双分化或多分化类器官的制作方法

本发明涉及人工类器官模型组织的领域。

发明背景

三维(3d)类器官培养技术允许类似体内发育的复杂的器官样组织发育(wo2014/090993；lancasteretal.,nature501,373–379(2013)；lancaster&knoblich,science345,1247125(2014))。重要的是，脑类器官重演了胚胎皮质发育的许多方面，包括与不同脑部位身份相对应的多种多样细胞类型的生成(lancaster&knoblich,natprotoc9,2329–2340(2014))。例如，脑类器官可以分别产生生成兴奋性神经元和抑制性中间神经元的背侧和腹侧前脑祖先。此外，脑类器官可以从人患者来源的诱导多能干细胞(hipsc)生成，并用于神经系统病症(如小头畸形和自闭症)的功能基因组研究。

maroofetal.,cellstemcell12,559–572(2013)和nicholasetal.,cellstemcell12,573–586(2013)描述了在小鼠体内对人神经元发育进行建模的方法。该方法包括体外在皮质饲养层上培养干细胞，然后将细胞移植到免疫受损小鼠的新生的新皮层中以进一步发育。liuetal.,natprotoc8,1670–1679(2013)描述了将细胞培养成小的神经球(20μm-50μm)，并在培养中将神经球的细胞分化为gaba⁺神经元。

us2016/289635a1描述了产生人工端脑组织的方法。

wo2014/033322a1涉及通过分化前体细胞产生胰腺内胚层的方法。

wo2011/055855a1涉及在培养的干细胞中诱导分化的方法。

us2016/312181a1描述了自干细胞的神经元细胞分化。

此类现有模型系统仍不能模拟任何生理发育。例如，脑皮层含有两个主要的神经元群：兴奋性谷氨酸能锥体神经元和产生抑制性γ-氨基丁酸(gaba)的中间神经元。兴奋性皮质神经元主要由背侧前脑祖先生成，而抑制性gaba能皮质中间神经元是由腹侧前脑祖先生成。为了整合到皮质回路中，中间神经元从其腹侧起源到其目标背侧皮质区域进行长距离迁移。这种远程切向迁移受许多信号传导途径控制，并且一些神经系统疾病相关基因的突变可以破坏中间神经元迁移。然而，在没有合适的实验性人模型系统的情况下，患者特异性突变与人脑发育之间的关系仍然是未知的。

因此，需要在与脑非常相似的大型体外培养物中对天然脑，尤其是人脑的额外特征进行建模，并且将脑发育建模到尽可能晚/大的阶段。

发明概述

本发明提供了产生具有至少两种组织类型的双分化或多分化组织的方法，该方法包括以下步骤：提供发育至感兴趣的分化阶段的第一组织；提供发育至与第一组织的感兴趣的分化阶段不同的感兴趣的分化阶段的第二组织；将所述第一和第二组织放置在足以通过生长融合的接近处；允许第一和第二组织生长并彼此融合；从而产生包含具有不同分化阶段的第一和第二组织的双分化或多分化组织。

还提供了产生具有至少两种组织类型的双分化或多分化组织的方法，该方法包括以下步骤：将第一组织发育至感兴趣的分化阶段；将第二组织发育至与第一组织的感兴趣的分化阶段不同的感兴趣的分化阶段；将所述第一和第二组织放置在足以通过生长融合的接近处；允许第一和第二组织生长并彼此融合；从而产生包含具有不同分化阶段的第一和第二组织的双分化或多分化组织。

本发明进一步提供了通过此类方法体外可获得的双分化或多分化组织。具体而言，提供了具有不同分化阶段的至少两种组织类型的双分化或多分化组织，其中组织类型的至少一种包含腹侧神经元组织，并且至少另一种组织类型是基本上非腹侧的，但含有来自腹侧神经元组织的迁移细胞，占基本上非腹侧组织的细胞的不超过5％，并且双分化或多分化组织以其最长维度上具有100μm至10mm的大小。

进一步提供了测试影响双分化或多分化组织的发育的候选化合物的方法，其包括使本发明的方法中的细胞或组织与候选化合物接触或者使本发明的组织与候选化合物接触，并且在培养物中维持所述接触的组织，并且与未接触所述候选化合物的所述组织相比观察到组织中的任何发育变化。

还提供了适合于提供组织培养物的试剂盒，其包含腹侧分化诱导剂和背侧分化诱导剂，优选wnt抑制剂和/或ssh增强剂作为腹侧分化诱导剂和优选ssh抑制剂作为背侧分化诱导剂。试剂盒对于本发明的方法有用并且可以用于本发明的方法中。

在下面的详细描述中一起描述了本发明的所有实施方案，并且所有优选的实施方案均涉及所有实施方案、方面、方法、组织和试剂盒等。例如，试剂盒或其组分可以用于本发明的方法中或适合于本发明的方法。所述方法中使用的任何组分都可以在试剂盒中。本发明的组织是本发明的方法的结果或可以用于本发明的方法中。本发明的方法的优选和详细描述类似解释本发明的适用性和所得组织。除非另有说明，否则所有实施方案可以彼此组合。

发明详述

本发明提供了产生具有至少两种组织类型的双分化或多分化组织的方法，该方法包括以下步骤：提供处于感兴趣的分化阶段的第一组织或将第一组织发育至感兴趣的分化阶段；提供处于与第一组织的感兴趣的分化阶段不同的感兴趣的分化阶段的第二组织或将第二组织发育至与第一组织的感兴趣的分化阶段不同的感兴趣的分化阶段；将所述第一和第二组织放置在足以通过生长融合的接近处；允许第一和第二组织生长并彼此融合；从而产生包含具有不同分化阶段的第一和第二组织的双分化或多分化组织。该方法通常在体外或离体进行，例如在容器如小瓶或皿或其他细胞培养设备中。通常，第一和/或第二组织，尤其是两者(和任选地进一步的组织)是体外衍生的，即来自体外培养物。优选地，第一和/或第二组织，尤其是两者(和任选地进一步的组织)在体外衍生自多能干细胞，或者换句话说，衍生自多能干细胞的体外培养物。特别优选的是第一和/或第二组织，尤其是两者(和任选地进一步的组织)衍生自诱导多能干细胞(其继而可以例如衍生自从患者分离的细胞)，或者换句话说，衍生自诱导多能干细胞的体外培养物。

人工组织培养方法(包括3d培养)从以下已知：wo2014/090993、lancasteretal.,nature501,373–379(2013),lancaster&knoblich,science345,1247125–1247125(2014)和lancaster&knoblich,natprotoc9,2329–2340(2014)(所有均通过引用并入本文)。可以根据本发明使用此类现有方法来发育形成本发明的双分化或多分化组织的一部分的第一和第二以及任何进一步组织。pct/ep2017/050469(通过引用并入本文)描述了在三维基质中的支撑物上创建类器官的改进方法。此类方法也可以根据本发明使用。us2011/0143433也描述了培养可以发育成组织的干细胞，其可以根据本发明使用。先前的类器官成功地创建了具有自然脑样特征和分层的人工体外神经元组织。

总之，许多组织已得以发育。此类组织可以用作本发明的起点，作为处于给定的感兴趣的分化阶段的已发育的第一组织，以及作为处于给定的感兴趣的分化阶段的第二(以及任选地任何进一步)组织。特别感兴趣的是神经或神经元组织。神经组织经历复杂的分化模式，并且正确的人脑建模给发育生物学造成了困难。尽管已经取得了进步(lancaster等人和lancaster&knoblich(同上)的所有论文)，但仍无法对可以演化为动物或人脑的组织的完整发育进行建模(brüstle,nature501(2013):319-320；chambersetal.,cellstemcell(2013)13:377-378)。尽管由于对于神经组织已经显示出特定的有益效果和结果，本发明的方法和组织优选地涉及这些组织，但是由于对任何种类的组织都可能是有益的，这不应理解为将本发明的贡献限于特定组织。

第一、第二和任选地进一步的组织的细胞可以发育成特定的器官类型，或者可以已经开始向特定的分化命运分化。组织的细胞可以已成为多向(multipotent)(来自先前多能的或甚至不太分化的)，一些细胞甚至可以是单能的或体细胞的组织细胞。组织命运可以朝向任何组织。优选地，靶组织选自神经元组织、结缔组织、肝组织、胰腺组织、肾组织、骨髓组织、心脏组织、视网膜组织、肠组织、肺组织和内皮组织。例如，组织可以包含已经经历组织特异性分化的此类组织的任何干细胞。优选地，组织包含选自以下的细胞：神经元或神经源性、成脂性、肌源性、成腱性(tenogenic)、成软骨性、成骨性、成韧带性(ligamentogenic)、皮源性(dermatogenic)、肝或内皮细胞。在一些情况下，组合也是可能的，例如，器官细胞(例如神经元、肌源性、肝的)以及将发育成支持组织的细胞(例如内皮、成脂性、成韧带性细胞)。在各方法中，分化可以通过通常已知的组织特异性生长或分化因子，也称为分化诱导剂来引发。它们例如在本领域中是已知的，例如公开于wo2009/023246a2、wo2004/084950a2和wo2003/042405a2中。此外，分化或生长因子可以是骨形态发生蛋白、软骨衍生的形态发生蛋白、生长分化因子、血管生成因子、血小板衍生的生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、神经生长因子、集落刺激因子、神经营养蛋白、生长激素、白介素、结缔组织生长因子、甲状旁腺激素相关蛋白(例如公开于wo2004/084950a2中)。这些因子/试剂是可商购的并且不需要进一步描述。当然，对于上述组织类型中的任何一种，此类因子/试剂可以包括在本发明的试剂盒中。优选地，神经元或神经源性物质在该方法中使用或在试剂盒中提供，并且优选地，神经元或神经源性细胞存在于本发明的组织中。

组织可以包含任何组织(特别是上述组织)的祖细胞，例如干细胞。祖细胞优选选自下组：全能干细胞、多能干细胞(pluripotentstemcell)、多向干细胞(multipotentstemcell)、间充质干细胞、神经元干细胞、造血干细胞、胰腺干细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、神经干细胞，尤其是神经嵴干细胞、肾干细胞、肝干细胞、肺干细胞、成血管细胞和内皮祖细胞。该方法中使用的多能细胞或祖细胞可以衍生自去分化的成软骨细胞、肌源细胞、成骨细胞、成腱细胞、成韧带细胞、成脂细胞或皮源细胞。

分化可以通过使细胞与组织特异性生长或分化因子接触来实现。然后细胞可以发育成所期望的组织。此类组织特异性生长或分化因子可以是神经元或神经源性、肌源性、成腱性、成软骨性或成骨性分化因子，尤其优选神经元分化因子。这将决定在以后的发育中发育成各种类型的细胞组织。因此，细胞将从多能细胞转变为多向细胞。然后，不应成为其他组织类型或仅可能再次恢复为多能状态。通常，并非所有细胞分化为所选的组织类型。通常足够的是约30％或更多或至少40％或至少50％，或至少60％或至少70％或至少80％的细胞开始向所选择的组织类型分化，并转化以减少具有各自组织命运的多向细胞的分化潜能(％-值为细胞量的分数)。当然，这种分化命运仅适用于通过使用人工生长和去分化刺激物而未恢复到未分化或不太分化的状态的细胞。显然，甚至体细胞也可以恢复到多能细胞，这不意味着在本文中定义分化状态。优选地，不将使细胞恢复到多能细胞的因子引入细胞。

本发明的第一、第二和任选地进一步组织具有不同的发育或分化阶段。此类不同的分化意味着组织至少已开始分化为不同的组织类型，包括亚型或其他不同的器官部位或器官构造区(area)，例如腹侧和背侧发育和/或不同脑区的发育和/或左和右脑半球的发育。

然后将第一、第二和任选地进一步的组织放在接近处并允许一起生长或融合。令人惊讶地，这导致了在现已组合或融合的组织(也称为双分化或多分化组织)的发育中的引人注目的新观察结果。例如，前脑的发育涉及从腹侧到背侧部位长距离迁移gaba能中间神经元。尽管中间神经元迁移的缺陷与神经精神疾病如癫痫、自闭症和精神分裂症有关，但仍缺乏用于研究人中该过程的模型系统。开发了类器官共培养“融合”范式，以成功地将独立模式化的类器官组合到单个组织中。本发明的双分化或多分化组织不仅获得了先前的类器官模型的益处，而且最重要的是适于提供用于组织类型之间的细胞迁移(如人中间神经元迁移中)的模型。在脑类器官的情况下，通过将特定的类器官向背侧和腹侧前脑融合，已显示出连续的背-腹轴。使用荧光报告物，可以监测从腹侧到背侧前脑的定向gaba能中间神经元迁移。这些细胞的分子分类学和迁移动力学类似于皮质中间神经元的。人中间神经元迁移的延时成像是可能的。此类迁移的抑制(例如通过cxcr4拮抗剂amd3100)也是可观察的。结果表明脑类器官融合培养可以对不同脑部位之间的复杂相互作用进行建模。结合重新编程技术，融合物提供了使用来自神经精神疾病患者的细胞分析复杂的神经发育缺陷并测试潜在治疗化合物的可能性。

细胞共培养是本领域已知的。例如，干细胞与其他细胞混合培养以为干细胞提供另外的支持或发育因子(paschosetal.,tissueengregenmed(2014)doi:10.1002/term.1870)。本发明涉及一种不同的共培养。本发明提供了在组织水平上的共培养物，其中将两个或更多个不同发育的组织一起培养以形成融合组织，即双分化或多分化组织。从业者不混合不同原始组织的个别细胞，因为原始不同组织在双分化或多分化组织内保持着组织类型的分开的部位。然而，细胞迁移当然是允许的。事实上，期望细胞从一个组织自然迁移到另一个组织，并显示融合组织的自然发育。一些细胞在不同组织类型之间形成连接。

可以进行组织的生长以形成双分化或多分化组织，如组织培养领域中已知的。优选在三维基质中培养。三维基质不同于2d培养，例如在平坦表面的皿中的2d培养。“三维培养”意指培养物可以在所有三个维度扩展，而不会被一侧壁(例如皿的底板)所阻挡。优选地，此类培养是悬浮的。三维基质可以是凝胶，尤其是刚性稳定的凝胶，其导致生长的细胞培养物/组织的进一步扩展和分化。合适的三维基质可以包含胶原。更优选地，三维基质包含细胞外基质(ecm)或其任何选自胶原、层粘连蛋白、触觉蛋白(entactin)和肝素硫酸化蛋白聚糖或其任何组合的组分。细胞外基质可以来自engelbreth-holm-swarm肿瘤或其任何组分，例如层粘连蛋白、胶原(优选4型胶原)、巢蛋白以及任选地另外的乙酰肝素硫酸化蛋白聚糖或其任何组合。此类基质是基质胶。基质胶在本领域中是已知的(us4,829,000)，并且先前已经用于对3d心脏组织(wo01/55297a2)或神经元组织(wo2014/090993)进行建模。优选地，基质包含层粘连蛋白、胶原和触觉蛋白，优选地浓度为30％-85％层粘连蛋白、3％-50％胶原和足以使基质形成凝胶的触觉蛋白，通常为0.5％-10％触觉蛋白。如果胶原的量不足以形成凝胶，则层粘连蛋白可需要触觉蛋白的存在以形成凝胶。甚至更优选地，基质包含至少3.7mg/ml含有(按重量份计)约50％-85％层粘连蛋白、5％-40％胶原iv、任选地1％-10％巢蛋白(nidogen)，任选地1％-10％硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和1％-10％触觉蛋白的浓度。基质胶的固体组分通常包含大约60％层粘连蛋白、30％胶原iv和8％触觉蛋白。对于基质组分给定的所有％值均以重量％计。触觉蛋白是与层粘连蛋白和胶原相互作用的桥接分子。此类基质组分可以在步骤r)中添加。这些组分也是本发明的试剂盒的优选部分。三维基质可以进一步包含生长因子，例如egf(表皮生长因子)、fgf(成纤维细胞生长因子)、ngf、pdgf、igf(胰岛素样生长因子)中的任何一种，尤其是igf-1、tgf-β、组织纤溶酶原激活剂。三维基质也可以没有任何这些生长因子。

通常，三维基质是生物相容性基质的三维结构。它优选包含胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸、甲基纤维素、层粘连蛋白和/或藻酸盐。基质可以是凝胶，特别是水凝胶。有机化学水凝胶可以包含聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和具有大量亲水基团的共聚物。水凝胶包含亲水的聚合物链的网络，有时以胶体凝胶发现，其中水是分散介质。水凝胶是高吸收性(其可以含有超过99重量％的水)天然或合成聚合物。水凝胶由于其相当大的水含量，还具有与天然组织非常相似的柔性程度。三维基质或其组分(尤其是ecm或胶原)可能仍保持在产生的组织培养物中。优选地，该三维基质是胶原基质，优选地其含有i型和/或iv型胶原。

用作融合起始材料的第一、第二和任选地进一步组织也可以在如上所述的三维基质中培养或分化——当然，如上所述，合适的生长因子也可以用于分化为所期望的组织类型。因此，本发明还提供了在三维基质中培养细胞，优选干细胞并使细胞分化为将在本发明方法中进一步使用的第一和/或第二和/或进一步的组织的步骤。本发明还提供使用已经在三维基质中培养的组织。

优选地，将第一组织发育至感兴趣的分化阶段与将第二组织发育至不同的感兴趣的分化阶段是分开的。分开第一和第二组织的分化(以及如果意图使用的话，以及还有进一步组织)允许更好地控制分化。当然共同分化也是可能的，至少至某个阶段，例如朝向通用的器官目的地，如一般的神经元组织或如上所述任何其他器官或组织类别的，分开向特定的组织亚型，如背侧或腹侧组织分化。分开分化可以是例如在分开的容器，例如不同的小瓶、烧瓶或皿中。

特别地，提供了包含第一和/或第二组织的人工组织培养物。此类培养物可以从细胞或细胞的聚集体体外培养。培养物特别地不是体内发育的脑或其组织样品的培养物。用作产生本发明的起始块的第一和第二组织优选是可分开的，即尚未一起培养。它们可以分开而无需断开细胞或ecm(细胞外基质)键，例如通过切割或撕裂。

然后将第一和第二组织放置在允许通过生长融合的接近处。可以将组织直接相邻放置或之间留有很小的空间(例如，由基质材料填充，例如上述三维基质的基质材料)，这允许通过生长连接组织。此类距离可以是0.001μm至50μm，优选0.01μm至20μm或0.1μm至10μm或高达1μm。将所述第一和第二组织放置在足以通过生长融合的接近处并允许第一和第二组织生长并彼此融合的步骤优选地在悬浮培养中进行，例如在放置在充足的培养基或基质(例如3d基质如水凝胶)中后。

在连接期间以及还有之后，优选地在三维基质中培养组织。因此，如上所述，将第一和第二(以及任选地进一步)组织放置在三维基质材料(优选为水凝胶)内。然后，组织将继续生长并融合以形成双分化或多分化组织。双分化或多分化组织可以继续生长或维持在三维基质如水凝胶中以进一步发育。此类进一步的发育可以包括允许细胞从一种组织类型迁移到另一种组织类型。组织类型是那些由原始的分开的第一和第二组织(如果存在的话，任选地进一步组织)产生的组织。因此在优选方案中，本发明包含在所述双分化或多分化组织中将细胞从第一组织迁移到第二组织。

优选地，即使在连接(融合)之后，仍要进一步培养组织。连接后，可以观察到令人感兴趣的过程，例如组织类型之间的细胞迁移。可发生进一步的发育。优选地，双分化或多分化组织在连接后培养至少5天，优选在连接后培养至少10天。

在本发明的优选实施方案中，组织是神经元组织，特别地，本发明的双分化或多分化组织是脑类器官。脑类器官例如公开于wo2014/090993、pct/ep2017/050469、lancaster等人、lancaster&knoblich(均同上)中。类器官是在三维上体外产生的器官的微型化和简化的形式，其显示出现实的显微解剖。它们衍生自来自组织的一种或几种细胞，胚胎干细胞或诱导多能干细胞，由于其自我更新和分化能力，它们可以在三维培养中自我组织起来。鉴于相应的生长或分化因子刺激物，第一、第二和任选地进一步组织可以已经是类器官或能够发育成类器官。优选地，至少将双分化或多分化组织培养成类器官，其然后成为双分化或多分化类器官。

在优选方案中，至少第一组织包含神经元组织，优选地包含外放射状神经胶质、皮质脑室下区和皮质内纤维层(和/或包含神经祖细胞和神经元)。或者或另外，特别是另外，优选地至少第二组织包含神经元组织，优选地包含外放射状神经胶质、皮质脑室下区和皮质内纤维层(和/或包含神经祖细胞和神经元)。这些部位、区域(zone)和层是晚期发育的脑类器官的标志，并且优选存在以研究晚期神经发育。优选地，双分化或多分化组织包含神经元组织，优选地包含外放射状神经胶质、皮质脑室下区和皮质内纤维层(和/或包含神经祖细胞和神经元)。

优选地，第一组织的分化阶段包含腹侧前脑祖组织或吻腹侧前脑组织。向腹侧或腹侧样组织类型的分化可以通过wnt抑制和/或shh信号传导增强来引发。可以用于处理第一组织的细胞的合适的wnt抑制剂是iwp2(“wnt产生抑制剂-2”，例如cas号：686770-61-6)。可以用于处理第一组织的细胞的合适的shh信号传导增强剂是sag(“平滑激动剂”，例如cas号：364590-63-6)。可以使用如实施例中所述的浓度。wnt抑制和/或shh信号传导增强优选与神经诱导(即分化祖细胞朝向神经组织发育)同时发生。同样优选地，第二组织的分化阶段包含背侧前脑组织或没有分化为腹侧或背侧前脑的神经外胚层。向背侧或背侧样组织类型的分化可以通过shh活性抑制引发。可以用于处理第二组织的细胞的合适的shh活性抑制剂是环巴胺(cyclopamine)a(cyca)。可以使用如实施例中所述的浓度。shh抑制优选与神经诱导(即分化祖细胞朝向神经组织发育)同时发生。优选地，双分化或多分化组织包含处于一个组织部位(对应于第一组织)的腹侧前脑祖组织或吻腹侧前脑组织，以及处于另一个部位(对应于第二组织)的没有分化为腹侧或背侧前脑的背侧前脑组织或神经外胚层。简而言之，腹侧和背侧组织允许观察到晚期神经发育，例如正在迁移的神经细胞，特别是gaba能神经元细胞，例如形成中间神经元的那些。此类细胞可以迁移出腹侧部位，因此其优选地存在于本发明的第一组织中和/或双分化或多分化组织中。

优选地，将双分化或多分化组织分化以发育为神经板或进一步发育为神经管。神经板或神经管可以存在于本发明的双分化或多分化组织中。

在本发明的优选的实施方案中，将第一组织培养到至少100μm，优选至少150μm，特别优选至少200μm的大小。同样优选地，将第二组织培养到至少至少100μm，优选至少150μm，特别优选至少200μm的大小。优选地，将第一和第二组织的大小培养至大约相同的大小，之后允许融合以形成双分化或多分化组织。大约相同的大小意指体积相差至多40％，优选至多30％、至多20％或至多10％。“大小”是指3d空间中最长的维度。优选地，组织是球形的，特别是最短维度不小于最长维度的20％，特别地不小于最长维度的30％或不小于40％。优选地，第一和/或第二组织的体积为至少1x10⁶μm³，特别优选至少2x10⁶μm³、至少4x10⁶μm³、至少6x10⁶μm³。双分化或多分化组织可以具有相同的大小、形状和体积，或甚至更大的大小和体积，例如至少8x10⁶μm³、至少10x10⁶μm³、至少15x10⁶μm³的体积和/或至少250μm，特别优选至少350μm的大小。

第一和第二组织通常是小的细胞聚集体，并且可以具有至多2mm，优选至多1250μm或至多800μm的大小，例如具有至多8mm³、至多2mm³或至多1mm³的体积。在一些实施方案中，双分化或多分化组织可以更大，具有至多15mm，优选至多10mm或至多5mm的大小，例如具有至多60mm³、至多30mm³或至多10mm³的体积。

第一组织和第二组织可以表达某些分化表达标志物，或者缺乏此类表达标志物的表达，作为特异性分化的信号。表达标志物是这两种组织的不同分化的迹象。

优选地，本发明的第一组织和/或双分化或多分化组织包含细胞，其表达dlx2。dlx2在腹侧前脑身份的细胞中得以表达。优选地，这种组织类型包含在本发明的组织中。

优选地，本发明的第一组织和/或双分化或多分化组织包含细胞，其表达gsx2。gsx2在背-外侧神经节隆起和尾神经节隆起身份的细胞中得以表达。优选地，这种组织类型包含在本发明的组织中。

优选地，本发明的第一组织和/或双分化或多分化组织包含细胞，其表达nkx2-1。nkx2-1在腹-内侧神经节隆起身份的细胞中得以表达。优选地，这种组织类型包含在本发明的组织中。

优选地，本发明的第一组织和/或双分化或多分化组织包含细胞，其表达lhx6。lhx6在腹-内侧神经节隆起身份的亚部位的细胞中得以表达。优选地，这种组织类型包含在本发明的组织中。

优选地，本发明的第一组织,第二组织和/或双分化或多分化组织包含细胞，其表达foxg1。foxg1在背侧皮质身份的细胞中得以表达。优选地，这种组织类型包含在本发明的组织中。

优选地，本发明的第二组织和/或双分化或多分化组织包含细胞，其表达tbr1。tbr1在背侧前脑身份的细胞中得以表达。优选地，这种组织类型包含在本发明的组织中。

优选地，本发明的第二组织和/或双分化或多分化组织包含细胞，其表达tbr2。tbr2在背侧皮质身份的细胞中得以表达。优选地，这种组织类型包含在本发明的组织中。

本发明的双分化或多分化组织可以在类似产生它们的第一和第二组织的组织类型之间含有融合部位。此类融合的部位可以允许组织类型的部位并置，从而产生作为连续组织的组织，其中一侧是第一组织类型的，而另一侧是第二组织类型的。

优选地，第一和/或第二组织表达可检测标志物，该可检测标志物是来自第一和第二组织的组的另一者不表达的。在优选的实施方案中，同样适用于进一步组织(如果存在的话)。不应将可检测标志物与上一段的表达标志物混淆。在此，可检测标志物是指引入(例如用于重组表达)第一和/或第二组织的细胞中作为所述组织的标记物的标记物。重点是易于检测和测量，例如在荧光标志物的情况下。可检测标志物优选提供光信号，例如颜色或荧光。可检测标志物可以用于追踪遍及双分化或多分化组织的第一或第二组织来源(组织类型)的细胞。如所述，细胞可以在组织类型之间迁移和行进。

本发明还提供了通过本发明的方法可获得的双分化或多分化组织。根据本发明的方法，当在体外进行时，则也在体外提供组织。或者，可以将其植入到非人动物，例如啮齿动物中。

本发明提供了具有不同分化阶段的至少两种组织类型的双分化或多分化组织，其中组织类型的至少一种包含腹侧神经元组织，并且至少另一种组织类型是基本上非腹侧的，但含有占基本上非腹侧组织的细胞的不超过5％的来自腹侧神经元组织的迁移细胞。该组织也可以在体外提供或植入到非人动物，例如啮齿动物中。体外与上述意义相同，优选将组织在容器如小瓶中提供。它可以悬浮或可悬浮(即不固定在容器的壁上)提供。

由于根据发育至不同分化阶段的组织的用途，本发明的组织是不同组织的融合的产物，因此本发明的双分化或多分化组织将反映并包含这些不同的组织融合。优选的是如上所述的任何发育阶段，例如腹侧或背侧发育的组织。其他实施方案提供了健康的和疾病的发育阶段的融合物，例如选自神经精神疾病如癫痫、自闭症和精神分裂症的疾病，如上所述。两种不同疾病状态的融合也是可能的。此类融合物显示出根据疾病的特征性细胞迁移或其损伤。迁移可以在其他(通常是健康的)组织中监视。健康意指未患病状态。优选地，在双分化或多分化组织中仍然存在三维基质，例如水凝胶。

优选地，用于植入的非人动物是免疫受损的以避免组织排斥。

此类组织构成了其中腹侧分化的第一组织与另一个非腹侧分化的组织，如背侧分化的第二组织或神经元分化的组织(没有进一步的腹侧分化)融合的组织，如以上更详细地讨论的。当然，上述所有优选实施方案也都涉及该组织，特别是部位、大小和检测标志物或表达标志物等实施方案。例如，组织类型的至少一种表达可检测标志物，优选荧光标志物，其不由双分化或多分化组织的另一种组织类型表达。这允许容易检测所述组织及其细胞，所述细胞可以迁移到其他组织类型。优选地，具有标志物的组织类型是腹侧分化的第一组织。

提供的组织可以具有正在迁移或已迁移的细胞。此类细胞可以已经移动到基本上非腹侧的(例如背侧的)另一种组织类型。在非腹侧组织中来自腹侧神经元组织的迁移细胞可以占基本上非腹侧组织的细胞的不超过5％(非腹侧/第二组织的细胞量的％)。优选地，在非腹侧组织或者一般地第二或任选地进一步组织中找到5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少或者1％或更少的腹侧细胞或一般地第一组织的细胞(在找到腹侧/第一组织细胞的组织的细胞量的％)。

双分化或多分化组织优选在其最长维度上具有100μm至10mm的大小，或者已经提到的任何大小、形状或体积。优选的是250μm至10mm或500μm至5mm的大小。

本发明的双分化或多分化组织可以以球状体的形式提供，例如如上文所述以任何给定的形状或纵横比(维度比)。双分化或多分化组织也可以作为组织切片提供。可以如上所详述培养双分化或多分化组织，然后可以获得组织切片。此类切片可以具有例如3μm至100μm或5μm至50μm或10μm至30μm，优选约20μm的厚度。其他维度，例如如上所述的最长维度仍可以通过切片显示。切片切出优选在冷冻状态下进行。切片可以用于检测组织切片中的检测和/或表达标志物。切片可以用于显微成像。

该组织认为是人工组织。“人工”意指其在体外培养，并具有人工培养的某些特征，如大小、稠度、形状和细胞构造。形状可以是不规则的，并且与天然存在的组织不同，并且由于大小限制，细胞构造可以有所不同。具体而言，“人工”排除天然存在的组织和器官及其部分，例如天然组织切片。三维基质可以仍在培养物中和/或人工组织可以具有通过在此类基质中生长而确定的形状。例如，培养物可以通过在三维基质(特别是如上所述的那些)中生长可获得。优选地，本发明的组织是类器官，尤其是脑类器官。

组织可以是以上提到的任何组织类型的，例如神经元组织、结缔组织、肝组织、胰腺组织、肾组织、骨髓组织、心脏组织、视网膜组织、肠组织、肺组织和内皮组织；并且可以包含任何细胞，例如以上提到的干细胞。

本发明提供了类器官融合测定法，其允许分析人皮质中间神经元迁移。这项技术增强了可用于脑类器官的表型测定的全集(repertoire)，并继而提高了可以用于研究人神经系统疾病的发育细胞生物学的表型的复杂性。

例如，提供了测试或筛选影响双分化或多分化组织发育的候选化合物的方法，所述方法包括使本发明的任一种方法中的细胞或组织与候选化合物接触或使本发明的组织与候选化合物与组织接触并且在培养物中维持所述接触的组织，并且与不与所述候选化合物接触的所述组织相比观察到组织中的任何发育变化。

接触步骤是待发育为本发明的组织的细胞或组织或其前体组织(如第一、第二和/或任何进一步组织)的处理步骤。候选化合物可以是小有机分子，例如具有100da至5000da的质量的分子。其他候选化合物可以是生物分子，如蛋白质、核酸或碳水化合物。另外的候选化合物可以是散装化学品，如溶剂，例如乙醇(当然以通常对细胞可行的浓度使用)或聚合物。处理应在可以预期化合物的特定作用的浓度下进行。各种浓度可以并行测试。通常，候选化合物的浓度为1ng/ml至100mg/ml，例如100ng/ml至1mg/ml。

特别优选地，本发明的方法或组织可以用于测试候选药物作为候选化合物中的副作用。优选地，通过监测任何变化来研究先天性病症的原因、性质和可能的治愈。例如，当与潜在的致病物质/环境变化/遗传修饰接触时，可以通过监测本发明的组织的发育和/或生长来测试致畸作用。

通过这种方法，可以研究受候选化合物或其他环境影响的发育作用或病症。如果仅在初始分化期间预期作用，例如当使细胞分化并培养为第一/和/或第二或任选地进一步的组织时，接触细胞是足够的。如果在随后的分化和/或分化后的细胞排列或生长期间预期作用(例如器官特异性致畸物)，则接触第一和/或第二或任选地进一步的组织可以是足够的。在融合之后或融合期间也可以接触组织。当然，这可以与细胞分化期间的接触组合。例如，此类致畸化合物是乙醇，若胚胎或胎儿在发育期间暴露于乙醇，则它导致胎儿酒精病症，例如胎儿酒精综合征。乙醇对发育中组织(例如发育期间的脑组织)的作用可以用本发明的方法研究。

根据一个优选方案，本发明提供了研究发育组织作用的方法，其包括：本发明的方法期间的任何阶段，i)降低或增加细胞中感兴趣的基因的表达，或ii)向细胞施用候选药物，其中所述细胞朝向根据本发明的双分化或多分化组织培养，优选在分化为组织类型和/或融合期间。

还提供了筛选适合于治疗感兴趣的发育组织缺陷的候选治疗剂的方法，其包括进行本发明的分化和/或融合方法，并在该方法期间的任何阶段(如上所述)，优选在所有阶段对所述细胞施用候选试剂。

还提供了针对发育作用，特别是先天性病症作用测试候选药物的方法，其包括向根据本发明的组织或在方法期间(例如在分化、第一/第二组织的发育期间、融合期间或融合后)施用候选药物并确定所述组织的细胞的感兴趣的活性，并将所述活性与未施用所述候选药物的组织的细胞活性进行比较，其中差异活性(相对于对照)指示发育作用。

还提供了化合物和物质的试剂盒。试剂盒可以包含进行任何本发明的方法的手段。当然，由于一些是标准化学品或通常可获得，因此不需要包括所有物质。然而，优选地提供核心物质。在其他试剂盒中，提供了较为罕见的物质。当然，本发明的试剂盒或其物质可以组合。试剂盒中的组分通常在分开的容器，例如小瓶或烧瓶中提供。容器可以包装在一起。优选地，试剂盒包含用于进行本发明的方法或其步骤的手册或说明书。

提供了适合于提供根据本发明的组织培养物的试剂盒。试剂盒可以包含腹侧分化诱导剂和背侧分化诱导剂，优选wnt抑制剂和/或ssh增强剂作为腹侧分化诱导剂，并且优选ssh抑制剂作为背侧分化诱导剂。没有腹侧或背侧分化活性的神经生长或分化因子也是可能的。此类试剂盒可以用于神经分化，例如以生成脑类器官。在替代试剂盒中，可以包括上述任何组织、组织类型和器官的生长或分化因子。

优选地，试剂盒包含如上所述的三维基质，或其组分以生成此类三维基质。可以以固体状态(例如冻干状态)提供基质组分，以将其重构为基质，例如通过水合作用。试剂盒中可以包括如上所述的任何基质或其组分。优选地，基质是水凝胶，尤其是如上所述的胶原水凝胶。试剂盒可以包含此类可重构的(优选胶原的)组分。进一步优选的基质组分是碳水化合物，特别是以聚合物形式(多糖)。优选的多糖是琼脂糖。

任何试剂盒可以进一步包含细胞生长营养物，优选dmem/f12、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、2-巯基乙醇或其任何组合。实施例中提及的任何化合物均可以包括在试剂盒中。

预期可以就本文所述的任何其他方法或产品而言执行本文所述的任何方法或产品，并且可以组合不同的实施方案。

最初提出的权利要求书旨在涵盖任何提交的权利要求或提交的权利要求的组合的多项从属的权利要求。预期可以就本发明的任何方法或产品而言执行本文所讨论的任何实施方案，反之亦然。可以就不同条件而言应用或执行就特定条件讨论的任何实施方案。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。

“包含”理解为开放式术语，即允许另外的组分或物质的步骤。“由…组成”理解为封闭式术语，不具有任何另外的组分或物质的步骤。

在整个本申请中，术语“约”可以用于表明值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差，或者在设定值中可以指±10％。

通过以下附图和实施例进一步描述本发明，而不必限于本发明的这些实施方案。

附图：

图1.腹侧药物处理产生含有腹侧前脑的脑类器官。(a)在神经诱导步骤期间具有腹侧药物模式化应用(2.5μmiwp2和100nmsag)的脑类器官方案的示意图。(b)人冠状脑切片的示意图，表明用于qpcr/ihc分析的模式化标志物的部位表达。(c)不同脑部位标志物的表达的qpcr分析，显示腹侧脑类器官中腹侧前脑身份增加以及背侧前脑身份减少。将值绘制为相对于参照基因tbp的相对表达水平(2^-δct)。每个数据点对应于8-10个类器官的合并批次。数据表示为平均值±sd，并使用student’st检验(df＝9)对对照(n＝6批次)对iwp2+sag(n＝5批次)处理进行统计学显著性检验。(d-e)对照和腹侧脑类器官的免疫染色分析的宽视野图像表明腹侧类器官的腹侧前脑身份(d)，以及对照类器官的背侧前脑身份(e)。比例尺为200μm。

图2.脑类器官的融合允许腹侧和背侧前脑组织之间的细胞迁移。(a)脑类器官融合共培养方法的实验概述。(b)在整个类器官融合规程中的不同阶段的代表性宽视野图像。(c)腹侧::背侧类器官融合的免疫染色冰冻切片的平铺扫描(tile-scan)图像表明腹侧(nkx2-1⁺)和背侧(tbr1⁺)部位的组合。(d)来自不同龄期的类器官的免疫染色的腹侧::背侧类器官融合物冰冻切片显示gfp⁺细胞从腹侧迁移到背侧组织中的时间进程。(e)在来自32(n＝3个类器官)、46(n＝3)、58(n＝4)和80(n＝4)日龄的类器官的切片中对背侧组织中的gfp⁺细胞密度进行定量。数据表示为平均值±sd，并使用单因素anova[f(3,10)＝12.59，p＝0.0010]与用于组间比较的tukey事后检验进行统计学显著性检验。比例尺为500μm。

图3.混合脑类器官融合物的组织组分表明从腹侧到背侧部位中的最稳健的迁移。(a)创建脑类器官融合物，其含有腹侧(v)、对照(c)或背侧(d)经处理的组织的不同组合。组分用gfp(绿色)或tdtomato(红色)标记。(a)约80日龄的类器官融合物的整装图像显示在腹侧-对照和腹侧-背侧类器官融合物中，tdtomato⁺组织中出现了gfp⁺点(箭头)。(b)免疫染色的混合类器官融合物冰冻切片的平铺扫描共聚焦图像显示gfp⁺细胞跨过中线(虚线)迁移到gfp-类器官中。(c)来自组织切片的gfp^-组织中gfp⁺细胞密度的定量。每个数据点都对应于单独的类器官，并且数据表示为平均值±sd，其中使用单因素anova[f(3,19)＝8.214，p＝0.0010]与用于组间比较的tukey事后检验进行统计学显著性检验。与对照::对照(n＝4个类器官)和背侧::背侧(n＝4)融合物相比，腹侧::对照(n＝7个类器官)和腹侧::背侧(n＝8)融合物显示gfp⁺细胞的最多迁移。比例尺为500μm。

图4.gaba能中间神经元在融合的背侧-腹侧脑类器官之间迁移。(a)免疫染色的80日龄腹侧::背侧类器官融合物冰冻切片的整个类器官共聚焦平铺扫描图像。可以观察到gfp⁺细胞，其从gfp⁺腹侧跨过融合中线(虚线)迁移到gfp^-背侧组织中。可以以类似于gfp的模式观察到gaba能标志物gad1(箭头)。(b-c)(a)中类器官融合物的外周(b)和内部部位(c)的放大图。可以在这两个部位(箭头)中观察到表达gad1的gfp⁺细胞。(d)在80日龄的腹侧::背侧类器官融合物冰冻切片的背侧部位中gfp/reln免疫染色的共聚焦图像，显示迁移的gfp⁺细胞(箭头)不表达reln。(e)在58日龄的腹侧::背侧类器官融合物冰冻切片的背侧部位中gfp/dcx/neun免疫染色的共聚焦图像，显示正在迁移的gfp⁺细胞是dcx⁺不成熟的神经元(黄色箭头)，并且一些是成熟的(dcx⁺/neun⁺)神经元(蓝色箭头)。比例尺为(a)500μm，(b-e)20μm。

图5.在腹侧::背侧脑类器官融合物中正在迁移的中间神经元表达各种中间神经元亚型标志物。(a-h)在80日龄的腹侧::背侧类器官融合物冰冻切片的背侧部位中免疫染色的共聚焦图像。gaba能标志物gad1或vgat的表达用于鉴定中间神经元。观察到表达gad1或vgat的各种迁移的gfp⁺中间神经元的实例，它们表达mge衍生的中间神经元标志物sox6(a)或亚型标志物som(b)、npy(c)、cb(d)和pv(e)。迁移的gfp⁺中间神经元也表达lge/cge衍生的中间神经元标志物sp8(f)、coup-tfii(g)或亚型标志物cr(h)。比例尺为20μm。缩写：som＝促生长素抑制素，npy＝神经肽y，cb＝钙结合蛋白，pv＝小白蛋白，cr＝钙网膜蛋白，vgat＝囊泡gaba转运蛋白，gad1＝谷氨酸脱羧酶1。

图6.脑类器官融合物中正在迁移的细胞表现出在切向迁移的中间神经元的迁移动力学，并且对cxcr4活性敏感。(a)用于迁移动力学的短期延时成像或长期药物处理的类器官融合物切片培养测定的示意图。显示了整个腹侧::背侧类器官融合物切片的代表性平铺扫描图像，其中腹侧gfp⁺部位标记为绿色且未标记者或tdtomato背侧部位以红色画出轮廓。(b)中所示的含有正在迁移的细胞的部位用黄色框标出。(b)显示了正在迁移的gfp⁺细胞的3天延时实验的静止图像。由于细胞体遵循引导过程之一，分支的引导过程表现出伸展的(封闭箭头)和缩回的(开放箭头)分支两者。(c)具有似乎为轴突生长锥的簇的延伸神经突(封闭箭头)在整个视野中沿一个方向行进。(d)迁移到来自未经处理(对照)或用cxcr4抑制剂(amd3100)处理的长期类器官融合物切片培养物的tdtomato⁺背侧部位(红色轮廓)中的gfp⁺细胞的宽视野图像。(e)定量迁移的gfp⁺细胞密度，其中数据表示为平均值±sd，其中将对照(n＝3个类器官)与amd3100(n＝3)处理进行比较，使用student’st检验(df＝4)进行统计学显著性检验。每个数据点代表来自单独类器官的一个切片。在经amd3100处理的切片培养物中观察到较少的正在迁移的细胞。比例尺为(a)500μm，(b-c)50μm和(d)500μm。

实施例

实施例1：细胞培养

饲养物依赖性人诱导多能干细胞(hipsc)(systemsbiosciences，目录号sc101a-1)是从systembiosciences获得的，具有多能性验证且无污染。在明胶(pbs中0.1％明胶)包被的6孔培养板上使用人胚胎干细胞(hesc)培养基将饲养物依赖性hipsc与经照射的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)饲养细胞(mti-globalstem，目录号6001g)一起培养，所述人胚胎干细胞(hesc)培养基为：dmem/f12(invitrogen)，含有20ng/mlbfgf(由imba研究所分子生物学服务核心机构(imbainstitutemolecularbiologyservicecorefacility)生产)、3.5μl/500ml的2-巯基乙醇介质、20％knockout血清(invitrogen)、1％glutamax(invitrogen)、1％mem-neaa(sigma)和3％fbs。从wicell获得无饲养物h9人胚胎干细胞(hesc)，具有经验证的正常核型且无污染。使用mtesr1(stemcelltechnologies)在hesc合格的基质胶(corning，目录号354277)包被的6孔板上培养无饲养物hesc。将所有干细胞维持在处于37℃的5％co2培养箱中。如前所述(lancaster&knoblichnatprotoc9,2329–2340(2014))，使用标准规程来培养和分离hpsc。常规测试所有细胞系的污染并确认支原体阴性。

实施例2：克隆/分子生物学/生成hpsc细胞系

为了对细胞进行遍在的荧光标记，如先前用talen技术所做的(hockemeyeretal.nat.biotechnol.27,851–857(2009))使用aavs1sa-2a-puro供体载体作为模板将报告物构建体插入到hpsc中的安全港aavs1基因座中。创建了含有核心鸡hs4绝缘子的侧翼串联重复序列(2xchs4)的修饰主链。将荧光报告物表达盒插入侧翼绝缘子序列之间。将以下表达构建体插入到ipsc中：1)2xchs4-ef1α-egfp-sv40-2xchs4，2)2xchs4-ef1α-tdtomato-sv40-2xchs4。在无饲养物的h9hescs中，插入2xchs4-cag-egfp-wpre-sv40-2xchs4构建体以增强gfp表达，用于延时成像实验。

使用与制备eb¹¹相同的细胞解离规程，将hpsc制备为单细胞悬液用于核转染。每次含有1μg每种talen引导物以及3μg的供体质粒dna的核转染使用800,000个细胞遵循制造商指南，将amaxa核转染器(lonza)与干细胞试剂盒1一起使用。核转染后，将总共600μl核转染溶液中的200μl涂板到10cm细胞培养皿上。使来自单细胞的集落生长4天，然后用嘌呤霉素(puro)(jenabio-science，目录号nu-931-5)处理。对于饲养物依赖性细胞，应用1.1μg/ml嘌呤霉素，以及对于无饲养物细胞，应用0.7μg/ml。嘌呤霉素处理持续5-7天，直到存活的集落足够大以手动挑取并转移到24孔板中。当从24孔板中分离集落时，半数的细胞用于基因分型，而另一半扩增到12孔以及然后6孔形式，然后用于进一步的实验。为了进行基因分型，使用quickextract溶液(epicentre)提取dna，并使用以下引物进行pcr以鉴定正确靶向的aavs1插入：1)puro(aavs1_puro-fwd:tcccctcttccgatgttgag(seqidno:1)和aavs1_puro-rev:gttcttgcagctcggtgac(seqidno:2))，2)egfp(aavs1_egfp-fwd:gaacggcatcaaggtgaact(seqidno:3)和aavs1_egfp-rev:cttcttggccacgtaacctg(seqidno:4))，以及3)tdtomato(aavs1_tdtomato-fwd:ctacaaggtgaagatgcgcg(seqidno:5))和(aavs1_tdtomato-rev:tccagcccctcctactctag(seqidno:6))。为了确定插入是杂合的还是纯合的，使用另外的pcr引物测试wt等位基因的存在：4)wt(aavs1_wt-fwd:tcccctcttccgatgttgag(seqidno:7)和aavs1_wt-rev:tccagcccctcctactctag(seqidno:8))。通过用cellbanker2溶液(amsbio，目录号11891)冷冻来对具有正确靶向的杂合或纯合插入的细胞克隆进行建档和/或对所述细胞克隆进行培养以进行进一步的实验。

实施例3：脑类器官生成和融合

遵循先前描述于wo2014/090993、lancasteretal.,nature501,373–379(2013)、lancaster&knoblich,science345,1247125–1247125(2014)和lancaster&knoblich,natprotoc9,2329–2340(2014)中的方案在略有修改的情况下生成脑类器官。在使用以下处理之一的方案的神经诱导步骤(约第5-11天)期间应用药物模式化处理：1)对照，无药物，2)腹侧，2.5μmiwp2(sigma，目录号i0536)和100nmsag(millipore，目录号566660)，3)背侧，5μmcyca(calbiochem，目录号239803)。药物储备液的创建如下：iwp2(5mm于dmso中)、sag(1mm于h2o中)和cyca(5mm于dmso中)。嵌入在基质胶(corning，目录号356235)中后，在含有25ml的分化培养基的10cm细胞培养皿中培养类器官，并且在第一次培养基更换后维持在轨道摇床上，其中每5-7天进行培养基更换。方案的第40天后，当类器官开始从基质胶液滴中生长出来时，对分化培养基中补充1％基质胶。

为了创建类器官融合物，使eb分开生长，并使用如上所述的对照、背侧或腹侧方案分别进行模式化。在基质胶嵌入期间，将两个eb转移到同一石蜡膜孔中，并嵌入在基质胶的单个液滴(约30μl)中。使用20μl移液器尖端将eb轻轻推到尽可能近，以确保eb将以极其接近保持在凝固的基质胶液滴的中部内。

实施例4：rna提取/qpcr

对于每个药物模式化处理组，在第30-40天将8-12个类器官收集到2ml无rna酶的管中，并且在整个规程中在冰上冷却。在冷的pbs中将类器官洗涤3次，然后通过在冷却的cellrecoverysolution(corning，目录号354253)中于4℃温育类器官1小时使基质胶溶解。溶解的基质胶通过在冷的pbs中冲洗3次而除去。使用rneasymini试剂盒(qiagen)提取rna。使用2μg的总rna和superscriptii(invitrogen)酶根据制造商的方案进行cdna合成。使用sybrgreen预混液(promega)在biorad384孔仪(cxf384)上使用以下反应方案进行qpcr反应：1)95℃3分钟，2)95℃10秒，3)62℃10秒，4)72℃40秒，5)转到2，40个循环，6)95℃1分钟，7)50℃10秒。通过使用tbp作为参照基因计算δct值，在excel中进行量化。数据表示为相对于tbp的表达水平(2^-δct)。

实施例5：脑类器官切片培养和药物处理

通过振动切片机对类器官融合物切出切片生成切片培养物。将类器官融合物组织包埋在4％低熔点琼脂糖(biozym，目录号850080)中，并在冰冷的pbs(无ca²⁺/mg²⁺)中切出切片，以形成200-250μm的切片。将切片转移到6孔细胞培养板中的millicell有机型插入物(millipore，目录号picm01250)上。对于延时成像，将切片培养1-2天，然后封固(mount)用于使用转盘共聚焦显微镜(visiscope)进行成像。从培养物插入膜上切去切片并倒置到玻璃底皿上。通过将细胞培养插入物放置在切片的顶部并使用真空油脂将其附着于皿来固定切片。对于药物处理，首先将长期切片培养物在分化培养基(+5％fbs)中培养过夜。然后将培养基更换为新鲜培养基(对照)或含有cxcr4抑制剂amd3100(sigma，#a5602)的培养基，并再培养3周，然后进行组织固定和进一步的免疫荧光处理。

实施例6：组织学/切出冰冻切片/免疫荧光

在所期望的龄期收集类器官组织，在pbs中冲洗3次，并在4％pfa中于4℃固定过夜。第二天，将组织在pbs中冲洗3次，并在pbs中的30％蔗糖中于4℃冷冻保护过夜。然后将组织在30％蔗糖/pbs和o.c.t.冷冻包埋培养基(sakura，目录号4583)的1:1混合物中温育2-4小时。接下来，将2-4个类器官的组从蔗糖/oct混合物转移至冷冻模具(cryomold)中，并用o.c.t.填充。将包埋的组织在干冰上冷冻，然后置于-80℃中用于长期储存，直至进行低温恒温器切片。使用低温恒温器(leica)将冷冻的类器官组织切成20μm切片，并收集在superfrostultraplus载玻片上。排列组织切片，使得顺序收集每第10个切片，直至每个载玻片含有每组织块的8-10个切片。将切片干燥过夜，然后用于免疫荧光标记，或储存于-20℃直至准备好染色。

在载玻片上直接对组织切片进行免疫荧光。o.c.t.通过使用载玻片架(sigma，wash-n-dry)在pbs中洗涤10分钟来除去。将切片使用4％pfa直接在载玻片上于rt后固定10分钟，然后在pbs中清洗3x10分钟。使用疏水性pap笔勾勒出组织区的轮廓。使用具有0.05％叠氮化钠的pbs中的5％bsa/0.3％tx100进行透化/封闭，并在黑暗的加湿载玻片箱中于室温(rt)温育30分钟。以所期望的稀释度将一抗(可以在方法部分的末尾找到使用过的一抗和二抗的表)加入到抗体溶液(具有0.05％叠氮化钠的pbs中的5％bsa、0.1％tx100)中并于4℃温育过夜。将载玻片在pbs中冲洗3次，然后在轨道摇床上于rt在pbst中洗涤3x10分钟。将二抗以1:500加入抗体溶液中，并于室温温育2小时。加入dapi溶液(2μg/ml)5分钟，然后如一抗施加后完成一样洗涤载玻片，其中使用pbs最后洗涤。使用dako封固介质(agilentpathologysolutions，目录号s3023)封固盖玻片，并允许其硬化过夜。然后将载玻片储存于4℃直至成像，或于-20℃进行长期储存。

对于长期切片培养，将在细胞培养插入物上培养的切片用pbs冲洗，然后在4％pfa中于4℃固定2天。将切片在pbs中洗涤3×10分钟，然后如对载玻片上的冰冻切片所进行一样透化/封闭。一抗和二抗温育于4℃进行过夜，然后在每个步骤后在pbs中洗涤3x10分钟。将切片封固在含有dapi的vectashield(vectorlabs)中。

实施例7：成像/显微术

使用zeissplan-neofluar2.5x0.085和zeisslda-plan10x0.25ph1物镜，使用zeissaxiovert.a1宽视野显微镜和axiocamerc5s相机(zeiss，zeissgmbh)进行荧光细胞培养成像。分别记录tdtomato和gfp通道两者，并且随后使用imagej的fiji包进行伪着色和合并。

使用solasm2照明源、(5x0.15plan-neofluar、10x0.3plan-neofluar、20x0.5plan-neofluar)物镜和hamamatsuorcaflash4相机，使用axioimagerz2(zeiss，zeissgmbh)对ihc染色和长期切片培养物进行宽视野成像。使用的滤光片为ex360/40nmem445/50nm、ex480/40nmem535/50nm和ex560/55nmem645/75nm。

使用具有20x0.8plan-apochromat干物镜的zeisslsm700axioimager进行共聚焦成像。405nm(5mw)、488nm(10mw)、555nm(10mw)和639nm(5mw)的激光以及与波长对应的滤光片sp490、sp555、sp640和lp490、lp560、lp640一起用于记录。对于整个类器官平铺扫描，使用xy扫描台和zeisszen实现的拼接算法。对于标志物的共定位，以20倍进行z扫描。

使用ex488激光和em滤光片525/50，使用用visitronvisiview软件控制并且在eclipseti-e显微镜(nikon，nikoninstrumentsbv)上安装的yokogawaw1转盘共聚焦显微镜(visiscope，visitronsystemsgmbh，puchheim，germany)获得用于细胞密度计数和延时迁移的经gfp染色的载玻片的成像。使用10x0.45cfiplanapolambda(nikon，nikoninstrumentsbv)物镜与scmos相机pcoedge4.2m记录测量值。使用平铺扫描获取功能进行用于细胞计数的整个ihc切片成像。然后使用fiji中的grid/collection拼接插件⁵¹拼接平铺扫描。对于延时影片，记录了平铺扫描的z栈(stack)。如细胞计数一样进行拼接后，将创建最大z投影，并将z投影时栈用于细胞迁移的全局可视化。使用fiji创建裁剪区域，并保存为未压缩的avi文件。使用handbrake软件将avi文件转换为mp4格式，以生成补充影片。

为了生成图和呈现图像，使用“裁剪”功能，并使用fiji的“亮度/对比度”功能更改最大/最小水平。

实施例8：细胞密度定量

使用fiji的“细胞计数器(cellcounter)”插件手动计数迁移到脑类器官融合物的gfp^-靶部位中的gfp⁺细胞的数量。用roi工具勾勒出类器官融合物中的gfp^-区，并使用“测量”功能计算出面积。将细胞计数除以面积以确定已迁移的gfp⁺细胞的密度。对于迁移时间进程(图2e、f)和类器官融合物混合(图3b、c)实验，使用组织冰冻切片的共聚焦平铺扫描图像进行定量。对于长期切片培养实验(图6d、e)，使用含有gfp^-部位的宽视野5x图像进行计数。

实施例9：统计量

所有图和统计分析均使用prism7(graphpad)生成。当仅比较两组(图1c、6e)时，进行了不成对的双尾student’st检验，对于比较多组的剩余数据，则使用单因素anova与tukey事后检验(图2f、3c)。在检验统计学显著性之前，测试样品的正态性。没有使用统计方法来预先确定样本量。实验的样本量是基于先前具有显示显著性的类似设置的经验估算的。实验不是随机的，并且研究者是非盲性的。

一抗

二抗

qpcr引物

实施例10：通过脑类器官组织的药物模式化的分化增强腹侧前脑身份的产生。

脑类器官方法(wo2014/090993、lancaster等人，都为lancaster&knoblich，均同上)能够产生许多不同的脑部位，包括背侧和腹侧前脑。然而，由于其依赖于内在模式化，因此一些部位的产生是可变的且不频繁的，尤其是更多腹侧(nkx2-1+)中间神经元祖部位。为了增加腹侧前脑中间神经元祖部位的一致性和产量，我们纳入腹侧药物处理(图1a)。我们利用wnt抑制和增强的shh信号传导的组合，以促进吻腹侧前脑身份。腹侧类器官的qpcr分析显示前脑标志物foxg1的表达显著增加(图1b、c)。与对照类器官相比在腹侧类器官中背侧前脑标志物tbr1变得检测不到，而腹侧前脑标志物dlx2显著增加(图1b、c)。为了进一步证实脑类器官组织的成功腹侧化，我们检查了腹侧前脑神经节隆起(ge)亚部位的特异性标志物的表达，该亚部位产生不同亚型的中间神经元。gsx2在背-外侧ge(lge)和尾ge(cge)中表达，nkx2-1在腹-内侧ge(mge)中表达，而lhx6在产生更多腹侧衍生的mge(vmge)中间神经元的mge的亚部位中表达(图1b)。gsx2在对照类器官中表达，但在腹侧类器官中进一步增加(图1c)。nkx2-1和lhx6的表达在对照类器官中检测不到，但在腹侧类器官中大大增加(图1c)。最后，免疫染色证实了qpcr结果，表明在对照和腹侧类器官中foxg1广泛表达，但只有腹侧类器官表达腹侧前脑标志物nkx2-1(图1d)。有趣的是，对照类器官广泛表达了祖神经元(pax6)和早期产生神经元(tbr1)两者的背侧前脑标志物(图1e)。相反，腹侧类器官仅含有pax6⁺或tbr1⁺组织的小部位(图1e)。因此，这些结果证实了腹侧药物处理后以背侧组织为代价成功地产生了腹侧脑类器官。

实施例11：融合的脑类器官组织重演了连续的背侧-腹侧前脑轴和长距离细胞迁移。

为了在单个组织中重建完整的背侧-腹侧身份轴，我们开发了类器官组织共培养方法，我们将其称为类器官“融合”。对照类器官主要产生背侧前脑组织(图1c、e)。然而，用平滑受体抑制剂环巴胺a(cyca)抑制shh活性可以增强从hpsc的2d神经元分化中的背侧前脑身份。因此，为了支持背侧身份，在脑类器官方案的神经诱导步骤期间，用cyca处理类器官(图2a)。在这种方法中，将胚状体(eb)单独进行分化并模式化为背侧(cyca)或腹侧(iwp2+sag)前脑类器官(图2a、b)。分化处理后，将腹侧和背侧eb一起嵌入单个基质胶液滴内(图2a)，并且随着时间的流逝，类器官一起生长并融合(图2b)。对融合的腹侧::背侧类器官的免疫染色显示连续组织的产生，其中一侧对腹侧标志物nkx2-1呈高度阳性，而另一侧对背侧标志物tbr1呈阳性(图2c)。因此，类器官融合方法允许将背侧和腹侧前脑部位在与脑发育期间发生的排列类似的排列中并置。

为了测试细胞是否可以在融合的类器官之间迁移，我们使用了含有遍在的gfp报告物的细胞系来创建腹侧/gfp⁺::背侧类器官融合物。免疫荧光分析显示在gfp^-背侧类器官内许多来自腹侧类器官的gfp⁺细胞(图2d)。在第30天左右观察到少量正在迁移的细胞(图2d、e)。从第30天到第46天，它们的密度急剧增加，但是从第46天到第80天，我们没有观察到显著的增加(图2e)。由于类器官的大小随着龄期而增加，因此迁移细胞的绝对数量必须随时间增加以维持相似的密度。此外，在80日龄的类器官中，细胞似乎在整个背侧部位中分布更为分散(图2d)。因此，基于这些结果，我们将未来的分析专注于60天龄以上的类器官上。

实施例12：混合脑类器官双分化融合物的组织组分表明定向的腹侧到背侧皮质细胞迁移。

在体内脑发育期间，gaba能中间神经元在腹侧前脑祖部位中起源，然后它们迁移至其背侧前脑靶标。为了测试这种定向性是否在融合的类器官中重演，我们改变了它们个别的组织组分的身份(图3)。我们一致地用gfp标记一个类器官并用tdtomato标记另一个类器官，并以起源::靶标(gfp::tdtomato)排列描绘融合物。使用这种范式，我们分析了当差异控制脑类器官融合物的起源和靶标部位的背侧/腹侧身份时的正在迁移的细胞的数量。腹侧::对照和腹侧::背侧融合物的整装成像表明在tdtomato⁺组织内存在gfp⁺斑点(图3a)。相反，在对照:对照或背侧:背侧融合物中很少观察到斑点(图3a)。当分析类器官融合组织的免疫染色冰冻切片时，这种差异甚至更加明显。正在迁移的细胞的最大量发生在腹侧::对照和腹侧::背侧融合物中，而最少的迁移发生在背侧::背侧融合物中(图3b、c)。尽管腹侧::对照融合物中正在迁移的细胞的平均密度与腹侧::背侧融合物没有显著差异，但腹侧::背侧融合物更一致地含有大量的正在迁移的细胞(图3c)。这些数据证实了我们对从腹侧到背侧类器官组织中的定向性偏向迁移的初步观察，并强烈暗示融合的类器官之间的迁移类似于中间神经元迁移。最后，该实验表明腹侧::背侧融合类器官在类器官组织之间产生最稳健的迁移。

实施例13：gaba能中间神经元在融合的脑类器官组织之间迁移。

由于实施例12暗示在腹侧::背侧类器官融合物中的迁移类似于中间神经元迁移，因此我们首先通过检查正在迁移的gfp⁺细胞是否表达gad1(合成gaba的关键酶之一)来测试正在迁移的细胞是否是gaba能的。免疫染色显示，已迁移到靶类器官中的gfp⁺细胞广泛表达gad1(图4a-c)。令人注意的是，当可视化整个类器官时，gad1以与正在迁移的gfp⁺细胞相似的模式表达(图4a)。此外，gad1的表达在类器官边缘附近的部位似乎更强(图4b)，并且远离正在迁移的细胞的起源。因此，中间神经元可以在类器官融合物内从腹侧迁移到背侧部位。

在正在发育的人脑中另一个切向迁移细胞的主要群体是非gaba能的cajal-retzius细胞。这些细胞通过reelin(reln)的表达来鉴定。因此，我们测试了类器官融合物中迁移性的gfp⁺细胞是否也表达reln。令人惊讶的是，尽管在类器官融合物的背侧靶部位中大量存在gfp^-、reln⁺细胞，但我们仍观察到gfp⁺细胞明显缺乏reln的表达(图4d)。因此，我们的数据表明类器官融合物中迁移性的gfp⁺细胞不是cajal-retzius细胞，并且与我们先前的研究结果相结合增强了它们作为gaba能中间神经元的身份。

最后，我们通过分析未成熟的正在迁移的神经元标志物dcx和/或成熟神经元标志物neun的表达来测试正在迁移的细胞是否可以产生成熟的神经元。我们观察到gfp⁺细胞表达dcx(图4e)，证实了它们的神经元身份，并且亚组也表达neun(图4e)。该发现表明正在迁移的gfp⁺细胞是迁移性的神经元(dcx⁺)，而且迁移性的神经元也可以变为成熟的神经元(dcx⁺/neun⁺)。我们的结果共同表明，中间神经元可以在融合的腹侧-背侧类器官之间迁移，并可以变为成熟的神经元。

实施例14：在融合的脑类器官组织中正在迁移的中间神经元产生各种lge/cge和mge衍生的皮质中间神经元亚型。

由于正在迁移的gfp⁺细胞可以变为成熟的神经元(图4e)，并且似乎主要是gaba能中间神经元(图4a、b)，因此我们接下来测试产生了哪些中间神经元亚型。中间神经元是特别异质的，并且可以使用多种分子标志物来鉴定由腹侧前脑内的独特祖先亚群产生的各种亚型。在人中，大多数中间神经元是从mge的nkx2-1⁺部位产生的。我们测试了正在迁移的gfp⁺细胞是否产生mge衍生的中间神经元亚型。在人中，sox6在mge中以及在从该部位出现的未成熟的和成熟的中间神经元中表达。在类器官融合物中，我们在gfp⁺正在迁移的gfp⁺细胞(也呈gad1⁺的gfp⁺细胞)中观察到多个sox6⁺mge中间神经元(图5a)。因此，mge衍生的中间神经元可以在脑类器官融合物中生成。为了证实这一发现，我们还检查了mge衍生的中间神经元的标志物的表达。我们观察到gfp+迁移中间神经元(gad1+或vgat+)的促生长素抑制素(som)(图5b)、神经肽y(npy)(图5c)、钙结合蛋白d-28k(cb)(图5d)和小白蛋白(pv)(图5e)的表达。因此，在类器官融合组织中，可以生成多种mge衍生的中间神经元亚型。

人脑中剩余的中间神经元源自lge/cge。与针对mge的sox6相似，转录因子coup-tfii/nr2f2和sp8可以用作皮质中间神经元的lge/cge命运定位标志物。sp8(图5f)和coup-tfii(图5g)均由类器官融合物中的正在迁移的gfp⁺中间神经元(gad1⁺)表达。作为这一结果的证实，我们还分析了lge/cge衍生的亚型的标志物的表达。我们先前的数据已经表明，正在迁移的gfp⁺细胞缺乏reln表达(图4)，除了非中间神经元cajal-retzius细胞外，gaba能mge和cge衍生的中间神经元的亚群也表达reln。我们也没有观察到任何表达血管活性肠肽(vip)的gfp⁺中间神经元。然而，我们确实观察到了类器官融合物中表达钙网膜蛋白(cr)的gfp⁺中间神经元(vgat⁺)(图5h)。这些结果共同表明类器官融合物含有许多多种多样的中间神经元亚型，它们源于主要腹侧前脑亚部位(mge和lge/cge)。

实施例15：融合的脑类器官组织中的神经元迁移类似于皮质中间神经元的切向迁移。

正在切向迁移的皮质中间神经元的迁移动力学已使用延时成像实验进行了广泛记录。这种行为不同于沿径向神经胶质纤维移动的正在径向迁移的皮质细胞的行为，或正在线性迁移的细胞的行为，例如在lge衍生的嗅球中间神经元中观察到的链式迁移。为了确定在类器官融合物中正在迁移的gfp⁺细胞的行为是否类似于皮质中间神经元的行为，我们在腹侧-背侧类器官融合物切片培养物中进行了正在迁移的gfp⁺细胞的延时记录(图6a)。可以容易地将类器官融合物的gfp⁺腹侧起源部位与gfp^-背侧靶部位区分开来(图6a)。因此，我们可以容易可视化已迁移到背侧类器官融合部位中的稀疏标记的gfp⁺细胞的形态。在3天里，我们观察到了静止细胞和运动细胞两者(图6b)，而且令人惊讶的是，我们还观察到了类似于延伸长距离的轴突的动态神经元过程(图6c)。令人注意的是，迁移性的细胞表现出的动力学恰好类似于胚胎小鼠皮层的边缘区(mz)和中间区(iz)中正在迁移的中间神经元的动力学。正在迁移的细胞含有引导过程和尾随过程。引导过程通常是分支的，并且迁移的方向由分支动力学决定。例如，我们观察到细胞的多个实例，该细胞在未来行进的方向上延伸分支，而缩回在交替方向上延伸的分支(图6b)。此外，细胞在多个方向上迁移，方向频繁突然变化，这类似于在皮层内正在切向迁移的皮质中间神经元所表现出的多方向的游荡行为。

化学引诱物sdf-1(cxcl12)及其受体cxcr4调节中间神经元的切向迁移。为了测试我们在脑类器官融合物中观察到的迁移是否依赖于cxcr4，我们创建了用cxcr4拮抗剂amd3100处理的类器官融合物的长期切片培养物。与从相同的类器官融合物制备的未经处理的对照切片相比，在amd3100处理后，正在向gfp^-背侧部位中迁移的gfp⁺细胞的密度显著降低。因此，脑类器官融合物中的细胞迁移依赖于cxcr4活性。结合我们先前的数据，该结果证实在脑类器官中观察到的细胞迁移与正在切向迁移的中间神经元的细胞迁移一致。

观察结果：

在腹侧/gfp::背侧类器官融合物的背侧部位内观察了正在迁移的gfp⁺细胞。观察到的细胞在单个方向上迁移。引导过程是分支的，其中不同的分支似乎彼此独立地动态延伸和缩回。随着细胞体向前移动，尾随过程随之进行，并且引导过程多次变成尾随过程。随着细胞向前移动，一个引导过程得以延伸而剩余过程缩回。然后，随着细胞向前进展，整个迁移动态循环得以重复。

观察了表现出许多方向变化(涉及若干过程的动态延伸和缩回)的细胞。当细胞体保持静态时，分支在多个方向上延伸，然后每个主分支延伸出另外的更高阶的分支。最后，在特定方向上延伸分支，然后缩回另一个主分支。然后，细胞体在延伸分支的方向上移动。当细胞决定迁移的方向时，该循环得以重复。

观察了多个正在迁移的细胞。1)最初，细胞正在向上迁移。随着新的引导过程向下延伸并变为分支，向上的过程缩回。然后，细胞迁移方向变为向下。二分叉的引导过程是动态的，使得随着另一个过程缩回，一个过程延伸。然后，细胞体朝向延伸的引导过程移动。在核运动(nucleokinesis)之前，观察到肿胀，从细胞体移动到引导过程的近端部分中。然后，细胞体平行于肿胀移动，最后细胞体移动到肿胀中。2)第二细胞迁移并改变方向几次。随着方向的每次变化，尾随过程变为引导过程。随着尾随过程缩回，新的引导过程朝向行进的方向延伸。

观察了在具有延伸和缩回过程的情况下在不同方向上迁移的多个细胞。从观察的约45小时开始，一个细胞以恒定的方向迁移并快速行进，但是在约70小时时，随着引导过程分支，进展变慢。

观察了多个正在迁移的细胞。开始观察后约6小时，细胞以分支的引导过程迁移。多次观察到3个分支。随着细胞向前进展，分支在行进的方向上延伸，而其他分支则缩回。约23小时，细胞突然改变方向。这涉及到新过程的延伸，而先前的引导过程缩回。在约39小时，引导过程开始转弯，然后产生180度转角，然后延伸。然后，细胞体跟随引导过程。

观察了神经突，它们似乎在过程结束时具有增大簇的轴突，其类似于生长锥的。过程是高度动态的，并且在单个方向上表现出延伸，但是在方向上也突然变化。

实施例16：细胞迁移测定法

我们开发了使用融合的脑类器官的细胞迁移测定法。腹侧-背侧类器官融合物表现出稳健的长距离细胞迁移，其类似于腹侧前脑衍生的皮质抑制性中间神经元的。我们观察到脑类器官融合物中实质性较多的从腹侧到背侧前脑部位中的迁移。类器官融合物内正在迁移的细胞表达gaba能标志物(gad1/vgat)。已迁移的gfp⁺细胞可以产生多种中间神经元亚型。另外，正在迁移的gfp⁺细胞缺乏reln表达支持了腹侧前脑衍生的中间神经元身份。在融合的类器官中gfp⁺细胞的迁移动力学类似于皮层内切向迁移的中间神经元所表现出的特征性迁移行为。最后，如在正在发育的小鼠皮层中正在切向迁移的中间神经元所观察到的，cxcr4抑制作用抑制了类器官融合物中的细胞迁移。总之，我们已经重演了在背侧前脑部位中来自腹侧的人皮质中间神经元的迁移。此外，这些细胞表现出未成熟的和成熟的神经元标志物两者的观察结果表明它们一旦到达其背侧皮质前脑靶部位就经历成熟的能力。这代表了相比于先前单一类器官方法中可能实现的情况，重新创建含有增强的细胞多样性全集的正在发育的人皮质回路的令人兴奋的机会。

这项技术的令人兴奋的应用是研究人发育生物学及其与神经系统疾病的关系。考虑到这一点，在表征该测定法时，我们提出了不同的实验范式，每种范式可以用于研究与神经元细胞迁移有关的各个方面和科学问题。例如，用荧光报告物标记融合的类器官之一内的细胞允许远距离神经元迁移的可视化。这可以甚至通过完整类器官融合物的整装成像随时间连续监测。另外，可以使用免疫染色鉴定神经元亚型容易地检查细胞的身份。这之所以有用，是因为许多精神疾病(例如精神分裂症)认为涉及特定中间神经元亚群的选择性缺陷(lewiscurrentopinioninneurobiology26,22–26(2014))。分析的第二类型是剖析特定分子在神经元迁移中的作用，以确定它们是否以细胞自主或细胞非自主方式起作用。例如，使用本发明的双分化组织，可以通过从含有感兴趣的基因的突变体或野生型等位基因的独特细胞系中衍生出起源和靶类器官来独立地对来自迁移的起源或靶标的类器官进行遗传操作。

我们还提出了类器官融合物切片培养范式，其中共聚焦延时成像可以用于分析神经元细胞迁移的短期动力学。这是一个重要的工具，因为一些分子(例如gaba)影响正在迁移的中间神经元的运动，这在长期迁移测定中可以产生细微的表型，并因此取而代之需要对正在迁移的细胞的动力学进行更高的时间分辨率分析。另外，可以使用长期切片培养物来测试不同的药物处理可以如何影响细胞迁移。这允许药物筛选以确定许多不同分子对细胞迁移的作用。

最后，融合的类器官组织还呈现超出细胞迁移的独特应用。作为一个进一步的实例，我们观察了大量的具有轴突投射的表象的神经突动力学。此外，尽管我们特别地专注于腹侧-背侧前脑融合物，但类器官融合范式允许可以一起培养的脑部位身份的灵活性。结合另外的脑部位特异性类器官方案(joetal.stemcell19,248–257(2016)；hockemeyeretal.nat.biotechnol.27,851–857(2009)；preibischetal.bioinformatics25,1463–1465(2009))，可以使用类器官融合物进行建模的可能的脑回路是巨大的。因此，类器官融合技术极大地增强了脑类器官中可能的表型分析，并且该方法的灵活性极大地扩展了人神经系统疾病的体外模型的未来发展。

序列表

<110>imba-莫利库尔生物技术研究所

<120>双分化或多分化类器官

<130>r72602

<150>ep17168051.5

<151>2017-04-25

<160>22

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

tcccctcttccgatgttgag20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

gttcttgcagctcggtgac19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gaacggcatcaaggtgaact20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

cttcttggccacgtaacctg20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

ctacaaggtgaagatgcgcg20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

tccagcccctcctactctag20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

tcccctcttccgatgttgag20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

tccagcccctcctactctag20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

acgtcccttactccgccaag20

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

agtagatggtgcggggtttcc21

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

tggcccatgtcgcccttcct20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

gccgacgtggtgccgttgta20

<210>13

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

caccgccaccacctacaac19

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

caggagttgcgtgctagtga20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

ccgtctgcaggcaagaacat20

<210>16

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

gacacacggagcactcgag19

<210>17

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

gccgtaccaggacaccatg19

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

atgttcttgctcacgtcccc20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

gggcaccactccactgtatc20

<210>20

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

cgaagtgcaatggtctttagg21

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

ctcagttcatcgccgtcacc20

<210>22

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

agccggtgtagatcgtgtcata22