提高微细藻类对于硝酸的底物类似物的耐性的方法与流程

本发明涉及一种提高微细藻类对于硝酸的底物类似物的耐性的方法、具有对硝酸的底物类似物的耐性的微细藻类的转化体、及具有对硝酸的底物类似物的耐性的转化体的制作方法。
背景技术：
：一般而言，为了生产生物燃料或有用物质而进行的微生物的培养以作为目的的微生物的纯粹培养为前提。因此，为了防止作为目的的微生物以外的微生物的污染，通常对培养基或培养设备实施灭菌处理或杀菌处理。但是，培养规模越大，培养基等灭菌处理或杀菌处理所花费的能量或设备费越多。进而，即使使用实施有灭菌处理、杀菌处理的培养基，对于在处理后产生的污染，抑制目的外的微生物的增殖是困难的。特别是使用开放型的露天池塘等在户外将微生物(特别是微细藻类)进行培养的情况下，产生污染的风险升高。由此认为，抑制目的外的微生物的增殖、可以在长时间内选择性地进行培养目的微生物的微生物株或微生物的培养方法的开发重要。作为防止微生物的污染的方法，可以使用利用基因重组技术导入有抗生物质耐性基因等外来基因标记物的微生物。但是，导入外来基因而制作的株属于基因重组体，作为在自然环境下外来基因扩散的风险，根据卡塔赫纳法等要求，其使用受到限制。例如，担心在导入到微生物的细胞内的外来基因会通过水平传播等向其它生物种扩散的可能性。因此，将不利用外来基因而改变内在性的基因，将利用了由此获得的性质的目的微生物选择性地进行培养的技术备受关注。作为内在性的基因，存在编码硝酸还原酶(nitratereductase、以下也称为“nr”)的基因(以下，也称为“nr基因”)(参照非专利文献1)。nr为氮代谢酶的1种，如图1所示，催化将硝酸离子(no3－)还原而生成亚硝酸离子(no2－)的反应。另外，该nr也可以催化将作为硝酸离子的底物类似物的氯酸离子(clo3－)还原并生成亚氯酸离子(clo2－)的反应。一般而言，已知亚氯酸离子会显示细胞毒性，以及，抑制nr基因的表达而在氯酸的存在下也可以生长。由此，期待通过nr基因的抑制而提高氯酸耐性、利用该氯酸耐性可以进行选择性的培养目的微生物。另外，作为与氮同化关联的蛋白质，存在硝酸盐转运蛋白(nitratetransporter，以下也称为“nrt”)。nrt为在生物中的氮同化(硝酸同化)的最初的阶段从外界向细胞内部输送硝酸离子的蛋白质。因此，已知在莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)中，通过抑制编码nrt的基因(以下，也简称为“nrt基因”)的表达，可以赋予氯酸耐性(参照非专利文献2)。近年来，作为在生物燃料生产中是有用的藻类，微细藻类备受关注。特别是属于拟微绿球藻(nannochloropsis)属的藻类等、真眼点藻纲的微细藻类能够通过光合作用生产可作为生物柴油燃料利用的油脂，而且不与食物竞争，因此，作为新一代的生物质资源备受关注。因此，作为使用开放型的露天池塘等将这些微细藻类在户外进行培养时的污染对策，期待不使用外来的基因而利用内在性的基因、以某种药剂耐性为指标的目的藻类的选择性的培养方法的开发。但是，迄今为止，没有对利用真眼点藻纲的内在性基因赋予某种药剂耐性的报道。现有技术文献非专利文献非专利文献1:proceedingsofthenationalacademyofsciences,2011,vol.108(52),p.21265－21269非专利文献2:mol.cell.biology.,1995,vol.15(10),p.5762－5769技术实现要素：本发明涉及一种使微细藻类的基因组上的编码下述蛋白质(a)或(b)的基因缺失或抑制编码下述蛋白质(a)或(b)的基因的表达、提高微细藻类对于硝酸的底物类似物的耐性的方法。另外，本发明涉及一种微细藻类的基因组上的编码下述蛋白质(a)或(b)的基因、以及编码下述蛋白质(c)或(d)的基因缺失或抑制表达、提高微细藻类对于硝酸的底物类似物的耐性的方法。(a)由序列号41表示的氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由与上述蛋白质(a)的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列构成、且具有硝酸盐转运活性(以下，也简称为“nrt活性”)的蛋白质。(c)由序列号42表示的氨基酸序列构成的蛋白质。(d)由与上述蛋白质(c)的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列构成、且具有硝酸还原酶活性(以下，也简称为也称为“nr活性”)的蛋白质。另外，本发明涉及一种微细藻类的转化体，其具有对硝酸的底物类似物的耐性，其中，基因组上的编码上述蛋白质(a)或(b)的基因缺失，或抑制编码上述蛋白质(a)或(b)的基因的表达。另外，本发明涉及一种微细藻类的转化体，其具有对硝酸的底物类似物的耐性，其中，基因组上的编码上述蛋白质(a)或(b)的基因、以及编码上述蛋白质(c)或(d)的基因缺失或表达被抑制。另外，本发明涉及一种转化体的制作方法，其具有对硝酸的底物类似物的耐性，其中，使微细藻类的基因组上的编码上述蛋白质(a)或(b)的基因缺失，或抑制编码上述蛋白质(a)或(b)的基因的表达，将对硝酸的底物类似物的耐性作为指标而取得转化体。进而，本发明涉及一种转化体的制作方法，其具有对硝酸的底物类似物的耐性，其中，使微细藻类的基因组上的编码上述蛋白质(a)或(b)的基因、以及编码上述蛋白质(c)或(d)基因缺失或抑制表达，将对硝酸的底物类似物的耐性作为指标而取得转化体。本发明的上述及其它特征及优点参照适当添加的附图，由下述的记载进一步明确。附图说明图1是示意性地表示微细藻类中的nr和nrt协作而进行的硝酸离子和其底物类似物(氯酸离子)的代谢路径的图。图2是示意性地表示眼点拟微绿球藻(nannochloropsisoculata)的野生株中的nrt基因及nr基因周边的基因组序列的图。图3(a)是实施例1中制作的nrt基因同源重组质粒的示意图。图3(b)是实施例1中制作的nr基因同源重组质粒的示意图。图3(c)是实施例1中制作的nrt－nr基因同源重组质粒的示意图。图4(a)是示意性地表示使用有nr基因同源重组盒的nr基因破坏株的制作方法的图。图4(b)是对眼点拟微绿球藻的野生株和nr基因破坏株将为了确认同源重组盒的导入而扩增的dna片段的尺寸进行比较的示意图。图4(c)是通过pcr而扩增的基因组片段的电泳照片(用照片替代附图)。图5(a)是示意性地表示使用有nrt基因同源重组盒的nrt基因破坏株的制作方法的图。图5(b)是对眼点拟微绿球藻的野生株和nrt基因破坏株将为了确认同源重组盒的导入而扩增的dna片段的尺寸进行比较的示意图。图5(c)是通过pcr而扩增的基因组片段的电泳照片(用照片替代附图)。图6(a)是示意性地表示使用有nrt－nr基因同源重组盒的nrt－nr基因破坏株的制作方法的图。图6(b)是对眼点拟微绿球藻的野生株和nrt－nr基因破坏株将为了确认同源重组盒的导入而扩增的dna片段的尺寸进行比较的示意图。图6(c)是通过pcr而扩增的基因组片段的电泳照片(用照片替代附图)。图7是将实施例1中制作的各种转化体在琼脂培养基上进行了培养的替代附图的照片。图8(a)是实施例2中制作的nrt－nr基因同源重组质粒的示意图。图8(b)是示意性地表示使用有nrt基因及nr基因同源重组盒的nrt基因及nr基因破坏株的制作方法的图。图8(c)是对眼点拟微绿球藻的野生株和nrt基因及nr基因破坏株将为了确认同源重组盒的导入而扩增的dna片段的尺寸进行比较的示意图。图8(d)是通过pcr而扩增的基因组片段的电泳照片(用照片替代附图)。具体实施方式如上所述，关于制作在真眼点藻纲的微细藻类中不利用外来基因而改变内在性的基因、对某种药剂提高了耐性的微细藻类的方法，并没有报告。因此，本发明涉及提供一种通过改变内在性基因、不利用外来的药剂基因标记物、可以经长期间进行选择性的纯粹培养的藻类。本发明人等鉴于上述课题，进行了深入研究。本发明人等首先以非专利文献1中记载的现有的见解为基础，取得破坏真眼点藻纲的拟微绿球藻的nr基因并抑制该基因的表达的株，确认了对作为硝酸的底物类似物的氯酸的耐性。但是，没有发现通常所报道的氯酸耐性的提高。进而，以非专利文献2中记载的莱茵衣藻的见解为参考，尝试了nrt基因的表达的抑制。但是，拟微绿球藻的nrt基因至今没有被确定。因此，本发明人等将拟微绿球藻的nrt基因重新确定，破坏确定的nrt基因，测定得到的转化体的氯酸耐性。其结果，与仅破坏了nr基因的情况相比，氯酸耐性提高。进而，制作破坏了nrt基因和nr基因的转化体，测定氯酸耐性。其结果也发现：通过nrt和nr的活性均被抑制而氯酸耐性飞跃性地提高。而且发现：通过在氯酸等硝酸的底物类似物的存在下进行培养而抑制目的外的微生物的增殖，可以选择性地培养上述转化体。基于这些见解，直至完成本发明。根据提高对本发明的微细藻类中的硝酸的底物类似物的耐性的方法，可以提高微细藻类中的硝酸的底物类似物耐性，达到不导入外来基因而可以进行长期的选择性的纯粹培养的程度。另外，本发明的转化体其对硝酸的底物类似物的耐性优异，即使在选择压条件下(硝酸的底物类似物条件下)，也可以长期培养。进而，本发明的转化体的制作方法不导入外来基因，以对硝酸的底物类似物的耐性为指标，即使在选择压条件下(硝酸的底物类似物条件下)，也可以制作能够长期培养的转化体。本说明书中，碱基序列及氨基酸序列的同一性利用lipman－pearson法(science，1985，vol.227，p.1435－1441)来计算。具体而言，使用遗传信息处理软件genetyx－win的同一性分析(searchhomology)程序，通过将unitsizetocompare(ktup)设为2进行分析而算出。另外，本说明书中作为“严格的条件”，可举出例如molecularcloning－alaboratorymanualthirdedition[josephsambrook,davidw.russell.,coldspringharborlaboratorypress]记载的方法。可举出例如在含有6×ssc(1×ssc的组成：0.15m氯化钠、0.015m柠檬酸钠、ph7.0)、0.5％sds、5×denhart’s及100mg/ml鲱鱼精子dna的溶液中与探针一起在65℃下恒温8～16小时并进行杂交的条件。进而，在说明书中，基因的“上游”表示不是来自翻译起始点的位置、而是作为对象捕捉的基因或区域的5'末端侧的部位或与其连接的区域。另一方面，基因的“下游”表示作为对象捕捉的基因或区域的3'末端侧的部位或与其连接的区域。另外，本说明书中，将对宿主进行所期望的基因的改变而得到的微细藻类称为“转化体”。在本发明的第1实施方式中，使特定的微细藻类的基因组上的nrt基因缺失。或者，抑制特定的微细藻类的基因组中所编码的nrt基因的表达。通过在特定的微细藻类中后述的nrt基因的缺失或抑制该基因的表达，提高对微细藻类的生长性给予影响的硝酸的底物类似物的耐性、优选氯酸的耐性。本发明的转化体也可以以对提高的硝酸的底物类似物的耐性(优选氯酸耐性)为指标进行选抜。进而，如上所述，通过氮代谢而将氯酸离子还原而生成的亚氯酸离子对通常的微生物显示高的毒性。与此相对，本发明的转化体对氯酸具有高的耐性。因此，在含有氯酸的培养基上将本发明的转化体进行培养的情况下，可以防止目的外的微生物的污染。特别是即使将本发明的转化体在各种微生物或它们的营养源混入的可能性高的户外进行培养，也可以对培养中的污染充分地适当处置。予以说明，本说明书中“nrt基因”除由编码nrt的区域的碱基序列构成的dna之外，也包含由调节nrt的表达的区域的碱基序列构成的dna、或由编码nrt的区域和调节nrt的表达的区域的碱基序列构成的dna。本发明中的nrt是指上述蛋白质(a)或(b)。序列号41表示的氨基酸序列为源自眼点拟微绿球藻nies－2145株的nrt(以下，也称为“nonrt”)。予以说明，对莱茵衣藻(非专利文献2中记载)的nrt的氨基酸序列的序列号41表示的氨基酸序列的同一性约为38％。上述蛋白质(a)及(b)均具有nrt活性。本说明书中“nrt活性”意指从外界向细胞内部输送硝酸离子或氯酸离子的输送能力。蛋白质具有nrt活性可以通过如下方法来确认，例如，将在宿主细胞内起作用的启动子的下游连结有编码上述蛋白质的基因的dna导入于硝酸离子的输送体缺损的宿主细胞，在导入的基因表达的条件下将细胞进行培养，将硝酸作为氮源分析是否可以生长。蛋白质(b)由与上述蛋白质(a)的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列构成，且具有nrt活性。一般而言，已知有编码蛋白质的氨基酸序列不一定是如果不保存全区域的序列、则不显示作为蛋白质的功能的氨基酸序列，也存在即使氨基酸序列发生变化、也不会对功能给予影响的区域。在这样的功能不是必须的区域中，即使导入氨基酸的缺失、置换、插入或附加的变异，也可以维持蛋白质本来的活性。在本发明中，也可以使用这样保持nrt活性、且氨基酸序列一部分发生了变异的蛋白质。在上述蛋白质(b)中，从nrt活性的方面考虑，与上述蛋白质(a)的氨基酸序列的同一性优选为75％以上，更优选80％以上，更优选85％以上，更优选90％以上，更优选92％以上，更优选95％以上，更优选98％以上，进一步优选99％以上。另外，作为上述蛋白质(b)，可举出在上述蛋白质(a)的氨基酸序列中缺失、置换、插入或附加有1个或多个(例如1个以上141个以下、优选1个以上117个以下、更优选1个以上94个以下、更优选1个以上71个以下、更优选1个以上47个以下、更优选1个以上38个以下、更优选1个以上24个以下、更优选1个以上10个以下、更优选1个以上5个以下)的氨基酸的蛋白质。作为编码上述蛋白质(a)或(b)的基因，可举出由下述dna(a)或(b)构成的基因。(a)由序列号39表示的碱基序列构成的dna。(b)由与上述dna(a)的碱基序列的同一性为55％以上的碱基序列构成、且编码具有nrt活性的蛋白质的dna。序列号39的碱基序列为编码nonrt的基因的碱基序列。在上述dna(b)中，从nrt活性方面考虑，与上述dna(a)的碱基序列的同一性更优选为60％以上，优选65％以上，更优选70％以上，更优选75％以上，更优选80％以上，更优选85％以上，更优选90％以上，更优选92％以上，更优选95％以上，更优选98％以上，进一步优选99％以上。另外，作为上述dna(b)，也优选在上述dna(a)的碱基序列中缺失、置换、插入、或附加有1个或多个(例如1个以上634个以下、优选1个以上563个以下、更优选1个以上493个以下、更优选1个以上423个以下、优选1个以上352个以下、更优选1个以上282个以下、更优选1个以上212个以下、更优选1个以上141个以下、更优选1个以上113个以下、更优选1个以上71个以下、更优选1个以上29个以下、更优选1个以上15个以下)的碱、且编码具有nrt活性的上述蛋白质(a)或(b)的dna。进而，作为上述dna(b)，也优选为与上述dna(a)互补的碱基序列构成的dna在严格的条件下进行杂交、且编码具有nrt活性的上述蛋白质(a)或(b)的dna。nrt基因可以通过通常的基因工程的方法而得到。例如，可以基于序列号41所示的氨基酸序列或序列号39所示的碱基序列，人工地合成nrt基因。nrt基因的合成例如可以利用invitrogen公司等服务。另外，也可以由眼点拟微绿球藻通过克隆而取得。例如，可以通过molecularcloning－alaboratorymanualthirdedition[josephsambrook,davidw.russell,coldspringharborlaboratorypress(2001)]记载的方法等而进行。另外，实施例中使用的眼点拟微绿球藻nies－2145可以从国立环境研究所(nies)获得。本发明的第2实施方式除前述的nrt基因之外，也使nr基因缺失或抑制其表达。通过这些基因缺失或抑制表达，对硝酸的底物类似物的耐性进一步提高。因此，即使在以更高的浓度含有硝酸的底物类似物、优选氯酸的条件下，得到的转化体也可以生长。因此，本发明的转化体可以以对提高的硝酸的底物类似物的耐性(优选氯酸耐性)为指标选抜。在此，本说明书中的“nr”为将硝酸离子进行还原而产生亚硝酸离子的酶。另外，作为硝酸离子的底物类似物将氯酸离子进行还原，也进行亚氯酸离子的生成。予以说明，本说明书中“nr基因”除由编码nr的区域的碱基序列构成的dna之外，也包含由调节nr的表达的区域的碱基序列构成的dna、或由编码nr的区域和调节nr的表达的区域的碱基序列构成的dna。予以说明，本说明书中，nrt基因及nr基因“缺失或抑制表达”意指下述(i)、(ii)、(iii)或(iv)所示的基因操作。(i)分别缺失nrt基因及nr基因。(ii)分别抑制nrt基因及nr基因的表达。(iii)缺失nrt基因，抑制nr基因的表达。(iv抑制nrt基因的表达，缺失nr基因。本说明书中的nr是指上述蛋白质(c)或(d)。由序列号42的氨基酸序列构成的蛋白质为源自作为属于拟微绿球藻属的微细藻类的眼点拟微绿球藻nies－2145株的nr(以下，也称为“nonr”)。上述蛋白质(c)及(d)均具有nr活性。本说明书中“nr活性”意指催化将硝酸离子进行还原而生成亚硝酸离子的反应的活性、或催化将氯酸离子进行还原而生成亚氯酸离子的反应的活性。蛋白质(d)由与上述蛋白质(c)的氨基酸序列的同一性为70％以上的氨基酸序列构成，且具有nr活性。一般而言，已知有编码酶蛋白质的氨基酸序列不一定是如果不保存全区域的序列、则不显示酶活性的氨基酸序列，也存在即使氨基酸序列发生变化、也不会对酶活性给予影响的区域。在这样的酶活性不是必须的区域中，即使导入氨基酸的缺失、置换、插入或附加这样的变异，也可以维持酶本来的活性。在本发明中，也可以使用这样保持nr活性、且氨基酸序列一部分发生了变异的蛋白质。在上述蛋白质(d)中，从nr活性的方面考虑，与上述蛋白质(c)的氨基酸序列的同一性优选为75％以上，更优选80％以上，更优选85％以上，更优选90％以上，更优选92％以上，更优选95％以上，更优选98％以上，进一步优选99％以上。另外，作为上述蛋白质(d)，可举出在上述蛋白质(c)的氨基酸序列中缺失、置换、插入或附加有1个或多个(例如1个以上255个以下、优选1个以上212个以下、更优选1个以上170个以下、更优选1个以上128个以下、更优选1个以上85个以下、更优选1个以上68个以下、更优选1个以上43个以下、更优选1个以上17个以下、更优选1个以上9个以下)的氨基酸的蛋白质。予以说明，眼点拟微绿球藻等藻类可以由私有的或公有的研究所等保存机关获得。例如，眼点拟微绿球藻nies－2145株可以由国立环境研究所(nies)获得。作为编码上述nr、优选蛋白质(c)或(d)的基因，可举出由下述dna(c)或(d)构成的基因。(c)由序列号40表示的碱基序列构成的dna。(d)由与上述dna(c)的碱基序列的同一性为70％以上的碱基序列构成、且编码具有nr活性的蛋白质的dna。序列号40的碱基序列为编码nonr的基因的碱基序列。在上述dna(d)中，从nr活性方面考虑，与上述dna(c)的碱基序列的同一性优选为75％以上，更优选80％以上，更优选85％以上，更优选90％以上，更优选92％以上，更优选95％以上，更优选98％以上，进一步优选99％以上。另外，作为上述dna(d)，也优选在序列号40表示的碱基序列中缺失、置换、插入、或附加1个或多个(例如1个以上764个以下、优选1个以上636个以下、更优选1个以上509个以下、优选1个以上382个以下、更优选1个以上255个以下、更优选1个以上204个以下、更优选1个以上128个以下、更优选1个以上51个以下、更优选1个以上26个以下)的碱、且编码具有nr活性的上述蛋白质(c)或(d)的dna。进而。作为上述dna(d)，也优选与上述dna(c)互补的碱基序列构成的dna在严格的条件下进行杂交、且编码具有nr活性的上述蛋白质(c)或(d)的dna。nr基因可以通过通常的基因工程的方法而得到。例如，可以基于序列号42所示的氨基酸序列或序列号40所示的碱基序列人工地合成nr基因。nr基因的合成例如可以利用invitrogen公司等服务。另外，也可以由眼点拟微绿球藻通过克隆而取得。例如，可以通过molecularcloning－alaboratorymanualthirdedition[josephsambrook,davidw.russell,coldspringharborlaboratorypress(2001)]记载的方法等而进行。另外，实施例中使用的眼点拟微绿球藻nies－2145可以由国立环境研究所(nies)获得。在本发明中，作为基因组上的nrt基因或nr基因的缺失或抑制表达的方法，没有特别限制，可以从常规方法中适当选择。nrt基因或nr基因缺失或抑制它们的表达可以通过以常规方法测定转化体的基因组序列的分析、或nrt活性、nr活性而确认。例如，通过破坏基因组上的nrt基因或nr基因，可以使nrt基因或nr基因缺失。具体而言，可以将含有nrt基因或nr基因的一部分的适当的dna片段取入于微细藻类的细胞内，通过nrt基因或nr基因的一部分区域中的同源重组而将基因组上的nrt基因或nr基因的全部或一部分用其它任意的dna片段(例如任意的选择标记物)置换，或插入任意的dna片段(例如任意的选择标记物)而将nrt基因或nr基因切断，使nrt基因或nr基因缺失。另外，作为随机的基因的表达的抑制方法，可举出：使用n－甲基－n’－硝基－n－亚硝基胍等变异诱发剂的方法、通过照射紫外线或γ射线等诱发nrt基因或nr基因的突变的方法、在nrt基因或nr基因中(例如活性部位、基质结合部位、以及转录或翻译起始区域)诱发部位特异的点突变(例如移码突变、整码突变、终止密码子的插入等)的方法、反义法、rna干涉法、启动子竞争等。在本发明中，优选破坏基因组上的nrt基因或nr基因，使这些基因缺失。用于nrt基因或nr基因的破坏的同源重组dna盒的尺寸可以考虑对微细藻类的导入效率、或同源重组效率、上述各种基因的尺寸等而适当设定。例如，优选为400bp以上，更优选500bp以上。另外，其上限值优选为2.0kbp，更优选2.5kbp。另外，通过同源重组而缺损的基因组的长度优选为15kbp以下，更优选10kbp以下。进而，导入的各种基因的长度优选为10kbp以下，更优选8kbp以下。将上述同源重组dna盒导入于微细藻类的转化方法可以根据微细藻类的种类、从常规方法中适当选择。可举出例如：使用钙离子的转化方法、一般的感受态细胞转化方法、原生质体转化法、电穿孔法、lp转化方法、使用有土壤杆菌的方法、粒子枪法等。另外，在本发明中，也可以使用naturecommunications,doi:10.1038/ncomms1688,2012等中记载的电穿孔法进行转化。就本发明中使用的微细藻类而言，从已确立了基因改变技术的观点出发，优选为真眼点藻纲的微细藻类，更优选真眼藻目(eustigmatales)的微细藻类，更优选拟微绿球藻属的微细藻类。作为拟微绿球藻属的微细藻类的具体例，可举出：眼点拟微绿球藻、海洋拟微绿球藻(nannochloropsisoceanica)、海洋富油拟微绿球藻(nannochloropsisgaditana)、盐生拟微绿球藻(nannochloropsissalina)、极微拟微绿球藻(nannochloropsisatomus)、斑拟微绿球藻(nannochloropsismaculata)、颗粒拟微绿球藻(nannochloropsisgranulata)、拟微绿球藻(nannochloropsissp.)等。其中，优选眼点拟微绿球藻、海洋拟微绿球藻或眼点拟微绿球藻、海洋富油拟微绿球藻，更优选眼点拟微绿球藻。nrt基因或nr基因缺失或抑制它们的表达的转化体的选择通过常规方法而进行，优选将对硝酸的底物类似物的耐性作为指标而进行，更优选将氯酸耐性作为指标而进行。具体而言，根据宿主的种类，适当选择培养基中所含的硝酸的底物类似物(优选氯酸)或其盐的浓度和转化体的培养时长，将在硝酸的底物类似物(优选氯酸)的存在下进行培养时可以生长的株作为获得了硝酸的底物类似物(优选氯酸)耐性的转化体选抜。培养基中所含的氯酸或其盐的浓度优选为3mm以上，更优选5mm以上。另外，培养时长优选为1周以上，更优选2周以上，优选8周以下。在nrt基因或nr基因缺失或抑制它们的表达的转化体中，有时硝酸同化性降低。该情况下，优选在含有尿素、氨、亚硝酸等作为氮源的培养基中培养转化体。培养基中所含的上述氮源的浓度可以适当设定。具体而言，上述氮源的浓度以氮原子等量计优选为1mg/l以上，更优选5mg/l以上，更优选10mg/l以上。另外，其上限值优选为2,000mg/l，更优选1,000mg/l，更优选500mg/l，更优选200mg/l。关于上述的实施方式，本发明进一步公开提高以下的微细藻类对于硝酸的底物类似物的耐性的方法、和微细藻类的转化体。＜1＞一种使微细藻类的基因组上的编码下述蛋白质(a)或(b)的基因缺失或抑制编码下述蛋白质(a)或(b)的基因的表达、提高微细藻类对于硝酸的底物类似物的耐性的方法。(a)由序列号41表示的氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由与上述蛋白质(a)的氨基酸序列的同一性为70％以上、优选75％以上、更优选80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选92％以上、更优选95％以上、更优选98％以上、更优选99％以上、的氨基酸序列构成、且具有nrt活性的蛋白质。＜2＞一种使微细藻类的基因组上的编码下述蛋白质(a)或(b)的基因、以及编码下述蛋白质(c)或(d)的基因缺失或抑制表达、提高微细藻类对于硝酸的底物类似物的耐性的方法。(a)由序列号41表示的氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由与上述蛋白质(a)的氨基酸序列的同一性为70％以上、优选75％以上、更优选80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选92％以上、更优选95％以上、更优选98％以上、更优选99％以上、的氨基酸序列构成、且具有nrt活性的蛋白质。(c)由序列号42表示的氨基酸序列构成的蛋白质。(d)由与上述蛋白质(c)的氨基酸序列的同一性为70％以上、优选75％以上、更优选80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选92％以上、更优选95％以上、更优选98％以上、更优选99％以上、的氨基酸序列构成、且具有nr活性的蛋白质。＜3＞一种微细藻类的转化体，其具有对硝酸的底物类似物的耐性，其中，基因组上的编码上述蛋白质(a)或(b)的基因缺失，或抑制编码下述蛋白质(a)或(b)的基因的表达。＜4＞一种微细藻类的转化体，其具有对硝酸的底物类似物的耐性，其中，基因组上的编码上述蛋白质(a)或(b)的基因、以及编码上述蛋白质(c)或(d)的基因缺失或表达被抑制。＜5＞一种转化体的制作方法，其具有对硝酸的底物类似物的耐性，其中，使微细藻类的基因组上的编码上述蛋白质(a)或(b)的基因缺失，或抑制编码上述蛋白质(a)或(b)的基因的表达，将对硝酸的底物类似物的耐性作为指标而取得转化体。＜6＞一种转化体的制作方法，其具有对硝酸的底物类似物的耐性，其中，使微细藻类的基因组上的编码上述蛋白质(a)或(b)的基因、以及编码上述蛋白质(c)或(d)的基因缺失或抑制表达，将对硝酸的底物类似物的耐性作为指标而取得转化体。＜7＞根据上述＜1＞～＜6＞中任一项所述的方法或转化体，其中，上述的硝酸的底物类似物为氯酸。＜8＞根据上述＜1＞～＜7＞中任一项所述的方法或转化体，其中，上述转化体在含有3mm以上、优选5mm以上的氯酸或其盐的培养基上培养1周以上、优选2周以上、8周以下时，可以生长。＜9＞根据上述＜1＞～＜8＞中任一项所述的方法或转化体，其中，将上述转化体在含有选自尿素、氨及亚硝酸中的至少1种作为氮源的培养基上进行培养。＜10＞根据上述＜9＞项记载的方法或转化体，其中，培养基中所含的上述氮源的浓度以氮原子等量计为1mg/l以上，优选为5mg/l以上，更优选为10mg/l以上，为2,000mg/l以下，优选为1,000mg/l以下，更优选为500mg/l以下，更优选为200mg/l以下。＜11＞根据上述＜1＞～＜10＞中任一项所述的方法或转化体，其中，上述蛋白质(b)为在上述蛋白质(a)的氨基酸序列中缺失、置换、插入或附加有1个或多个、优选1个以上141个以下、更优选1个以上117个以下、更优选1个以上94个以下、更优选1个以上71个以下、更优选1个以上47个以下、更优选1个以上38个以下、更优选1个以上24个以下、更优选1个以上10个以下、更优选1个以上5个以下的氨基酸的蛋白质。＜12＞根据上述＜1＞～＜11＞中任一项所述的方法或转化体，其中，编码上述蛋白质(a)或(b)的基因为由下述dna(a)或(b)构成的基因。(a)由序列号39表示的碱基序列构成的dna。(b)由与上述dna(a)的碱基序列的同一性为55％以上、优选60％以上、更优选65％以上、更优选70％以上、优选75％以上、更优选80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选92％以上、更优选95％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上的碱基序列构成、且编码具有nrt活性的蛋白质的dna。＜13＞根据上述＜12＞项记载的方法或转化体，其中，上述dna(b)为由在上述dna(a)的碱基序列中缺失、置换、插入、或附加有1个或多个、优选1个以上634个以下、更优选1个以上563个以下、更优选1个以上493个以下、更优选1个以上423个以下、更优选1个以上352个以下、更优选1个以上282个以下、更优选1个以上212个以下、更优选1个以上141个以下、更优选1个以上113个以下、更优选1个以上71个以下、更优选1个以上29个以下、更优选1个以上15个以下的碱的碱基序列构成、且编码具有nrt活性的蛋白质的dna、或与上述dna(a)互补的碱基序列构成的dna在严格的条件下进行杂交、且编码具有nrt活性的蛋白质的dna。＜14＞根据上述＜2＞、＜4＞、及＜6＞～＜13＞中任一项所述的方法或转化体，其中，上述蛋白质(d)为在上述蛋白质(c)的氨基酸序列中缺失、置换、插入或附加有1个或多个、优选1个以上523个以下、更优选1个以上457个以下、更优选1个以上392个以下、更优选1个以上327个以下、更优选1个以上261个以下、更优选1个以上196个以下、更优选1个以上130个以下、更优选1个以上104个以下、更优选1个以上65个以下、更优选1个以上26个以下、进一步优选1个以上13个以下的氨基酸的蛋白质。＜15＞根据上述＜2＞、＜4＞、及＜6＞～＜14＞中任一项所述的方法或转化体，其中，编码上述蛋白质(c)或(d)的基因为由下述dna(c)或(d)构成的基因。(c)由序列号40表示的碱基序列构成的dna。(d)由与上述dna(c)的碱基序列的同一性为70％以上、优选75％以上、更优选80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选92％以上、更优选95％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上、的碱基序列构成、且编码具有nr活性的蛋白质的dna。＜16＞根据上述＜15＞项记载的方法或转化体，其中，上述dna(d)为由在上述dna(c)的碱基序列中缺失、置换、插入、或附加有1个或多个、优选1个以上764个以下、更优选1个以上636个以下、更优选1个以上509个以下、优选1个以上382个以下、更优选1个以上255个以下、更优选1个以上204个以下、更优选1个以上128个以下、更优选1个以上51个以下、更优选1个以上26个以下的碱的碱基序列构成、且编码具有nr活性的蛋白质的dna、或与上述dna(c)互补的碱基序列构成的dna在严格的条件下进行杂交、且编码具有nr活性的蛋白质的dna。＜17＞根据上述＜1＞～＜16＞中任一项所述的方法或转化体，其中，上述微细藻类为真眼点藻纲、优选真眼藻目的微细藻类、更优选拟微绿球藻属的微细藻类。＜18＞根据上述＜1＞～＜17＞中任一项所述的方法或转化体，其中，上述微细藻类为选自眼点拟微绿球藻、海洋拟微绿球藻、海洋富油拟微绿球藻、盐生拟微绿球藻、极微拟微绿球藻、斑拟微绿球藻、颗粒拟微绿球藻、及拟微绿球藻之中的藻类，优选为选自眼点拟微绿球藻、海洋拟微绿球藻及海洋富油拟微绿球藻之中的藻类，更优选为眼点拟微绿球藻。实施例以下，基于实施例，对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不限定与于实施例。在此，将本实施例中使用的引物的碱基序列示于表1。实施例1对眼点拟微绿球藻的氯酸耐性的赋予(1)博莱霉素耐性基因表达用质粒的构建人工合成博莱霉素耐性基因(序列号1)，将其作为模板，使用表1所示的引物序列号2及引物序列号3的引物对进行pcr，扩增博莱霉素耐性基因。另外，将眼点拟微绿球藻nies－2145株(从独立行政法人国立环境研究所(nies)获得)的基因组作为模板，分别使用表1所示的引物序列号4及引物序列号5的引物对、以及引物序列号6及引物序列号7的引物对进行pcr，将vcp1启动子序列(序列号8)及vcp1终止子序列(序列号9)进行扩增。进而，将质粒载体puc118(takara生物社制)作为模板，使用表1所示的引物序列号10及引物序列号11的引物对进行pcr，将质粒载体puc118进行扩增。使用in－fusionhdcloningkit(clontech公司制)将得到的4个片段进行融合，构建博莱霉素耐性基因表达用质粒。(2)拟微绿球藻内在性nrt基因及nr基因的同源重组质粒的构建将从眼点拟微绿球藻nies－2145株中提取的基因组作为模板，分别使用表1所示的引物序列号12及引物序列号13的引物对、引物序列号14及引物序列号15的引物对、引物序列号16及引物序列号17的引物对、以及引物序列号18及引物序列号19的引物对进行pcr，将图2所示的nrt基因及nr基因(以下，也称为“nrt－nr基因”)周边的基因组序列(序列号20)的部分序列(基因组序列(w)(序列号20的2254～3849位(序列号21))、基因组序列(x)(序列号20的5969～7479位(序列号22))、基因组序列(y)(序列号20的6816～8286位(序列号23))、基因组序列(z)(序列号20的8516～10053位(序列号24))进行扩增。另外，以前述的博莱霉素耐性基因表达用质粒为模板，使用表1所示的引物序列号25及引物序列号26的引物对进行pcr，取得博莱霉素耐性基因表达盒pvcp1－ble－tvcp1。其后，使用in－fusionhdcloningkit(clontech公司制)将得到的基因组序列(w)片段、基因组序列(x)片段、博莱霉素耐性基因表达盒、及前述的质粒载体puc118进行融合，构建nrt基因同源重组质粒(以下，也称为“nrt基因ko质粒”)。同样地，将基因组序列(y)片段、基因组序列(z)片段、博莱霉素耐性基因表达盒片段、及质粒载体puc118进行融合，构建nr基因同源重组质粒(以下，也称为“nr基因ko质粒”)。进而，将基因组序列(w)片段、基因组序列(z)片段、博莱霉素耐性基因表达盒片段、及质粒载体puc118进行融合，构建nrt－nr基因同源重组质粒(1)(以下，也称为“nrt－nr基因ko质粒(1)”)。予以说明，这些质粒由以序列号20的上游基因组序列(基因组序列(w)片段或基因组序列(y)片段)、vcp1启动子序列、博莱霉素耐性基因、vcp1终止子序列、及序列号20的下游基因组序列(基因组序列(x)片段或基因组序列(z)片段)的顺序连结的插入序列和puc118载体序列构成(参照图3(a)～(c))。(3)向眼点拟微绿球藻导入同源重组质粒将上述nrt基因同源重组质粒作为模板，使用表1所示的引物序列号27及引物序列号28的引物对进行pcr，将nrt基因同源重组盒(图3(a)所示的质粒的插入序列)进行扩增。同样地，将上述nr基因同源重组质粒作为模板，使用表1所示的引物序列号29及引物序列号30的引物对进行pcr，将nr基因同源重组盒(图3(b)所示的质粒的插入序列)进行扩增。进而，将上述nrt－nr基因同源重组质粒(1)作为模板，使用表1所示的引物序列号27及引物序列号30的引物对进行pcr，将nrt－nr基因同源重组盒(1)(图3(c)所示的质粒的插入序列)进行扩增。使用highpurepcrproductpurificationkit(rocheappliedscience公司制)将扩增的各dna片段进行精制。将培养的眼点拟微绿球藻nies－2145株进行离心回收，用384mm的山梨糖醇溶液清洗，将悬浮在山梨糖醇中的细胞液用作宿主。将上述中扩增的3种同源重组盒约500ng分别与宿主细胞混合，在50μf、500ω、2,200v/2mm的条件下进行电穿孔。在尿素液体培养基(尿素400mg、nah2po4·2h2o30mg、维生素b120.5μg、生物素0.5μg、硫胺素100μg、na2sio3·9h2o10mg、na2edta·2h2o4.4mg、fecl3·6h2o3.16mg、cocl2·6h2o12μg、znso4·7h2o21μg、mncl2·4h2o180μg、cuso4·5h2o7μg、na2moo4·2h2o7μg/人工海水1l)(以下，称为“尿素培养基”)中进行24小时恢复培养。其后，涂布于含有2μg/ml的博莱霉素的尿素琼脂培养基，在25℃、0.3％co2气氛下、12h/12h明暗条件下培养2～3周。(4)nr基因破坏株、nrt基因破坏株、以及nrt基因及nr基因破坏株的选抜从以博莱霉素耐性为指标得到的菌落中，利用同源重组盒分别通过pcr选抜眼点拟微绿球藻的nr基因、nrt基因、或nrt－nr基因被破坏的株。nr基因破坏株(以下，也称为“δnr株”)如图4(a)所示，通过利用了野生(wt)株的基因组dna和上述nr基因同源重组盒(nr－ko片段)的相同序列的重组，可以通过破坏在基因组上所编码的nr基因而取得。就δnr株的选抜而言，使用表1所示的引物序列号31及引物序列号32的引物对进行pcr，将被扩增的片段的长度的不同作为指标而进行(参照图4(b)及(c))。如图4(c)所示，在wt株中，确认了约3.4kbp的基因片段的扩增。与此相对，在δnr株中，确认了约5.0kbp的基因片段的扩增。nrt基因破坏株(以下，也称为“δnrt株”)如图5(a)所示，通过利用了wt株的基因组dna和上述nrt基因同源重组盒(nrt－ko片段)的相同序列的重组，可以通过破坏在基因组上所编码的nrt基因而取得。就δnrt株的选抜而言，使用表1所示的引物序列号33及引物序列号34的引物对进行pcr，将片段扩增的有无作为指标而进行(参照图5(b)及(c))。如图5(c)所示，在wt株中，不进行基因片段的扩增。与此相对，在δnr株中，确认了约3.3kbp的基因片段的扩增。就nrt－nr基因的破坏株(以下，也称为“δnrtδnr株”)而言，如图6(a)所示，通过利用了wt株的基因组dna和上述nrt－nr基因同源重组盒(1)(nrt－nr－ko片段(1))的相同序列的重组，可以通过破坏在基因组上所编码的nrt基因及nr基因而取得。就δnrtδnr株的选抜而言，使用表1所示的引物序列号35及引物序列号36的引物对进行pcr，将被扩增的片段的长度的不同作为指标而进行(参照图6(b)及(c))。如图6(c)所示，在wt株中，确认了约6.9kbp的基因片段的扩增。与此相对，在δnrtδnr株中，确认了约4.1kbp的基因片段的扩增。(5)δnr株、δnrt株、δnrtδnr株的氯酸耐性评价将δnr株、δnrt株及δnrtδnr株分别播种于尿素琼脂培养基、将作为尿素琼脂培养基的氮源的尿素置换为硝酸的硝酸琼脂培养基(硝酸1.1g、nah2po4·2h2o30mg、维生素b120.5μg、生物素0.5μg、硫胺素100μg、na2sio3·9h2o10mg、na2edta·2h2o4.4mg、fecl3·6h2o3.16mg、cocl2·6h2o12μg、znso4·7h2o21μg、mncl2·4h2o180μg、cuso4·5h2o7μg、na2moo4·2h2o7μg/人工海水1l)、及含有5mm氯酸钾(kclo3)的尿素琼脂培养基这3种琼脂培养基上，在25℃、0.3％co2气氛下、12h/12h明暗条件下培养2～3周。作为对照，对wt株也进行同样的研究。将培养后的琼脂培养基的情形示于图7。如图7所示，使用硝酸琼脂培养基的情况下，仅wt株可以生长，但在δnr株、δnrt株、及δnrtδnr株不能确认生长。另一方面，wt株、δnr株、δnrt株、及δnrtδnr株均可以在尿素琼脂培养基上生长。由这些结果显示：在属于拟微绿球藻属的藻类中nrt基因或nr基因被破坏时，丧失硝酸的同化性。另外显示，对于拟微绿球藻，也可以作为氮源使用尿素来替代硝酸。另外，如上所述，通常已知有由于氯酸经过nr变换而显示细胞毒性。因此，关于对拟微绿球藻的氯酸的感受性，通过比较wt株、δnr株、δnrt株、及δnrtδnr株在含有氯酸的琼脂培养基上的生长而进行评价。其结果，如图7的下段所示，wt株因暴露于氯酸而死亡。另外，如通常所说的那样，对于在抑制了nr基因的表达的株(δnr株)也评价了其生长性，但在5mm的氯酸条件下无法确认生长，仅破坏nr基因不能使氯酸耐性提高。与此相对，确认到：δnrt株即使在氯酸暴露条件下也确认生长，通过抑制nrt活性，与wt株相比提高了氯酸耐性。还确认到：对于δnrtδnr株来说，即使与δnrt株进行比较，也可看到良好的生长，通过使nrt和nr的活性均被抑制而氯酸耐性显著提高。进而，变更添加于尿素琼脂培养基的氯酸钾浓度，通过与前述同样的方法，评价了wt株、δnr株、δnrt株、及δnrtδnr株的生长性(spot后3周)。予以说明，生长性的评价根据下述的评价基准而进行。(评价基准)－：不生长+：生长受到抑制、(一些)色素褪色++：生长受到抑制+++：充分地生长将其结果示于表2。kclo3浓度wt株δnr株δnrt株δnrtδnr株0mm++++++++++++5mm－－+++++10mm－－－+++15mm－－－+++20mm－－－++30mm－－－+如表2所示，确认到：δnrt株即使在氯酸的浓度为5mm的条件下也能够确认到生长，通过抑制nrt活性，与wt株或δnr株相比氯酸耐性提高。还确认到：δnrtδnr株的氯酸耐性显著提高，即使在氯酸的浓度为30mm的条件下，也可以生长。综上所述，对于真眼点藻纲来说，通过使nrt基因缺失或抑制nrt基因的表达，可以使对氯酸等硝酸的底物类似物的耐性提高。进而，除了nrt基因之外，还可以通过nr基因缺失或抑制nr基因的表达，显著提高对硝酸的底物类似物的耐性，制作即使在高浓度的氯酸存在下也能够生长的转化体。实施例2以眼点拟微绿球藻的氯酸耐性为指标的δnrtδnr株的取得(1)拟微绿球藻内在性nrt－nr基因的同源重组质粒的构建将实施例1中制作的nrt－nr基因ko质粒(1)(参照图3(c))作为模板，使用表1所示的引物序列号37及引物序列号38的引物对进行pcr，将利用puc118载体序列连结有图2所示的nrt－nr基因周边的基因组序列(序列号20)的部分序列(基因组序列(w)(序列号21)、基因组序列(z)(序列号24))的片段进行扩增。将该扩增片段利用与实施例1同样的方法进行融合，构建不含药剂耐性基因(ble)表达盒的nrt－nr基因同源重组质粒(2)(以下，也称为“nrt－nr基因ko质粒(2)”)。予以说明，本表达质粒由依次连结有图2所示的眼点拟微绿球藻nies－2145株的基因组序列(w)和基因组序列(z)的插入序列和puc118载体序列构成(参照图8(a))。(2)向眼点拟微绿球藻导入同源重组质粒将上述nrt－nr基因同源重组质粒(2)作为模板，使用表1所示的引物序列号27及引物序列号30的引物对进行pcr，将nrt－nr基因同源重组盒(2)(图8(a)所示的质粒的插入序列)进行扩增。使用扩增的dna片段，利用与实施例1同样的方法导入至眼点拟微绿球藻，进行恢复培养。恢复培养后，涂布于含20mm氯酸钾(kclo3)的尿素琼脂培养基，在25℃、0.3％co2气氛下、12h/12h明暗条件下培养2～3周，将氯酸耐性作为指标而取得菌落。(3)氯酸耐性株的nrt－nr周边基因组的分析对以氯酸耐性为指标所取得的转化体，确认nrt－nr基因周边的基因组。使用表1所示的引物序列号35及引物序列号36的引物对进行pcr，将nrt－nr基因周边基因组进行扩增。其结果，在全部的以氯酸耐性作为指标而取得的株中，均扩增了约2.2kbp的片段。如图8(b)所示，在wt株的基因组dna和上述nrt－nr基因同源重组盒(2)(nrt－nr－ko片段(2))的相同序列处产生同源重组时，取得δnrtδnr株。因此，通过上述条件下的pcr而被扩增的片段在wt株中约6.9kbp的片段被扩增，在δnrtδnr株中约2.2kbp的片段被扩增(参照图8(c)及(d))。由以上的结果得知：以氯酸耐性为指标所取得的株全部为δnrtδnr株。由此显示：能够以氯酸耐性为指标取得转化体。将本发明与其实施方式一起进行了说明，但我们认为：只要没有特别指定，在说明本发明时的任何细节都不限定我们的发明，能够以不违背权利要求书所示的发明的精神和范围的情况下，广泛地进行解释。本申请主张基于2017年4月12日在日本国进行了专利申请的日本特愿2017－078886的优先权，其在此作为参照，将其内容作为本说明书的记载的一部分引入。序列表<110>花王株式会社<120>提高微细藻类对于硝酸的底物类似物的耐性的方法<130>p17-0614wo00<150>jp2017-078886<151>2017-04-12<160>42<170>patentinversion3.5<210>1<211>375<212>dna<213>人工序列<220><223>博来霉素耐性基因<400>1atggccaagctgaccagcgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtc60gagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggt120gtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggac180aacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggag240gtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcag300ccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggcc360gaggagcaggactaa375<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.2<400>2atggccaagctgaccagcgc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.3<400>3ttagtcctgctcctcggcca20<210>4<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.4<400>4acacaggaaacagctggcggtcttttgtcctttcc35<210>5<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.5<400>5ggtcagcttggccataatctgctcggaggggagga35<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.6<400>6gaggagcaggactaagcttctgtggaagagccagt35<210>7<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.7<400>7tcggggctggcttaactgatcttgtccatctcgtg35<210>8<211>802<212>dna<213>眼点拟微绿球藻（nannochloropsisoculata）<400>8ggcggtcttttgtcctttcctctatagcccgcccgtctagagggcacacgcgatgatctt60tatatctcttcatgtgtctttgttttaactaggatactgccgggtgaatgcccatcggac120aagaggccaaactctatctacacccttttgacttctgttgtggtcgtagtgtgtgcttgc180atgccctgaaagtccaggcatcccacttgtgctctaaccccattcaaaacagcagaagtg240cttaattaagatatagattcatgatctcctgtcccctccttcttaccttttcacaaacct300cacacagaagtctccactcttcgcctctaaaacctctttttaaattatggtaagttcgtg360cggcagtgggttttcggatctatatttgtcaagatccagttcaaggtcagggatgtagat420taagtacagaaggagaagcacaagcgcgccagttcgcccctcacggcctggagcagggca480tttaatccctctatcttaccagaaccatactatacaaccaatcctgttggcatcgctctg540tctatttgtcgtgcgtgcatgtgtccatggtgtggtggggggcaggggttttcggggttg600cggttgaaggcaccttatcagaaagatgccctcagagatagaggtagccccctccccccg660atcttcgaccagtcctgtcaggcgaacactttcacccgtcgttcacctcgttacacacaa720ggagtagacctctgaagttctaattgtcataaatgcccctcccccctccctctttccctt780gatcctcccctccgagcagatt802<210>9<211>643<212>dna<213>眼点拟微绿球藻（nannochloropsisoculata）<400>9gcttctgtggaagagccagtggtagtagcagtagcagcagcagtagcagccgcagcactc60agtgttggcgcgagagattgtccatcccttcttaacctaccggaagagaaataaggcctt120tctcccgtagctgtcttcgtttgtttgtgctgattgcttgatatgagagtgttgaattcc180tgcatcatgtttttctctgtagtcctttcctacccccgtcattttcttttctccctggtt240cttcttttgtcacccttattttacataaaattttctttgtttatagtgagaggaaggtag300agaggggaaaacaagaacaacgaacgcaagcgtgtgaaaggagggcgagtagaagagaaa360cagatctgttgagcattgagagtggagccgggggaaaggcttgtgtgttgtctttgaaaa420agttgtttaaatcacgaatccgttagttctcatgtgtacctctttcactacatgtgatgg480agaaaacaaaagtgtgaggattaattgaagaaaaagaagagttcgacacgtcaaaccgcc540caaaagacgtcacaaagagaacttgattctctttgccgtgttgatcctgtcttttccccc600agcttttcttgccacccgtggcacacgagatggacaagatcag643<210>10<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.10<400>10agctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctc32<210>11<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.11<400>11ttaagccagccccgacacccgccaacacccgctg34<210>12<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.12<400>12acacaggaaacagctcctgggaaatgtgccattg34<210>13<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.13<400>13ggacaaaagaccgccacgtgttccttctgagaaag35<210>14<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.14<400>14gatggacaagatcagtttatgtcagacgcaaggtc35<210>15<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.15<400>15tcggggctggcttaacataactggatgacaatgagcacaag41<210>16<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.16<400>16acacaggaaacagctcagtacagacgcgcgagacg35<210>17<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.17<400>17ggacaaaagaccgccgattccaaatacgccagcac35<210>18<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.18<400>18gatggacaagatcagcatccatctctatctttacc35<210>19<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.19<400>19tcggggctggcttaacagtcactagcgacgtattc35<210>20<211>12750<212>dna<213>眼点拟微绿球藻（nannochloropsisoculata）<400>20agtaatagaagaagaagaagaagaaggaatcataaacgtacccattggaggacgacgaca60taaagcagcacgaatggcaaatgttcccacgagataaggccaccgaagagacgaccaacc120tcctggtacaattgcagggacaggatccgcttccccgtccatctaggctgctgaaacggg180cgggccatggccaagtgctggtatttgcgtcgggagaagcggtggttgtggcagtggcgt240gaagaggagtggcagggctatggaagatggaaggcggcgatgatgatgacgctgccggca300agtaaggttggaaagcggagctgctaaatgctgaagccaacggtgcctggcagatgactc360ctatacctgtggagcgtatatgtaagtgtgggtgcctttgaaagggcggtatgttgacag420gaggatgggaggccgtcgtcttctttccttcgctcttgaatcaagcgagtgaccgtttcc480acgattctatggggagtctatgccttgagaatcgggtccaaaattcattttgggacacaa540actagcctccaaccgggcccaagtagaaaatatttcatattcgataagtaattgggagtg600cattcccgggttgtggcgttcataaaaacccctttttcctctttttgagactcgccttcc660gggcgatcgagctggcagcaaacttagacactgtccccgagtgattaaggtcgtgtcaat720ccccaccccttaagacatgttctacaccatacgacgtgttgcacctatcgcaccaccacc780caccaattatcaagaccaatgagatcggcgccaaggacatctgtgcgccgatgtacgcca840gctctattgcgaggtggagatgcgaaaggaggccatcagaagcagcaaatcgagcgatta900caccgacccagtagatctcggtataagttggtggcagacagtacgcttattttccccctc960agcaaatactcgtcctttttacttctttttgtttcccaccaatcctgacgtcgtttgttt1020cgtcttgctaattgtttcgtcttgctattgagtcataattagggctgtacaaaaaatcac1080taccaaaaaaggtcgaatagcgcagagtggaagattgaaagtttttcaagagaagcgaac1140gacgacctactccttcccctcccacgcaccactcttaagtcgtgaaagacaaggaggttt1200tatctgacgttatcttgtcctcgaggttaagcttcttcgacacgtcaacaaccttcatgc1260gacgcatcctcatgctccaatcacatacatacacaaaacacaaaaccaccagaaaccctc1320atgtacctctccctctcccgtttccctccccccttcctccccttactgaaattgtcccga1380gctgtcccacctactggtactaaaagcataacaaatcgtcaatatccaaacgctcgtaaa1440aatccttcccacatacgcctctcgcggggtgaatctgtcgttccctaacaccaacctggc1500tgagttgaaggccacttgcaacaattctgccagtccgttaatggttaaaattgcctttag1560ccgcgtcttgatccgcgaatttcgtgagaaagactgcacgagagagaggagcacgcctac1620caagttcgcacataagagaccgacgacaggtaagacgatgagggctcggcggaaggcacc1680agaaatctggtccgcgagctcgtaaaggtgcgtggcacgtgcagtgaggatcatgaacaa1740aatacacacacccgtgttgccgactgtacgcatgatgcgtgggtagaggatctcgtgacg1800ccccgccgaggaggacgttggttgcgaggtgtagtaccgttgatagctgtaggaagatga1860gacagggccccacggacgggtcacgggacccccggcagcagcagctgcggcgtaattccc1920tccttgttgttgttgtcgctgttgtggctcttgcggagggtcgtcgttgacgttgttgcg1980tggatgccgggtgccagattgttggggaggaggaggtacaaagctgctgccgccgcgggc2040gtcgatgggtggctgcttttggtcattcgtgtgagtggtagaggtgcgaaggagggatga2100gtgatggaaagatacatttagagacatcgagaatgtatgtgtacgtgtaagttaatgggc2160accaca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