等于或大于hcvrna水平的2-log10国际单位(iu)降低量。安全性包括在次要终点之间。

患者接受最长28天的筛查/清洗期，随后进行随机化(比率为1:1:1)，每周接受0.3或3mg/kg巴维昔单抗输注或聚乙二醇化干扰素α-2a(聚乙二醇化干扰素，也称为peg-ifnα-2a)皮下注射12周，均每日两次口服利巴韦林1000mg(体重<75kg)或1200mg(体重≥75kg)。12周后显示evr的患者接受聚乙二醇化干扰素加利巴韦林的长达48周疗程的非研究处理。

共有66名患者(38名男性和28名女性)参与了所述研究，平均年龄为39.1岁。22名患者各自接受0.3mg/kg巴维昔单抗、3mg/kg巴维昔单抗和聚乙二醇化干扰素。接受的0.3和3mg/kg巴维昔单抗剂量的中值数分别为12剂，并且平均处理持续时间分别为78天和75天。

在这项研究中，在使用巴维昔单抗加利巴韦林处理的一些患者中观察到超过12周的病毒逐渐减少。有趣的是，看到evr在使用较低剂量的巴维昔单抗(0.3mg/kg)处理的患者中增加了一倍，其与3mg/kg较高剂量的巴维昔单抗相反(18％对9％)。虽然接受聚乙二醇化干扰素的患者的evr率要高于任何剂量下的巴维昔单抗，但是巴维昔单抗显示出更有利的安全性；与含有巴维昔单抗的组相比，聚乙二醇化干扰素组中几乎两倍的患者报告了ae。

实施例iv

用巴维昔单抗和太平洋紫杉醇处理乳腺癌患者

转向临床癌症处理，本实例提供了使用巴维昔单抗与紫杉烷、太平洋紫杉醇组合处理her2阴性转移性乳腺癌患者的数据。

在由研究者资助的单中心研究中，14名her2阴性转移性乳腺癌患者每周接受3mg/kg巴维昔单抗并在4周周期中的第1天、第8天和第15天给予太平洋紫杉醇(80mg/m²)。骨痛、疲劳、头痛和嗜中性白细胞减少症是最常见的不良事件(ae)。可控制的输注相关反应是与巴维昔单抗相关的最常见的ae。巴维昔单抗没有显示血栓形成增加的迹象。处理引起总反应率(orr)为85％，其中2名患者具有完全反应，中位无进展存活期(pfs)为7.3个月(95％ci：2.8、10.8)。

总之，本研究表明，巴维昔单抗与太平洋紫杉醇组合对于转移性乳腺癌患者的处理具有良好的耐受性，在临床应答率(rr)和pfs方面观察到了有希望的结果。

实施例v

用巴维昔单抗和太平洋紫杉醇-卡铂处理乳腺癌患者

本实例报告ii期、开放标记、单组研究的结果，所述研究评估巴维昔单抗加太平洋紫杉醇和卡铂在局部晚期或转移性乳腺癌患者中的安全性和功效，其不受激素或her2状态限制。

这项ii期研究采用了simon两期设计。15名患者进入a期，并且所述试验在b期扩展至另外31名患者，总共46名患者。主要目标是确定总体响应率(orr)，定义为完全响应(cr)加部分响应(pr)，cr+pr。次要目标包括肿瘤进展时间、应答持续时间(dor或dr)、总存活期(os)和安全性。

每周给予巴维昔单抗(3mg/kg)直至疾病进展，并且在28天循环的第1、8和15天给予卡铂(剂量auc＝2)和太平洋紫杉醇100mg/m²持续最多6个循环。46例患者中有16例(34.8％)未接受过处理。

最常见的4级处理后出现的不良事件(teae)是嗜中性白细胞减少症(12名患者，26.1％)，其为与本研究中所用的化学疗法处理的患者的预期发生率。最常见的3级teae是白细胞减少症(11例，23.9％)、嗜中性白细胞减少症(9例，19.6％)和贫血症(5例，10.9％)。这些也是本研究中所用的化学疗法处理的患者的预期发生率。

46例患者中有34例(73.9％)出现根据实体肿瘤响应评估标准(recist)的客观响应；46名患者中有5名(10.9％)具有cr，并且29名患者(63.0％)具有pr。中值响应持续时间(dor)为3.7个月(95％置信区间[ci]：3.1、5.8)，并且中值pfs为6.9个月(95％ci：5.6,7.7)。在研究结束时，中值os被测定为23.2个月(95ci：553天至'未确定')。这些结果对于巴维昔单抗的持续研发非常令人鼓舞，特别是在组合疗法中。

实施例vi

用巴维昔单抗和多西他赛处理乳腺癌患者

本实例报告了另一ii期、开放标记、单组研究的结果，所述研究评估了这次与多西他赛组合的巴维昔单抗在局部晚期或转移性乳腺癌患者中的安全性和功效。

这一试验也是利用simon两期设计的ii期多中心临床试验。15名患者进入a期，并且所述试验在b期扩展至另外31名患者，总共46名患者。主要目标是测定orr(cr+pr)。次要目标包括肿瘤进展时间、dor、os和安全性。

每周给予巴维昔单抗(3mg/kg)直至进展，并且在联合，在计划的4周周期的第1、8和15天给予多西他赛(35mg/m²)持续6个周期。所有患者先前均接受过一次化疗方案。在最常见的所报告的teae中，只有疲劳、头痛、背痛和高血压≥3级。

在这项研究中，据测定，46例患者中有28例(60.9％)出现客观响应；46例患者中有5例(10.9％)具有cr，46例患者中有23例(50.0％)具有pr。中值dor为6.1个月(95％ci：5.7,7.5)，中值pfs为7.4(95％ci：6.1、9.1)个月。在最终分析时，中值os约为20.7个月(95％ci：16.1个月至'未确定')。这些数据为巴维昔单抗的进一步研发提供了强有力的支持，包括与多西他赛的组合疗法。

实施例vii

用巴维昔单抗和索拉非尼处理肝癌患者

在所述实例中，展示来自使用巴维昔单抗与索拉非尼组合处理晚期肝细胞癌(hcc)患者的数据。

进行了巴维昔单抗和索拉非尼在晚期肝细胞癌(hcc)中的ii期单一机构研究。患者每周静脉内(iv)接受3mg/kg巴维昔单抗，口服400mg索拉非尼，每天两次(pobid)直至有放射学进展。次要终点包括总存活期(os)、疾病特异性存活期、4个月无进展存活期、安全性和应答率。所述研究累计有38名患者。

在来自本研究中6名患者的相关翻译数据中，据测定，在一次巴维昔单抗处理周期后，所评估的一半患者的抗肿瘤免疫细胞增加，其与多种临床前癌症模型中相关的ps靶向抗体所示相似。此外，免疫应答的增加与保持处于研究处理较长时间段的患者相关，表明临床上有意义的抗肿瘤免疫应答。评估的6名患者中有3名具有活化的抗肿瘤t细胞(cd8)浸润到肿瘤微环境中增加，这与疾病进展的延长时间相关。此外，这些应答患者在开始处理之前最初表达较低水平的pd-1阳性细胞，这是t细胞活化和疾病结果的既定标记物，随后在巴维昔单抗治疗后出现可测量的升高。

临床上，未记录到4级或5级不良事件。最常见的所有等级事件是腹泻(32％)、疲劳(26％)和厌食(24％)。中值os(mos)为6.2个月。两名患者实现部分应答，并且四个月pfs为61％。

这些结果证明，巴维昔单抗和索拉非尼在晚期hcc患者中耐受良好，没有伴随其它检查点免疫疗法可见的自体免疫不良事件的迹象。进展时间、疾病控制率和4个月无进展存活期的临床结果令人鼓舞，特别是在这个难以预处理的患者组中，所述患者组由于其不利的疾病生物学(包括高血管侵入率)而预后极差。

实施例viii

用巴维昔单抗和吉西他滨处理胰腺癌患者

在本实例中，展现来自用吉西他滨与巴维昔单抗组合处理患有先前未处理的iv期胰腺癌的患者的数据。

本研究(pphm1002)是ii期、随机、开放标记研究，其用于在先前未处理的iv期胰腺癌患者中评估与巴维昔单抗一起给予或不与其一起给予的吉西他滨。主要目标是比较处理组中患者的os。次要目标包括比较pfs、orr、dr和安全性。

入组患者以1:1比率随机化接受单独的吉西他滨或吉西他滨与每周3mg/kg巴维昔单抗的研究处理。在每个28天周期(4周)的第1、8和15天给予吉西他滨(1000mg/m²)直至出现疾病进展或不可接受的毒性。共有70名患者参与所述研究。一般而言，患者群体具有非常广泛的疾病负担，这可能会降低两组的应答。

巴维昔单抗加吉西他滨处理组最常见的teae是恶心(44.1％)、贫血(35.3％)、和疲劳、便秘和厌食(每种都发生在32.4％的患者中)。随机分配至吉西他滨的3名(9.1％)患者仅发生5级(致命)事件(猝死[1名患者]、肝脓肿[1名患者]和心脏骤停[1名患者])。吉西他滨加巴维昔单抗组均未发生5级(致命)事件。

尽管大多数疗效终点在处理组之间相当，但在巴维昔单抗和吉西他滨组中，1年时的应答率和存活概率在数值上更高。在研究结束时，仅吉西他滨处理组的中值总存活率(95％ci)为5.2(4.0至6.3)个月，而巴维昔单抗加吉西他滨处理组为5.6(4.7至7.0)个月。添加巴维昔单抗的这些结果令人鼓舞，特别是在具有非常广泛疾病负担的患者群体中。

在实施例x的iii期试验和实施例xiii的功能性β2gpi分析之后，显示功能性β2gpi水平与处理结果相关，还测试了来自本ii期试验的储存样品的功能性β2gpi。如实施例xiv中所报告，这些分析的结果强化了功能性β2gpi水平是成功的巴维昔单抗处理的生物标志物的发现。

实施例ix

巴维昔单抗和多西他赛在nsclc患者中的ii期试验

在i期和单组ii期经验的基础上，本实例涉及在先前处理的iiib/iv期非鳞状非小细胞肺癌(nsclc)患者中进行测试巴维昔单抗加多西他赛的ii期试验。

本研究(pphm0902)是ii期、随机、双盲、安慰剂对照试验，其评估先前接受过处理的局部晚期或转移性非鳞状nsclc患者中的巴维昔单抗加多西他赛。本研究的主要目的是比较处理组之间的orr(cr+pr)。次要目标包括比较pfs、dr、os、安全性和pk。

患者以1:1:1的比例随机化接受多西他赛加安慰剂、多西他赛加巴维昔单抗1mg/kg，或多西他赛加巴维昔单抗3mg/kg。在每个21天周期的第1天给予多西他赛75mg/m²持续多达6个周期，并且每周给予安慰剂或指定剂量的巴维昔单抗。患者继续每周接受指定的盲法处理(安慰剂、1mg/kg巴维昔单抗或3mg/kg巴维昔单抗)直至出现进展或毒性。

总体研究人群(每组6名患者)的一个子集参与pk子研究以研究巴维昔单抗和多西他赛之间的药物-药物相互作用。在周期1和2期间的特定时间点对这些患者进行额外的抽血。

共有121名患者(76名男性和45名女性)参与所述研究，平均年龄为60.0岁。在独立数据监测委员会(idmc)会议之后，研究处理是非盲的，其中确定已达到orr的主要终点，因此建议研究治疗揭盲。此外，idmc没有发现任何安全性担忧或问题。

在研究揭盲后，发现包装和标签供应商的标签错误涉及安慰剂和1mg/kg组。将调查汇总提交给食品和药物管理局(fda)，并且将来自用安慰剂或1

mg/kg巴维昔单抗投配的患者的数据合并以形成用于探索性分析和与3mg/kg巴维昔单抗组比较的组合对照组。

总体而言，处理组之间毒性等级的ae发生率没有观察到显著差异。处理组之间的sae没有观察到显著差异。组合对照组中的3名患者(3.8％)和伴随多西他赛的3mg/kg巴维昔单抗组中的2名患者(5.0％)具有5级(致命)事件。具有致命事件的组合对照患者包括1名患有败血症的患者、1名患有脑血管意外的患者以及1名患有肺炎和假单胞菌败血症的患者。在3mg/kg巴维昔单抗加多西他赛组中，1名患者患有与巴维昔单抗无关的致命性败血症，并且1名患者具有不能茁壮成长事件，其也与巴维昔单抗无关。

功效终点的汇总示于表3中，其中所述分析基于所述意向治疗(itt)人群和中央审查数据。与组合对照组(安慰剂或1mg/kg巴维昔单抗)相比，所有终点(orr、pfs和os)均显示出巴维昔单抗3mg/kg优越性的趋势。与组合组相比，巴维昔单抗3mg/kg的orr大约高50％。虽然组合组和3mg/kg巴维昔单抗组的中值pfs相似，但接受巴维昔单抗3mg/kg的患者的中值os时间约为60％。特别地，用3mg/kg巴维昔单抗加多西他赛处理的患者具有11.7个月的mos，而对于组合组中的患者，mos仅7.3个月(hr＝0.66)。

表3

基于ii期试验的功效分析汇总

在实施例x的iii期试验和实施例xiii中功能性β2gpi的分析之后，其显示功能性β2gpi水平与治疗结果相关，还测试了来自本ii期试验的储存样品的功能性β2gpi。来自实施例xiv中所述的这些分析的结果进一步证实功能性β2gpi的水平是成功的巴维昔单抗治疗的生物标志物。

实施例x

巴维昔单抗和多西他赛在nsclc患者中的iii期试验

如前述实例中所报告，来自i期和ii期研究的总体结果证明了巴维昔单抗的临床上有意义的治疗作用。基于此类结果，特别是基于上述双盲ii期试验，进行iii期试验，本实例描述了iii期试验和得到的数据。

iii期临床试验为巴维昔单抗加多西他赛在先前经处理的iiib/iv期非鳞状非小细胞肺癌(nsclc)的患者的随机化、双盲、安慰剂对照的多中心试验。这项全局双盲iii期试验于2012年启动。选择标准适用于iiib/iv期非鳞状nsclc患者，对其进行铂双联化疗(如果已知egfr或alk突变，应在适当的靶向疗法上取得进展)，同时允许ecogps0-1和先前免疫疗法(ecog是easterncooperativeoncologygroup定义的性能状态标度)。所述试验以1:1比率累计597例此类患者接受多达6个21天周期的多西他赛以及每周3mg/kg巴维昔单抗(巴维昔单抗加多西他赛，b+d)或安慰剂(单独的多西他赛，d)直到出现进展或毒性。主要终点是总存活期(os)并且次要终点包括客观应答率(independentcentralreview，icr)、无进展存活期(icr)、安全性、pk、生活质量(lcss)和探索性生物标志物，包括免疫相关性。所选患者的基线特征显示在表4中，其中'安慰剂'栏是指单独用多西他赛处理的患者，'巴维昔单抗'栏是指用巴维昔单抗加多西他赛处理的患者。

表4

iii期试验中患者的基线特征

a.安全性

在达到70％的目标os事件时，评定中值os(mos)(见下文)。在此刻，据测定，两组之间的安全概况普遍相似。因此，单抗与多西他赛的组合的安全概况与安慰剂加多西他赛相似。

b.功效

在达到70％的目标os事件时，巴维昔单抗加多西他赛组中297例患者的mos为10.7个月(95％置信区间[ci]，8.6-11.5)，并且单独多西他赛组中的300名患者的mos为10.8个月(95％ci，9.2-12.6)(死亡风险比(hr)，1.10(0.89，1.37))。研究中约15％的患者接受了随后的免疫疗法，均匀分布在巴维昔单抗加多西他赛组和单独多西他赛组之间(参见实施例xvi)。

当达到70％的靶向os事件时，两组中无进展存活期(pfs)也相似，其中巴维昔单抗加多西他赛组的中值pfs为4.1个月，单独多西他赛组的中值pfs为3.9个月。客观应答率(itt)和响应的持续时间(dor)在此阶段中的分析列于表5中，其中p值是基于双侧分级柯尔伦-曼特尔-汉塞尔(cochran-mantel-haenszel)精确方法。分层因素包括疾病阶段(iiib与iv)、地理区域(北美、欧洲、世界其它地方)、以前的维护和/或靶向治疗(是与否)。

表5

第三阶段试验，客观应答率

伴随对最后一名随机化患者的12个月随访，达到约85％的目标os事件，巴维昔单抗加多西他赛组中297例患者的中值os为10.5个月(95％置信区间[ci]，8.4-11.9)，并且单独多西他赛组中300例患者中的中值os为10.9个月(95％ci，9.2-12.1)(hr，1.06；p＝0.533)。此阶段的pfs在巴维昔单抗加多西他赛组中为4.2个月(95％ci，3.9-4.6)，在单独多西他赛组中为4.1个月(95％ci，3.2-4.8)(hr，1.02；p＝0.876)。此阶段的orr在巴维昔单抗加多西他赛组中为15％，而单独多西他赛组为11％(优势比为0.7；p＝0.15)。各组之间此阶段的安全概况类似。在巴维昔单抗加多西他赛组中有68％的患者发生3级或更高的不良事件，并且在单独的多西他赛组中有60％发生所述不良事件。

这些中值os的结果与上文实施例ix中描述的ii期数据和用于充实研究的假定mos意外地不同，后者对于巴维昔单抗加多西他赛为9.1个月mos，而对于单独多西他赛为7.0个月mos(473个os事件，以提供80％的动力和单侧2.5％的显著水平，假设9.1对7.0个月mos；hr0.77)。

回顾性veri蛋白质组测试在巴维昔单抗加多西他赛组的80％和单独多西他赛组的84％表现出了良好vs特征标志(实施例xi)。尽管经先前处理的非鳞状nsclc患者的iii期试验并未达到巴维昔单抗加多西他赛组优效os的主要目标，但这一结果可能受到总体良好vs特征标志比例高于预期的影响，特别是单独多西他赛组。

实施例xi

巴维昔单抗iii期试验的初步生物标志物分析

关于上述iii期试验，进行生物标志物分析以针对从含有巴维昔单抗的治疗方案中获益最多的患者鉴别一种或多种生物标志物或生物标志物模式(巴维昔单抗“特征标志”)。本实施例涉及proteomic签名分析及其在生物标志物指导的持续临床巴维昔单抗开发中的应用。

a.样品采集

设计了iii期试验，并获得了收集患者血液样品的知情同意书。使用适当的静脉切开术技术获得患者血液样品。止血带被放置在静脉穿刺部位上方7至10厘米处，但是用于初步静脉选择的止血带不允许超过一分钟。要求患者闭合，但不要泵其第一个，并且用70％异丙醇垫使用从中心到周边的圆周运动清洁静脉穿刺部位并允许风干。

使用21号计量注射针，将患者血液收集在5.0ml金顶血清分离管(sst)中。在血液开始流动后，止血带尽快释放，并允许管完全充满。收集后立即将管倒置5次，并使其凝结至少30分钟。为了分离血清，将管在收集的30至60分钟内以1,000至1,300g离心15分钟。用移液管将约1.25ml血清转移到3.6ml冷冻管×2中并冷冻那些样品。

将冷冻的小瓶放入样品袋中并密封。干冰运送器的底部用干冰分层，并将样品袋放在盒子里。添加干冰直至盒子装满，将盖子固定在适当的位置，并将样品运送到中心实验室以在-70℃下储存。

中心实验室通过解冻样品制备供细分用的小瓶。使用移液管将至少250μl血清转移到2ml天然帽冷冻管×4中并在-70℃下再冷冻。重复相同的运送指导内容，将亚等分样品在干冰上冷冻运送到测试实验室用于生物标志物测试。

b.veri分析

应了解，癌症的多维特征对于患者选择和处理计划非常重要。所述veri测试是针对晚期nsclc患者的市售的，基于血液的预测和预后的蛋白质组学测试。除了预测之外，veristrat还可以预测单药处理方案之间的差异治疗效益。veristrat在来自iii期临床试验的患者样品上回顾性进行。也正在针对巴维昔单抗专门探索单独的蛋白质组学方法。

来自的iii期临床试验中的患者的治疗前血清样品的蛋白质表达使用质谱法测试，将患者分类为veristrat(vs)不良(vs-p)，其与更严重的疾病相关，或vs良好(vs-g)，其与更有利的预后相关。使用kaplan-meier统计方法由veristrat亚组分析os。

veristrat分类适用于597名随机患者的569名患者。在巴维昔单抗加多西他赛组中，80％为vs良好，20％为vs不良。在单独多西他赛组中，84％为vs良好，16％为vs不良。所述veristrat良好/不良的特征标志因此在iii期临床试验的处理组间基本平衡。

所有vs良好的中值总存活期(mos)为11.5个月(95％置信区间[ci]，10.6-12.9)和5.7(95％ci，4.2-7.2)；p<0.0001，危险比[hr]os(vs-gvs.vs-p)0.49(95％ci0.37-0.64)；p<0.001。这些veristrat结果与prose试验一致(gregorc等人，2014)并且是pfs和os的总体预后。

在vs良好的患者中，巴维昔单抗加多西他赛组的mos是11.2个月(95％ci，10.2-12.8)，并且在单独多西他赛组为11.8个月(95％ci，10.4-13.5)；p值＝0.38。在vs不良的患者中，巴维昔单抗加多西他赛组的mos是5.8个月(95％ci，5.0-11.3)，并且在单独多西他赛组为4.7个月(95％ci，3.4-7.2)；p值＝0.27。鉴于本组患者的治疗选择有限，巴维昔单抗改善vs不良患者中的os的能力是很重要的。

总之，iii期临床试验中的veristrat结果是pfs和os总体预后，但不能预测巴维昔单抗处理应答。多西他赛组的意外os结果可能受到veristrat良好患者的相对较高的总体比例的影响。确切地说，此iii期临床试验中veristrat良好患者的百分比(大于80％)比先前报告(约67％)的高，表明患者总体预后较好，从而部分地解释了多西他赛组好于预期的表现。

c.巴维昔单抗免疫标志物

除了前面的veristrat分析，巴维昔单抗的独特免疫生物标志物签名的开发正在进行中。首先，基于干扰素γ(ifnγ)水平的生存分析表明，ifnγ是用巴维昔单抗成功治疗的生物标志物。特别是，具有低水平(外周)ifnγ的患者，治疗前在巴维昔单抗治疗中表现更好(实施例xvii)。还可以在肿瘤微环境中测量ifnγ水平。

其次，探讨pd-l1表达作为预后生物标志物。在患者的一个子集中基线pd-l1表达证明，在巴维昔单抗治疗的患者中，与阳性pd-l1表达(tc1/2/3)比较，阴性pd-l1表达(tc0)与显著延长os相关联(实施例xv)。

总之，这些观察结果与巴维昔单抗一致，证明在pd-l1阴性、“免疫冷淡”肿瘤中具有更多作用。这些和相关的免疫相关测试被设计用于未来临床研究中的患者选择。

实施例xii

功能性β2gpi的测定

本实例涉及明确设计用于检测流体样品中功能性(活性)β2gpi的β2gpi测定的研发。所述测试方法独特地适用于检测和量化功能性β2gpi，其意指能够结合ps和巴维昔单抗的β2gpi。本实例因此提供了与巴维昔单抗处理有关的进一步的有意义的生物标志物分析所需的先前未可获得的工具。

a.材料和方法

1.材料和设备

在测定中使用以下特定材料和设备以产生在所述实例中的章节b1和b2下呈现的结果。材料：96孔中等结合平底板(greinerbioone，目录号655001)；96孔非结合圆底板(科斯塔，目录号3605)；己烷(西格玛，目录号32293)；ps抗原(西格玛，目录号p6641)；卵白蛋白(西格玛，目录号a5503)；发色底物，四甲基联苯胺(tmb)，(kpl，目录号50-76-00)；2mh2so4(飞世尔，目录号sa818-4)；板盖(飞世尔015-027-11)；粘合板密封剂(vwr232701)；试剂储存器(vistalab目录号3054-1000)。还使用1.5ml微量离心管、50ml锥形管和15ml锥形管。

设备：涡旋(scientificindustries)；计时器(vwr62344-64)；10到1,000μl的移液器(rainin)；100到300μl的多通道移液器(rainin)；450和650nm下的板阅读器(en1835)。还使用了刻度搅拌棒和37℃培养箱。伴随测定使用softpro软件。

2.缓冲液和技术

洗涤缓冲液是1×磷酸盐缓冲盐水(pbs)并且封闭缓冲液是于1×pbs中的2％卵白蛋白。

在整个测定中，当使用大体积(例如，≥500μl)时，使用减成移液。首先移取全部量的稀释剂。在添加另外的试剂之前除去等体积的稀释剂。所有潜在危险的蒸汽都在通风橱中进行处理。

3.巴维昔单抗-hrp

使巴维昔单抗抗体缀合于辣根过氧化物酶(hrp)以制备供测定用的巴维昔单抗-hrp检测剂。使用ez-plus活化过氧化物酶物(赛默科技(thermoscientific)，目录号31487)，按照在由制造商提供的ph7.2下缀合活化过氧化物酶与抗体的程序进行缀合。简言之，将1mg巴维昔单抗在ph7.2的pbs中稀释至1mg/ml。将其添加1mg冻干的ez-linkplus活化过氧化物酶中以重构。在重构后立即将10μl5m氰基硼氢化钠溶液添加到反应中并在室温下培育1小时。培育完成后，添加20μl猝灭缓冲液并在室温下培育15分钟。将缀合的巴维昔单抗-hrp(1mg/ml)在4℃下储存长达4周。

4.涂布

如下用ps抗原涂布elisa板：制备5μg/mlps抗原，并在鼓风机关闭的情况下在通风橱中稀释到6ml己烷中。使用12通道移液管向每个孔中添加50μlps溶液。将通风橱鼓风机重新打开，使己烷蒸发30-45分钟，通常30分钟。

5.封闭

如下封闭经ps涂布的elisa板：制备每板100ml封闭缓冲液(于1×pbs中的2％卵白蛋白)。使用12通道移液管向每个孔中添加200μl封闭缓冲液。将封闭的elisa板在37℃下培育120分钟(±10分钟，其不改变测定性能)。

6.样品制备

如下所述进行用于测定的标准阳性对照和样品制备。

阳性对照的β2gpi标准物获自haematologictechnologies公司。(hti；目录号b2gl-0001-c；1.0mg/ml)，处于0.2m甘氨酸、0.15mnacl，ph7.4的缓冲液中。将一小瓶β2gpi解冻，并如下进行标准和阳性对照制备：

在封闭缓冲液中制备1ml呈10μg/ml的β2gpi亚类a；

通过从亚类a中减去移液100μl，在封闭缓冲液中制备1ml的呈1,000ng/ml的β2gpi亚类b；

通过从亚类b中减去移液250μl，在封闭缓冲液中制备1ml的呈250ng/ml的β2gpi标准物；并且

使用减法移液，从1000ng/ml子储备液制备200ng/ml、75ng/ml、30ng/ml和5ng/ml的对照样品。

制备未知样品用于如下测试：在封闭缓冲液中制备未知样品，最终稀释度为1:4000和1:8000；首先制备1:100稀释度的未知样品；由1:100稀释液制备1:40稀释液，以达到1:4000的稀释度；由1:100稀释液制备1:80稀释液，以达到1:8000的稀释度。

如下进行的非结合板制备：将75μl缓冲液添加到行b-h的栏1-3；将150μl的250ng/ml标准物添加到栏1-3，行a；使用多通道移液器，将75μl栏1-3从行a连续稀释至行g；将75μl阳性对照和样品添加到指定孔中；并将75μl封闭缓冲液添加到任何空白孔中。板设置示于表6中。

表6

用于功能性β2gpi测定的板设置

7.检测

在完成阻断之前，在封闭缓冲液中制备6ml300ng/ml巴维昔单抗-hrp。将测定板用1×pbs通过将250μl移液到每个孔中来洗涤，所述步骤再重复2次。可以使用洗板器，在这种情况下，所述板用1×pbs洗涤一次。确保所述板尽可能干燥。

将50μl300ng/ml巴维昔单抗-hrp添加到测定板的所有孔中。从非结合板的每个相应孔中添加50μl。温育在37℃下进行90分钟。

8.显影

在使用前至少1小时从冰箱中取出tmb过氧化物酶底物和tmb过氧化物酶溶液b。将测定板用1×pbs通过将250μl移液到每个孔中来洗涤，所述步骤再重复2次。可以使用洗板器，在这种情况下，所述板用1×pbs洗涤一次。确保所述板尽可能干燥。

通过将6mltmb过氧化物酶底物与6mltmb溶液b混合来制备12mltmb混合物。将100μltmb溶液添加到测定板的每个孔中并使其显影5-6分钟。通过向测定板的每个孔中添加100μl2mh2so4来终止显影。读取测定板并在停止反应30分钟内测定450nm下的光密度(od)。微板读数仪与softmaxpro板数据和分析模板结合使用，其可提供测定数据的打印输出。

9.制备切口β2gpi

从人类血浆纯化的β2gpi和重组人类β2gpi的样品均用纤溶酶(酶水解)处理以制备含有大部分切口β2gpi的样品。对于初始研究，切口β2gpi未纯化至均质，但确定切口β2gpi过量存在于未切口的或“完整的”β2gpi上。

10.总β2gpi的测定

设计了一种检测，所述检测应根据制造商针对所用抗体的说明书检测总β2gpi。这是使用来自usbiological的市售抗体的测定，其中用针对β2gpi的捕获抗体涂布板，并且使用抗β2gpi-hrp缀合物作为检测抗体检测任何结合的β2gpi。抗体目录号是：捕获抗体，usbiologicala2299-81a号；亲和纯化的抗β2gpi和检测抗体，usbiological#a2299-81b；过氧化物酶缀合的抗β2gpi。

在ph9.6的碳酸盐缓冲液(50mm碳酸氢钠)中制备1:100稀释度的捕获抗体。将100μl添加到elisa板的每个孔中并在室温下培育。用含有tween-20的1×pbs缓冲液洗涤板，然后用200微升/孔含有1％bsa的测定稀释液封闭，并在37℃下培育。纯化的β2gpi用于制备在测定稀释剂中以500ng/ml开始的两倍稀释标准曲线。将样品稀释在测定稀释剂中以达到标准曲线的线性区域内的浓度。在封闭培育后，洗涤板，然后添加100微升/孔的标准曲线和样品，一式两份或一式三份。添加标准曲线和样品后，将板在37℃下培育。将检测抗体在测定稀释剂中以1:400稀释。在培育样品和标准曲线后，洗涤板，然后添加100微升/孔的检测抗体。将板在37℃下培育。在二抗培育后，洗涤板，然后用tmb显影。在板读数器上在450nm下读板，并根据标准曲线确定样品浓度。

b.结果

1.区分功能性与切口β2gpi

从人类血浆(“人类”)纯化的β2gpi或在重组表达后(“重组”)用纤溶酶处理以制备β2gpi测试样品，其含有大部分不与ps结合的纤溶酶裂解(切口)β2gpi。在本发明测定(表7b)中，并使用利用市售捕获和检测抗体的设计用于检测总β2gpi的测定(表7a)，测试那些样品与无纤溶酶(完整)β2gpi和各自的50:50混合物。结果如下所示。

表7a

在总β2gpi测定中测试切口和功能性β2gpi

表7b

在功能性β2gpi测定中测试切口和功能性β2gpi

首先可以看出，使用市售抗体的所谓“总β2gpi测定”(表7a)和本发明“功能性β2gpi测定”(表7b)均读出相似浓度的β2gpi(约141ng/ml和136ng/ml)。使用总β2gpi测定，检测纤溶酶处理的重组β2gpi中基本上没有差异，并且随着来自人类血浆的纤溶酶处理的β2gpi的量增加(141至104ng/ml)，检测中仅出现适度减少。相比之下，使用功能性β2gpi测定，增加量的纤溶酶处理的β2gpi(重组或血浆衍生)引起结合显著降低(136至33ng/ml)。

与测定的设计一致，这些结果因此表明，相对于切口β2gpi，本发明测定能够有效地检测功能性β2gpi，即结合ps和巴维昔单抗的β2gpi。这将本发明功能性β2gpi测定与商购检测试剂盒(以及使用商购的抗β2gpi抗体的测定)区分开来，其检测切口β2gpi(非ps结合)以及结合ps的β2gpi。

2.量化功能性β2gpi

所述测定能够成功地确定流体样品中功能性β2gpi的量，其是，结合ps和巴维昔单抗的β2gpi。目前已常规进行这一测定以制备可再现的β2gpi标准曲线。在这方面，使用四参数逻辑拟合，其是用于非线性回归分析的统计方程。四参数拟合方程为：

其中：

a是对应于x轴低值的渐近线(即曲线的平坦部分)的y值；

b是描述曲线从曲线中心的渐近线过渡的速度的系数，通常称为斜率因子；

c是对应于a和d之间的中点的x值；通常称为ec50；并且

d是对应于x轴的高值的渐近线的y值。

生成了功能性β2gpi的标准曲线，并且从这种标准曲线可以测定出人类血液样品(如血浆或血清样品)中功能性β2gpi的浓度。主要是出于准确性，但也出于样品制备的经济性，标准曲线以ng/ml(纳克/毫升)为单位制备。由于正常人群中β2gpi的平均水平为约200μg/ml(微克/毫升)(mehdi等人，1999；miyakis等人，2004)，因此制备标准曲线以期望测试样品将在测定中进行分析前稀释。在测定中运作稀释的血浆或血清测试样品，然后通过调节稀释因子计算患者中β2gpi的浓度。

这一测定现已用于测定来自上述iii期试验的患者的功能性β2gpi水平，其结果列于下文实施例xiii以及实施例xiv和实施例xvii中。

3.替代性等效测定组分和步骤

除了在本实例中章节a1-a8中描述的特定材料、设备和测定步骤之外，可以在不脱离用于检测和量化功能性β2gpi的测定的概念的情况下制备和实施组分和方法步骤的变化形式。以下结果表明，相关的试剂可以代替章节a1-a8中所述的试剂，并且获得基本上相同的结果。

某些优选的elisa板是针对脂质吸附而优化的那些，其可用于替换上文章节a1中的elisa板。已知针对脂质吸附优化elisa板，其具有提供更好脂质(ps)结合的表面化学。一种此类elisa板是赛默飞世尔(thermofisher)poly板，其已以新测定形式使用。

上述章节a4中的基于己烷的ps涂布方法可以优选用基于异丙醇的ps涂布方法代替，其可以为用户提供某些安全益处(通过避免使用己烷)。在使用异丙醇作为呈新测定形式的涂布缓冲液时，elisa板涂布有ps抗原，使用在异丙醇中稀释的10μg/ml抗原ps，并且培育时间是90分钟。

为了产生有效的β2gpi校准曲线，可以使用任何已知的获得β2gpi的方法。例如，从商业供应商处购买，如hti(以上章节a6)。还可以研发替代的β2gpi制剂用于限定的、可再现的校准控制。一种此类优选方法是在cho细胞中表达β2gpi并纯化所表达的β2gpi。

优选的从cho细胞中纯化β2gpi包括：收集澄清，染色质提取步骤，其去除污染物并使澄清的收集物通过0.2μm过滤器；使用切向流过滤(tff)系统，以缓冲交换澄清的收集物并降低其电导率而不增加体积；在阴离子流通模式中的captoadhere(gelifesciences)步骤，以去除其它污染物；使用nuvia^tms去除聚集体和其它污染物的强阳离子步骤，浓缩洗脱液并促进任何缓冲液交换步骤；并且任选地，使用tff系统缓冲交换并浓缩纯化的β2gpi。已经以这种方式表达和纯化β2gpi并以新测定形式使用。

除上述章节a3外，某些优选的巴维昔单抗-hrp检测剂是使用两种常用的非专有交联剂smcc(4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯)或sata(s-乙酰硫代乙酸n-琥珀酰亚胺酯)交联的缀合物。其它优选的巴维昔单抗-hrp检测剂是其中hrp的数量超过巴维昔单抗抗体的缀合物，特别是引起hrp:巴维昔单抗比率为2:1或3:1的那些，其基本上没有游离(未缀合的)抗体。通过s-300上浆柱纯化此类缀合物以除去未反应的反应组分。具有这些成分和特性中的每一种的巴维昔单抗-hrp检测剂已获自马里兰州弗雷德里克的温彻斯特大道4985(4985winchesterblvd.,frederick,maryland)，21703的columbiabiosciences，并以新测定形式以600ng/ml使用。

尽管上述替代组分和测定步骤中的一种或多种可能是优选的，但甚至所有此类替代物的组合使用会提供功能性β2gpi测定，其提供与本实例中最初描述，即根据章节a1-a8的测定基本相同的结果。这些比较结果显示在下表8中，其展现使用从圣地亚哥血库(sandiegobloodbank)获得的四个随机人类样品(供体)以两种不同测定形式测量的功能性β2gpi水平。

表8

功能性β2gpi分析的可比性能

实施例xiii

巴维昔单抗iii期试验中的β2gpi生物标志物分析

利用上述功能性β2gpi测定，本实施例报告在实施例x的iii期临床试验的患者的治疗前功能性β2gpi水平。根据功能性β2gpi的水平与治疗结果相关联，本实施例还涉及功能性β2gpi作为成功巴维昔单抗治疗，如用巴维昔单抗和多西他赛治疗的nsclc患者中的生物标志物。

a.患者的功能性β2gpi水平

上述iii期试验累计有597名患者。在实施例xi，a中描述了来自iii期试验中患者的血液样品的收集。在进行本分析时，有592个患者样品可评估功能性β2gpi。使用上面实施例中刚刚描述的测定测试那些592名患者血液样品的亚等分试样的功能性β2gpi。

表9展示了治疗前功能性β2gpi的水平(μg/ml)和统计学汇总，其中'巴维昔单抗'行是指用巴维昔单抗加多西他赛处理的患者，'安慰剂'行是指用单独多西他赛处理的患者。

表9

iii期患者中的功能性β2gpi水平

治疗前功能性β2gpi水平范围为0.5至402μg/ml。在用巴维昔单抗加多西他赛处理的患者中，功能性β2gpi的范围为22至365μg/ml。用单独多西他赛处理的患者中的功能性β2gpi的分布涵盖研究的全部范围(0.5至402μg/ml)。

对于每个治疗组(202和195μg/ml)，并且对于整个研究(198μg/ml)，治疗前功能性β2gpi的水平与文献(mehdi等人，1999，20mg/dl，miyakis等人，2004，200mg/l)中所报告的200μg/ml的平均水平一致。

据测定，对于用巴维昔单抗加多西他赛处理的患者，治疗前β2gpi水平等于或大于200μg/ml的患者百分比为56％，并且对于用单独多西他赛处理的患者，其为49％。

b.初始β2gpi生物标志物分析

进行亚组分析以评估作为接受巴维昔单抗加多西他赛疗法的患者的应答预测因子的功能性β2gpi，表明存在存活延长的趋势。

首先使用单一截止法评估患者β2gpi数据。在以这种方式搜索最佳截止值时，步骤1是针对巴维昔单抗加多西他赛组中的患者搜索高β2gpi对低β2gpi组的显著os分离；步骤2是针对那些高β2gpi患者搜索巴维昔单抗加多西他赛组与单独多西他赛组(安慰剂)的显著os分离。

通过施加单一截止法到578名可评估患者的作为可能的生物标志物的功能性β2gpi的初始分析出人意料地表明，在高β2gpi患者中，巴维昔单抗加多西他赛组中167名患者的mos是11.9个月(95％ci，9.0-14.7)，并且单独多西他赛组中141名患者的mos是9.4个月(95％ci，7.7-11.7)(死亡hr，0.77；p＝0.1)。在这些初步分析中，“高β2gpi”被定义为等于或高于200μg/ml(≥200μg/ml)的功能性β2gpi的治疗前水平。由于这些分析是基于单一截止值，因此不具有“高β2gpi”的患者具有小于200μg/ml(＜200μg/ml)的功能性β2gpi。

随后将单一截止值分析扩展至592名可评估患者。尽管并非统计学显著的，但这些分析也证明了当患者具有等于或大于200μg/ml功能性β2gpi的治疗前水平时，在巴维昔单抗加多西他赛组中有出人意料的存活延长趋势。这些结果通过图3中功能性β2gpi≥200μg/ml的kaplan-meier存活曲线表示。在592名可评估患者中，在功能性β2gpi的治疗前水平≥200μg/ml的患者中，巴维昔单抗加多西他赛组中167名患者的mos为11.9个月(95％ci，9.0-14.7)，并且单独多西他赛组中146名患者的mos为10.1个月(95％ci，8.5-11.7)(死亡hr，0.81；p＝0.155，ci(0.60，1.09))。

c.详细的β2gpi生物标志物分析

上述初步分析促进了对592名可评估患者的数据的进一步广泛分析。这些分析采用了两种截止方法(klein&moeschberger，2003)。在双截止法中，步骤1是针对用巴维昔单抗(加多西他赛)处理的患者，搜索“范围内”与“范围外”的显著os分离，并且步骤2是针对“范围内”患者搜索巴维昔单抗与安慰剂组的显著os分离。

这些详细的亚组分析在592名可评估的患者中使用两种截止方法产生了令人惊讶的发现，即治疗前的功能性β2gpi水平在200-240μg/ml范围内可预测用巴维昔单抗加多西他赛治疗的患者与单用多西他赛治疗的患者相比的总体存活率的益处。这些结果通过功能性β2gpi在200-240μg/ml范围的kaplan-meier存活曲线表示(图4)。

总结图4中的结果，在功能性β2gpi在200-240μg/ml范围内(“200,240”或“200<＝β2gpi<＝240”)的患者中，巴维昔单抗加多西他赛组的94名患者中mos为13.2个月(95％ci，9.0-17.9)，单独多西他赛组77名患者中为7.7个月(95％ci，6.6-12.1)(死亡的hr，0.67，ci(0.44,1.00)；对数秩p值＝0.049)。因此，与具有相同范围的β2gpi水平的对照组患者相比，治疗前β2gpi水平在200和240μg/ml之间的巴维昔单抗组患者(约占研究人群的30％)经历了mos的统计学显著性改善，为期5.5个月。

文献中并未表明等于或大于200μg/ml的功能性β2gpi的治疗前水平将指示巴维昔单抗处理有存活延长趋势，并且也未表明200-240μg/ml的功能性β2gpi治疗前水平可预测用巴维昔单抗处理的患者有总体存活期方面的益处。实际上，在使用巴维昔单抗的大部分先前临床经验中没有提出此类结果。此外，这些发现与来自广泛的临床前模型的数据极为不一致，这表明不同水平的血清β2gpi不会显著影响巴维昔单抗的处理结果。确切地说，临床前经验表明，相当较低水平的血清β2gpi，如大约10-20至50-60μg/ml，足以支持巴维昔单抗结合和活性(实施例i,e)。

特别地，使用不同的测定法，实施例i，e报道了β2gpi与抗体的摩尔比0.12至0.25；0.125,0.5至2；0.93；和1.43至2.86有效支持巴维昔单抗与ps的结合。考虑若干不同的结合和功能测试系统，包括临床前数据，其表明巴维昔单抗在约2.86的β2gpi与抗体摩尔比下是有效的，应不需要大于3的β2gpi与抗体摩尔比。在本发明iii期试验中使用3mg/kg剂量的巴维昔单抗时，在低于60μg/ml的β2gpi水平下实现此类比率(图5)。作为参考，iii期临床试验的β2gpi量、抗体和可比较的β2gpi-抗体比率示于表10中，其中n＝具有处于每一限定增量内的功能性β2gpi水平的患者人数(来自592名可评估患者)。

表10

iii期患者的β2gpi和抗体水平和比率

对表10与用于建模的数据(实施例i,e)进行比较，可以看出，iii期临床试验中的绝大大多数患者具有等同于远足以饱和单抗结合的β2gpi与抗体摩尔比(≥2.86)的功能性β2gpi水平，即以60μg/ml或1.2μm(表10；图5)开始，甚至当巴维昔单抗处于其在血液中的最大浓度时(c最大为56.4μg/ml；实施例ii；gerber等人，2011)。实际上，592名可评估患者中仅有4名(0.68％)具有小于60μg/ml的功能性β2gpi的治疗前水平。此外，随着功能性β2gpi水平增加(试验中大多数患者的情况如此)，β2gpi与巴维昔单抗的摩尔比远高于2或3，如在200μg/ml时超过10和在240μg/ml时超过12。在先前的临床前建模或临床经验中没有指出此类β2gpi水平或比率对于巴维昔单抗治疗是有益的。确切地说，如图5所示，临床前数据表明，以约10μg/ml或更低开始(β2gpi在5μg/ml时的β2gpi:ab摩尔比为0.257)，并且宜处于约60μg/ml的低水平的血清β2gpi足以支持巴维昔单抗结合和活性(实施例i,e)。

虽然出乎意料，但这些对功能性β2gpi的治疗前水平作为巴维昔单抗结果的可能的生物标志物的详细分析是非常令人鼓舞的。因此，测量患者中功能性β2gpi的治疗前浓度提供了预测对巴维昔单抗处理的应答，即选择叫可能，并且最可能受益于巴维昔单抗处理的患者的策略。这首先在使用巴维昔单抗和多西他赛时观察到，特别是在nsclc中。然而，由于巴维昔单抗在功能性β2gpi和ps复合物中的结合机制以及巴维昔单抗整体的免疫激活机制对于所有巴维昔单抗疗法都是常见的，因此基于等于或大于200μg/ml的治疗前β2gpi水平(例如治疗前β2gpi水平在200-240μg/ml的范围)选择患者可以包括在使用巴维昔单抗的所有未来试验和疗法中，以完全有理由期望这将提高治疗结果。实际上，在实施例xiv和实施例xvii中提供了支持这一点的进一步证据。

实施例xiv

其它巴维昔单抗临床试验中的β2gpi生物标志物分析

根据实施例xiii中鉴别功能性2gpi为成功的巴维昔单抗处理的生物标志物，本实例延伸将功能性β2gpi测定用于来自早期巴维昔单抗临床试验的样品。以下结果表明，相同水平的功能性β2gpi也与巴维昔单抗的成功处理结果相关，因此证实功能性β2gpi是巴维昔单抗的生物标志物。

a.实施例ix的ii期试验

使用实施例xii的功能性β2gpi测定测试来自实施例ix(pphm0902)的nsclcii期试验的样品。共有119个患者样品，其中可评估治疗前功能性β2gpi水平，其中40名患者处于巴维昔单抗3mg/kg组，79名患者处于组合对照组(安慰剂或1mg/kg巴维昔单抗)中。

所有患者的治疗前功能性β2gpi水平范围为0.5至266μg/ml。在用巴维昔单抗3mg/kg加多西他赛治疗的患者中，功能性β2gpi范围为0.5至266μg/ml。组合对照组中的患者的功能性β2gpi的分布为0.5到257.4μg/ml。对于每个处理组(对于巴维昔单抗3mg/kg，169.4μg/ml；且对于组合对照组，171.8μg/ml)以及整体研究(171.0μg/ml)，治疗前功能性β2gpi水平与文献中所报告的平均值一致。

使用定义为等于或高于200μg/ml(≥200μg/ml)的功能性β2gpi的治疗前水平的“高β2gpi”的截止值，据测定，β2gpi≥200μg/ml在巴维昔单抗3mg/kg组中具有总存活期增加趋势，而不是在另一个组。例如，对于用巴维昔单抗3mg/kg处理的患者，功能性β2gpi等于或高于200μg/ml的患者的mos为16.8月，而对于小于200μg/ml的“低β2gpi”，mos仅为9.4个月。此外，在功能性β2gpi≥200μg/ml的患者中，用巴维昔单抗3mg/kg处理的患者的16.8月的mos超过了组合对照组中患者的仅8.7月的mos。

b.实施例viii的ii期试验

使用实施例xii的功能性β2gpi测定来测试来自实施例viii(pphm1002)的ii期胰腺癌试验的样品。存在其中可以评估治疗前功能性β2gpi的水平的31个患者样品。所有患者的治疗前功能性β2gpi水平范围为82.5至343.2μg/ml。对于这些31名患者，治疗前功能性β2gpi的平均水平(219.2μg/ml)与文献中所报告的平均值一致。

虽然样品量小，并且疾病极具侵略性，但使用等于或高于200μg/ml(≥200μg/ml)的功能性β2gpi的“高β2gpi”的截止值，确定β2gpi≥200μg/ml对于巴维昔单抗具有总体存活期增加趋势。用功能性β2gpi等于或高于200μg/ml的巴维昔单抗处理的患者的mos为7.4月，而小于200μg/ml的“低β2gpi”的mos为5.3个月。

c.巴维昔单抗和太平洋紫杉醇/卡铂在nsclc中的ii期试验

在先前未处理的患有局部晚期或转移性非鳞状nsclc的患者中进行随机、开放标记的太平洋紫杉醇/卡铂(伴随或不伴随巴维昔单抗)的ii期试验(pphm1001)。使用实施例xii的功能性β2gpi测定来测试来自所述试验的样品。存在其中可以评估治疗前功能性β2gpi的水平的84个患者样品，其中44名患者处于巴维昔单抗组中，并且40名患者处于太平洋紫杉醇/卡铂组中。

所有患者的治疗前功能性β2gpi水平范围为0.5至326μg/ml。在用巴维昔单抗处理的患者中，功能性β2gpi范围为0.5至326μg/ml。患者在太平洋紫杉醇/卡铂组中的患者中的功能性β2gpi范围为88.8至292.7μg/ml。对于每个处理组(对于巴维昔单抗，187.9μg/ml，并且对于太平洋紫杉醇/卡铂组，186.4μg/ml)，以及整个研究(187.2μg/ml)的，预处理功能性β2gpi水平同样与文献中所报告的平均值一致。

使用呈等于或高于200μg/ml(≥200μg/ml)的功能性β2gpi的治疗前水平的“高β2gpi”的同一截止值，确定β2gpi≥200μg/ml同样在巴维昔单抗组中具有增加总存活期趋势，而不是在对照(太平洋紫杉醇/卡铂)组中。例如，对于使用巴维昔单抗处理的患者，功能性β2gpi等于或高于200μg/ml的患者的mos为17.0个月，而小于200μg/ml的“低β2gpi”的mos为14.2月。此外，在功能性β2gpi≥200μg/ml的患者中，用巴维昔单抗处理的患者的17.0个月的mos超过了对照组中的患者的仅13.2个月的mos。

总之，来自四个独立临床试验的实施例xiii和实施例xiv中的数据一致显示，功能性β2gpi水平与治疗结果相关，因此验证功能性β2gpi水平为成功的巴维昔单抗处理的生物标志物。

实施例xv

pd-l1表达作为巴维昔单抗的预后生物标志物

本实施例涉及实施例x的iii期试验的患者中治疗前pd-l1表达的分析。这些研究表明，与接受巴维昔单抗的患者的阳性pd-l1表达(表征为tc1/2/3)相比，阴性pd-l1表达(表征为tc0)与显著延长的os相关。

a.方法

在实施例x的iii期试验中要求但不必须在诊断时获得的存档组织。用一组淋巴(或肿瘤)细胞标记物的抗体染色福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)载玻片，如feng等人，2015中所述：cd3+、cd8+、foxp3+、pd-l1+、cd163+和ck+(细胞角蛋白，上皮细胞癌标志物)，使用多路复用(mutliplex)(6-plex)定量免疫组织化学(ihc)测定法(perkinelmer,waltham,ma,usa)并使用dapi。所使用的pd-l1抗体是称为的兔抗pd-l1抗体(cellsignalingtechnology,(cst),danvers,ma,目录#13684；mahoney等人，2015)。基线pd-l1表达在肿瘤细胞(tc，即ck+)上进行回顾性评分，表达pd-l1的肿瘤细胞根据其在肿瘤细胞总数中的百分比使用已建立的测定法和分类进行分类(fehrenbacher等人，2016)，如下：tc3≥50％；tc2≥5％且<50％；tc1≥1％且<5％；和tc0<1％。pd-l1ihc亚群的cox回归模型用于与os相关。

b.结果

在具有可用诊断活组织检查的患者子集中(597名随机患者中的110名)，tc3的pd-l1表达的患病率为5.45％；tc2/3为18.2％；tc1/2/3为34.5％；tc0为65.5％。巴维昔单抗加多西他赛组患者的mos对于阴性pd-l1表达者为11.5个月(tc0，<1％；“ck+<1％”)，而比较而言，较高pd-l1表达者仅为6.0个月(tc1/2/3，≥1％；“ck+>＝1％”)，hr为0.38(95％ci，0.19-0.76)；p值＝0.004(图8a)。在多西他赛单独组中的患者的mos对于阴性pd-l1为11.1个月(tc0，<1％；“ck+<1％”)和对于较高pd-l1为10.4个月(tc1/2/3，≥1％；“ck+>＝1％”)，hr为0.93(95％ci，0.47-1.87)；p值＝0.844(图8b)。

因此，来自iii期试验的患者亚组中的基线pd-l1表达证明了与接受巴维昔单抗加多西他赛的患者中阳性pd-l1表达(tc1/2/3)相比，阴性pd-l1表达(tc0)与显著延长的os相关。通过pd-l1表达，在多西他赛单独组中的患者中未观察到os的显著差异。图8a中曲线的明显分离(对于巴维昔单抗患者)与图8b(对照患者)中的超强曲线形成对比。这些观察结果也与巴维昔单抗一致，证明在pd-l1阴性、“免疫冷淡”肿瘤中具有更多作用。

实施例xvi

与随后的免疫疗法组合的巴维昔单抗的存活期益处

尽管与单独多西他赛组相比，实施例x的iii期试验的初始分析并未显示巴维昔单抗加多西他赛组的优越os，但正在进行的研究旨在鉴别巴维昔单抗处理具有治疗益处的其它可能性指标。本实例表明，相对于用单独多西他赛处理，随后进行免疫疗法的患者，用巴维昔单抗和多西他赛处理，随后进行免疫疗法(sact-io)的患者具有统计学显著更好的mos。

用巴维昔单抗和多西他赛或单独多西他赛治疗后，约15％的患者(597例中的91例)随后接受抗癌疗法(sact)，其呈后续免疫肿瘤学(io)疗法(sact-io或后续io)形式。这91名患者在处理组之间均匀平衡，其中45名患者先前接受巴维昔单抗和多西他赛处理，46名患者先前接受使用单独多西他赛的处理。

出人意料地，据测定，当用后续io处理时，相对于安慰剂，先前接受巴维昔单抗处理的患者的mos急剧增加(图6)。确切地说，对于随后接受io的患者，巴维昔单抗和多西他赛组(95％ci，15.2-na)的mos尚未达到，而对于单独多西他赛组，mos为12.6个月(95％ci，10.4-17.8)；hr＝0.46且p＝0.006(图6；表11)。对于随后未接受io的患者，mos在巴维昔单抗和多西他赛组中为9.2个月，并且在单独多西他赛组为10.2个月；hr＝1.16，p＝0.172。

表11

与随后的免疫疗法组合的巴维昔单抗的存活期益处

在后续io组中，还鉴别“第一后续io”的特定免疫治疗剂。在用巴维昔单抗(和多西他赛)和随后io处理的45名患者中，免疫治疗剂示于表12中，其均是呈与ctla-4、pd-1或pdl-1结合的封闭性抗体形式的检查点抑制剂抗体(免疫检查点抑制剂)。确切地说，所用封闭性抗体是曲美木单抗，一种与ctla-4结合的封闭性抗体；纳武单抗，一种与pd-1结合的封闭性抗体；和德瓦鲁单抗(medi4736)，一种与pd-l1结合的封闭性抗体。

表12

巴维昔单抗和后续免疫治疗剂

将注意到，四名患者接受了多于一种io剂，即其“第一后续io”疗法本身就是“io组合”，即第一和第二检查点抑制剂抗体。因此，在“itt”(意向治疗)分析中，存在接受第一后续io的用巴维昔单抗处理的45名患者，但表12中存在47种后续io剂。这是因为有两名患者接受了“io双重疗法”。总体而言，4名患者接受了超过一次的io，并且每名患者都接受了medi4736(德瓦鲁单抗)和曲美木单抗的双重疗法。在这四个个体中，两个处于巴维昔单抗组，两个处于安慰剂组。

在随后接受io治疗的91例患者中，使用单独多西他赛(安慰剂)处理的患者也接受了曲美木单抗、纳武单抗或德瓦鲁单抗(medi4736)。此外，安慰剂组中两名患者接受派姆单抗(先前mk-3475)并且安慰剂组中一名患者接受regn2810，其均为结合于pd-1的封闭性抗体。总体而言，安慰剂组中的第一后续io是：曲美木单抗(3)、纳武单抗(39)、德瓦鲁单抗(3)、派姆单抗(2)和regn2810(1)，在46名患者中总计有48种药剂，其中两名患者接受medi4736-曲美木单抗的io双重疗法。

总之，本实施例中的数据首次表明，巴维昔单抗增强了人类患者中免疫治疗剂的活性。因此，这些结果有力地支持了巴维昔单抗与免疫治疗剂，特别是免疫检查点抑制剂组合治疗癌症患者的持续和未来的治疗。

实施例xvii

巴维昔单抗和后续免疫疗法的β2gpi生物标志物分析

如在实施例xvi中所示，用巴维昔单抗(加多西他赛)和随后io处理的患者的mos要比用单独多西他赛和随后io处理的患者的mos显著更好。本实例进一步证明了使用功能性β2gpi作为巴维昔单抗生物标志物，显示出功能性β2gpi的相同水平也与成功的巴维昔单抗与免疫疗法组合的处理相关。

使用实施例xii的测定，显示200μg/ml或更高的功能性β2gpi水平与成功的巴维昔单抗处理相关，包括在iii期试验中(实施例xiii)。基于呈等于或高于200μg/ml(≥200μg/ml)的功能性β2gpi的治疗前水平的“高β2gpi”的同一截止值，再次确定β2gpi≥200μg/ml与用巴维昔单抗和随后io处理的患者的总存活期增加相关，但在接受后续io的对照患者中没有(图7a和7b)。

确切地说，对于功能性β2gpi等于或高于200μg/ml的患者，用巴维昔单抗和随后io处理的患者的mos尚未达到，而用多西他赛和随后io处理的患者的mos为12.3个月(10.2-17.6)(图7a；p＝0.002)。正如实施例xiii中的数据所预测，在没有随后io的患者中，与对照(9.2个月)相比，用巴维昔单抗(10.5个月)处理的患者中的β2gpi≥200μg/ml仍具有总存活期增加趋势，尽管曲线分离不如进行随后io的患者观察到的那样明显(图7a)。比较图7a与图7b，显示，与巴维昔单抗处理相反，当β2gpi小于200μg/ml时，对照组中的患者存在存活期延长趋势，对于伴随后续io(18.6vs.12.3个月)和没有后续io(11.6vs.9.2个月)的那些患者均如此。图7b中的数据的进一步详细分析受到β2gpi＜200μg/ml组中使用巴维昔单抗和后续io处理的患者数量(n＝12)相对较少的影响。

因此，这些临床数据显示，功能性β2gpi是用于巴维昔单抗与免疫疗法，特别是与免疫检查点抑制剂，如曲美木单抗、纳武单抗、派姆单抗、德瓦鲁单抗和阿特珠单抗组合的成功治疗的生物标志物。

实施例xviii

低干扰素-γ(ifnγ)作为巴维昔单抗的生物标志物

本实施例涉及来自实施例x的iii期试验的患者的血液和组织中的治疗前ifnγ的测量值以及ifnγ作为巴维昔单抗的潜在生物标志物的分析。用巴维昔单抗和多西他赛在利于低治疗前血清ifnγ处理的患者中观察到os的统计学显著分离，而在单独多西他赛(安慰剂)组中观察到os没有差异。

a.方法

在实施例x的ⅲ期试验中，治疗前的档案活检是可选的，主要收集用于多重ihc。如果可能的话，在其余的肿瘤标本的免疫基因表达(包括肿瘤内ifnγ)采用基于的基因表达平台(sironadx,lakeoswego,or,usa)进行分析。

在从iii期临床试验的所有随机nsclc患者中筛选时以及在治疗期间定期地和在疾病进展时分离血清。使用(quanterix)测定(myriadrbm,austin,tx,usa)评价血清样品中的ifnγ水平。来自597名随机患者中的582名患者的治疗前血清样本可用于与os相关。

使用kaplan-meier统计方法和cox比例风险模型来基于从2017年2月28日iii期试验(实施例x)切下的数据评价和对比外周(和肿瘤内)ifnγ水平与os的相关性。通过ifnγ分类的os还在具有或不具有随后的抗癌治疗情况下与免疫检查点抑制剂(sact-10)相关联，如在实施例xvi中描述。

b.结果

利用有限的肿瘤内ifnγ基因表达数据(n＝33)，统计相关性对于肿瘤ifnγ是不可能的。

对于血清ifnγ，中值治疗前血清ifnγ值在巴维昔单抗和多西他赛组被确定为0.093pg/ml。在任一组的每位患者被分类为治疗前血清“ifnγ高”(≥截止值)或“ifnγ低”(<截止值)，使用0.093pg/ml的中值ifnγ作为截止值。

在低ifnγ组中观察到用巴维昔单抗和多西他赛处理的患者的os的统计学显著提高，而单独多西他赛处理的患者没有观察到os差异。特别是在巴维昔单抗和多西他赛组，低ifnγ的mos为11.9个月，与ifnγ高的9.2个月对比；p＝0.046。相比之下，对于多西他赛单独组，低ifnγ的mos为11.1个月，与ifnγ高的10.6个月对比。

对于具有低治疗前ifnγ、接受后续io(实施例xvi)的患者，在巴维昔单抗和多西他赛组没有达到mos；在相应的单独多西他赛组mos为12.1个月；hr＝0.24且p<0.001。对于ifnγ低、没有接受后续io的患者，在巴维昔单抗和多西他赛组mos为10.5个月；在相应的单独多西他赛组mos为10.8个月；hr＝1.17且p＝0.328。对于具有高治疗前ifnγ、接受后续io的患者，在巴维昔单抗和多西他赛组mos为13.9个月；在相应的单独多西他赛组mos为13.5个月；hr＝1.0且p＝0.998。对于ifnγ高、没有接受后续io的患者，在巴维昔单抗和多西他赛组mos为9.0个月；在相应的单独多西他赛组mos为9.2个月；hr＝1.14且pp＝0.375。

概括地说，通过ifnγ和sact-io分类两种分析证实os统计学显著差异在具有低治疗前ifnγ、接受后续io的患者中有利于巴维昔单抗和多西他赛组(hr＝0.24，p<0.001)。对于高治疗前ifnγ，不管是否有随后io，在巴维昔单抗和安慰剂之间没有观察到os差异。

总体而言，这些临床数据支持机械观察，即巴维昔单抗调节免疫应答以增强免疫治疗剂的活性。连同实施例xvi中的数据，这些结果支持使用巴维昔单抗联合免疫治疗剂例如检查点抑制剂对癌症患者进行进一步临床治疗。

实施例xix

用巴维昔单抗联合cbt-501治疗癌症

如在实施例xvi所示，用巴维昔单抗和多西他赛、随后免疫疗法(sact-io)治疗患者相对于首先用安慰剂和多西他赛、接着随后免疫疗法治疗患者具有统计学显著更好的mos。本实施例涉及使用巴维昔单抗以增强在人体内io剂的活性，并且特别地涉及用巴维昔单抗联合cbt-501治疗癌症患者。

本实施例描述了cbt-501与巴维昔单抗在患有先前治疗的转移性非小细胞肺癌(nsclc)的患者中的开放标记ii期试验，其在全世界约10个中心(包括在美国)进行。它设计为约12个月累计(n＝42)或18个月累计(n＝64)，估计随访12个月。因此，入组的总样本量为42或64名患者。第1阶段招募了42名患者。在第2阶段期间，另外22名患者参加，总共64名患者。

测试产品、剂量和给药方式如下：巴维昔单抗以无菌、无防腐剂的溶液形式提供，其中为ph5.0的10mm乙酸盐和注射用水。根据临床方案，巴维昔单抗以每周至少3mg/kg体重的静脉内(iv)输注施用，或作为平剂量施用。cbt-501作为iv输注施用。

目的如下：主要目的，评估由客观应答率(orr)确定的抗肿瘤活性；并表征巴维昔单抗和cbt-501联合用药的安全性和耐受性；次要目的，评估临床受益应答率(cr+pr+sd持续≥16周)；评估总生存期(os)、无进展生存期(pfs)和应答持续时间(dor)；通过基线β2gp1水平和/或ifnγ和/或pd-l1表达来评估orr；探索性/相关性目的，评估用巴维昔单抗联合阿特珠单抗治疗的患者的免疫变化；并将肿瘤和免疫细胞上pd-l1表达水平与临床结果相关联。

研究设计是cbt-501加巴维昔单抗在既往治疗过的nsclc患者中的开放标记ii期临床试验。在治疗阶段，采用simon两阶段minmax设计来评估接受巴维昔单抗联合cbt-501的患者的客观应答率(orr)。在第1阶段，多达42名患者每周接受至少3mg/kg巴维昔单抗，或平剂量，与cbt-501联合使用，直至疾病进展或不可接受的毒性。观察到7个或更多应答，并且招募22个额外的患者并参加第2阶段。每位患者的治疗期始于c1d1。患者将继续研究治疗，直至疾病进展、由于毒性而停药、撤回同意或研究结束。研究设计的示意如下：

在治疗后随访阶段，停止所有研究治疗但未经历疾病进展或启动随后的抗癌治疗的患者继续根据研究计划进行肿瘤和相关评估，直至疾病进展或随后癌症治疗的开始。

在生存随访阶段，不再接受任何研究治疗并经历疾病进展或开始随后的抗癌治疗的患者进行生存随访。大约每3个月收集一次生存随访信息，直至死亡、失访、撤回同意或终止研究。

诊断和主要入选/排除标准是：

入选标准

1.在进行任何研究特定评估之前，能够理解并签署机构审查委员会/独立伦理委员会批准的知情同意书。

2.目标人群

a)签署知情同意书的当天至少18岁的男性或女性。

b)组织学记录的转移性非小细胞肺癌，基于铂的方案先前有进展(维持治疗如培美曲塞被认为是一线方案的一个组成部分)。具有已知egfr激活突变或alk易位的患者应在适当的靶向治疗(或不耐受适当的靶向治疗)后进展。

c)肿瘤组织(或档案组织)或基线研究活检必须可用于生物标志物评估。

3.根据recist1.1标准进行横断面成像的可测量疾病。如果已经在这样的病变中证实了进展，则靶肿瘤病变可以在先前照射的区域中。

4.东部肿瘤协作组(ecog)表现状态0或1。

5.实验室要求证明有足够的器官功能：

a)血液学：

绝对中性粒细胞计数[anc]≥1,000个细胞/μl

血小板≥100,000个细胞/μl

血红蛋白≥9g/dl

b)肾脏

血清肌酐≤1.5xuln-or-如果血清肌酐>1.5xuln，测量或计算的肌酐>60ml/min；肌酐清除率可以使用机构/实验室标准计算

c)肝脏

总胆红素≤1.5xuln-or-对于总胆红素>1.5xuln的患者，直接胆红素<uln

ast和alt≤2.5xuln；肝转移患者的alt和/或ast可≤5×uln

d)凝血[正在考虑]

inr或pt<1.5xuln，除非患者接受抗凝治疗，只要inr或pt不超过抗凝剂预期用途的推荐范围

aptt<1.5xuln，除非患者接受抗凝治疗，只要aptt不大于预期使用抗凝剂的推荐范围

6.生殖状况

a)女性患者必须在第1天1周内进行阴性血清人绒毛膜促性腺激素(hcg)试验(双侧卵巢切除术和/或子宫切除术患者或绝经后>1年的患者不需要进行妊娠试验)。

b)在期间和研究治疗的最后一个剂量后的5个月，有生殖潜力的所有患者(即，不手术不育或绝经后)必须同意使用非常有效的避孕方法，这有调查员来确定。

排除标准

1.研究第1天(c1d1)前2周内用另一种抗癌疗法或研究药物治疗2.先前的抗pd-1、抗pd-l1或抗pd-l2治疗[正在考虑]

3.持续性>与先前治疗相关的1级不良事件

例外：允许因先前治疗引起的2级神经病变和脱发

4.先前恶性肿瘤的病史除外：

有疗效地治疗的非黑色素瘤皮肤癌

先前实体瘤有疗效地治疗超过5年，没有复发迹象

研究者认为其他恶性肿瘤的历史不会影响研究治疗效果的确定

5.在研究第1天(c1d1)前4周内输注血液制品(包括血小板或红细胞)或给予集落刺激因子(包括g-csf、gm-csf或重组促红细胞生成素)

6.已知的活动性中枢神经系统(cns)转移和/或癌性脑膜炎

注意：先前治疗过的脑转移患者可以参与，前提是它们是稳定的(通过成像[使用相同的成像模式进行每次评估，mri或ct扫描]至少在第一剂研究治疗前4周没有进展的证据，和任何神经系统症状已恢复到基线状态)，没有新的或扩大脑转移的证据，并且在研究治疗前至少7天没有使用类固醇。该例外不包括癌症性脑膜炎，无论临床稳定性如何，都将其排除在外

7.在研究第1天前7天内诊断免疫缺陷或接受全身性类固醇治疗。已知的艾滋病病史；已知活动性乙型肝炎或丙型肝炎。

8.在过去2年内需要全身治疗的活动性自身免疫性疾病(即，使用疾病调节剂、皮质类固醇或免疫抑制药物)。替代疗法(例如，甲状腺素、胰岛素或肾上腺或垂体功能不全的生理性皮质类固醇替代疗法等)不被认为是全身治疗的一种形式。

使用局部皮质类固醇或含有皮质类固醇的滴眼液是可以接受的。

吸入类固醇排除在外。

在与赞助商协商后，可以批准使用生理剂量的皮质类固醇

9.需要全身治疗的活动性感染。

10.目前非感染性肺炎的证据。

11.间质性肺病的病史。

12.根据研究者的判断，任何其他合并疾病会使患者处于危险之中

13.孕妇或母乳喂养或期望在试验预计的持续时间内怀孕或生育孩子，包括最后一剂阿司唑仑单抗后90天和最后一剂巴维昔单抗后30天

14.研究第1天的30天内的活病毒疫苗接种；允许使用不含活病毒的季节性流感疫苗

15.对巴维昔单抗、阿特珠单抗或其任何赋形剂过敏的病史。

16.严重的不愈合伤口，包括二次伤口愈合。

17.c1d1前4周内的大手术。

18.使用巴维昔单抗的在先治疗。

评估标准如下：

安全性：

不良事件(aes)。

实验室测量：血液学(血小板和差异的全血细胞计数)，生物化学(包括肾脏、肝脏)，甲状腺功能测试和抗药物抗体(ada)。

其他安全性评估包括生命体征评估(心率、收缩压和舒张压)、ecog表现状态和体格检查。

功效：

orr：最佳总体应答为完全应答(cr)或部分应答(pr)的患者百分比。

dor：应答持续时间(dor)：从第一次cr或pr(以第一次记录为准)到第一次记录的肿瘤进展(按recist1.1)或因任何原因死亡的天数，以先发生者为准

pfs：从第一剂研究治疗到第一次记录的肿瘤进展(按recist1.1)或由于任何原因导致死亡的天数，以先发生者为准。

os：从第一剂研究药物到因任何原因死亡的天数。

探索性：

免疫相关，如ifnγ和pd-l1状态

血清β2-gp1水平

统计考虑因素：

样本量：

采用simon两阶段minmax设计，将招募42或64名患者，具体取决于研究是否进入第2阶段。

数据分析：

功效：

使用clopperpearson精确方法，将以95％置信区间(ci)报告orr。时间至事件端点，包括pfs、dor和os，将使用kaplan-meier产品限制方法进行汇总并以图形方式显示。

安全性：

将使用来自接受任何量研究治疗的所有患者(巴维昔单抗和/或阿特珠单抗)的数据进行安全性评估。ae评估将侧重于治疗紧急事件。整体安全性特

征将通过类型、频率、严重程度、发作时间、持续时间以及与任何ae的研究治疗或实验室测试异常的关系来表征。将进行任何导致停止研究治

疗的严重不良事件(sae)或ae的列举和描述。还将评估免疫原性。将为ae(包括那些被认为是严重的)、实验室结果和抗药物抗体(ada)数据提供表格。

探索性/相关性：

将评估免疫效应，包括pd-l1表达对临床结果的相关性。

实施例xx

如在实施例xvi所示，用巴维昔单抗和多西他赛、随后免疫疗法(sact-io)治疗患者相对于首先用安慰剂和多西他赛、接着随后免疫疗法治疗患者具有统计学显著更好的mos。本实施例涉及使用巴维昔单抗以增强在人体内io剂的活性，并且特别地涉及用巴维昔单抗联合抗pd-1或抗pd-l1抗体治疗癌症患者。

本实施例描述在已经对转移性非小细胞肺癌(nsclc)或转移性胃癌进行抗pd-1抗pd-l1疗法有进展的患者的巴维昔单抗与研究者选择的抗pd-1或抗pd-l1抗体的开放标记、二期试验。该试验在全球约10个中心进行，包括美国。试验的目标是，观察与抗pd-1或抗pd-l1单一治疗的历史结果相比，联合治疗的临床意义改善，并且观察是否存在其对组合疗法应答的生物标志物亚组相对于其他生物标志物亚组具有统计学显著性。

测试产品、剂量和给药方式如下：巴维昔单抗以无菌、无防腐剂的溶液形式提供，其中为ph5.0的10mm乙酸盐和注射用水。根据临床方案，巴维昔单抗以静脉内(iv)输注施用至少3mg/kg且不超过10mg/kg体重，或作为平剂量，每周或更少频率施用。根据其标记或通过组合剂量发现研究建立的方案施用抗pd-1或抗pd-l1疗法。

根据生物标志物状态对患者进行分层来进行试验。生物标志物包括但不限于基线β2gp1水平和/或ifnγ和/或pd-l1表达；评估患者的基线免疫状态。

实施例xxi

本实施例涉及使用巴维昔单抗以增强在人体内io剂的活性，并且特别地涉及用巴维昔单抗联合抗pd-1或抗pd-l1抗体治疗癌症患者。

本实施例描述了具有复发性/转移性鳞状细胞头颈癌(hnscc)、在pd-1抑制剂上进展的患者中巴维昔单抗与派姆单抗的开放标签、二期试验。该试验在美国进行。该试验的目的是确定巴维昔单抗是否可能与pd-1抑制剂疗法协同作用，以在pd-1抑制剂上进展的复发/转移性鳞状细胞头颈癌(hnscc)患者中产生有效的抗肿瘤免疫应答。

测试产品、剂量和给药方式如下：巴维昔单抗以无菌、无防腐剂的溶液形式提供，其中为ph5.0的10mm乙酸盐和注射用水。根据临床方案，巴维昔单抗以静脉内(iv)输注施用至少3mg/kg且不超过10mg/kg体重，或作为平剂量，每周或更少频率施用。派姆单抗根据其标签给药。

探索性相关性用于确定与治疗应答相关的生物标志物。在基线和第1、2、4周期和研究结束时收集血液用于pd分析。提交新鲜活检组织用于分析，并且如果可行，在治疗开始后4-6周期间获得重复肿瘤核心活组织检查。进行以下相关性研究：

·收集β2-gp1-血样以评估ps表达。

·治疗前后的pd-l1表达-在肿瘤组织上评估。

·自动化免疫组化染色包括：β2m、b7h3、b7h4、csf1r、hla-abc、hla-dr/dq/dp、hla-dr、ido1和tim3

·根据临床标准获得hpv状态。如果医疗记录中有此数据，则无需重复测试。

·对于选定的患者，考虑进行体细胞基因组分析。

·根据研究结果和材料可用性，在库存材料上考虑额外的免疫相关分析，包括用于评估免疫相关基因表达谱的基因表达谱。

实施例xxii

本实施例涉及使用巴维昔单抗以增强在人体内io剂的活性，并且特别地涉及用巴维昔单抗联合抗pd-1抗体治疗癌症患者。

本实施例描述了在晚期肝细胞癌(hcc)患者中巴维昔单抗与派姆单抗的开放标记、ii期试验。该试验在美国进行。该试验的目的是确定组合派姆单抗和巴维昔单抗在晚期hcc患者中的总体应答率(orr)。

测试产品、剂量和给药方式如下：巴维昔单抗以无菌、无防腐剂的溶液形式提供，其中为ph5.0的10mm乙酸盐和注射用水。根据临床方案，巴维昔单抗以静脉内(iv)输注施用至少3mg/kg且不超过10mg/kg体重，或作为平剂量，每周或更少频率施用。派姆单抗根据其标签给药。

在这项研究中，所有患者可能在基线(用于临床护理)和开始研究药物后5-6周之间进行多达两次图像引导(ct或超声)的核心穿刺活检单个hcc部位(仅限研究)。治疗前活组织检查用于评估持久应答的潜在标志物。这包括通过免疫组织化学分析肿瘤内的肿瘤浸润淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。此外，在基线时分析pd-l1表达并分析相关的结果测量。同时，如果有足够的材料，则使用rna分析来描绘肿瘤组织的基线特征，包括局部肿瘤微环境。分析来自rna分析的肿瘤的分子特征与orr和疾病的其他临床特征的关联，以探索应答的标志物。治疗后活组织检查用于确定派姆单抗和巴维昔单抗对肿瘤标志物的影响和用于rna分析。将临床结果与应答标志物相关。在基线时收集血浆、血清和全血样品，并在治疗时每9-12周收集一次。血液样本用于测量循环肿瘤dna或肿瘤负荷的其他特征，并与疾病应答相关。

***

根据本公开内容，无需过度实验即可制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和方法。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于所属领域技术人员显而易见的是，组合物和方法以及本文中所述方法的步骤或步骤的顺序可以改变，且不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时可以获得相同或相似的结果。对于所属领域技术人员显而易见的是，所有这些类似的替代和修改均视为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

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序列表

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151015

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202530

<210>30

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>/注="人工序列的描述:合成的

肽"

<400>30

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1510

<210>31

<211>333

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<213>人工序列

<220>

<221>来源

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多核苷酸"

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多肽"

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151015

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多核苷酸"

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多肽"

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<213>人工序列

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多肽"

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