嵌合多肽和改变它们的在细胞膜中的定位的方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月28日提交的美国临时专利申请系列号62/477,733和2017年11月16日提交的美国临时专利申请系列号62/587,262的优先权；其全部内容通过引用并入本文。

本公开涉及生物技术领域，并且更具体地，涉及嵌合多肽的细胞定位的调节。

发明背景

嵌合抗原受体(car)是单链和多链多肽的亚类。嵌合抗原受体通常包括例如抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和cd3ζ或其他信号传导结构域。已经研究了将car用于哺乳动物中不同癌症例如血液学癌症的临床治疗中，并相当成功。然而，限制因素一直是与car抗癌活性相关的不可控制的毒性。

核激素受体是一类包括几个结构域的多肽，其包括dna结合基序和配体结合结构域。在配体不存在的情况下，天然存在的核激素受体与各种分子伴侣和其他相互作用蛋白缔合，将核激素受体隔离在细胞核之外。配体结合诱导核激素受体构象和相互作用配偶体的变化，并允许核激素靶基因的核易位和转录激活或抑制。虽然类固醇信号传导的经典观点认为这些激素结合充当配体激活的转录因子的细胞内受体，但据报道，类固醇也可以通过细胞表面处的非基因组机制起作用。

发明概述

本公开至少部分地基于以下发现：可以将包括跨膜结构域的嵌合多肽的可逆细胞外膜定位利用于医学应用中，其中期望在细胞外膜上可逆地表达感兴趣的蛋白质或肽。本公开的示例性特征是与cart细胞相关的毒性可以通过在其表面上可逆地表达car的抗原结合结构域来调节。

本公开进一步至少部分地基于以下发现：哺乳动物细胞中包括跨膜结构域和激素受体配体结合结构域的嵌合多肽的质膜定位或细胞外膜定位可以通过使哺乳动物细胞与激素或激素类似物接触来调节，其中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约700个氨基酸(例如1至约500个氨基酸)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽(例如，单链嵌合抗原受体)中。鉴于这一发现，本文提供：单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合抗原受体；编码其的核酸；包括这些核酸的任一个的载体；包括这些载体的任一个的哺乳动物细胞；以及可逆地诱导细胞外膜定位的方法和改变这些单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合多肽的膜定位的方法。

在一些实施方案中，使用本文公开的一种或多种组合物或方法可逆地诱导多肽(例如单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体)的质膜定位或细胞外膜定位在基于细胞的过继免疫疗法的领域中是有用的，其中从受试者分离的免疫细胞可以经修饰以表达合成蛋白，这使细胞在随后被转移回到受试者中之后能够执行新的治疗功能。此类合成蛋白的非限制性实例是嵌合抗原受体(car)和工程化t细胞受体(tcr)。

在一些实施方案中，使用本文公开的一种或多种组合物或方法可逆地诱导多肽(例如单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体)的质膜定位或细胞外膜定位在控制嵌合抗原t细胞(car-t细胞)的毒性作用中是有用的，通过调节细胞的质膜或细胞外膜上抗原结合部分的存在或不存在所述嵌合抗原t细胞(car-t细胞)参与消除癌细胞。

本文提供了单链嵌合多肽，其包括：跨膜结构域；和激素受体配体结合结构域，其中：跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137或cd154。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。

在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸(例如1至250个氨基酸或约1至50个氨基酸)分隔。

本文还提供了包括编码本文所述的任何单链嵌合多肽的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包括包含编码本文所述的任何单链嵌合多肽的核苷酸序列的任何核酸的载体。本文还提供了包括本文所述的任何载体的哺乳动物细胞。

本文还提供了诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的膜定位的方法，其包括：使表达本文所述的任何单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽定位于细胞的质膜的细胞外侧。

还提供了可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与减少量的激素或激素类似物接触，所述减少量的激素或激素类似物导致哺乳动物细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与增加量的激素或激素类似物接触，所述增加量的激素或激素类似物导致与步骤(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽的水平增加。

本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：将编码单链嵌合多肽的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合多肽的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞(例如，选自下组的t细胞：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞)。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。

本文还提供了单链嵌合抗原受体，其包括：细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域；激素受体配体结合结构域；共刺激结构域；和基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)；其中：跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域选自下组：scfv、(scfv)2、vhh结构域和vnar结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scfv。

在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：cd19、wt-1、cd22、l1-cam、ror-1、cd30、cd125、afp、cea、eta、mage和muc16。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是cd19。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。

在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137或cd154。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。

在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40l、cd40、pd-1、pd-l1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd160、light、btla、tim3、cd244、cd80、lag3、nkg2c和b7-h3。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域是4-1bb或cd28。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，itam包括来自cd3ζ的细胞质信号传导序列。

在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸(例如1至250个氨基酸或1至50个氨基酸)分隔。

本文还提供了包括编码本文所述的任何单链嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包括包含编码本文所述的任何单链嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸的载体。本文还提供了包括本文所述的任何载体的哺乳动物细胞。

还提供了诱导哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的膜定位的方法，其包括：使表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧。

本文还提供了改变哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合抗原受体的水平降低。这些方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致与(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合抗原受体的水平增加。

本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：将编码单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，t细胞选自下组：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物患有癌症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物中癌症的治疗。

本文还提供了多链嵌合抗原受体，其包括至少一个第一多肽，所述至少一个第一多肽包括：细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域；和激素受体配体结合结构域；其中：跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域选自下组：scfv、(scfv)2、vhh结构域和vnar结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scfv。

在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：cd19、wt-1、cd22、l1-cam、ror-1、cd30、cd125、afp、cea、eta、mage和muc16。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是cd19。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。

在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137或cd154。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。

在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸(例如1至250个氨基酸或1至50个氨基酸)分隔。

在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个多肽进一步包括共刺激结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40l、cd40、pd-1、pd-l1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd160、light、btla、tim3、cd244、cd80、lag3、nkg2c或b7-h3。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域是4-1bb或cd28。

本文还提供了诱导哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的膜定位的方法，其包括：使表达本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导多链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧。

本文还提供了改变哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导多链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的多链嵌合抗原结合受体的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的多链嵌合抗原结合受体的水平增加。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：将编码单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，t细胞选自下组：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物患有癌症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物中癌症的治疗。

本文还提供了治疗受试者(例如人)中癌症的方法，其包括：(a)向受试者施用表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体或本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞，其中抗原结合结构域与受试者中癌症表达的抗原特异性结合；(b)向受试者施用一定量的激素或激素，所述激素或激素的量足以诱导单链或多链嵌合抗原受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；(c)确定(b)之后的受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者；(d)将确定的与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，确定的与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者与对照比较；和(e)向受试者施用一定量的激素或激素类似物，所述激素或激素类似物的量足以降低细胞的质膜的细胞外侧的单链或多链嵌合抗原受体的水平，使得(e)之后的受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者降低。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少25％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少50％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少75％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少100％。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与毒性相关的一种或多种症状选自下组：高烧、肿胀、发冷、低血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、喉咙发痒、呼吸困难、发红、极度疲乏、恶心和脑水肿。在这些方法的一些实施方案中，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子选自下组：包括肿瘤坏死因子alpha、ifnγ、il-10、il-1β、il-2、il-6、il-8和il-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和il-5。

本文还提供了单链嵌合多肽，其包括：细胞外激素受体配体结合结构域；和跨膜结构域，其中：激素受体配体结合结构域和细胞外跨膜结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137或cd154。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。

在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域由1至700个氨基酸(例如1至500个氨基酸、1至250个氨基酸、1至100个氨基酸、1至50个氨基酸或1至25个氨基酸)分隔。

在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。

本文还提供了包括编码本文所述的任何单链嵌合多肽的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包括包含编码本文所述的任何单链嵌合多肽的核苷酸序列的核酸的载体。本文还提供了包括本文所述的任何载体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，t细胞选自下组：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞。

本文还提供了诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽定位于细胞的质膜的细胞外侧。

本文还提供了可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与减少量的激素或激素类似物接触，所述减少量的激素或激素类似物导致哺乳动物细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与增加量的激素或激素类似物接触，所述增加量的激素或激素类似物导致与步骤(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽的水平增加。本文所述的任何方法的一些实施方案在步骤(a)之前进一步包括将编码单链嵌合多肽的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合多肽的哺乳动物细胞。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，t细胞选自下组：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。

本文还提供了单链嵌合抗原受体，其包括：细胞外抗原结合结构域；细胞外激素受体配体结合结构域；跨膜结构域；细胞内共刺激结构域；和细胞内基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)；其中：跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域选自下组：scfv、(scfv)2、vhh结构域和vnar结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scfv。

在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：cd19、wt-1、cd22、l1-cam、ror-1、cd30、cd125、afp、cea、eta、mage和muc16。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是cd19。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，两种不同的抗原的至少一种是肿瘤抗原。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：cd19、wt-1、cd22、l1-cam、ror-1、cd30、cd125、afp、cea、eta、mage和muc16。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是cd19。

在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137或cd154。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。

在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40l、cd40、pd-1、pd-l1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd160、light、btla、tim3、cd244、cd80、lag3、nkg2c或b7-h3。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内共刺激结构域是来自4-1bb或cd28的细胞质共刺激结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内itam包含来自cd3ζ的细胞质信号传导序列。

在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域由1至700个氨基酸(例如1至500个氨基酸、1至250个氨基酸、1至100个氨基酸、1至50个氨基酸或1至25个氨基酸)分隔。

在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和itam。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和itam。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和itam。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和itam。

本文还提供了包括编码本文所述的任何单链嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包括包含编码本文所述的任何单链嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸的载体。本文还提供了包括本文所述的任何载体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，t细胞选自下组：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞。

本文还提供了诱导哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧。

本文还提供了改变哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合抗原受体的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致与(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合抗原受体的水平增加。本文所述的任何方法的一些实施方案在步骤(a)之前进一步包括：将编码单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，t细胞选自下组：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物患有癌症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物中癌症的治疗。

本文还提供了多链嵌合抗原受体，其包括至少一个第一多肽，所述至少一个第一多肽包括：细胞外抗原结合结构域；细胞外激素受体配体结合结构域；和跨膜结构域；其中：跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域选自下组：scfv、(scfv)2、vhh结构域和vnar结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scfv。

在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：cd19、wt-1、cd22、l1-cam、ror-1、cd30、cd125、afp、cea、eta、mage和muc16。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是cd19。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，两种不同的抗原的至少一种是肿瘤抗原。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：cd19、wt-1、cd22、l1-cam、ror-1、cd30、cd125、afp、cea、eta、mage和muc16。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是cd19。

在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137或cd154。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包括氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。

在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域由1至700个氨基酸(例如1至500个氨基酸、1至250个氨基酸、1至100个氨基酸、1至50个氨基酸或1至25个氨基酸)分隔。

在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个多肽进一步包括细胞内共刺激结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40l、cd40、pd-1、pd-l1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd160、light、btla、tim3、cd244、cd80、lag3、nkg2c或b7-h3。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内共刺激结构域是来自4-1bb或cd28的细胞质共刺激结构域。

在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，至少一个第一多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，至少一个第一多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，至少一个第一多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，至少一个第一多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。

本文还提供了编码本文所述的任何多链嵌合抗原受体的核酸。本文还提供了一起编码本文所述的任何多链嵌合抗原受体的核酸的组。本文还提供了包括编码本文所述的任何多链嵌合抗原受体的核酸的哺乳动物细胞。本文还提供了包括一起编码本文所述的任何多链嵌合抗原受体的核酸的组的哺乳动物细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，t细胞选自下组：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞。

本文还提供了诱导哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导多链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧。

本文还提供了改变哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导多链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的多链嵌合抗原结合受体的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的多链嵌合抗原结合受体的水平增加。本文所述的任何方法的一些实施方案在步骤(a)之前进一步包括：将编码多链嵌合抗原受体的核酸或一起编码多链嵌合受体的一组核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，t细胞选自下组：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物患有癌症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物中癌症的治疗。

本文还提供了治疗受试者中癌症的方法，其包括：(a)向受试者施用表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体或本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞，其中抗原结合结构域与受试者中癌症表达的抗原特异性结合；(b)向受试者施用一定量的激素或激素，所述激素或激素的量足以诱导单链或多链嵌合抗原受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；(c)确定(b)之后的受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性或者与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者；(d)将确定的与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性或者确定的与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者与对照比较；和(e)向受试者施用一定量的激素或激素类似物，所述激素或激素类似物的量足以降低细胞的质膜的细胞外侧的单链或多链嵌合抗原受体的水平，使得(e)之后的受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性或者与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者降低。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少25％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少50％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少75％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少100％。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与毒性相关的一种或多种症状选自下组：高烧、肿胀、发冷、低血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、喉咙发痒、呼吸困难、发红、极度疲乏、恶心和脑水肿。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子选自下组：包括肿瘤坏死因子alpha、ifnγ、il-10、il-1β、il-2、il-6、il-8和il-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和il-5。

在名词之前使用术语“一个”意指该特定名词的“一个或多个”。例如，短语“一个哺乳动物细胞”意指“一个或多个哺乳动物细胞”。

术语“单链嵌合多肽”意指包括第一连续氨基酸序列(例如，第一结构域)和第二连续氨基酸序列(例如，第二结构域)的单链多肽，其中第一连续氨基酸氨基酸序列和第二连续氨基酸序列不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。在一些实例中，第一连续氨基酸序列和第二连续氨基酸序列在单链嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实例中，第一连续氨基酸序列和第二连续氨基酸序列由一个或多个居间的氨基酸(例如，一个或多个结构域)分隔。术语“单链嵌合多肽”不意图以任何方式限制单链多肽中第一连续氨基酸序列和第二连续氨基酸序列的相对位置。本文描述了单链嵌合多肽(例如，单链嵌合抗原受体)的非限制性实例。单链嵌合多肽(例如，单链嵌合抗原受体)的另外的实例是本领域已知的。

术语“嵌合抗原受体”和“car”在本文可互换使用，并且是指能够触发或抑制免疫细胞活化的人工多模块分子，其通常但不排他地包含细胞外结构域(例如配体/抗原结合结构域)、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。car分子及其衍生物(例如car变体)描述于pct申请号us2014/016527；fedorovetal.scitranslmed(2013)；5(215):215ra172；glienkeetal.frontpharmacol(2015)6:21；kakarla&gottschalk52cancerj(2014)20(2):151-5；riddelletal.cancerj(2014)20(2):141-4；pegrametal.cancerj(2014)20(2):127-33；cheadleetal.immunolrev(2014)257(1):91-106；barrettetal.annurevmed(2014)65:333-47；sadelainetal.cancerdiscov(2013)3(4):388-98；cartellierietal.,jbiomedbiotechnol(2010)956304中；其公开以其整体通过引用并入本文。

术语“多链嵌合多肽”意指包括两个或更多个单链多肽的多肽，其中两个或更多个单链多肽中的至少一个是如本文定义和描述的单链嵌合多肽。本文描述了多链嵌合多肽(例如，多链嵌合抗原受体)的非限制性实例。多链嵌合多肽(例如，多链嵌合抗原受体)的另外的实例是本领域已知的。

术语“跨膜结构域”意指包括至少一个连续氨基酸序列的多肽的结构域，所述连续氨基酸序列当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时横穿脂质双层。例如，跨膜结构域可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个连续氨基酸序列，当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时，其各自横穿脂质双层。如本领域中已知的，跨膜结构域可以例如包括至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)(当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时横穿脂质双层的)连续氨基酸序列，其在脂质双层中具有α-螺旋二级结构。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括两个或更多个(当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时各自横穿脂质双层的)连续氨基酸序列，其在脂质双层中形成β-桶二级结构。本文描述了跨膜结构域的非限制性实例。跨膜结构域的另外的实例是本领域已知的。

短语“质膜的细胞外侧”用于描述多肽的位置时意指多肽包括至少一个横穿质膜的跨膜结构域和至少一个定位于细胞外空间的结构域(例如，至少一个抗原结合结构域)。

术语“激素受体配体结合结构域”意指激素受体多肽中与激素或激素类似物特异性结合的结构域。本文描述了激素受体配体结合结构域(lbd)的非限制性实例。在一些情况下，核激素受体的lbd选自雌激素受体、蜕皮激素受体、pparγ受体、糖皮质激素受体、雄激素受体、甲状腺激素受体、盐皮质激素受体、孕酮受体、维生素d受体、ppar受体α、pparβ/δ受体、孕烷x受体、肝x受体、法尼酯x受体(farnesoidxreceptor)、类视色素x受体(retinoidxreceptor)、rar相关的孤儿受体和视黄酸受体。在一些情况下，本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的单个lbd。在一些情况下，本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的多个(例如，两个或更多个)lbd。在一些情况下，本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的两个lbd。在一些情况下，本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的三个lbd。在本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的多个(例如，两个或更多个)lbd的情况下，在一些情况下，多个lbd包含相同的氨基酸序列。在一些情况下，两个或更多个lbd是串联的，直接地或通过接头(例如，本文所述的任何接头)分隔。

术语“抗原结合结构域”意指与靶抗原特异性结合的结构域。在一些实例中，抗原结合结构域可以由存在于单链多肽内的氨基酸形成。在其他实例中，抗原结合结构域可以由存在于第一单链多肽内的氨基酸和存在于一个或多个另外的单链多肽(例如，第二单链多肽)内的氨基酸形成。本文描述了抗原结合结构域的非限制性实例，其包括但不限于scfv或生长因子的lbd。抗原结合结构域的另外的实例是本领域已知的。

如本文所用，术语“抗原”通常是指由本文所述的抗原结合结构域特异性识别的结合配偶体。示例性抗原包括不同类的分子，例如但不限于多肽及其肽片段、小分子、脂质、碳水化合物和核酸。本文描述了可以由任何抗原结合结构域特异性结合的一种或多种抗原的非限制性实例。可以由任何抗原结合结构域特异性结合的一种或多种抗原的另外的实例是本领域已知的。

术语“共刺激结构域”意指来自t淋巴细胞中表达的内源性共刺激跨膜多肽的信号传导结构域，其促进下游t细胞受体信号传导和/或t细胞活化。本文描述了共刺激域的非限制性实例。共刺激结构域的另外的是本领域已知的。参见，例如chenetal.,naturereviewsimmunol.13:227-242,2013。

术语“基于免疫受体酪氨酸的激活基序”或“itam”意指包括由两个其他氨基酸将一个酪氨酸与一个亮氨酸或异亮氨酸分隔的四氨基酸共有序列的氨基酸基序(yxxl/i)。四氨基酸共有序列中的酪氨酸残基在信号传导途径激酶(例如，淋巴细胞信号传导途径激酶)的相互作用后被磷酸化。本文描述了itam的非限制性实例。itam的另外的实例是本领域已知的。

术语“激素”意指与激素受体的配体结合结构域特异性结合并调节该激素受体的活性和/或位置的天然存在的分子。本文描述了激素的非限制性实例。激素的另外的实例是本领域已知的。

术语“激素类似物”意指模拟激素的结构并且与激素受体的配体结合结构域特异性结合的分子。本文描述了激素类似物的非限制性实例。激素类似物的另外的实例是本领域已知的。

短语“癌症的治疗”意指在患有癌症的受试者中减少一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)癌症症状的数量、频率或严重性。本文描述了癌症的非限制性症状。癌症的另外的症状是本领域已知的。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述了用于本发明中的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献以其整体通过引用并入。在有冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。

根据以下发明详述和附图以及权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。

附图简述

图1是测试的不同构建体的示意图。细胞外和细胞内的标记是指相对于细胞膜，其在这些标记之间描绘为灰色框。指示了细胞外scfv结构域和细胞内共刺激(“costim”)、cd3zeta和mcherry结构域。

图2是表达不同构建体之一的细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/ml4-羟基他莫昔芬(“4-oht”)处理。(a)用编码规范car的慢病毒载体或用含有v2、v3和v4car构建体的抗cd19(fmc63)era-lbd转导的jurkatt细胞。(b)用编码v4car构建体的慢病毒载体转导原代cd4和cd8人t细胞。

图3是用编码含有era-lbd的fmc63car融合物的慢病毒载体转导的hek-293t细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/ml4-oht处理。

图4是用编码fmc63nhrlbd-car融合物和具有j6m0scfv的nhrlbd-car的慢病毒载体转导的原代人cd4t细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/ml4-oht处理。

图5a是缺乏共刺激和cd3zeta结构域的v5核激素受体配体结合结构域nhr-lbdcar构建体的示意图，以及用编码v5构建体的慢病毒载体转导的细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/ml4-oht处理。

图5b是未经转导的jurkatt细胞或用编码car的慢病毒载体转导的jurkatt细胞的一组流式细胞术示意图，所述car中用flag标签替换了scfv结构域。转导的细胞未经处理或用500ng/ml4-oht处理。

图6是用具有孕酮受体lbd的car构建体转导的jurkatt细胞的一组流式细胞术示意图。细胞未经处理或用500ng/ml米非司酮(mifepristone)处理。

图7a是显示在与抗原阴性(k562细胞系)和抗原阳性(mm1s细胞系)靶标共培养过夜后，用编码j6m0-era-lbdcar构建体的慢病毒载体转导的原代人t细胞的t细胞活化的图。

图7b是显示在与抗原阴性(k562细胞系)和抗原阳性(mm1s细胞系)靶标共培养过夜后，用编码j6m0-era-lbdcar构建体的慢病毒载体转导的原代人t细胞的ifn-γ产生的图。

图8a是显示用编码v4fmc63-era-lbdcar或规范car对照的慢病毒载体转导的原代人cd4t细胞的增殖的一组流式细胞术示意图，其与抗原阴性(k562细胞系)或抗原阳性(raji细胞系)靶标共培养，并且使用渐增浓度的配体4-oht。

图8b是显示使用渐增浓度的4-oht，由用编码j6m0-era-lbdcar构建体的慢病毒载体转导的原代人t细胞介导的抗原阳性靶标(mm1s细胞系)的裂解的图。

图9是显示在渐增浓度的4-oht下，在相对于细胞膜的不同位置处具有lbd的各种car构建体的表面表达的图。

图10a是显示实验程序的时间线的图解。

图10b是显示与4-oht共培养之前和之后各种car构建体的表面表达的柱状图。

图11a是显示用flag-era-lbdcar转导，并且未经处理或用4-oht处理15或120分钟的的jurkatt细胞的一组流式细胞术示意图。

图11b是显示用编码fmc63-era-lbdcar的慢病毒载体转导，并且未经处理或用4-oht处理2小时、4小时或24小时的的人t细胞的一组流式细胞术示意图。

图12是表达具有eralbd的fmc63-car的原代人t细胞的一组流式细胞术示意图。细胞未经处理或用500ng/ml4-oht处理。一些样品用1μm布雷菲德菌素(brefeldin)a预处理。

图13是测试的v2car构建体和ecd.v1car(也称为lbd-ecdcar)构建体的示意图。细胞膜描绘为灰色框。描绘了细胞外scfv结构域、细胞外eralbd、跨膜结构域(嵌入细胞膜中)、细胞内4-1bb结构域和细胞内cd3γ结构域。

图14描绘了表达v2car构建体或lbd-ecdcar构建体的细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/ml4-羟基他莫昔芬(“4-oht”)处理。

图15是显示用编码lbd-ecdcar构建体(ecd.v1)的慢病毒载体转导的t细胞破坏nalm6肿瘤细胞(％裂解)的图。用1.5ng/ml至500ng/ml的4-oht处理细胞。阳性对照是用编码组成型car的慢病毒载体转导的t细胞。阴性对照是未经4-oht处理的具有lbd-ecdcar的t细胞。

图16描绘了表达组成型car、lbd-ecdcar或v2car的细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理，或在流式细胞术之前用含有cd3/cd28的珠子刺激48小时。珠子，dynabeadsacd3/acd28，来自thermofisher。参见，trickettetal.,j.immunol.methods275:251-255,2003。将每个构建体与cmyc标签融合。

图17是显示在4-羟基他莫昔芬存在(500ng/ml)或不存在的情况下将携带car的t细胞与nalm-6靶标共培养过夜后，从ecd.v1car-t细胞或常规car-t细胞产生il-2的图。

发明详述

本文提供了单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体(car)和多链嵌合抗原受体；编码其的核酸；包括这些核酸的任一个的载体；包括这些载体的任一个的哺乳动物细胞；以及可逆地诱导细胞外膜定位的方法和改变这些单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合多肽的膜定位的方法。

本文还提供了具有嵌合抗原受体(car)的经遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些情况下，经遗传修饰的哺乳动物细胞衍生自干细胞、祖细胞或衍生自干细胞或祖细胞的细胞。在一些情况下，哺乳动物细胞是t淋巴细胞或nk细胞。

这些单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合抗原受体、核酸、载体、哺乳动物细胞和方法的非限制性方面描述如下，并且可以以任何组合使用而没有限制。这些单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合抗原受体、核酸、载体、哺乳动物细胞和方法的另外的方面是本领域已知的。

在一些实施方案中，本文公开的组合物和/或方法可以用于在存在与多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体)中存在的lbd结合的激素或激素类似物的情况下选择性杀伤受试者中的癌细胞。在一些实施方案中，在存在激素或激素类似物的情况下，多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体)定位于细胞外表面，在细胞的外部呈现抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的scfv或其他抗原结合结构域)。多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)可以识别与其结合的抗原，并因此可以选择性杀伤在其表面表达抗原的靶细胞(例如癌细胞)。

在一些实施方案中，多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)定位于细胞外表面可以在受试者中导致毒性。在一些实施方案中，由于激素或激素类似物诱导的多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)定位于细胞外表面而经历毒性的受试者可以通过减少激素或激素类似物的剂量，或完全消除受试者的激素或激素类似物治疗来治疗或改善。此类剂量的减少或激素或激素类似物治疗的消除可以导致多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合多肽)从细胞表面去除并减少或消除抗原结合结构域在细胞表面上的呈递，从而减少或消除受试者中的毒性。

单链嵌合多肽

单链嵌合多肽—细胞内激素受体lbd

本文提供的是包括跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)和激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)的单链嵌合多肽，其中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域直接彼此邻接域或者由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物(例如人)中同一(单个)内源性单链多肽中。

在单链嵌合多肽的一些实例中，跨膜结构域直接邻接激素受体配体结合结构域(即，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间没有居间的氨基酸)。在单链嵌合多肽的一些实例中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由以下分隔：1个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸、约5个氨基酸、约4个氨基酸或约3个氨基酸(包含在内)；约2个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸、约5个氨基酸或约4个氨基酸(包含在内)；约3个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸或约5个氨基酸(包含在内)；约4个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸或约6个氨基酸(包含在内)；约5个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸或约8个氨基酸(包含在内)；约6个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸或约8个氨基酸(包含在内)；约8个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约52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基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸或约310个氨基酸(包含在内)；约310个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸或约320个氨基酸(包含在内)；约320个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸或约330个氨基酸(包含在内)；约330个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸或约340个氨基酸(包含在内)；约340个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸或约350个氨基酸(包含在内)；约350个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸或约360个氨基酸(包含在内)；约360个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸(包含在内)；约370个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸或约380个氨基酸(包含在内)；约380个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸或约390个氨基酸(包含在内)；约390个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸或约400个氨基酸(包含在内)；约400个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸或约410个氨基酸(包含在内)；约410个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸或约420个氨基酸(包含在内)；约420个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸或约440个氨基酸(包含在内)；约430个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸或约440个氨基酸(包含在内)；约440个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸或约450个氨基酸(包含在内)；约450个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸或约460个氨基酸(包含在内)；约460个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸(包含在内)；约470个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸或约480个氨基酸(包含在内)；约480个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸或约490个氨基酸(包含在内)；约490个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸或约500个氨基酸(包含在内)；约500个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸或约520个氨基酸(包含在内)；约520个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸或约540个氨基酸(包含在内)；约540个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸或约560个氨基酸(包含在内)；约560个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸或约580个氨基酸(包含在内)；约580个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸或约600个氨基酸(包含在内)；约600个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸或约620个氨基酸(包含在内)；约620个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸或约640个氨基酸(包含在内)；约640个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸或约660个氨基酸(包含在内)；约660个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸或约680个氨基酸(包含在内)；约680个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸或约700个氨基酸(包含在内)；约700个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸或约720个氨基酸(包含在内)；约720个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸或约740个氨基酸(包含在内)；约740个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸或约760个氨基酸(包含在内)；约760个氨基酸至约800个氨基酸或约780个氨基酸(包含在内)；或约780个氨基酸至约800个氨基酸(包含在内)。

在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是接头肽或者包括接头肽。在一些实施方案中，接头肽可以包括以下氨基酸序列的一个或多个：gsgsgsgsgs(seqidno:20)、gsgsgsgs(seqidno:21)、rsgsgsgs(seqidno:22)或gsgsgsgs(seqidno:23)。在一些实施方案中，接头肽可以由以下核酸序列的一个或多个编码：ggatccggcagcggatctggcagtggaagc(seqidno:24)、ggatctggctctggaagcggcagc(seqidno:25)、agatccggatctggaagtggctcc(seqidno:26)或ggaagtggatctgggagcggctct(seqidno:27)。在一些实施方案中，接头肽可以例如串联包括seqidno:20-23中任一个的一个或多个(例如，两个、三个或四个)拷贝。

在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是邻接内源性多肽中跨膜结构域的细胞内序列或者包括邻接内源性多肽中跨膜结构域的细胞内序列，所述跨膜结构域(例如本文所述的任何跨膜结构域)衍生自该内源性多肽。在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是一个或多个另外的结构域或者包括一个或多个另外的结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性另外的结构域)。在一些实施方案中，单链嵌合多肽可以是单链嵌合抗原受体(例如，本文所述的任何单链嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，嵌合多肽可以进一步包括一个或多个另外的结构域。可以包括在单链嵌合多肽中的另外的结构域的非限制性实例包括以下的一个或多个：细胞外配体结合结构域(例如抗原结合结构域，例如本文所述的任何抗原结合结构域)、itim(例如，本领域已知的任何itim)、itam(例如，本文所述或本领域已知的任何itam)、二聚化结构域(例如，能够与哺乳动物细胞中表达的另一种多肽(例如重组多肽)中存在的另一种二聚化结构域二聚化，例如本领域已知的任何二聚化结构域)和肽标签(例如聚his标签)。

单链嵌合多肽—细胞外激素受体lbd

本文提供了包括细胞外激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)和跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)的单链嵌合多肽，其中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物(例如人)中单个内源性单链多肽中。

在单链嵌合多肽的一些实例中，跨膜结构域直接邻接激素受体配体结合结构域(即跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间没有居间的氨基酸)。在单链嵌合多肽的一些实例中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域由以下分隔：1个氨基酸至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)。

在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是接头肽或者包括接头肽。在一些实施方案中，接头肽可以包括以下氨基酸序列的一个或多个：gsgsgsgsgs(seqidno:20)、gsgsgsgs(seqidno:21)、rsgsgsgs(seqidno:22)或gsgsgsgs(seqidno:23)。在一些实施方案中，接头肽可以由以下核酸序列的一个或多个编码：ggatccggcagcggatctggcagtggaagc(seqidno:24)、ggatctggctctggaagcggcagc(seqidno:25)、agatccggatctggaagtggctcc(seqidno:26)或ggaagtggatctgggagcggctct(seqidno:27)。在一些实施方案中，接头肽可以例如串联包括seqidno:20-23中任一个的一个或多个(例如，两个、三个或四个)拷贝。在一些实施方案中，接头肽可以是seqidno:45、47、49、58、60、62和106的一个或多个或者可以包括seqidno:45、47、49、58、60、62和106的一个或多个。在一些实施方案中，接头肽可以是gs或者包括gs。

在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是邻接内源性多肽中跨膜结构域的序列或者包括邻接内源性多肽中跨膜结构域的序列，所述跨膜结构域(例如本文所述的任何跨膜结构域)衍生自该内源性多肽。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是一个或多个另外的结构域或者包括一个或多个另外的结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性另外的结构域)。在一些实施方案中，单链嵌合多肽可以是单链嵌合抗原受体(例如，本文所述的任何单链嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，嵌合多肽可以进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)另外的结构域。可以包括在单链嵌合多肽中的另外的结构域的非限制性实例包括以下的一个或多个：细胞外配体结合结构域(例如抗原结合结构域，例如本文所述的任何抗原结合结构域)、itim(例如，本领域已知的任何itim)、itam(例如，本文所述或本领域已知的任何itam)、二聚化结构域(例如，能够与哺乳动物细胞中表达的另一种多肽(例如重组多肽)中存在的另一种二聚化结构域二聚化，例如本领域已知的任何二聚化结构域)和肽标签(例如聚his标签)。

在一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，单链嵌合多肽包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。

单链嵌合抗原受体

单链嵌合抗原受体—细胞内激素受体lbd

本文还提供了单链嵌合抗原受体，其包括：细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何抗原结合结构域)、跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)、激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)、共刺激结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何共刺激结构域)和基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)，其中：跨膜结构域和激素配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一(单个)内源性单链多肽中。本文所述的单链嵌合抗原受体可以与本文所述的任何示例性抗原或本领域已知的任何其他抗原结合。在一些实施方案中，单链嵌合抗原受体与单一抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原)特异性结合。在一些实施方案中，单链嵌合抗原受体与两种不同的抗原(例如，本文所述的示例性抗原的任何组合)特异性结合。

在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域邻接激素受体配体结合结构域。在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸不包含结构域。在其他实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括一个或多个居间的结构域(例如，一个或多个共刺激结构域和/或一个或多个itam)。在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括来自同一内源性跨膜蛋白质的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性跨膜蛋白质。在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括接头序列。

这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)共刺激结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性共刺激结构域的任何组合)。这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案包括4-1bb共刺激结构域和cd28共刺激结构域之一或两者。

这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)itam(例如，本文所述或本领域已知的任何itam)。在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，itam包括来自cd3ζ(例如，人cd3ζ)的细胞质信号传导序列。

在这些单链嵌合抗原受体的任一个的一些实施方案中，任何两个相邻的结构域可以由以下分隔：1个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸、约4个氨基酸或约3个氨基酸(包含在内)；约2个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸或约4个氨基酸(包含在内)；约3个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸或约5个氨基酸(包含在内)；约4个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸或约6个氨基酸(包含在内)；约5个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸或约7个氨基酸(包含在内)；约6个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸或约8个氨基酸(包含在内)；约8个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸或约10个氨基酸(包含在内)；约10个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸或约15个氨基酸(包含在内)；约15个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸或约20个氨基酸(包含在内)；约20个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸或约25个氨基酸(包含在内)；约25个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸或约30个氨基酸(包含在内)；约30个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸或约35个氨基酸(包含在内)；约35个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸(包含在内)；约40个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸或约45个氨基酸(包含在内)；约45个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸或约50个氨基酸(包含在内)；约50个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸或约55个氨基酸(包含在内)；约55个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸或约60个氨基酸(包含在内)；约60个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸或约65个氨基酸(包含在内)；约65个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸或约70个氨基酸(包含在内)；约70个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸或约75个氨基酸(包含在内)；约75个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸或约75个氨基酸(包含在内)；约75个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸或约80个氨基酸(包含在内)；约80个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸或约90个氨基酸(包含在内)；约100个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸或约110个氨基酸(包含在内)；约110个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸或约120个氨基酸(包含在内)；约120个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸或约120个氨基酸(包含在内)；约120个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸或约130个氨基酸(包含在内)；约130个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸或约140个氨基酸(包含在内)；约140个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸或约150个氨基酸(包含在内)；约150个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸或约160个氨基酸(包含在内)；约160个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸或约170个氨基酸(包含在内)；约170个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸或约180个氨基酸(包含在内)；约180个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸或约190个氨基酸(包含在内)；约190个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸或约200个氨基酸(包含在内)；约200个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸或约220个氨基酸(包含在内)；约220个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸或约240个氨基酸(包含在内)；约240个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸或约260个氨基酸(包含在内)；约260个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸或约280个氨基酸(包含在内)；约280个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸或约300个氨基酸(包含在内)；约300个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸或约320个氨基酸(包含在内)；约320个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸或约340个氨基酸(包含在内)；约340个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸或约360个氨基酸(包含在内)；约360个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸或约380个氨基酸(包含在内)；约380个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸或约400个氨基酸(包含在内)；约400个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸或约420个氨基酸(包含在内)；约420个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸或约440个氨基酸(包含在内)；约440个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸或约460个氨基酸(包含在内)；约460个氨基酸至约500个氨基酸或约480个氨基酸(包含在内)；或约480个氨基酸至约500个氨基酸(包含在内)。

在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述跨膜结构域的同一内源性单链多肽的序列(例如，cd8α铰链区，例如seqidno:112)。在一些实施方案中，包含seqidno:42、55或112的序列定位于细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是抗体的铰链区序列或者包括抗体的铰链区序列，所述抗体例如但不限于人抗体(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包含接头序列(例如，非天然存在的接头序列，例如gs或本文所述的任何其他接头序列)。

在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在激素受体配体结合结构域之后，下一个结构域是共刺激结构域，其后是itam。在这些实施方案的一些中，激素受体配体结合结构域和共刺激结构域之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述itam的同一内源性单链多肽的序列或者包括来自同一内源性单链多肽的序列。在这些实施方案的一些中，激素受体配体结合结构域和共刺激结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，共刺激结构域和itam之间的一个或多个氨基酸是来自同一内源性单链多肽的序列或者包括来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述itam的同一内源性单链多肽的序列。

在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在激素受体配体结合结构域之后，下一个结构域是共刺激结构域，其后是itam。在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在配体结合结构域之后，下一个结构域是itam，其后是共刺激结构域。在这些实施方案的一些中，激素受体配体结合结构域与itam之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述itam的同一内源性单链多肽的序列或者包括来自同一内源性单链多肽的序列。在这些实施方案的一些中，激素受体配体结合结构域和itam之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，itam和共刺激结构域之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述itam或衍生所述共刺激结构域的同一内源性单链多肽的序列或者包括来自同一内源性单链多肽的序列，所述itam或共刺激结构域衍生自该内源性单链多肽。

在一些实施方案中，在两个或更多个共刺激结构域包括在单链嵌合抗原受体中的情况下，该两个或更多个共刺激结构域可以置于激素受体配体结合结构域和一个或多个itam之间。在本文所述的单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域和itam可以在单链嵌合抗原受体的一级氨基酸序列中交替。

本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以进一步包括二聚化结构域和/或肽标签。

在一些实例中，单链嵌合抗原受体可以包含与seqidno:31、33、35、37、39或52至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同的序列。

单链嵌合抗原受体–细胞外激素受体lbd

本文还提供了单链嵌合抗原受体，其包括：细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何抗原结合结构域)、细胞外激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)、跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)、共刺激结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何共刺激结构域)和基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)，其中：跨膜结构域和细胞外激素配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。本文所述的单链嵌合抗原受体可以与本文所述的任何示例性抗原或本领域已知的任何其他抗原结合。在一些实施方案中，单链嵌合抗原受体与单一抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原)特异性结合。在一些实施方案中，单链嵌合抗原受体与两种不同的抗原(例如，本文所述的示例性抗原的任何组合)特异性结合。

在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域邻接细胞外激素受体配体结合结构域。在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸不包含结构域。在其他实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括一个或多个居间的结构域(例如，抗原结合结构域或另外的抗原结合结构域)。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括来自同一内源性跨膜蛋白质的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性跨膜蛋白质。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括接头序列。

这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)共刺激结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性共刺激结构域的任何组合)。这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案包括4-1bb共刺激结构域和cd28共刺激结构域之一或两者。

这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)itam(例如，本文所述或本领域已知的任何itam)。在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，itam包括来自cd3ζ(例如，人cd3ζ)的细胞质信号传导序列。

在这些单链嵌合抗原受体的任一个的一些实施方案中，任何两个相邻的结构域可以由1个氨基酸至约500个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。

在一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域或细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述跨膜结构域的同一内源性单链多肽的序列(例如，来自人cd8α的铰链序列，例如seqidno:112)。在一些实施方案中，包含seqidno:42、55或112的序列定位于细胞外激素受体配体结合结构域或细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域或细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是抗体的铰链区序列或者包括抗体的铰链区序列，所述抗体例如但不限于人抗体(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域或细胞外激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包含接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包含接头序列(例如，非天然存在的接头序列，例如gs或本文所述的任何其他接头序列)。

在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在跨膜结构域之后，下一个结构域是共刺激结构域，其后是itam。在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在跨膜结构域之后，下一个结构域是itam，其后是共刺激结构域。在这些实施方案的一些中，跨膜结构域和共刺激结构域或itam之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述itam的同一内源性单链多肽的序列或者包括来自同一内源性单链多肽的序列。在这些实施方案的一些中，跨膜结构域和共刺激结构域或itam之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在这些实施方案的一些中，共刺激结构域和itam之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，共刺激结构域和itam之间的一个或多个氨基酸是来自同一内源性单链多肽的序列或者包括来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述itam的同一内源性单链多肽的序列。

在一些实施方案中，在两个或更多个共刺激结构域包括在单链嵌合抗原受体中的情况下，该两个或更多个共刺激结构域可以置于一个或多个itam之间。在一些实施方案中，在两个或更多个itam包括在单链嵌合抗原受体中的情况下，该两个或更多个itam可以置于一个或多个共刺激分子之间。在本文所述的单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域和itam可以在单链嵌合抗原受体的一级氨基酸序列中交替。

本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以进一步包括二聚化结构域和/或肽标签。

在一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和itam。在一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和itam。在一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和itam。在一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，单链嵌合多肽包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和itam。

在一些实例中，单链嵌合抗原受体可以包含与seqidno:98至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同的序列。

多链嵌合抗原受体

多链嵌合抗原受体—细胞内激素受体lbd

本文还提供了多链嵌合抗原受体，其包括至少一个第一多肽，所述至少一个第一多肽包括：细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何抗原结合结构域)、跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)和激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)，其中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于同一(单个)内源性单链多肽中。在这些多链嵌合抗原受体的任一个中由抗原结合结构域特异性结合的抗原可以是本文所述或本领域已知的任何抗原。在一些实施方案中，多链嵌合抗原受体与单一抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原)特异性结合。在一些实施方案中，多链嵌合抗原受体与两种不同的抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原的任何组合)特异性结合。

在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域彼此邻接。在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，1至约500个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)在至少一个第一多肽中细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是来自同一内源性单链多肽的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性单链多肽。在一些实施方案中，至少一个第一多肽的细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是人抗体(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)的铰链区序列或者包括人抗体的铰链区序列。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。

在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域邻接激素受体配体结合结构域。在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸不包含结构域。在其他实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括一个或多个居间的结构域(例如，一个或多个共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和/或一个或多个itam(例如，本文所述的任何itam))。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括来自同一内源性跨膜蛋白质的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性跨膜蛋白质。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。

在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽可以进一步包括以下的一个或多个(例如，两个或三个)：二聚化结构域(例如，本领域已知的任何二聚化结构域)、共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和/或肽标签(例如，本领域已知的任何肽标签)。

这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案进一步包括第二多肽，其可以包括以下的一个或多个(例如，两个、三个或四个)：跨膜结构域(例如，本文所述的任何跨膜结构域)、二聚化结构域(例如，可以与哺乳动物细胞中至少一个第一多肽中的二聚化结构域相互作用的二聚化结构域)、一个或多个共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和一个或多个itam(例如，本文所述的任何itam)。如本领域技术人员可以理解的，第二多肽中的一对或每对相邻的结构域可以彼此邻接或者可以由1至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)分隔。第二多肽中一对相邻的结构域之间的一个或多个氨基酸可以是来自内源性单链多肽的序列，存在于第二多肽中的跨膜、共刺激结构域或itam衍生自该自内源性单链多肽。

多链嵌合抗原受体—细胞外激素受体lbd

本文还提供了多链嵌合抗原受体，其包括至少一个第一多肽，所述至少一个第一多肽包括：细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何抗原结合结构域)、细胞外激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)和跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)，其中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于单个内源性单链多肽中。在这些多链嵌合抗原受体的任一个中由抗原结合结构域特异性结合的抗原可以是本文所述或本领域已知的任何抗原。在一些实施方案中，多链嵌合抗原受体与单一抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原)特异性结合。在一些实施方案中，多链嵌合抗原受体与两种不同的抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原的任何组合)特异性结合。

在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域彼此邻接。在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，1至约700个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)在至少一个第一多肽中细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是来自同一内源性单链多肽的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性单链多肽。在一些实施方案中，至少一个第一多肽的细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是人抗体(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)的铰链区序列或者包括人抗体的铰链区序列。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和抗原结合结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。

在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域邻接细胞外激素受体配体结合结构域。在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸不包含结构域。

在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括一个或多个居间的结构域(例如，抗原结合结构域)。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和抗原结合结构域之间的氨基酸包括来自同一内源性跨膜蛋白质的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性跨膜蛋白质。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和抗原结合结构域之间的氨基酸包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，至少一个第一多肽的抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是人抗体(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)的铰链区序列或者包括人抗体的铰链区序列。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中抗原结合结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。

在一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，至少一个第一多肽包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，至少一个第一多肽包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以n末端至c末端方向移动时，至少一个第一多肽包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以c末端至n末端方向移动时，至少一个第一多肽包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。

在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽可以进一步包括以下的一个或多个(例如，两个或三个)：二聚化结构域(例如，本领域已知的任何二聚化结构域)、共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和/或肽标签(例如，本领域已知的任何肽标签)。

这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案进一步包括第二多肽，其可以包括以下的一个或多个(例如，两个、三个或四个，以任何顺序或组合)：跨膜结构域(例如，本文所述的任何跨膜结构域)、二聚化结构域(例如，可以与哺乳动物细胞中至少一个第一多肽中的二聚化结构域相互作用的二聚化结构域)、一个或多个共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和一个或多个itam(例如，本文所述的任何itam)。如本领域技术人员可以理解的，第二多肽中的一对或每对相邻的结构域可以彼此邻接或者可以由1至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)分隔。第二多肽中一对相邻的结构域之间的一个或多个氨基酸可以是来自内源性单链多肽的序列，存在于第二多肽中的跨膜、共刺激结构域或itam衍生自该自内源性单链多肽。第二多肽中一对相邻的结构域之间的一个或多个氨基酸可以是接头序列或者可以包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。

如本领域中可以理解的，存在于多链嵌合抗原受体中的两个或更多个多肽可以经由彼此相互作用的结构域对(通过二聚化结构域)缔合。在一些实施方案中，二聚化结构域之间的相互作用可以通过添加小分子来触发。在一些实施方案中，存在于多聚嵌合抗原受体中的两个或更多个多肽可以通过(例如，在二聚化结构域之间的缔合之间的)非共价相互作用缔合。在一些实施方案中，存在于多聚嵌合抗原受体中的两个或更多个多肽可以通过共价相互作用(例如，通过二硫键、通过酯键、通过酰胺键、通过硫酯键或其组合)。

跨膜结构域

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性多肽的跨膜结构域或其部分，其中内源性多肽选自下组：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28(也称为tp44)、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37(也称为gp52-40或tspan26)、cd64(也称为fcgr1a)、cd80(也称为b7、b7-1、b7.1、bb1、cd28lg、cd28lg1和lab7)、cd45(也称为ptprc、b220、cd45r、gp180、l-ca、lca、ly5、t200和蛋白酪氨酸磷酸酶、c型受体)、cd4、cd5(也称为leu1和t1)、cd8α(也称为leu2、mal和p32)、cd9(也称为btcc-1、drap-27、mic3、mrp-1、tspan-29和tspan29)、cd16(也称为fcgr3和fcg3)、cd22(也称为siglec-2和siglec2)、cd86(也称为b7-2、b7.2、b70、cd28lg2和lab72)、cd134(也称为tnfrsf4、act35、rp5-902p8.3、imd16、ox40、txgp1l和肿瘤坏死因子受体超家族成员4)、cd137(也称为tnfrsf9、4-1bb、cdw137、ila和肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、cd27(也称为s152、s152.lpfs2、t14、tnfrsf7和tp55)、cd152(也称为ctla4、alps5、celiac3、ctla-4、grd4、gse、iddm12和细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4)、pd1(也称为pdcd1、cd279、pd-1、sleb2、hpd-1、hpd-l、hsle1和程序性细胞死亡1)、icos(也称为ailim、cd278和cvid1)、cd272(也称为btla和btla1)、cd30(也称为tnfrsf8、d1s166e和ki-1)、gitr(也称为tnfrsf18、rp5-902p8.2、aitr、cd357和gitr-d)、hvem(也称为tnfrsf14、rp3-395m20.6、atar、cd270、hvea、hvem、lightr和tr2)、dap10和cd154(也称为cd40lg、cd40l、higm1、igm、imd3、t-bam、tnfsf5、trap、gp39、hcd40l和cd40配体)。前句中的字母“cd”代表“分化群”。例如，cd3代表“分化群3”。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性哺乳动物(例如人)多肽(例如，以上列出的任何多肽的哺乳动物或人同源物)的跨膜结构域或其部分。

用于将内源性多肽锚定在哺乳动物细胞的脂质双层(例如质膜)中的任何跨膜结构域或其部分适合根据本文公开的组合物和方法使用。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人cd28的跨膜结构域或其部分，例如登录号p01747，例如seqidno:1的氨基酸153至179。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括与seqidno:1的氨基酸153至179或其部分至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％相同)的跨膜结构域。

在一些实施方案中，跨膜结构域可以包含与seqidno:114(或其部分)至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。

seqidno:1

mlrlllalnlfpsiqvtgnkilvkqspmlvaydnavnlsckysynlfsrefraslhkgldsavevcvvygnysqqlqvysktgfncdgklgnesvtfylqnlyvnqtdiyfckievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人cd3的跨膜结构域或其部分，例如登录号p20963，例如seqidno:2的氨基酸31至51。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括跨膜结构域，所述跨膜结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:2的氨基酸31至51至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％相同)。

seqidno:2

mkwkalftaailqaqlpiteaqsfglldpklcylldgilfiygviltalflrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括seqidno.3-9的任一项的跨膜结构域或其部分。

lgllvagvlvllvslgvaihlcc(seqidno:3)；

vaailglglvlgllgplaillalyll(seqidno:4)；

alivlggvaglllfiglgiffcvrc(seqidno:5)；

lcylldgilfiygviltalflrv(seqidno:6)；

wvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seqidno:7)；

iyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:8)；和

alpaalavisfllglglgvacvla(seqidno:9)。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括跨膜结构域，所述跨膜结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno.3-9的任一项至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％相同)。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括跨膜结构域，所述跨膜结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:43、56或114至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％相同)。

如本领域普通技术人员将理解的，某些内源性多肽具有至少在其一级多肽序列上不同的两个或更多个同等型。本文公开的单链嵌合多肽，单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体可以包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包括来自内源性跨膜蛋白质(例如内源性哺乳动物，例如人跨膜蛋白质)的任何同等型的氨基酸的序列，其包括，例如以下的同等型(例如人同等型)：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137、cd27、cd152、pd1或cd154。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的跨膜结构域或其部分包括表现出与来自以下内源性哺乳动物(例如人)跨膜蛋白质的一个或多个的跨膜结构域至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列一致性的氨基酸的序列:t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137、cd27、cd152、pd1或cd154。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的跨膜结构域或其部分包括与以下内源性哺乳动物(例如人)跨膜蛋白质的跨膜结构域相比，具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸的序列：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137、cd27、cd152、pd1或cd154。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽，单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括合成的跨膜结构域。在一些情况下，合成的跨膜结构域可以包括占主导地位的疏水残基，例如但不限于亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，合成的跨膜结构域在该结构域的每个末端处包括三联体的苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括跨膜结构域，所述跨膜结构域是具有来自两个或更多个内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的跨膜结构域的部分的嵌合跨膜结构域，所述内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽例如但不限于t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd33、cd37、cd64、cd80、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd86、cd134、cd137、cd27、cd152、pd1和cd154，例如所述跨膜结构域的两个或更多个部分一起构成功能性跨膜结构域。在一些实施方案中，与野生型跨膜结构域的相应部分相比，此类嵌合跨膜结构域的部分可以包括一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。

跨膜结构域可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个连续氨基酸序列，当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时，其各自横穿脂质双层。如本领域中已知的，跨膜结构域可以例如包括至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)(当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时横穿脂质双层的)连续氨基酸序列，其在脂质双层中具有α-螺旋二级结构。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括两个或更多个(当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时各自横穿脂质双层的)连续氨基酸序列，其在脂质双层中形成β-桶二级结构。跨膜结构域的另外的实例和特征是本领域已知的。

激素受体配体结合结构域

在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是雌激素受体配体结合结构域或其片段或者包含雌激素受体配体结合结构域或其片段。可以用于本文所述的任何多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)的激素受体配体结合结构域的另外的实例包括以下的配体结合结构域：例如，雌激素受体、蜕皮激素受体、pparγ受体、糖皮质激素受体、雄激素受体、甲状腺激素受体、盐皮质激素受体、孕酮受体、维生素d受体、ppar受体α、pparβ/δ受体、孕烷x受体、肝x受体、法尼酯x受体、类视色素x受体、rar相关的孤儿受体和视黄酸受体。

人雌激素受体配体结合结构域的非限制性实例是seqidno:10的氨基酸10至247。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:10的氨基酸10至247至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:10(人)

雌激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:11的氨基酸4至241。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:11的氨基酸4至241至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:11(人)

在一些实施方案中，雌激素受体配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)氨基酸取代。在一些实施方案中，雌激素受体配体结合结构域具有野生型序列，除了其在氨基酸位置521(例如g521r取代)和537(例如g537f取代)之一或两者处包含氨基酸取代(每个相对于人雌激素受体的全长野生型序列，例如下面的seqidno:119进行编号)。

seqidno:119(人)

雌激素受体配体结合结构域的非限制性实例可以包括以下序列：所述序列与seqidno:110(或其片段)至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同。

激素受体配体结合结构域的另外的非限制性实例是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:46、59或110至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同。

雌激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:88的氨基酸314至551。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:88的氨基酸314至551至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:88(小鼠)

雌激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:89的氨基酸315至552。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:89的氨基酸315至552至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:89(大鼠)

雌激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:90的氨基酸310至547。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:90的氨基酸310至547至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:90(狒狒)

在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是孕酮受体配体结合结构域或其片段或者包含孕酮受体配体结合结构域或其片段。人孕酮受体配体结合结构域的非限制性实例是seqidno:12的氨基酸11至258。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:12的氨基酸11至258至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:12(人)

孕酮受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:13的氨基酸14至261。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:13的氨基酸14至261至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:13(人)

孕酮受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:91的氨基酸679至926。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:91的氨基酸679至926至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:91(小鼠)

孕酮受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:92的氨基酸676至923。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:92的氨基酸676至923至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:92(大鼠)

孕酮受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:93的氨基酸686至933。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:93的氨基酸686至933至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:93(狒狒)

在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是雄激素受体配体结合结构域或其片段或者包含雄激素受体配体结合结构域或其片段。人雄激素受体配体结合结构域的非限制性实例是seqidno:14的氨基酸2至247。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:14的氨基酸2至247至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:14(人)

雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:15的氨基酸34至279。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:15的氨基酸34至279至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:15(人)

雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:16的氨基酸19至264。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:16的氨基酸19至264至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:16(人)

雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:94的氨基酸652至897。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:94的氨基酸652至897至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:94(小鼠)

雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:95的氨基酸655至900。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:95的氨基酸655至900至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:95(大鼠)

雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:96的氨基酸648至893。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:96的氨基酸648至893至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:96(狒狒)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:28。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:28的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:28(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是seqidno:29。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:29的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:29(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是蜕皮激素受体的配体结合结构域。例如，蜕皮激素受体的配体结合结构域可以是seqidno:74的氨基酸256至467。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:74的氨基酸256至467至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:74(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是pparγ受体的配体结合结构域。例如，pparγ受体的配体结合结构域可以是seqidno:75的氨基酸237至504。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:75的氨基酸237至504至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:75(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是糖皮质激素受体的配体结合结构域。例如，糖皮质激素受体的配体结合结构域可以是seqidno:76的氨基酸531至777。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:76的氨基酸531至777至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:76(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是甲状腺激素受体的配体结合结构域。例如，甲状腺激素受体的配体结合结构域可以是seqidno:77的氨基酸162至370。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:77的氨基酸162至370至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:77(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是盐皮质激素受体的配体结合结构域。例如，盐皮质激素受体的配体结合结构域可以是seqidno:78的氨基酸737至984。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:78的氨基酸737至984至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:78(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是维生素d受体的配体结合结构域。例如，维生素d受体的配体结合结构域可以是seqidno:79的氨基酸124至426。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:79的氨基酸124至426至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:79(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是pparα受体的配体结合结构域。例如，pparα受体的配体结合结构域可以是seqidno:80的氨基酸201至467。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:80的氨基酸201至467至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:80(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是pparβ/δ受体的配体结合结构域。例如，pparβ/δ受体的配体结合结构域可以是seqidno:81的氨基酸173至440。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:81的氨基酸173至440至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:81(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是孕烷x受体的配体结合结构域。例如，孕烷x受体的配体结合结构域可以是seqidno:82的氨基酸143至428。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:82的氨基酸143至428至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:82(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是肝x受体的配体结合结构域。例如，肝x受体的配体结合结构域可以是seqidno:83的氨基酸20至255。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:83的氨基酸20至255至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:83(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是法尼酯x受体的配体结合结构域。例如，法尼酯x受体的配体结合结构域可以是seqidno:84的氨基酸247至467。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:84的氨基酸247至467至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:84(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是rar相关的孤儿受体a的配体结合结构域。例如，rar相关的孤儿受体a的配体结合结构域可以是seqidno:85的氨基酸217至456。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:85的氨基酸217至456至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:85(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是rar相关的孤儿受体c的配体结合结构域。例如，rar相关的孤儿受体c的配体结合结构域可以是seqidno:86的氨基酸268至506。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:86的氨基酸268至506至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:86(人)

配体结合结构域的另一个非限制性实例是视黄酸受体的配体结合结构域。例如，视黄酸受体的配体结合结构域可以是seqidno:87的氨基酸156至385。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:87的氨基酸156至385至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

seqidno:87(人)

如本领域中可以理解的，在激素受体配体结合结构域的不同哺乳动物同源物之间不保守的氨基酸更有可能在配体结合结构域的激素或激素类似物结合活性中不发挥重要作用，而在激素受体配体结合结构域的不同哺乳动物同系物之间保守的那些氨基酸在配体结合结构域的激素或激素类似物结合活性中更可能发挥重要作用。一些配体结合结构域可以包括在激素受体配体结合结构域的不同哺乳动物同源物之间不保守的氨基酸的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)氨基酸取代。

抗原结合结构域

在单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，抗原结合结构域可以选自scfv、scfv-fc、vhh结构域、vnar结构域、(scfv)2和bite。可以用于单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体中的抗原结合结构域的另外的实例是本领域已知的。

单链fv或scfv片段包括单多肽链中的vh结构域和vl结构域。vh和vl通常通过肽接头连接。在其他实例中，接头可以是单氨基酸。在一些实例中，接头可以是化学键。参见，例如pluckthun,antibodiesfrome.coli.inrosenbergm.&mooreg.p.(eds.),thepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,pp.269-315,spinger-verlag,newyork,1994。可以用于scfv中的示例性vl和vh序列显示于实施例中的seqidno:104和108中。可以在scfv中的vl和vh结构域之间使用的示例性接头可以是本文所述的任何示例性接头(例如，具有seqidno:106的序列的接头)。

sc-fv-fc片段包括附接于fc结构域的scfv。例如，fc结构域可以附接于例如scfv的c末端。fc结构域可以跟随vl或vh，根据scfv中可变结构域的取向。fc结构域可以是本领域已知的任何fc结构域。在一些实例中，fc结构域是igg1、igg2、igg3或igg4fc结构域(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4fc结构域)。

bite是在单个多肽中包括两个vl和两个vh(其一起形成两个scfv)的抗原结合结构域，所述scfv可以各自与相同抗原上的不同表位结合，或者各自与不同的抗原结合。参见，例如baeuerleetal.,curr.opin.mol.ther.11:22-30,2009；wolfetal.,drugdiscoverytoday10:1237-1244,2005；和huehlsetal.,immunol.cellbiol.93:290-296,2015。

vhh结构域是在骆驼科动物中发现的单个单体可变抗体结构域，而vnar结构域是在软骨鱼中发现的单个单体可变抗体结构域。vhh结构域和vnar结构域描述于例如vanaudenhoveetal.,ebiomedicine8:40-48,2016；krahetal.,immunopharmacol.immunotoxicol.38:21-28,2016；cromieetal.,curr.top.med.chem.15:2543-2557,2016；kijankaetal.,nanomedicine10:161-174,2015；kovalevaetal.,expert.opin.biol.ther.14:1527-1539,2014；demeyeretal.,trendsbiotechnol.32:263-270,2014；mujic-delicetal.,trendspharmacol.sci.35:247-255,2014；muyldermans,ann.rev.biochem.82:775-797,2013；vinckeetal.,methodsmol.biol.911:15-26,2012；rahbarizadehetal.,immunol.invest.40:299-338,2011；vanbockstaeleetal.,curr.opin.investig.drugs10:1212-1224,2009；wesolowskietal.,med.microbiol.immunol.198:157-174,2009；degenstetal.,dev.comp.immunol.30:187-198,2006；muyldermans,j.biotechnol.74:277-302,2001；和muyldermansetal.,trendsbiochem.sci.26:230-235,2001中。

在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，组成多链嵌合抗原受体的多肽的至少两个可以一起相互作用以形成抗原结合结构域。在此类实施方案中，抗原结合结构域可以选自下组：抗原结合抗体片段、双亲和力重靶向抗体(dart)、fab-scfv-fc、triomab、crossmab、ortho-fabigg、igg-scfv、scfv2-fc、双纳米抗体、tanden抗体、dart-fc、scfv-has-scfv、dnl-fab3、daf(二合一或四合一)、dutamab、dt-igg、突出-进入-空穴(knobs-in-hole)共同lc、突出-进入-空穴组装、fab臂交换抗体、seedbody、triomab、luz-y、scdiabody-fc、fcab、kλ-body、正交fab、dvd-igg、igg(h)-scfv、scfv-(h)igg、igg(l)-scfv、scfv-(l)-igg、igg(l,h)-fc、igg(h)-v、v(h)-igg、igg(l)-v、v(l)-igg、kihigg-scfab、2scfv-igg、igg-2scfv、scfv4-ig、zybody、dvi-igg、纳米抗体、纳米抗体-hsa、二价抗体、atandab、scdiabody、scdiabody-ch3、电荷配对抗体(chargepairantibody)、二价抗体-ch3、cov-x-bod、三价抗体(triplebody)、微型抗体(miniantibody)、dvd-ig、微抗体(minibody)、二合一iggtribi微抗体、scfv-ch3kih、fab-scfv、scfv-ch-cl-scfv、f(ab')2-scfv2、scfv-kih、四价hcab、二价抗体-fc、串联scfv-fc、胞内抗体(intrabody)、对接并锁定(dockandlock)双特异性抗体、immtac、hsabody、scdiabody-has、串联scfv、igg-igg和scfv1-peg-scfv2。

抗原结合抗体片段的非限制性实例包括fv片段、fab片段、f(ab')2片段和fab'片段。抗原结合抗体片段的另外的实例是igg的抗原结合片段(例如，igg1、igg2、igg3或igg4的抗原结合片段)(例如，人或人源化的igg(例如，人或人源化的igg1、igg2、igg3或igg4)的抗原结合片段)；iga的抗原结合片段(例如，iga1或iga2的抗原结合片段)(例如，人或人源化的iga(例如，人或人源化的iga1或iga2)的抗原结合片段)；igd的抗原结合片段(例如，人或人源化的igd的抗原结合片段)；ige的抗原结合片段(例如，人或人源化的ige的抗原结合片段)；或igm的抗原结合片段(例如，人或人源化的igm的抗原结合片段)。

dvd-ig的实例描述于例如，digiammarinoetal.,methodsmol.biol.899:145-156,2012；jakobetal.,mabs5:358-363,2013；和美国专利号7,612,181；8,258,268；8,586,714；8,716,450；8,722,855；8,735,546；和8,822,645中。dart的实例描述于例如，garber,naturereviewsdrugdiscovery13:799-801,2014中。triomab、具有普通lc的kihigg、crossmab、ortho-fabigg、二合一igg、igg-scfv、scfv2-fc、双纳米抗体、tanden抗体、dart-fc、scfv-has-scfv和dnl-fab3的实例描述于例如，kontermannetal.,drugdiscoverytoday20:838-847,2015中。daf(二合一或四合一)、dutamab、dt-igg、突出-进入-空穴共同lc、突出-进入-空穴组装、电荷配对抗体、fab臂交换抗体、seedbody、triomab、luz-y、fcab、kλ-body、正交fab、dvd-igg、igg(h)-scfv、scfv-(h)igg、igg(l)-scfv、scfv-(l)-igg、igg(l,h)-fc、igg(h)-v、v(h)-igg、igg(l)-v、v(l)-igg、kihigg-scfab、2scfv-igg、igg-2scfv、scfv4-ig、zybody、dvi-igg、纳米抗体、纳米抗体-hsa、二价抗体、tandab、scdiabody、scdiabody-ch3、二价抗体-ch3、三价抗体、微型抗体、微抗体、tribi微抗体、scfv-ch3kih、fab-scfv、scfv-ch-cl-scfv、f(ab')2-scfv2、scfv-kih、fab-scfv-fc、四价hcab、scdiabody-fc、二价抗体-fc、串联scfv-fc、胞内抗体、对接并锁定双特异性抗体、immtac、hsabody、scdiabody-has、串联scfv、igg-igg、cov-x-body和scfv1-peg-scfv2的实例描述于例如spiessetal.,mol.immunol.67:95-106,2015中。

本文所述的任何抗原结合结构域可以与抗原结合，其中解离平衡常数(kd)为小于1x10^-7m、小于1x10^-8m、小于1x10^-9m、小于1x10^-10m、小于1x10^-11m、小于1x10^-12m或小于1x10^-13m。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白复合物可以与第一和/或第二抗原结合，其中kd为约1x10^-4m至约1x10^-6m、约1x10^-5m至约1x10^-7m、约1x10^-6m至约1x10^-8m、约1x10^-7m至约1x10^-9m、约1x10^-8m至约1x10^-10m或约1x10^-9m至约1x10^-11m(包含在内)。可以使用本领域已知的多种不同方法来确定抗原结合结构域的kd值(例如，电泳迁移率变动测定、滤膜结合测定、表面等离子体共振和生物分子结合动力学测定等)。

抗原

在一些实施方案中，本文所述的抗原结合结构域可以与单一抗原(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性抗原)结合。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合结构域可以与两种或更多种不同的抗原(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性抗原的两种或更多种)结合。抗原的非限制性实例包括：her2、a33抗原、9-0-乙酰基-gd3、ca19-9标志物、bhcg、ca-125标志物、碳酸酐酶ix(mn/caix)、钙网蛋白、ccr5、ccr8、cd2、、cd3、cd5、cd16、cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd27、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40l、cd44、cd44v6、cd63、cd70、cd84、cd96、cd100、cc123、cd133、cd137、cd138、cd150、cd152(ctla-4)、cd160、crtam、cs1(cd319)、dnam-1(cd226)、cd229、cd244、cd272(btla)、cd274(pdl-1、b7h1)、cd279(pd-1)、cd319、cd352、crtam(cd355)、cd358、dr3、gitr(tnfrsf18)、hvem、icos、light、ltbr、ox40、kir的活化形式、nkg2c、nkg2d、nkg2e、一种或多种天然细胞毒性受体、ntb-a、pen-5、癌胚抗原(cea；cd66e)、桥粒芯蛋白4、e-钙粘蛋白新表位、内皮唾液酸蛋白、肝配蛋白(ephrin)a2(epha2)、表皮生长因子受体(egfr)、上皮细胞粘附分子(epcam)、岩藻糖基gm1、gd2、gd3、gm2、神经节苷脂gm3、globoh、糖蛋白100、her2/neu、her3、her4、胰岛素样生长因子受体1、lewis-y、lg、ly-6、黑色素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(mcscp)、间皮素、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5ac、muc5b、muc7、muc16、穆勒氏抑制物质(mis)ii型受体、浆细胞抗原、polysa、psca、psma、音猬因子(sonichedgehog)(shh)、sas、steap、stn抗原、tnf-α前体、2b4(cd244)、β2-整合素、kir、kir2dl1、kir2dl2、kir2dl3、kir3dl2、kir-l、klrgi、lair-1、nkg2a、nkr-pia、siglec-3、siglec-7、siglec-9、tcra、tcrb、tcr5y、tim1、lag3、lair1、pd-1h、tigit、tim2和tim3。抗原的另外的实例是本领域已知的。

共刺激结构域

在正常淋巴细胞中，t细胞活化由两类细胞内信号传导结构域介导。经由t细胞受体(例如tcr/cd3复合物)经由mhc介导的抗原依赖性激活来启动初级信号传导。次级或共刺激信号由不同的受体提供，所述受体包括以非抗原依赖性方式起作用的共刺激信号传导结构域。仅通过tcr的信号传导结构域生成的信号不足以用于完全t细胞活化；还需要共刺激信号。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的共刺激结构域或其部分，所述内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽选自下组：cd27(也称为s152、s152.lpfs2、t14、tnfrsf7和tp55)、cd28(也称为tp44)、4-1bb(也称为tnfrsf9、cd137、cdw137、ila和肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、ox40(也称为tnfrsf4、act35、rp5-902p8.3、imd16、cd134、txgp1l和肿瘤坏死因子受体超家族成员4)、cd30(也称为tnfrsf8、d1s166e和ki-1)、cd40l(也称为cd40lg、cd154、higm1、igm、imd3、t-bam、tnfsf5、trap、gp39、hcd40l和cd40配体)、cd40(也称为bp50、cdw40、tnfrsf5、p50、cd40(蛋白质)和cd40分子)、pd-1(也称为pdcd1、cd279、pd-1、sleb2、hpd-1、hpd-l、hsle1和程序性细胞死亡1)、pd-l1(也称为cd274、b7-h、b7h1、pd-l1、pdcd1l1、pdcd1lg1、pdl1、cd274分子和程序性细胞死亡1配体1)、icos(也称为ailim、cd278和cvid1)、lfa-1(也称为淋巴细胞功能相关抗原1)、cd2(也称为lfa-2、srbc、t11和cd2分子)、cd7(也称为gp40、leu-9、tp41、tp40和cd7分子)、cd160(也称为by55、nk1、nk28和cd160分子)、light(也称为tnfsf14、cd258、hveml、light、ltg、tr2、tnlg1d和肿瘤坏死因子超家族成员14)、btla(也称为cd272和btla1)、tim3(也称为havcr2、havcr-2、kim-3、tim3、timd-3、timd3、tim-3、cd366和甲型肝炎病毒细胞受体2)、cd244(也称为2b4、nail、nkr2b4、nmrk、slamf4和cd244分子)、cd80(也称为b7、b7-1、b7.1、bb1、cd28lg、cd28lg1、lab7和cd80分子)、lag3(也称为cd223和淋巴细胞活化3)、nkg2c(也称为cd314、d12s2489e、klr、nkg2-d、nkg2d和杀伤细胞凝集素样受体k1)、gitr(也称为tnfrsf18、rp5-902p8.2、aitr、cd357和gitr-d)、hvem(也称为tnfrsf14、rp3-395m20.6、atar、cd270、hvea、hvem、lightr和tr2)、tlrl、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlrio、cardll、cd54(icam)、cd83、dap10、lat、slp76、trim、zap70和b7-h3(也称为cd276、4ig-b7-h3、b7h3、b7rp-2和cd276分子)。前句中的字母“cd”代表“分化群”。例如，cd3代表“分化群3”。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽(例如，以上列出的任何多肽的哺乳动物或人同源物)的共刺激结构域或其部分。

用于提供共刺激信号的任何共刺激结构域或其部分都适合根据本文公开的组合物和方法使用。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人cd28的共刺激结构域或其部分(例如登录号p01747，例如来自seqidno:18的氨基酸180至220)。在一些实施方案中，共刺激结构域是以下序列或其片段或者包括以下序列或其片段：所述序列与seqidno:18的氨基酸180至220至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(或者与其相同)。在一些实施方案中，共刺激结构域是以下序列或其片段或者包括以下序列或其片段：所述序列与seqidno:116至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或者与其相同)。

seqidno:18

mlrlllalnlfpsiqvtgnkilvkqspmlvaydnavnlsckysynlfsrefraslhkgldsavevcvvygnysqqlqvysktgfncdgklgnesvtfylqnlyvnqtdiyfckievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人4-1bb的共刺激结构域或其部分(例如登录号q07011，例如来自seqidno:19的氨基酸214至255)。在一些实施方案中，共刺激结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:19的氨基酸214至255或其部分至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

seqidno:19

mgnscynivatlllvlnfertrslqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspqiisfflaltstallfllffltlrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel

在一些实施方案中，共刺激结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与seqidno:44、57或116或其部分至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

本文公开的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体可以包括共刺激结构域，所述共刺激结构域包括来自具有共刺激结构域的内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的任何同等型的氨基酸的序列，其包括例如，以下的同等型：cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40l、cd40、pd-1、pd-l1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd160、light、btla、tim3、cd244、cd80、lag3、nkg2c或b7-h3(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的共刺激结构域或其部分包括表现出与以下共刺激结构域至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列一致性的氨基酸的序列：所述共刺激结构域来自哺乳动物(例如人)cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40l、cd40、pd-1、pd-l1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd160、light、btla、tim3、cd244、cd80、lag3、nkg2c或b7-h3的一个或多个。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的共刺激结构域或其部分包括与以下内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的一个或多个的共刺激结构域相比，具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸的序列：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40l、cd40、pd-1、pd-l1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd160、light、btla、tim3、cd244、cd80、lag3、nkg2c或b7-h3(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括共刺激结构域，所述共刺激结构域是具有来自两个或更多个内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的共刺激结构域的部分的嵌合共刺激结构域，所述内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽包括但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40l、cd40、pd-1、pd-l1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd160、light、btla、tim3、cd244、cd80、lag3、nkg2c或b7-h3(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)，使得该跨膜结构域的两个或更多个部分一起构成功能性共刺激结构域。在一些实施方案中，与野生型共刺激结构域的相应部分相比，此类嵌合共刺激结构域的部分可以包括一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。

本文公开的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的共刺激结构域可以是任何合适的长度。例如，共刺激结构域可以具有以下的长度：约20个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸或约25个氨基酸(包含在内)；约25个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸或约30个氨基酸(包含在内)；约30个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸或约35个氨基酸(包含在内)；约35个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸或约40个氨基酸(包含在内)；约40个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸或约45个氨基酸(包含在内)；约45个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸或约50个氨基酸(包含在内)；约50个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸或约55个氨基酸(包含在内)；约55个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸或约60个氨基酸(包含在内)；约60个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸或约65个氨基酸(包含在内)；约65个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸或约70个氨基酸(包含在内)；约70个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸或约80个氨基酸(包含在内)；约80个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸或约90个氨基酸(包含在内)；约90个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸或约100个氨基酸(包含在内)；约100个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸或约110个氨基酸(包含在内)；约110个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸或约120个氨基酸(包含在内)；约120个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸或约130个氨基酸(包含在内)；约130个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸或约140个氨基酸(包含在内)；约140个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸或约150个氨基酸(包含在内)；约150个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸或约160个氨基酸(包含在内)；约160个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸或约170个氨基酸(包含在内)；约170个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸或约180个氨基酸(包含在内)；约180个氨基酸至约200个氨基酸或约190个氨基酸(包含在内)；或约190个氨基酸至约200个氨基酸(包含在内)。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括两个或更多个共刺激结构域，例如两个、三个、四个或五个或更多个共刺激结构域。在一些实施方案中，该两个或更多个共刺激结构域是相同的(例如，它们具有相同的氨基酸序列)。在一些实施方案中，共刺激结构域是不相同的。例如，共刺激结构域可以选自不同的内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽，其包括但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40l、cd40、pd-1、pd-l1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd160、light、btla、tim3、cd244、cd80、lag3、nkg2c或b7-h3(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)。在一些实施方案中，该两个或更多个共刺激结构域可以通过一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)氨基酸取代、缺失或添加而彼此不同。在一些实施方案中，两个或更多个共刺激结构域表现出与彼此至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列一致性。

基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)

itam包括通过任意两个其他氨基酸与一个亮氨酸或异亮氨酸分隔的酪氨酸，并因此可以表示为例如tyr-x-x-leu/ile。itam通常在免疫系统的某些细胞表面蛋白质的细胞质尾中重复(例如两次或更多次)，并且通常由六至八个氨基酸分隔。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性哺乳动物(例如人)多肽的itam或其部分，其中内源性哺乳动物(例如人)多肽选自下组：cd3ζ(也称为cd3zeta)、cd3δ(cd3delta)、cd3ε(cd3epsilon)、cd3γ(cd3gamma)、dap12、fcεr1γ(fcepsilon受体igamma链)、fcry、fcrft、cd35、cd22、cd79a(抗原受体复合物相关蛋白alpha链)、cd79b(抗原受体复合物相关蛋白beta链)和cd66d。前句中的字母“cd”代表“分化群”。例如，cd3代表“分化群3”。

用于介导内源性哺乳动物(例如人)跨膜蛋白质中信号传导的任何itam或其部分都适合根据本文公开的组合物和方法使用。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人cd3zeta的itam或其部分(例如，登录号p20963，例如，存在于seqidno:17的氨基酸52-164的itam或其部分；或者seqidno:118或其部分)。在一些实施方案中，itam包含与以下序列至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％相同的序列：seqidno:17的氨基酸52-165的序列(或其部分)或者seqidno:118的序列(或其部分)。

seqidno:17

mkwkalftaailqaqlpiteaqsfglldpklcylldgilfiygviltalflrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

在一些实施方案中，itam包含作为以下序列的序列或者包括以下序列的序列：所述序列与seqidno:48、61或118或其部分至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同。

如本领域普通技术人员将理解的，某些多肽具有至少在其一级多肽序列上不同的两种或更多种同等型。例如，不同的同等型可以作为可变剪接的结果生成。本文公开的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体可以包括itam，所述itam包括来自具有itam的内源性哺乳动物跨膜多肽的任何同等型的氨基酸的序列，所述内源性哺乳动物跨膜多肽包括，例如以下的哺乳动物(例如人)同等型：cd3ζ、cd3d、cd3e、cd3g、dap12、fcer1g、fcry、fcrft、cd35、cd22、cd79a、cd79b或cd66d。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的itam或其部分包括与内源性哺乳动物(例如人)跨膜蛋白质(例如cd3ζ、cd3d、cd3e、cd3g、dap12、fcer1g、fcry、fcrft、cd35、cd22、cd79a、cd79b或cd66d)中一个或多个的itam的itam相比，具有一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸的序列。例如，itam的酪氨酸和亮氨酸或异亮氨酸可以保留，而将它们分隔的两个氨基酸可以用不同的氨基酸替换。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括itam，所述itam是具有来自两个或更多个内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的itam的部分的嵌合itam，所述内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽包括但不限于cd3ζ、cd3d、cd3e、cd3g、dap12、fcer1g、fcry、fcrft、cd35、cd22、cd79a、cd79b或cd66d(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)，使得该两个或更多个itam部分一起构成功能性itam。在一些实施方案中，与野生型itam的相应部分相比，此类嵌合itam的部分可以包括一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。

在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括两个或更多个itam，例如两个、三个、四个或五个或更多个itam。在一些实施方案中，该两个或更多个itam是相同的(例如，它们具有相同的氨基酸序列)。在一些实施方案中，itam是不相同的。例如，itam可以选自不同的内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽，其包括但不限于cd3ζ、cd3d、cd3e、cd3g、dap12、fcer1g、fcry、fcrft、cd35、cd22、cd79a、cd79b(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)。在一些实施方案中，该两个或更多个itam可以通过一个或多个氨基酸取代、缺失或添加而彼此不同。

核酸

本文还提供了编码任何单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合抗原受体的核酸。本文还提供了编码组成多链嵌合多肽的一个或多个单链多肽的一组核酸(例如，其中组成该多链嵌合多肽的至少一个单链多肽由组中的每个核酸编码)。

载体

本文提供了包括本文提供的任何核酸的载体。根据本公开的“载体”是能够诱导哺乳动物细胞中重组蛋白质(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)表达的多核苷酸。本文提供的载体可以是例如环形或线性化的形式。载体的非限制性实例包括质粒、sv40载体、腺病毒载体和腺相关病毒(aav)载体。载体的非限制性实例包括慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如gamma-逆转录病毒载体。参见，例如carlensetal.,exp.hematol.28(10:1137-1146,2000；parketal.,trendsbiotechnol.29(11):550-557,2011；和alonso-caminoetal.,mol.ther.nucleicacids2:e93,2013。逆转录病毒载体的非限制性实例包括衍生自以下的逆转录病毒载体：莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus)、骨髓增生性肉瘤病毒、鼠胚胎干细胞病毒、鼠干细胞病毒、脾病灶形成病毒(spleenfocusformingvirus)或腺相关病毒。逆转录病毒载体的非限制性实例描述于例如美国专利号5,219,740和6,207,453；milleretal.,biotechniques7:980-990,1989；miller,humangenetherapy1:5-14,1990；scarpaetal.,virology180:849-852,1991；burnsetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:8033-8037,1993；和boris-lawrieetal.,cur.opin.genet.develop.3:102-109,1993中。示例性慢病毒载体描述于例如wangetal.,j.immunother.35(9):689-701,2003；cooperetal.,blood101:1637-1644,2003；verhoeyenetal.,methodsmol.biol.506:97-114,2009；和cavalierietal.,blood102(2):497-505,2003中。

其中可以插入本文提供的任何核酸的示例性载体描述于例如，ausubeletal.,eds.“currentprotocolsinmolecularbiology”currentprotocols,1993；和sambrooketal.,eds.“molecularcloning:alaboratorymanual,”2nded.,coldspringharborpress,1989。

在一些实施方案中，载体进一步包括与本文所述的任何核酸可操作地连接的启动子和/或增强子。启动子的非限制性实例包括来自以下的启动子：人巨细胞病毒(cmv)、小鼠磷酸甘油酸激酶1、多瘤腺病毒、甲状腺刺激激素α、波形蛋白、猿猴病毒40(sv40)、肿瘤坏死因子、β-球蛋白、甲胎蛋白、γ-球蛋白、β-干扰素、γ-谷氨酰转移酶、人泛素c(ubc)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、劳斯氏肉瘤病毒、3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、金属硫蛋白ii(mtii)、淀粉酶、人ef1α、组织蛋白酶、mi毒蕈碱受体、逆转录病毒ltr(例如人t细胞白血病病毒htlv)、aavitr、白介素2、胶原酶、血小板源生长因子、腺病毒e2、溶基质素、鼠mx、大鼠胰岛素、葡萄糖调节蛋白78、人免疫缺陷病毒、葡萄糖调节蛋白94、α-2-巨球蛋白、mhci类、hsp70、增殖蛋白、免疫球蛋白轻链、t细胞受体、hladqα、hladqβ、白介素2受体、mhcii类、前白蛋白(运甲状腺素蛋白)、弹性蛋白酶i、白蛋白、c-fos、神经细胞粘附分子(ncam)、h2b组蛋白、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白(saa)、肌肉肌酸激酶、肌钙蛋白i(tni)和长臂猿猿白血病病毒(galv)。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。启动子的另外的实例是本领域已知的。

在一些实例中，本文提供的载体进一步包括poly(a)序列，其可操作地连接并定位于编码单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或组成多链嵌合抗原受体的任何多肽的序列的3’端。poly(a)序列的非限制性实例包括衍生自以下的poly(a)序列：牛生长激素(woychiketal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.81(13):3944-3948,1984和美国专利号5,122,458)、小鼠β-球蛋白、小鼠α-球蛋白(orkinetal.,emboj.4(2):453-456,1985)、人胶原、多瘤病毒(battetal.,mol.cellbiol.15(9):4783-4790,1995)、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(hsvtk)、igg重链基因聚腺苷酸化信号(美国专利申请公开号2006/0040354)、人生长激素(hgh)(szymanskietal.,mol.therapy15(7):1340-1347,2007)、sv40poly(a)位点，例如sv40后期和早期poly(a)位点(scheketal.,mol.cellbiol.12(12):5386-5393,1992)。在一些实施方案中，poly(a)序列包括高度保守的上游元件(aataaa)。该aataaa序列可以例如用能够信号传导聚腺苷酸化的与aataaa同源的其他六核苷酸序列取代，包括例如attaaa、agtaaa、cataaa、tataaa、gataaa、actaaa、aatata、aagaaa、aataat、aaaaaa、aatgaa、aatcaa、aacaaa、aatcaa、aataac、aataga、aattaa和aataag。参见例如，wo06012414a2)。

poly(a)序列可以例如是合成的聚腺苷酸化位点。参见，例如levittelal,genesdev.3(7):1019-1025,1989)。在一些实例中，poly(a)序列可以是可溶性神经纤毛蛋白(neuropilin)-1的聚腺苷酸化信号：aaataaaatacgaaatg。poly(a)序列的另外的实例是本领域已知的。载体的另外的实例和方面也是本领域已知的。

将核酸或载体引入到哺乳动物细胞中的方法

可以使用本领域已知的多种不同方法将本文公开的任何核酸和载体引入哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞，例如本文所述的任何t细胞(例如人t细胞))。可以用于将核酸或载体引入到哺乳动物细胞中的方法的非限制性实例包括脂质转染、转染、电穿孔、显微注射、磷酸钙转染、基于树状聚合物的转染、阳离子聚合物转染、细胞挤压、超声穿孔、光学转染、impalection、流体动力递送、磁转染、病毒转导(例如腺病毒和慢病毒转导)和纳米颗粒转染。将核酸或载体引入到哺乳动物细胞中的另外的方法是本领域已知的。

哺乳动物细胞

本文还提供了包括本文所述的任何核酸或载体的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞先前从受试者(例如，人受试者，例如，鉴定或诊断为患有癌症的人受试者)获得。

哺乳动物细胞的非限制性实例包括t细胞(例如人t细胞)。t细胞(例如人t细胞)的非限制性实例包括例如，未成熟的胸腺细胞、外周血淋巴细胞、初始t细胞、多能th细胞前体、淋巴样祖细胞、treg细胞、记忆t细胞、th17细胞、th22细胞、th9细胞、th2细胞、th1细胞、th3细胞、γδt细胞、αβt细胞、treg细胞和肿瘤浸润性t细胞。t细胞(例如人t细胞)的另外的实例包括cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞和自然杀伤t细胞。哺乳动物细胞的另外的实例包括肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀伤细胞。

激素和激素类似物

激素的非限制性实例包括雌激素(17β-雌二醇)、孕酮、睾酮和二氢睾酮。激素类似物的非限制性实例包括雌激素激素类似物，孕激素激素类似物和雄激素激素类似物。

雌激素类似物的非限制性实例包括：阿非昔芬(afimoxifene)(也称为4-羟基他莫昔芬、4-oht、4-ht和ohtam)；选择性雌激素受体调节剂(serm)，例如氯米芬(clomifene)、奥美昔芬(ormeloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)和奥培米芬(ospemifene)；雌二醇；雌酮；雷洛昔芬；雌三醇；金雀异黄素(genistein)；植物雌激素(例如，异黄酮，如金雀异黄素、黄豆苷元(daidzein)、芒柄花黄素(formononetin)和黄豆黄素(glycitein)；coumestans，如拟雌内酯(coumestrol)和repensolandtrifoliol；和木脂素类(lignans)，如落叶松脂素(lariciresinol)、罗汉松树脂酚(matairesinol)、松脂醇(pinoresinol)、开环异落叶松树脂酚(secoisolariciresinol)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)和五加前胡脂素(steganacin))；和外源性雌激素(xenoestrogen)(例如，己烯雌酚(diethylstilbestrol)、乙炔雌二醇、丁基羟基茴香醚、赤藓红(erythrosine)、樟脑(例如，4-甲基亚苄基樟脑)、对羟基苯甲酸酯类(parabens)(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯)、阿特拉津(atrazine)、二氯二苯基二氯乙烯、二氯二苯基三氯乙烷、甲氧氯、狄氏剂(dieldrin)、硫丹(endosulfan)、七氯、林丹(lindane)、酚类(例如，双酚a和壬基酚)、联苯类(例如，一氯联苯和二氯联苯)、邻苯二甲酸酯类(例如，邻苯二甲酸二-2-乙基己酯、邻苯二甲酸二异癸酯和邻苯二甲酸二异壬酯)和金属雌激素)。在一些实施方案中，雌激素类似物可以是例如，米非司酮(也称为ru-486)。在一些实施方案中，雌激素类似物可以是选择性孕酮受体调节剂(sprm)，如奥那司酮(onapristone)(zk98299)、罗那利桑(lonaprisan)(zk230211，bay86-5044)、apr19、ec304、way-255348、org31710、索普利尼(asoprisnil)(j867)、特拉司酮(telapristone)(proellex，cdb-4124)和cdb-2914(醋酸乌利司他(ulipristalacetate))。

孕酮激素类似物的非限制性实例包括选择性孕酮受体调节剂(sprm)，如奥那司酮(zk98299)、罗那利桑(zk230211，bay86-5044)、apr19、ec304、way-255348、org31710、索普利尼(j867)、特拉司酮(proellex，cdb-4124)和cdb-2914(醋酸乌利司他)。

雄激素类似物的非限制性实例包括依诺勃沙(enobosarm)(也称为ostarine、mk-2866、gtx-024和s-22)、bms-564,929、lgd-4033(ligandrol)、ac-262,356、jnj-28330835、lgd-2226、lgd-3303、s-40503、s-23、rad140、acetothiolutamide、andarine、lg-121071、tfm-4as-1和yk-11。

如本领域中可以理解的，雌激素或雌激素激素类似物可以与包括雌激素受体配体结合结构域的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体一起使用。

组合物和试剂盒

本文还提供了包括本文所述的任何核酸、载体、核酸的组、载体的组或哺乳动物细胞的组合物(例如药物组合物)。例如，本文提供了包括本文所述的任何核酸或核酸的组，或本文提供的任何载体或载体的组以及药学上可接受的溶剂或载体的组合物。

在一些实施方案中，组合物可以是本文所述的任何哺乳动物细胞(例如，先前从受试者(例如，鉴定或诊断为患有癌症的受试者)获得的本文所述的任何哺乳动物细胞)，其包含编码本文所述的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的任一个的核酸。在包括本文所述的任何哺乳动物细胞的组合物中，该组合物可以进一步包括细胞培养基或药学上可接受的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水)。包括本文所述的任何哺乳动物细胞的组合物可以配制用于静脉内或动脉内施用。

还提供了试剂盒，其包括本文所述的任何组合物的一个或多个。例如，试剂盒可以包括本文所述的任何组合物和配制用于向受试者施用的一种或多种剂量的激素或激素类似物(例如，配制用于口服、静脉内、肌内或皮下施用)。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包括用于进行本文所述的任何方法的说明书。

诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合多肽的膜定位的方法

本文还提供了诱导哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链嵌合多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的膜定位的方法，其包括：使表达单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链嵌合多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽、单链嵌合抗原结合受体或多链嵌合抗原受体分别定位于细胞的质膜的细胞外侧。

这些方法的一些实施方案进一步包括将编码单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞(例如本文所述或本领域已知的任何哺乳动物细胞)中以分别生成表达单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在这些方法的一些实例中，哺乳动物细胞是t细胞(例如，cd8+t细胞、cd4+t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞)。在一些实例中，哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)是先前从受试者(例如，已经鉴定或诊断为患有癌症，例如本文所述的任何癌症的受试者)中获得的哺乳动物细胞。这些方法的一些实施方案进一步包括从受试者获得哺乳动物细胞。

在这些方法的任一个的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在这些方法的任一个的一些实施方案中，接触步骤哺乳动物(例如患有癌症(例如本文所述的任何癌症)的哺乳动物(例如人))中进行。在一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物(例如人)中癌症的治疗。

可以使用本文提供的任何方法治疗的癌症的非限制性实例包括：急性淋巴母细胞白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、卡波济肉瘤、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓增生性新生物、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌，感觉神经母细胞瘤(esthesioneuroblastoma)、尤文肉瘤、眼癌、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、生殖细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝癌、下咽癌(hypopharngealcancer)、胰腺癌、肾癌、喉癌、慢性骨髓性白血病、唇和口腔癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口癌(mouthcancer)、口腔癌(oralcancer)、骨肉瘤、卵巢癌、阴茎癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。

在这些方法的任一个的一些实施方案中，该方法导致受试者中肿瘤负荷(例如，肿瘤质量和/或体积)减少。例如，本文所述的任何方法可以导致受试者中肿瘤负荷减少(例如，与治疗前的受试者中的肿瘤负荷相比)至少约1％至约99％(例如，约1％至约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约2％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约3％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约5％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％或约10％(包含在内)；约10％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％或约15％(包含在内)；约15％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％或约20％(包含在内)；约20％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％或约25％(包含在内)；约25％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％或约30％(包含在内)；约30％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％或约35％(包含在内)；约35％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％或约40％(包含在内)；约40％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％或约45％(包含在内)；约45％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％或约50％(包含在内)；约50％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％或约55％(包含在内)；约55％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％或约60％(包含在内)；约60％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％或约65％(包含在内)；约65％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％或约70％(包含在内)；约70％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％或约72％(包含在内)；约72％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％或约74％(包含在内)；约74％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％或约76％(包含在内)；约76％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％或约78％(包含在内)；约78％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％或约80％(包含在内)；约80％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％或约82％(包含在内)；约82％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％或约84％(包含在内)；约84％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％或约86％(包含在内)；约86％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％或约88％(包含在内)；约88％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％或约90％(包含在内)；约90％至约99％、约98％、约96％、约94％或约92％(包含在内)；约92％至约99％、约98％、约96％或约94％(包含在内)；约94％至约99％、约98％或约96％(包含在内)；或约96％至约99％或约98％(包含在内))。

在一些实施方案中，该方法导致受试者中癌症的进展速率降低。例如，本文所述的任何方法可以导致受试者中癌症的进展速率降低(例如，与治疗前的受试者中或者对照受试者或患有相同癌症且未施用治疗或施用不同治疗的受试者的对照群体中的癌症的进展速率相比)至少约1％至约99％(例如，约1％至约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约2％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约3％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约5％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％或约10％(包含在内)；约10％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％或约15％(包含在内)；约15％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％或约20％(包含在内)；约20％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％或约25％(包含在内)；约25％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％或约30％(包含在内)；约30％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％或约35％(包含在内)；约35％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％或约40％(包含在内)；约40％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％或约45％(包含在内)；约45％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％或约50％(包含在内)；约50％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％或约55％(包含在内)；约55％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％或约60％(包含在内)；约60％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％或约65％(包含在内)；约65％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％或约70％(包含在内)；约70％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％或约72％(包含在内)；约72％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％或约74％(包含在内)；约74％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％或约76％(包含在内)；约76％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％或约78％(包含在内)；约78％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％或约80％(包含在内)；约80％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％或约82％(包含在内)；约82％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％或约84％(包含在内)；约84％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％或约86％(包含在内)；约86％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％或约88％(包含在内)；约88％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％或约90％(包含在内)；约90％至约99％、约98％、约96％、约94％或约92％(包含在内)；约92％至约99％、约98％、约96％或约94％(包含在内)；约94％至约99％、约98％或约96％(包含在内)；或约96％至约99％或约98％(包含在内))。

在这些方法的任一个的一些实施方案中，该方法导致受试者中癌症的生存时间增加。例如，本文所述的任何方法可以导致受试者中癌症的生存时间增加(例如，与对照受试者或患有相同癌症且未接受治疗或者接受不同治疗的对照受试者的群体的生存时间相比)约1％至约800％(例如，约1％至约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％、约60％、约40％、约20％、约10％或约5％(包含在内)；约5％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％、约60％、约40％、约20％或约10％(包含在内)；约10％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％、约60％、约40％或约20％(包含在内)；约20％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％、约60％或约40％(包含在内)；约40％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％或约60％(包含在内)；约60％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％(包含在内)；约80％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％或约100％(包含在内)；约100％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％或约150％(包含在内)；约150％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％或约200％(包含在内)；约200％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％或约250％(包含在内)；约250％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％或约300％(包含在内)；约300％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％或约350％(包含在内)；约350％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％或约400％(包含在内)；约400％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％或约450％(包含在内)；约450％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％或约500％(包含在内)；约500％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％或约550％(包含在内)；约550％至约800％、约750％、约700％、约650％或约600％(包含在内)；约600％至约800％、约750％、约700％或约650％(包含在内)；约650％至约800％、约750％或约700％(包含在内)；约700％至约800％或约750％(包含在内)；或约750％至约800％(包含在内))。

可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合多肽的膜定位的方法

本文还提供了可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链嵌合多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的膜定位的方法，其包括：(a)使表达单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链嵌合多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与减少量的激素或激素类似物接触，其导致哺乳动物细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的水平降低(例如与步骤(a)中质膜的细胞外侧的水平相比)。在一些实施方案中，步骤(b)中降低的水平是步骤(a)中质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的水平至少5％降低、至少10％降低、至少15％降低、至少20％降低、至少25％降低、至少30％降低、至少35％降低、至少40％降低、至少45％降低、至少50％降低、至少55％降低、至少60％降低、至少65％降低、至少70％降低、至少75％降低、至少80％降低、至少85％降低、至少90％降低、至少95％降低或至少99％降低。在一些实施方案中，步骤(b)中降低的水平是步骤(a)中质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的水平100％降低。在一些实施方案中，步骤(b)中哺乳动物细胞不与任何激素或激素类似物激素接触。这些方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)与增加量的激素或激素类似物接触，其导致与步骤(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的水平增加。

这些方法的任一个的一些实施方案进一步包括将编码单链嵌合多肽的核酸引入到哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)中以生成表达单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是t细胞(例如人t细胞)。在一些实施方案中，t细胞(例如人t细胞)选自下组：cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、记忆t细胞、treg细胞和自然杀伤t细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者(例如人)获得的哺乳动物细胞。在一些实例中，受试者(例如人)已鉴定或诊断为患有癌症(例如，本文所述的任何类型的癌症)。一些实施方案进一步包括从受试者获得哺乳动物细胞。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物(例如，受试者)中进行。在一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物(例如人)中癌症的治疗。

可以使用本文提供的任何方法治疗的癌症的非限制性实例包括：急性淋巴母细胞白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、卡波济肉瘤、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓增生性新生物、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌，感觉神经母细胞瘤(esthesioneuroblastoma)、尤文肉瘤、眼癌、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、生殖细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝癌、下咽癌(hypopharngealcancer)、胰腺癌、肾癌、喉癌、慢性骨髓性白血病、唇和口腔癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、阴茎癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。

通过可逆地改变单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合多肽的膜定位来控制其在哺乳动物细胞中的毒性的方法

在一些实施方案中，本文公开的组合物和/或方法可以用于在存在与多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)中存在的lbd结合的激素或激素类似物的情况下选择性杀伤受试者(例如人)中的癌细胞。在一些实施方案中，在存在激素或激素类似物的情况下，多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)定位于哺乳动物细胞的细胞外表面，在细胞的外部呈现其抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的scfv或其他抗原结合结构域)。然后多肽可以识别与其结合的抗原，并因此可以选择性杀伤在其表面表达抗原的靶细胞。

在一些实施方案中，多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)定位于细胞外表面可以在受试者中导致毒性。此类毒性可以由例如细胞因子风暴(也称为高细胞因子血症或细胞因子释放综合征)引起。在一些实施方案中，由于激素或激素类似物诱导的多肽定位于细胞外表面而经历毒性的受试者可以通过减少施用于该受试者的激素或激素类似物的剂量，或完全消除激素或激素类似物治疗来治疗。此类剂量的减少或激素或激素类似物治疗的消除可以导致多肽从细胞表面去除并减少或消除抗原结合结构域在细胞表面上的呈递，从而减少或消除受试者中的毒性。

毒性的示例性症状包括但不限于高烧、肿胀、发冷、低血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、喉咙发痒、呼吸困难、发红、极度疲乏、恶心和脑水肿(脑肿胀)。在一些实施方案中，可以通过在向受试者施用一种或多种剂量的激素或激素类似物之后评价受试者中这些症状的一种或多种的存在或严重性来确定受试者中的毒性。在一些实施方案中，与毒性相关的这些或其他症状的一种或多种可以在将包括具有lbd的单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞(例如t细胞)以及结合lbd的激素或激素类似物引入到受试者中后确定。在一些实施方案中，可以将与毒性相关的这些或其他症状的一种或多种的确定的水平与缺乏毒性或毒性水平降低相关的基线水平进行比较。此类基线水平可以是例如在施用哺乳动物细胞、激素或激素类似物或两者之前受试者中这些或其他症状的一种或多种的水平。另外地或替代地，此类基线水平可以是未施用哺乳动物细胞、激素或激素类似物或两者的不同受试者中这些或其他症状的一种或多种的水平。本领域普通技术人员将知道合适的临床和实验室方法来确定与毒性相关的一种或多种症状的水平。

在一些实施方案中，毒性可以是细胞因子风暴的结果。经历细胞因子风暴的受试者的血清中促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子两者均升高。在经历细胞因子风暴的受试者的血清中升高的细胞因子的非限制性实例包括肿瘤坏死因子alpha、ifnγ、il-10、il-1β、il-2、il-6、il-8和il-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和il-5。在一些实施方案中，与细胞因子风暴相关的这些或其他细胞因子的一种或多种在将包括具有lbd的单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞(例如t细胞)以及结合lbd的激素或激素类似物引入到受试者中后确定。在一些实施方案中，可以将与细胞因子风暴相关的这些或其他细胞因子的一种或多种的确定的水平与缺乏细胞因子风暴或细胞因子风暴水平降低相关的基线水平进行比较。此类基线水平可以是例如在施用哺乳动物细胞、激素或激素类似物或两者之前受试者中这些或其他细胞因子的一种或多种的水平。另外地或替代地，此类基线水平可以是未施用哺乳动物细胞、激素或激素类似物或两者的不同受试者中这些或其他细胞因子的一种或多种的水平。细胞因子的水平(例如，向受试者施用哺乳动物细胞和激素或激素类似物后的细胞因子的水平和/或细胞因子的基线水平)可以通过多种方法和技术的任一种来确定，包括但不限于elisa、western印迹、抗体阵列板、多重阵列、elispot测定法、免疫组织化学或可用于确定细胞因子水平的各种商业测定法的任一种。

在一些实施方案中，提供了治疗受试者(例如哺乳动物，例如人)中癌症(例如本文所述的多种癌症的任一种)的方法。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括：(a)向受试者施用包括编码具有激素受体lbd的单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的核酸的哺乳动物细胞(例如t细胞)，(b)向受试者施用结合lbd的激素或激素类似物，；(c)确定与毒性相关的一种或多种症状的水平和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，(d)将确定的与毒性相关的一种或多种症状的水平和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子水平与症状或细胞因子的基线水平比较和(e)减少施用于受试者的激素或激素类似物的量，使得确定的与毒性相关的一种或多种症状的水平和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子水平降低。在一些实施方案中，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平降低了100％(例如，步骤(e)中没有哺乳动物细胞施用于受试者)。在一些实施方案中，在步骤(b)中施用激素或激素类似物之后，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体以可逆的方式定位于哺乳动物细胞的细胞外表面。在一些实施方案中，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体从细胞外表面去除，从而降低毒性(例如，与毒性相关的一种或多种症状和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子)。在一些实施方案中，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，毒性(例如，与毒性相关的一种或多种症状和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子)降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，毒性(例如，与毒性相关的一种或多种症状和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子)降低了100％(例如，受试者不经历毒性或者仅经历基线水平的毒性)。在一些实施方案中，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，毒性(例如，与毒性相关的一种或多种症状和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子)正常化至毒性的基线水平(例如，与缺乏细胞因子风暴或细胞因子风暴水平降低相关的水平)。例如，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，毒性可以正常化至以下水平：小于毒性的基线水平的10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍或小于毒性的基线水平。

在一些实施方案中，可以通过向受试者施用包括具有lbd的单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)和/或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞(例如t细胞)以及结合lbd的激素或激素类似物治疗受试者。可以监测受试者中毒性的水平，并且可以通过本文所述的任何方法来降低毒性，例如，通过降低激素或激素类似物的水平。在毒性降低后(例如降低至基线水平，或高于基线水平的足够低的水平)，可以随后增加激素或激素类似物的水平以提高治疗的功效。在一些实施方案中，激素或激素类似物的水平多次降低并随后提高以控制毒性，同时仍提供有效的治疗过程。在一些实施方案中，激素的水平随后提高至最初施用激素或激素类似物所处的水平的100％。在一些实施方案中，激素或激素类似物的水平随后提高至最初施用激素或激素类似物所处的水平的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，激素或激素类似物的水平随后增加至高于最初施用激素或激素类似物所处的水平的水平。例如，随后施用的激素或激素类似物可以以最初施用激素或激素类似物所处的水平的至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％的水平施用。

在一些实施方案中，可以通过向受试者施用第二激素或激素类似物来降低在向受试者施用第一激素或激素类似物之后产生的毒性。例如，第二激素或激素类似物可以对存在于单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体中的lbd具有降低的亲和力，使得与第一激素或激素类似物所促进的质膜定位相比，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体的质膜定位减少。在一些实施方案中，第二激素或激素类似物在促进单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体的质膜定位方面可以不如第一激素或激素类似物有效。在一些实施方案中，第二激素或激素类似物与第一激素或激素类似物竞争结合lbd。

在一些实施方案中，除了降低激素或激素类似物的水平以降低毒性之外，或作为替代方案，可以通过施用灭活或隔离(sequester)激素或激素类似物的组合物来进一步降低毒性。例如，可以向受试者施用外源lbd(例如，作为药学上可接受的制剂)以隔离先前施用于受试者的激素或激素类似物。作为另一个实例，可以向受试者施用灭活、降解或以其他方式隔离所施用的激素或激素类似物的组合物。此类组合物的非限制性实例是结合所施用的激素或激素类似物并使其无法穿透细胞膜，使其无法结合lbd或促进其降解的抗体或抗体片段。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1—构建体的生成

规范嵌合抗原受体(“规范car”，图1，左)经修饰以在蛋白质内各个位置处包括雌激素受体alpha(“era”)配体结合结构域(“era-lbd”，绿色且由箭头指示)。在car中不同位置处引入era-lbd(图1，右)以创建不同版本的era-lbd，分别表示为：“v.2”(也表示为“v2”或“v2”)、“v.3”(也表示为“v3”或“v3”)和“v.4”(也表示为“v4”或“v4”)。mcherry融合蛋白也包括在内以允许追踪含有经工程化的蛋白质的细胞。下文提供了v.2的核酸和多肽序列(分别为seqidno:30和31)，v.3的核酸和多肽序列(分别为seqidno:32和33)和v.4的核酸和多肽序列(分别为seqidno:34和35)。

seqidno:30

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seqidno:31

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seqidno:32

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seqidno:33

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seqidno:34

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seqidno:35

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实施例2—含有nhr-lbd的抗cd19嵌合抗原受体表现出配体诱导的car的表面表达。

用编码规范car的慢病毒载体或用实施例1中所述的含有v2、v3和v4car构建体的抗cd19(fmc63)era-lbd转导jurkatt细胞。然后细胞未经处理或用era-lbd的配体处理。药物处理一小时后，将细胞用蛋白质l-生物素染色(蛋白质l与细胞外scfv结合)，然后用链霉亲和素-bv421染色以检测car的表面表达。随后通过流式细胞术分析细胞的mcherry表达和细胞表面上car的存在(图2a)。无论药物存在或不存在，规范car均以相同的水平在表面上表达(图2a，“规范car”标题下的点图)。相反，含有era-lbd的v2和v4car(本文所述的示例性单链嵌合抗原受体)在存在配体的情况下表达(如通过mcherry阳性表达测定)，但在不存在配体的情况下，在细胞表面上未检测到car(图2a，顶行，蛋白质l染色，“v2”和“v4”标题下的点图)。用500ng/ml4-oht处理后，以与对照car相当的水平在细胞表面上检测到car(图2a，底行，蛋白质l染色)。值得注意的是，并非所有设计表现相同：在不存在配体的情况下，v3具有一些car的基础表面表达(图2a，“v3”标题下的顶部点图)，且表达在添加配体后进一步增加(图2a，“v3”标题下的底部点图)。

用编码v4car构建体的慢病毒载体转导原代cd4和cd8人t细胞。如本实施例中所述处理细胞，并使用抗cmyc抗体染色以检测细胞表面上的cmyc标记的scfv。将t细胞与500ng/ml4-oht配体共培养后，在cd4和cd8t细胞两者中均观察到了表面诱导(图2b)，表明表面诱导表型从jurkat延伸至原代人t细胞。

实施例3—nhr-lbd融合蛋白在多种细胞类型中表现出配体诱导的表面表达。

用实施例1中所述的编码含有era-lbd的fmc63car融合物的慢病毒载体转导hek-293t细胞。细胞未经处理，或与500ng/ml4-oht温育2小时，然后对表面car表达进行染色。与实施例2中证明的jurkat细胞和原代t细胞中的era-lbd结果一致，几种era-lbd-car融合物在不存在配体的情况下表现出最小的car表面表达，并且在配体处理后强烈上调表面car(图3)。这些数据表明，配体诱导的nhr-lbdcar融合物的表面表达在多种细胞类型中起作用，包括永生化细胞(jurkat和hek-293t)和原代细胞(人cd4和cd8t细胞)，以及淋巴样(jurkat和人t细胞)和非淋巴样(hek-293t)细胞类型。

实施例4—配体诱导的nhrlbd-car融合物的表面表达在不同的scfv之间是保守的。

为了证明nhrlbd-car融合蛋白的保守的功能和模块性，用识别b细胞成熟抗原(“bcma”)的不同scfv(j6m0)替换v4中的fmc63scfv。用编码nhr-lbdcar融合物的慢病毒载体转导原代人cd4t细胞，将其未经处理或用500ng/ml的era配体4-oht处理。与fmc63nhrlbd-car融合物相似，具有j6m0scfv的nhrlbd-car显示出配体诱导的表面表达(图4)。

实施例5—配体诱导的nhrlbd融合蛋白的表面运输不需要来自规范car的scfv或细胞内结构域。

实施例2中测试的lbd-car融合物除nhrlbd结构域外还含有一些蛋白质基序，包括cd137细胞内结构域、cd3z细胞内信号传导结构域和scfv结构域。为了确定car构建体的细胞内部分(cd137细胞内结构域和cd3z细胞内结构域)是否参与配体诱导的表面运输，生成了缺乏这些区域的构建体(“v5”，图5a，左)，并在原代人t细胞中进行了测试。构建体v5包括scfv结构域和mcherry结构域。构建体v5表现出与实施例2中的构建体v2和v4相当的配体诱导的运输，表明car细胞内基序不负责配体诱导的运输(图5a，右)。v5的核苷酸(seqidno:36)和氨基酸(seqidno:37)序列如下所示。

seqidno:36

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seqidno:37

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为了测试细胞外scfv是否参与配体诱导的表面表达，生成了缺乏scfv的构建体；在其位置上插入flag标签以允许蛋白质的表面检测(该构建体的核酸和多肽序列分别如下显示为seqidno:38和39)。用编码era-lbd融合蛋白的慢病毒载体转导jurkatt细胞，并在存在和不存在era配体4-oht的情况下对多肽的表面表达进行染色。配体处理诱导多肽的稳健表面检测(图5b)，表明nhr-lbd介导的表面表达不需要scfv，并且该技术可广泛推广至各种多肽。

seqidno:38

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seqidno:39

mihlghilfllllpvaaadykddddkqttpgersslpafypgtsgscsgcgslslpiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelgsgsgsgsdrrggrmlkhkrqrddgegrgevgsagdmraanlwpsplmikrskknslalsltadqmvsalldaeppilyseydptrpfseasmmglltnladrelvhminwakrvpgfvdltlhdqvhllecawleilmiglvwrsmehpgkllfapnllldrnqgkcvegmveifdmllatssrfrmmnlqgeefvclksiillnsgvytflsstlksleekdhihrvldkitdtlihlmakagltlqqqhqrlaqlllilshirhmsnkrmehlysmkcknvvplfdlllemldahrlhaptsrsgsgsgslrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprgsgsgsgsmvskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermypedgalkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelykcvtd

seqidno:39的多肽包括以下结构域：dap10信号肽(mihlghilfllllpvaaa，seqidno:40)、flag标签(dykddddk，seqidno:41)、dap10细胞外结构域(qttpgersslpafypgtsgscsgcgslslp，seqidno:42)、cd8跨膜结构域(iyiwaplagtcgvlllslvitlyc，seqidno:43)、4-1bb共刺激结构域(krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel，seqidno:44)、第一接头(gsgsgsgs，seqidno:45)、经修饰的era结构域(drrggrmlkhkrqrddgegrgevgsagdmraanlwpsplmikrskknslalsltadqmvsalldaeppilyseydptrpfseasmmglltnladrelvhminwakrvpgfvdltlhdqvhllecawleilmiglvwrsmehpgkllfapnllldrnqgkcvegmveifdmllatssrfrmmnlqgeefvclksiillnsgvytflsstlksleekdhihrvldkitdtlihlmakagltlqqqhqrlaqlllilshirhmsnkrmehlysmkcknvvplfdlllemldahrlhapts，seqidno:46)、第二接头(rsgsgsgs，seqidno:47)、cd3zeta信号传导结构域(lrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr，seqidno:48)、第三接头(gsgsgsgs，seqidno:49)、mcherry(mvskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermypedgalkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelykcvtd，seqidno:50)。

实施例6—配体诱导的nhr-lbd融合构建体的表面表达延伸至包括孕酮受体(pr)在内的不同nhr

为了测试孕酮受体(“pr”)lbd融合物是否表现出配体诱导的表面表达，生成了构建体(v33)(该构建体的核酸和多肽序列分别显示为seqidno:51和52)。测试的构建体含有用于表面检测的n末端flag标签。用编码该构建体的慢病毒载体转导jurkatt细胞，将其未经处理或用500ng/ml米非司酮(pr配体)处理。药物处理两个小时后，对细胞进行表面蛋白质表达染色。如通过流式细胞术检测到的，该构建体表现出多肽的配体诱导的表面表达(图6)，表明其他nhr-lbd(除era外)可以用于生成具有配体诱导的表面表达的构建体，并且该配体诱导的nhr-lbd融合蛋白的表面表达是可推广的现象。

seqidno:51

atgatccacctgggacacatcctgtttttgctgctgctgccagtggctgccgccgattacaaagacgacgatgataaacagacaacaccaggcgagagatctagcctgcccgccttctaccctggcaccagcggctcttgttctggctgtggcagcctgtctctgcccatctatatttgggcacccctggctggaacctgcggagtgctgctgctgtctctcgtgattacactgtattgcaaaaggggccggaaaaagctgctgtatattttcaaacagccttttatgaggcctgtgcagacaacacaggaagaggacggctgtagctgtcggttccccgaagaggaagaggggggctgcgaactgggatcaggcagtggctctggcagcgggcaagacattcagctcatacctcctttgataaatttgctgatgtctatagaaccagatgtcatatacgctggtcacgacaatacgaaaccggacacatcttcatctttgcttacctctctgaatcaactgggtgaacgacagctcctgagtgttgttaagtggtctaaaagcctcccgggcttcaggaatttgcacatagacgaccaaatcacgctcatccaatattcctggatgagtctcatggtctttggtctcggttggcgcagctataagcacgtctctggccagatgttgtatttcgcaccagacctgatcctgaacgaacagaggatgaaggaatcaagcttttactctctctgcttgactatgtggcaaatcccccaagaattcgtgaaacttcaagtttcccaagaagaattcctctgcatgaaagtccttcttttgctcaacacgattcccctggaaggcttgaggtctcaaacgcaattcgaggagatgcggagtagctatatacgcgaactcatcaaggccatcggtttgcggcaaaagggagtggtctctagtagccaacgattttaccagctgactaagctccttgacaaccttcacgatctcgtcaaacaactgcacctgtactgtcttaacacatttatacaatcacgggcactttctgtagagttcccagagatgatgtctgaggtcatcgcagcccaacttccgaaaattcttgcaggaatggtgaagccacttctgttccataagaaaagatccggatctggaagtggctccctgagagtgaagtttagcagaagcgccgacgcccctgcctatcagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaacctgggcaggcgggaagagtacgacgtgctggataagaggcggggcagggaccctgaaatgggcggcaaacccagacggaagaacccccaggaaggcctgtacaacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcggcggagaggcaagggacatgatggcctgtaccagggcctgtccaccgccaccaaggacacctatgacgccctgcacatgcaggccctgcctccaagaggaagtggatctgggagcggctctatggtgtctaagggggaagaggacaacatggccatcatcaaagaattcatgcggttcaaggtgcacatggaaggctccgtgaatggccacgaattcgagatcgagggggagggcgagggcagaccttatgagggaacccagaccgccaagctgaaagtgaccaagggcggacccctgcctttcgcctgggatatcctgtctccccagtttatgtacggcagcaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacctgaagctgagcttccctgagggcttcaagtgggagagagtgatgaatttcgaggacggcggagtcgtgacagtgacccaggatagctctctgcaggacggcgagttcatctacaaagtgaagctgcggggcaccaacttccccagcgacggacccgtgatgcagaaaaagaccatgggctgggaggccagctccgagagaatgtacccagaggacggggccctgaagggggagatcaagcagcggctgaaactgaaggatggcggccactacgacgcagaagtgaaaaccacctacaaggccaagaaacctgtgcagctgcctggcgcctacaatgtgaacatcaagctggacattaccagccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgggccgagggcaggcattctacaggcggaatggatgaactgtataagtgcgtgaccgac

seqidno:52

mihlghilfllllpvaaadykddddkqttpgersslpafypgtsgscsgcgslslpiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelgsgsgsgsgqdiqlipplinllmsiepdviyaghdntkpdtssslltslnqlgerqllsvvkwskslpgfrnlhiddqitliqyswmslmvfglgwrsykhvsgqmlyfapdlilneqrmkessfyslcltmwqipqefvklqvsqeeflcmkvllllntipleglrsqtqfeemrssyirelikaiglrqkgvvsssqrfyqltklldnlhdlvkqlhlyclntfiqsralsvefpemmseviaaqlpkilagmvkpllfhkkrsgsgsgslrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprgsgsgsgsmvskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermypedgalkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelykcvtd

seqidno:52的多肽包括以下结构域：dap10信号肽(mihlghilfllllpvaaa，seqidno:53)、flag标签(dykddddk，seqidno:54)、dap10细胞外结构域(qttpgersslpafypgtsgscsgcgslslp，seqidno:55)、cd8跨膜结构域(iyiwaplagtcgvlllslvitlyc，seqidno:56)、4-1bb共刺激结构域(krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel，seqidno:57)、第一接头(gsgsgsgs，seqidno:58)、孕酮受体lbd(gqdiqlipplinllmsiepdviyaghdntkpdtssslltslnqlgerqllsvvkwskslpgfrnlhiddqitliqyswmslmvfglgwrsykhvsgqmlyfapdlilneqrmkessfyslcltmwqipqefvklqvsqeeflcmkvllllntipleglrsqtqfeemrssyirelikaiglrqkgvvsssqrfyqltklldnlhdlvkqlhlyclntfiqsralsvefpemmseviaaqlpkilagmvkpllfhkk，seqidno:59)、第二接头(rsgsgsgs，seqidno:60)、cd3zeta信号传导结构域(lrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr，seqidno:61)、第三接头(gsgsgsgs，seqidno:62)和mcherry(mvskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermypedgalkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelykcvtd，seqidno:63)。

seqidno:51的核苷酸序列包括编码所指示的结构域的以下序列：dap10信号肽(atgatccacctgggacacatcctgtttttgctgctgctgccagtggctgccgcc，seqidno:63)、flag标签(gattacaaagacgacgatgataaa，seqidno:64)、dap10细胞外结构域(cagacaacaccaggcgagagatctagcctgcccgccttctaccctggcaccagcggctcttgttctggctgtggcagcctgtctctgccc，seqidno:65)、cd8跨膜结构域(atctatatttgggcacccctggctggaacctgcggagtgctgctgctgtctctcgtgattacactgtattgc，seqidno:66)、4-1bb共刺激结构域(aaaaggggccggaaaaagctgctgtatattttcaaacagccttttatgaggcctgtgcagacaacacaggaagaggacggctgtagctgtcggttccccgaagaggaagaggggggctgcgaactg，seqidno:67)、第一接头(ggatcaggcagtggctctggcagc，seqidno:68)、孕酮受体lbd(gggcaagacattcagctcatacctcctttgataaatttgctgatgtctatagaaccagatgtcatatacgctggtcacgacaatacgaaaccggacacatcttcatctttgcttacctctctgaatcaactgggtgaacgacagctcctgagtgttgttaagtggtctaaaagcctcccgggcttcaggaatttgcacatagacgaccaaatcacgctcatccaatattcctggatgagtctcatggtctttggtctcggttggcgcagctataagcacgtctctggccagatgttgtatttcgcaccagacctgatcctgaacgaacagaggatgaaggaatcaagcttttactctctctgcttgactatgtggcaaatcccccaagaattcgtgaaacttcaagtttcccaagaagaattcctctgcatgaaagtccttcttttgctcaacacgattcccctggaaggcttgaggtctcaaacgcaattcgaggagatgcggagtagctatatacgcgaactcatcaaggccatcggtttgcggcaaaagggagtggtctctagtagccaacgattttaccagctgactaagctccttgacaaccttcacgatctcgtcaaacaactgcacctgtactgtcttaacacatttatacaatcacgggcactttctgtagagttcccagagatgatgtctgaggtcatcgcagcccaacttccgaaaattcttgcaggaatggtgaagccacttctgttccataagaaa，seqidno:69)、第二接头(ggatctggaagtggctcc，seqidno:70)、cd3zeta信号传导结构域(ctgagagtgaagtttagcagaagcgccgacgcccctgcctatcagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaacctgggcaggcgggaagagtacgacgtgctggataagaggcggggcagggaccctgaaatgggcggcaaacccagacggaagaacccccaggaaggcctgtacaacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcggcggagaggcaagggacatgatggcctgtaccagggcctgtccaccgccaccaaggacacctatgacgccctgcacatgcaggccctgcctccaaga，seqidno:71)、第三接头(ggaagtggatctgggagcggctct，seqidno:72)和mcherry(atggtgtctaagggggaagaggacaacatggccatcatcaaagaattcatgcggttcaaggtgcacatggaaggctccgtgaatggccacgaattcgagatcgagggggagggcgagggcagaccttatgagggaacccagaccgccaagctgaaagtgaccaagggcggacccctgcctttcgcctgggatatcctgtctccccagtttatgtacggcagcaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacctgaagctgagcttccctgagggcttcaagtgggagagagtgatgaatttcgaggacggcggagtcgtgacagtgacccaggatagctctctgcaggacggcgagttcatctacaaagtgaagctgcggggcaccaacttccccagcgacggacccgtgatgcagaaaaagaccatgggctgggaggccagctccgagagaatgtacccagaggacggggccctgaagggggagatcaagcagcggctgaaactgaaggatggcggccactacgacgcagaagtgaaaaccacctacaaggccaagaaacctgtgcagctgcctggcgcctacaatgtgaacatcaagctggacattaccagccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgggccgagggcaggcattctacaggcggaatggatgaactgtataagtgcgtgaccgac，seqidno:73)。

实施例7—配体诱导的nhr-lbdcart细胞活化是抗原和药物依赖性的。

用编码j6m0-era-lbdcar构建体的慢病毒载体转导原代人t细胞。在存在渐增浓度的4-oht的情况下，与抗原阴性(k562细胞系)和抗原阳性(mm1s细胞系)靶标共培养过夜后，通过对规范t细胞活化标志物cd69的表面染色来评价t细胞活化(图7a)。对于每种构建体，观察到独特的剂量依赖性t细胞应答，其中lbd与细胞膜的接近与背景激活(在不存在配体的情况下的激活)和对配体的敏感性相关。在不断增加药物浓度的情况下，所有构建体均显示出与阳性对照(规范car)相当的活化水平。

j6m0-era-lbdcar细胞产生炎性细胞因子的能力经由对共培养上清液的ifn-γelisa进行评价，所述共培养上清液分离自t细胞与抗原阴性(k562细胞系)和抗原阳性(mm1s细胞系)靶标在存在渐增浓度的4-oht的情况下的过夜共培养物。ifn-γ产生显示为剂量依赖性，其中在配体浓度渐增的情况下所有nhr-lbd构建体均产生细胞因子(图7b)。

实施例8—配体诱导的nhr-lbdcart细胞增殖和杀伤是抗原和配体依赖性的。

用编码v4fmc63-era-lbdcar或规范car对照的慢病毒载体转导原代人cd4t细胞。在与抗原阴性(k562细胞系)或抗原阳性(raji细胞系)靶标共培养之前，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(“cfse”)标记细胞。还将细胞与渐增浓度的配体(4-oht)共培养。共培养后三天，经由流式细胞仪分析细胞，并通过cd4+t细胞上的cfse染料稀释来评价增殖。fmc63-era-lbdcart细胞仅在存在抗原和配体的情况下增殖(图8a)。

用实施例7中所述的编码j6m0-era-lbdcar构建体的慢病毒载体转导原代人t细胞。携带j6m0-era-lbdcar构建体的t细胞以药物依赖方式杀伤抗原阳性靶标(mm1s细胞系)的能力经由基于流式细胞术的杀伤测定法进行评价。共培养之前用cfse标记靶细胞，并且共培养后每个孔中剩余的细胞数经由使用intellicyt流式细胞仪定量固定的体积来确定。通过将每实验孔剩余的靶标数与含有靶标和非抗原特异性常规cart细胞(-ctrl)的对照孔中剩余的靶标数进行比较来确定特异性裂解。特异性裂解报告为源自以下方程式的百分比：1-(#事件每实验孔/#平均事件-ctrl孔)。靶细胞杀伤依赖于配体的剂量，其中所有构建体在较高的药物剂量下都能以与常规car(+ctrl)相当的水平消除抗原阳性靶标(图8b)。

实施例9—lbd在car多肽内的位置决定了对配体诱导的nhr-lbdcar的表面表达的敏感性。

在jurkatt细胞中比较了图1中所示的v2、v3和v4构建体的剂量反应性。与4-oht配体在图9的x轴上指示的浓度下温育1小时后，进行对jurkatt细胞上nhr-lbdcar蛋白的表面表达的检测。使用抗cmyc抗体检测表面受体表达，并报告为报告物-阳性细胞的百分比(由mcherry表达确定)。对于每个构建体，检测到的表面表达的配体剂量对应于每个构建体的lbd相对于表面膜的位置。带有紧邻表面膜的lbd的构建体v4在不存在配体的情况下未显示可检测的表面表达，其中仅在较高浓度的4-oht下检测到了表面表达。相反，当lbd定位离膜较远时(参见例如v2)，检测到较高的表面表达的基础水平(～20％)，并且观察到对4-oht的敏感性增强。用pma/离子霉素激活jurkatt细胞不导致非配体依赖性nhr-lbdcar表面表达，表明单独激活t细胞(例如通过内源性tcr)不导致受体运输至细胞表面。

实施例10—nhr-lbdcar表面表达的持续时间取决于lbd在多肽中的位置。

用fmc63-era-lbdcar转导t细胞，并将其暴露于35ng/ml的4-oht中1小时，然后使用抗cmyc抗体对其表面表达进行染色，或者在不存在药物的情况下洗涤并培养过夜(时间线如图10a中所示)。

表达表面蛋白质的细胞数报告为报告物阳性细胞的百分比(由mcherry表达确定)。对于构建体v2、v3和v4，细胞表面上nhr-lbdcar表达的持续时间得以确定。配体去除后24小时，带有最接近膜的lbd的构建体(v4)显示出最快速且最完全的回到基线(图10b，标有“v4”的条)。

实施例11—添加配体后nhr-lbd-car构建体的表面表达的动力学。

用实施例5中使用的flag-era-lbd构建体转导的jurkatt细胞未经处理或用500ng/ml4-oht处理15分钟或120分钟，并在配体处理后检测表面表达。配体处理在15分钟内诱导了表面表达，并且随着时间的推移观察到进一步的上调(图11a)。

用编码fmc63-era-lbdcar(如图1中所示的v2)的慢病毒载体转导人t细胞。在所指示的持续时间内，用era配体4-oht处理细胞，然后对car的表面表达进行染色(图11b)。图11b中的数据显示出与针对jurkatt细胞观察到的相似的配体处理诱导的表面表达的动力学。

实施例12—布雷菲德菌素a处理阻断配体诱导的nhrlbd融合物的表面运输。

表达具有eralbd融合物的fmc63-car的原代人t细胞未经处理或用500ng/ml4-oht配体处理2小时以诱导car的表面表达。在4-oht处理之前，将一半的细胞用1um布雷菲德菌素a预处理(图12，底部两幅图)以抑制蛋白质从高尔基体输出。布雷菲德菌素a预处理防止4-oht诱导的表面蛋白质表达增加。不希望受理论的束缚，这些数据表明，增加的表面表达起因于在不存在配体的情况下细胞内隔离的多肽的池的重新定位。

实施例13—构建体的生成

常规嵌合抗原受体(“常规car”，图13，左)经修饰以在蛋白质的细胞内部分(如实施例1中所述的v2car)或在蛋白质的细胞外部分(“隐蔽携带carecd.v1”或“lbd-ecdcar”)包括雌激素受体alpha(“era”)配体结合结构域(“eralbd，”图1，绿色)。将点突变引入到v2car和ecd.v1car两者的eralbd结构域中。下文提供了v2car的核酸和多肽序列(如上所示为seqidno:30和31)和ecd.v1(seqidno:97和98)的核酸和多肽序列。

seqidno:97(ecdv.1car)

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgattcctgaacagaagctgataagtgaggaggacttggacatccagatgacccagaccaccagcagcctgagcgccagcctgggcgatagagtgaccatcagctgcagagccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaaacccgacggcaccgtgaagctgctgatctaccacaccagcagactgcacagcggcgtgcccagcagattttctggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgctacctacttctgtcagcaaggcaacaccctgccctacaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcacaggcggcggaggatctggcggaggcggaagtggcggagggggatctgaagtgaaactgcaggaaagcggccctggcctggtggccccatctcagtctctgagcgtgacctgtaccgtgtccggcgtgtccctgcctgactatggcgtgtcctggatcagacagccccccagaaagggcctggaatggctgggagtgatctggggcagcgagacaacctactacaacagcgccctgaagtcccggctgaccatcatcaaggacaactccaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcacaagcgtgaccgtgtctagcggatccgatagaagaggcggcagaatgctgaaacacaagcggcagagggacgacggggaaggcagaggcgaagtgggatctgccggcgatatgagagccgccaacctgtggcctagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaactccctggccctgagcctgaccgccgaccagatggtgtctgccctgctggatgccgagccccccatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggaactggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggatctgacactgcacgaccaggtgcacctgctggaatgcgcttggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggcggagcatggaacaccctggcaagctgctgttcgcccccaacctgctgctggaccggaaccagggcaaatgcgtggaaggcatggtggaaatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaagagttcgtgtgtctgaagtccatcatcctgctgaatagcggcgtgtacaccttcctgagcagcaccctgaaaagcctggaagaaaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgattcacctgatggccaaggccggactgaccctgcagcagcagcatcagagactggctcagctgctgctgatcctgtcccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacatctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcctctgttcgatctgctgctggaaatgctggacgcccacaggctgcacgccccaacatccggatccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctag

seqidno:98(ecdv.1car)

mlllvtslllcelphpafllipeqkliseedldiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssgsdrrggrmlkhkrqrddgegrgevgsagdmraanlwpsplmikrskknslalsltadqmvsalldaeppilyseydptrpfseasmmglltnladrelvhminwakrvpgfvdltlhdqvhllecawleilmiglvwrsmehpgkllfapnllldrnqgkcvegmveifdmllatssrfrmmnlqgeefvclksiillnsgvytflsstlksleekdhihrvldkitdtlihlmakagltlqqqhqrlaqlllilshirhmsnkrmehlysmkcknvvplfdlllemldahrlhaptsgstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

ecd.v1中从n末端至c末端的ecd.v1中每个结构域的蛋白质和核酸序列如下所示。

seqidno:99(csf2ra信号肽)

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgattcct

seqidno:100(csf2ra信号肽)

mlllvtslllcelphpafllip

seqidno:101(cmyc标签)

gaacagaagctgataagtgaggaggacttg

seqidno:102(cmyc标签)

eqkliseedl

seqidno:103(fmc63vl)

gacatccagatgacccagaccaccagcagcctgagcgccagcctgggcgatagagtgaccatcagctgcagagccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaaacccgacggcaccgtgaagctgctgatctaccacaccagcagactgcacagcggcgtgcccagcagattttctggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgctacctacttctgtcagcaaggcaacaccctgccctacaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcaca

seqidno:104(fmc63vh)

diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleit

seqidno:105(vl和vh之间的(g4s)3接头)

ggcggcggaggatctggcggaggcggaagtggcggagggggatct

seqidno:106(vl和vh之间的(g4s)3接头)

ggggsggggsggggs

seqidno:107(fmc63vh)

gaagtgaaactgcaggaaagcggccctggcctggtggccccatctcagtctctgagcgtgacctgtaccgtgtccggcgtgtccctgcctgactatggcgtgtcctggatcagacagccccccagaaagggcctggaatggctgggagtgatctggggcagcgagacaacctactacaacagcgccctgaagtcccggctgaccatcatcaaggacaactccaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcacaagcgtgaccgtgtctagc

seqidno:108(fmc63vh)

evklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss

vh结构域和雌激素受体alpha配体结合结构域之间的gs接头

ggatcc

vh结构域和雌激素受体alpha配体结合结构域之间的gs接头

gs

seqidno:109(雌激素受体alpha配体结合结构域)(编码铰链的序列加下划线，编码螺旋12的序列以粗体显示)

gatagaagaggcggcagaatgctgaaacacaagcggcagagggacgacggggaaggcagaggcgaagtgggatctgccggcgatatgagagccgccaacctgtggcctagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaactccctggccctgagcctgaccgccgaccagatggtgtctgccctgctggatgccgagccccccatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggaactggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggatctgacactgcacgaccaggtgcacctgctggaatgcgcttggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggcggagcatggaacaccctggcaagctgctgttcgcccccaacctgctgctggaccggaaccagggcaaatgcgtggaaggcatggtggaaatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaagagttcgtgtgtctgaagtccatcatcctgctgaatagcggcgtgtacaccttcctgagcagcaccctgaaaagcctggaagaaaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgattcacctgatggccaaggccggactgaccctgcagcagcagcatcagagactggctcagctgctgctgatcctgtcccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacatctgtacagcatgaagtgcaagaac

seqidno:110(雌激素受体alpha配体结合结构域)(铰链加下划线，螺旋12以粗体显示)

drrggrmlkhkrqrddgegrgevgsagdmraanlwpsplmikrskknslalsltadqmvsalldaeppilyseydptrpfseasmmglltnladrelvhminwakrvpgfvdltlhdqvhllecawleilmiglvwrsmehpgkllfapnllldrnqgkcvegmveifdmllatssrfrmmnlqgeefvclksiillnsgvytflsstlksleekdhihrvldkitdtlihlmakagltlqqqhqrlaqlllilshirhmsnkrmehlysmkckn

雌激素受体alpha配体结合结构域和cd8alpha铰链区之间的gs接头

ggatcc

雌激素受体alpha配体结合结构域和cd8alpha铰链区之间的gs接头

gs

seqidno:111(cd8alpha铰链)

accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc

seqidno:112(cd8alpha铰链)

tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfac

seqidno:113(cd8alpha跨膜结构域)

gatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc

seqidno:114(cd8alpha跨膜结构域)

diyiwaplagtcgvlllslvitlyc

seqidno:115(4-1bb共刺激结构域)

aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaa

seqidno:116(4-1bb共刺激结构域)

krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggce

seqidno:117(cd3zeta信号传导结构域)

ctgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc

seqidno:118(cd3zeta信号传导结构域)

lrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

实施例14—lbd-ecd在不存在配体的情况下降低了car在细胞表面的背景定位

如所示，用编码cc.v2或lbdecd.v1构建体的慢病毒载体转导原代人t细胞。细胞未经处理或用500ng/ml的4-oht处理。处理的持续时间如图14中所示。随后使用抗mycalexafluor647抗体针对嵌合受体的表面表达对细胞进行染色。

相对于当lbd置于car的细胞内部分时，将lbd放置于car的细胞外部分降低当未加入配体时car表面表达的背景水平(图14)。当加入500ng/ml4-oht时，v2car和ecd.v1两者均在细胞的表面表达。

实施例15—lbd-ecdcar以药物依赖性方式杀伤细胞

如所示，用编码lbdecd.v1或对照car构建体的慢病毒载体转导原代人t细胞。扩增后允许t细胞休息，并随后与表达萤光素酶的nalm6肿瘤细胞以如图15中所示的效应物:靶标比例共培养。共培养24小时后，细胞被裂解并加入萤光素酶底物以定量存活的肿瘤细胞数。

lbdecd.v1car以药物依赖性方式杀伤细胞。加入渐增量的4-oht导致更高水平的细胞裂解(在500ng/ml4-oht时大约50％裂解)(图15)。

实施例16—在活化的t细胞中lbd-ecdcar定位于细胞内

如所示，用编码lbd_ecd、cc.v2或组成型对照car构建体的慢病毒载体转导原代人t细胞。细胞休息后，用acd3/acd28dynabeads再刺激细胞48小时。随后用抗myc抗体对细胞进行染色以检测car的表面表达，并经由流式细胞仪进行分析。

具有细胞外lbd的car(lbdecdv1)在暴露于cd3/cd28珠子时得以活化的t细胞中定位于细胞内。具有细胞内lbd的car(v2car)在活化的t细胞中显示一些定位于细胞表面(图16)。

实施例17—ecd.v1car(lbd_ecd)产生细胞因子il-2

在存在(500ng/ml)或不存在4-羟基他莫昔芬的情况下将携带car的t细胞与nalm-6靶标过夜共培养后，将来自ecd.v1cart细胞的il-2产生与常规car+对照进行比较(图16)。依赖于4-羟基他莫昔芬，来自ecd.v1car受体的il-2产生(图13)与常规car对照相当，并且在不存在药物的情况下不可检测。

其他实施方案

应当理解，尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。

序列表

<110>细胞设计实验室股份有限公司

<120>嵌合多肽和改变它们的在细胞膜中的定位的方法

<130>43159-0064wo1

<150>us62/587,262

<151>2017-11-16

<150>us62/477,733

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serthrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrile

275280285

alaserglnproleuserleuargproglualacysargproalaala

290295300

glyglyalavalhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyr

305310315320

iletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleu

325330335

valilethrleutyrcysglyserglyserglyserglyserglyser

340345350

aspargargglyglyargmetleulyshislysargglnargaspasp

355360365

glygluglyargglygluvalglyseralaglyaspmetargalaala

370375380

asnleutrpproserproleumetilelysargserlyslysasnser

385390395400

leualaleuserleuthralaaspglnmetvalseralaleuleuasp

405410415

alagluproproileleutyrserglutyraspprothrargprophe

420425430

serglualasermetmetglyleuleuthrasnleualaaspargglu

435440445

leuvalhismetileasntrpalalysargvalproglyphevalasp

450455460

leuthrleuhisaspglnvalhisleuleuglucysalatrpleuglu

465470475480

ileleumetileglyleuvaltrpargsermetgluhisproglylys

485490495

leuleuphealaproasnleuleuleuaspargasnglnglylyscys

500505510

valgluglymetvalgluilepheaspmetleuleualathrserser

515520525

argpheargmetmetasnleuglnglyglugluphevalcysleulys

530535540

serileileleuleuasnserglyvaltyrthrpheleuserserthr

545550555560

leulysserleugluglulysasphisilehisargvalleuasplys

565570575

ilethraspthrleuilehisleumetalalysalaglyleuthrleu

580585590

glnglnglnhisglnargleualaglnleuleuleuileleuserhis

595600605

ilearghismetserasnlysargmetgluhisleutyrsermetlys

610615620

cyslysasnvalvalproleupheaspleuleuleuglumetleuasp

625630635640

alahisargleuhisalaprothrserglyserglyserglysergly

645650655

sermetvalserlysglyglugluaspasnmetalaileilelysglu

660665670

phemetargphelysvalhismetgluglyservalasnglyhisglu

675680685

phegluilegluglygluglygluglyargprotyrgluglythrgln

690695700

thralalysleulysvalthrlysglyglyproleuprophealatrp

705710715720

aspileleuserproglnphemettyrglyserlysalatyrvallys

725730735

hisproalaaspileproasptyrleulysleuserpheproglugly

740745750

phelystrpgluargvalmetasnphegluaspglyglyvalvalthr

755760765

valthrglnaspserserleuglnaspglyglupheiletyrlysval

770775780

lysleuargglythrasnpheproseraspglyprovalmetglnlys

785790795800

lysthrmetglytrpglualasersergluargmettyrprogluasp

805810815

glyalaleulysglygluilelysglnargleulysleulysaspgly

820825830

glyhistyraspalagluvallysthrthrtyrlysalalyslyspro

835840845

valglnleuproglyalatyrasnvalasnilelysleuaspilethr

850855860

serhisasngluasptyrthrilevalgluglntyrgluargalaglu

865870875880

glyarghisserthrglyglymetaspgluleutyrlyscysvalthr

885890895

asp

<210>38

<211>2391

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有flag构建体的era-lbd融合蛋白

<400>38

atgatccacctgggacacatcctgtttttgctgctgctgccagtggctgccgccgattac60

aaagacgacgatgataaacagacaacaccaggcgagagatctagcctgcccgccttctac120

cctggcaccagcggctcttgttctggctgtggcagcctgtctctgcccatctatatttgg180

gcacccctggctggaacctgcggagtgctgctgctgtctctcgtgattacactgtattgc240

aaaaggggccggaaaaagctgctgtatattttcaaacagccttttatgaggcctgtgcag300

acaacacaggaagaggacggctgtagctgtcggttccccgaagaggaagaggggggctgc360

gaactgggatcaggcagtggctctggcagcgatagaagaggcggcagaatgctgaaacac420

aagcggcagagggacgacggggaaggcagaggcgaagtgggatctgccggcgatatgaga480

gccgccaacctgtggcctagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaactccctggcc540

ctgagcctgaccgccgaccagatggtgtctgccctgctggatgccgagccccccatcctg600

tacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgacc660

aacctggccgaccgggaactggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttc720

gtggatctgacactgcacgaccaggtgcacctgctggaatgcgcttggctggaaatcctg780

atgatcggcctcgtgtggcggagcatggaacaccctggcaagctgctgttcgcccccaac840

ctgctgctggaccggaaccagggcaaatgcgtggaaggcatggtggaaatcttcgacatg900

ctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaagagttcgtgtgt960

ctgaagtccatcatcctgctgaatagcggcgtgtacaccttcctgagcagcaccctgaaa1020

agcctggaagaaaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgatt1080

cacctgatggccaaggccggactgaccctgcagcagcagcatcagagactggctcagctg1140

ctgctgatcctgtcccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacatctgtacagc1200

atgaagtgcaagaacgtggtgcctctgttcgatctgctgctggaaatgctggacgcccac1260

aggctgcacgccccaacatccagatccggatctggaagtggctccctgagagtgaagttt1320

agcagaagcgccgacgcccctgcctatcagcagggacagaaccagctgtataacgagctg1380

aacctgggcaggcgggaagagtacgacgtgctggataagaggcggggcagggaccctgaa1440

atgggcggcaaacccagacggaagaacccccaggaaggcctgtacaacgaactgcagaaa1500

gacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcggcggagaggcaag1560

ggacatgatggcctgtaccagggcctgtccaccgccaccaaggacacctatgacgccctg1620

cacatgcaggccctgcctccaagaggaagtggatctgggagcggctctatggtgtctaag1680

ggggaagaggacaacatggccatcatcaaagaattcatgcggttcaaggtgcacatggaa1740

ggctccgtgaatggccacgaattcgagatcgagggggagggcgagggcagaccttatgag1800

ggaacccagaccgccaagctgaaagtgaccaagggcggacccctgcctttcgcctgggat1860

atcctgtctccccagtttatgtacggcagcaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatc1920

cccgactacctgaagctgagcttccctgagggcttcaagtgggagagagtgatgaatttc1980

gaggacggcggagtcgtgacagtgacccaggatagctctctgcaggacggcgagttcatc2040

tacaaagtgaagctgcggggcaccaacttccccagcgacggacccgtgatgcagaaaaag2100

accatgggctgggaggccagctccgagagaatgtacccagaggacggggccctgaagggg2160

gagatcaagcagcggctgaaactgaaggatggcggccactacgacgcagaagtgaaaacc2220

acctacaaggccaagaaacctgtgcagctgcctggcgcctacaatgtgaacatcaagctg2280

gacattaccagccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgggccgagggc2340

aggcattctacaggcggaatggatgaactgtataagtgcgtgaccgactag2391

<210>39

<211>796

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>具有flag构建体的era-lbd融合蛋白

<400>39

metilehisleuglyhisileleupheleuleuleuleuprovalala

151015

alaalaasptyrlysaspaspaspasplysglnthrthrproglyglu

202530

argserserleuproalaphetyrproglythrserglysercysser

354045

glycysglyserleuserleuproiletyriletrpalaproleuala

505560

glythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcys

65707580

lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

859095

argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe

100105110

proglugluglugluglyglycysgluleuglyserglyserglyser

115120125

glyseraspargargglyglyargmetleulyshislysargglnarg

130135140

aspaspglygluglyargglygluvalglyseralaglyaspmetarg

145150155160

alaalaasnleutrpproserproleumetilelysargserlyslys

165170175

asnserleualaleuserleuthralaaspglnmetvalseralaleu

180185190

leuaspalagluproproileleutyrserglutyraspprothrarg

195200205

propheserglualasermetmetglyleuleuthrasnleualaasp

210215220

arggluleuvalhismetileasntrpalalysargvalproglyphe

225230235240

valaspleuthrleuhisaspglnvalhisleuleuglucysalatrp

245250255

leugluileleumetileglyleuvaltrpargsermetgluhispro

260265270

glylysleuleuphealaproasnleuleuleuaspargasnglngly

275280285

lyscysvalgluglymetvalgluilepheaspmetleuleualathr

290295300

serserargpheargmetmetasnleuglnglyglugluphevalcys

305310315320

leulysserileileleuleuasnserglyvaltyrthrpheleuser

325330335

serthrleulysserleugluglulysasphisilehisargvalleu

340345350

asplysilethraspthrleuilehisleumetalalysalaglyleu

355360365

thrleuglnglnglnhisglnargleualaglnleuleuleuileleu

370375380

serhisilearghismetserasnlysargmetgluhisleutyrser

385390395400

metlyscyslysasnvalvalproleupheaspleuleuleuglumet

405410415

leuaspalahisargleuhisalaprothrserargserglysergly

420425430

serglyserleuargvallyspheserargseralaaspalaproala

435440445

tyrglnglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyarg

450455460

arggluglutyraspvalleuasplysargargglyargaspproglu

465470475480

metglyglylysproargarglysasnproglngluglyleutyrasn

485490495

gluleuglnlysasplysmetalaglualatyrsergluileglymet

500505510

lysglygluargargargglylysglyhisaspglyleutyrglngly

515520525

leuserthralathrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnala

530535540

leuproproargglyserglyserglyserglysermetvalserlys

545550555560

glyglugluaspasnmetalaileilelysgluphemetargphelys

565570575

valhismetgluglyservalasnglyhisgluphegluileglugly

580585590

gluglygluglyargprotyrgluglythrglnthralalysleulys

595600605

valthrlysglyglyproleuprophealatrpaspileleuserpro

610615620

glnphemettyrglyserlysalatyrvallyshisproalaaspile

625630635640

proasptyrleulysleuserpheprogluglyphelystrpgluarg

645650655

valmetasnphegluaspglyglyvalvalthrvalthrglnaspser

660665670

serleuglnaspglyglupheiletyrlysvallysleuargglythr

675680685

asnpheproseraspglyprovalmetglnlyslysthrmetglytrp

690695700

glualasersergluargmettyrprogluaspglyalaleulysgly

705710715720

gluilelysglnargleulysleulysaspglyglyhistyraspala

725730735

gluvallysthrthrtyrlysalalyslysprovalglnleuprogly

740745750

alatyrasnvalasnilelysleuaspilethrserhisasngluasp

755760765

tyrthrilevalgluglntyrgluargalagluglyarghisserthr

770775780

glyglymetaspgluleutyrlyscysvalthrasp

785790795

<210>40

<211>18

<212>prt

<213>人

<400>40

metilehisleuglyhisileleupheleuleuleuleuprovalala

151015

alaala

<210>41

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>flag标签

<400>41

asptyrlysaspaspaspasplys

15

<210>42

<211>30

<212>prt

<213>人

<400>42

glnthrthrproglygluargserserleuproalaphetyrprogly

151015

thrserglysercysserglycysglyserleuserleupro

202530

<210>43

<211>24

<212>prt

<213>人

<400>43

iletyriletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleu

151015

serleuvalilethrleutyrcys

20

<210>44

<211>42

<212>prt

<213>人

<400>44

lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

151015

argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe

202530

proglugluglugluglyglycysgluleu

3540

<210>45

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

<400>45

glyserglyserglyserglyser

15

<210>46

<211>297

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>经修饰的era配体结合结构域

<400>46

aspargargglyglyargmetleulyshislysargglnargaspasp

151015

glygluglyargglygluvalglyseralaglyaspmetargalaala

202530

asnleutrpproserproleumetilelysargserlyslysasnser

354045

leualaleuserleuthralaaspglnmetvalseralaleuleuasp

505560

alagluproproileleutyrserglutyraspprothrargprophe

65707580

serglualasermetmetglyleuleuthrasnleualaaspargglu

859095

leuvalhismetileasntrpalalysargvalproglyphevalasp

100105110

leuthrleuhisaspglnvalhisleuleuglucysalatrpleuglu

115120125

ileleumetileglyleuvaltrpargsermetgluhisproglylys

130135140

leuleuphealaproasnleuleuleuaspargasnglnglylyscys

145150155160

valgluglymetvalgluilepheaspmetleuleualathrserser

165170175

argpheargmetmetasnleuglnglyglugluphevalcysleulys

180185190

serileileleuleuasnserglyvaltyrthrpheleuserserthr

195200205

leulysserleugluglulysasphisilehisargvalleuasplys

210215220

ilethraspthrleuilehisleumetalalysalaglyleuthrleu

225230235240

glnglnglnhisglnargleualaglnleuleuleuileleuserhis

245250255

ilearghismetserasnlysargmetgluhisleutyrsermetlys

260265270

cyslysasnvalvalproleupheaspleuleuleuglumetleuasp

275280285

alahisargleuhisalaprothrser

290295

<210>47

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

<400>47

argserglyserglyserglyser

15

<210>48

<211>113

<212>prt

<213>人

<400>48

leuargvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglngln

151015

glyglnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglu

202530

tyraspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglygly

354045

lysproargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleugln

505560

lysasplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglyglu

65707580

argargargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthr

859095

alathrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleupropro

100105110

arg

<210>49

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

<400>49

glyserglyserglyserglyser

15

<210>50

<211>240

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mcherry

<400>50

metvalserlysglyglugluaspasnmetalaileilelysgluphe

151015

metargphelysvalhismetgluglyservalasnglyhisgluphe

202530

gluilegluglygluglygluglyargprotyrgluglythrglnthr

354045

alalysleulysvalthrlysglyglyproleuprophealatrpasp

505560

ileleuserproglnphemettyrglyserlysalatyrvallyshis

65707580

proalaaspileproasptyrleulysleuserpheprogluglyphe

859095

lystrpgluargvalmetasnphegluaspglyglyvalvalthrval

100105110

thrglnaspserserleuglnaspglyglupheiletyrlysvallys

115120125

leuargglythrasnpheproseraspglyprovalmetglnlyslys

130135140

thrmetglytrpglualasersergluargmettyrprogluaspgly

145150155160

alaleulysglygluilelysglnargleulysleulysaspglygly

165170175

histyraspalagluvallysthrthrtyrlysalalyslysproval

180185190

glnleuproglyalatyrasnvalasnilelysleuaspilethrser

195200205

hisasngluasptyrthrilevalgluglntyrgluargalaglugly

210215220

arghisserthrglyglymetaspgluleutyrlyscysvalthrasp

225230235240

<210>51

<211>2265

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pr配体结合结构域构建体

<400>51

atgatccacctgggacacatcctgtttttgctgctgctgccagtggctgccgccgattac60

aaagacgacgatgataaacagacaacaccaggcgagagatctagcctgcccgccttctac120

cctggcaccagcggctcttgttctggctgtggcagcctgtctctgcccatctatatttgg180

gcacccctggctggaacctgcggagtgctgctgctgtctctcgtgattacactgtattgc240

aaaaggggccggaaaaagctgctgtatattttcaaacagccttttatgaggcctgtgcag300

acaacacaggaagaggacggctgtagctgtcggttccccgaagaggaagaggggggctgc360

gaactgggatcaggcagtggctctggcagcgggcaagacattcagctcatacctcctttg420

ataaatttgctgatgtctatagaaccagatgtcatatacgctggtcacgacaatacgaaa480

ccggacacatcttcatctttgcttacctctctgaatcaactgggtgaacgacagctcctg540

agtgttgttaagtggtctaaaagcctcccgggcttcaggaatttgcacatagacgaccaa600

atcacgctcatccaatattcctggatgagtctcatggtctttggtctcggttggcgcagc660

tataagcacgtctctggccagatgttgtatttcgcaccagacctgatcctgaacgaacag720

aggatgaaggaatcaagcttttactctctctgcttgactatgtggcaaatcccccaagaa780

ttcgtgaaacttcaagtttcccaagaagaattcctctgcatgaaagtccttcttttgctc840

aacacgattcccctggaaggcttgaggtctcaaacgcaattcgaggagatgcggagtagc900

tatatacgcgaactcatcaaggccatcggtttgcggcaaaagggagtggtctctagtagc960

caacgattttaccagctgactaagctccttgacaaccttcacgatctcgtcaaacaactg1020

cacctgtactgtcttaacacatttatacaatcacgggcactttctgtagagttcccagag1080

atgatgtctgaggtcatcgcagcccaacttccgaaaattcttgcaggaatggtgaagcca1140

cttctgttccataagaaaagatccggatctggaagtggctccctgagagtgaagtttagc1200

agaagcgccgacgcccctgcctatcagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaac1260

ctgggcaggcgggaagagtacgacgtgctggataagaggcggggcagggaccctgaaatg1320

ggcggcaaacccagacggaagaacccccaggaaggcctgtacaacgaactgcagaaagac1380

aagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcggcggagaggcaaggga1440

catgatggcctgtaccagggcctgtccaccgccaccaaggacacctatgacgccctgcac1500

atgcaggccctgcctccaagaggaagtggatctgggagcggctctatggtgtctaagggg1560

gaagaggacaacatggccatcatcaaagaattcatgcggttcaaggtgcacatggaaggc1620

tccgtgaatggccacgaattcgagatcgagggggagggcgagggcagaccttatgaggga1680

acccagaccgccaagctgaaagtgaccaagggcggacccctgcctttcgcctgggatatc1740

ctgtctccccagtttatgtacggcagcaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatcccc1800

gactacctgaagctgagcttccctgagggcttcaagtgggagagagtgatgaatttcgag1860

gacggcggagtcgtgacagtgacccaggatagctctctgcaggacggcgagttcatctac1920

aaagtgaagctgcggggcaccaacttccccagcgacggacccgtgatgcagaaaaagacc1980

atgggctgggaggccagctccgagagaatgtacccagaggacggggccctgaagggggag2040

atcaagcagcggctgaaactgaaggatggcggccactacgacgcagaagtgaaaaccacc2100

tacaaggccaagaaacctgtgcagctgcctggcgcctacaatgtgaacatcaagctggac2160

attaccagccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgggccgagggcagg2220

cattctacaggcggaatggatgaactgtataagtgcgtgaccgac2265

<210>52

<211>755

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pr配体结合结构域构建体

<400>52

metilehisleuglyhisileleupheleuleuleuleuprovalala

151015

alaalaasptyrlysaspaspaspasplysglnthrthrproglyglu

202530

argserserleuproalaphetyrproglythrserglysercysser

354045

glycysglyserleuserleuproiletyriletrpalaproleuala

505560

glythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcys

65707580

lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

859095

argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe

100105110

proglugluglugluglyglycysgluleuglyserglyserglyser

115120125

glyserglyglnaspileglnleuileproproleuileasnleuleu

130135140

metserilegluproaspvaliletyralaglyhisaspasnthrlys

145150155160

proaspthrserserserleuleuthrserleuasnglnleuglyglu

165170175

argglnleuleuservalvallystrpserlysserleuproglyphe

180185190

argasnleuhisileaspaspglnilethrleuileglntyrsertrp

195200205

metserleumetvalpheglyleuglytrpargsertyrlyshisval

210215220

serglyglnmetleutyrphealaproaspleuileleuasnglugln

225230235240

argmetlysgluserserphetyrserleucysleuthrmettrpgln

245250255

ileproglngluphevallysleuglnvalserglngluglupheleu

260265270

cysmetlysvalleuleuleuleuasnthrileproleugluglyleu

275280285

argserglnthrglnphegluglumetargsersertyrileargglu

290295300

leuilelysalaileglyleuargglnlysglyvalvalserserser

305310315320

glnargphetyrglnleuthrlysleuleuaspasnleuhisaspleu

325330335

vallysglnleuhisleutyrcysleuasnthrpheileglnserarg

340345350

alaleuservalglupheproglumetmetsergluvalilealaala

355360365

glnleuprolysileleualaglymetvallysproleuleuphehis

370375380

lyslysargserglyserglyserglyserleuargvallyspheser

385390395400

argseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyr

405410415

asngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplys

420425430

argargglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasn

435440445

proglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglu

450455460

alatyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysgly

465470475480

hisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyr

485490495

aspalaleuhismetglnalaleuproproargglyserglysergly

500505510

serglysermetvalserlysglyglugluaspasnmetalaileile

515520525

lysgluphemetargphelysvalhismetgluglyservalasngly

530535540

hisgluphegluilegluglygluglygluglyargprotyrglugly

545550555560

thrglnthralalysleulysvalthrlysglyglyproleuprophe

565570575

alatrpaspileleuserproglnphemettyrglyserlysalatyr

580585590

vallyshisproalaaspileproasptyrleulysleuserphepro

595600605

gluglyphelystrpgluargvalmetasnphegluaspglyglyval

610615620

valthrvalthrglnaspserserleuglnaspglyglupheiletyr

625630635640

lysvallysleuargglythrasnpheproseraspglyprovalmet

645650655

glnlyslysthrmetglytrpglualasersergluargmettyrpro

660665670

gluaspglyalaleulysglygluilelysglnargleulysleulys

675680685

aspglyglyhistyraspalagluvallysthrthrtyrlysalalys

690695700

lysprovalglnleuproglyalatyrasnvalasnilelysleuasp

705710715720

ilethrserhisasngluasptyrthrilevalgluglntyrgluarg

725730735

alagluglyarghisserthrglyglymetaspgluleutyrlyscys

740745750

valthrasp

755

<210>53

<211>18

<212>prt

<213>人

<400>53

metilehisleuglyhisileleupheleuleuleuleuprovalala

151015

alaala

<210>54

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>flag标签

<400>54

asptyrlysaspaspaspasplys

15

<210>55

<211>30

<212>prt

<213>人

<400>55

glnthrthrproglygluargserserleuproalaphetyrprogly

151015

thrserglysercysserglycysglyserleuserleupro

202530

<210>56

<211>24

<212>prt

<213>人

<400>56

iletyriletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleu

151015

serleuvalilethrleutyrcys

20

<210>57

<211>42

<212>prt

<213>人

<400>57

lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

151015

argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe

202530

proglugluglugluglyglycysgluleu

3540

<210>58

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

<400>58

glyserglyserglyserglyser

15

<210>59

<211>256

<212>prt

<213>人

<400>59

glyglnaspileglnleuileproproleuileasnleuleumetser

151015

ilegluproaspvaliletyralaglyhisaspasnthrlysproasp

202530

thrserserserleuleuthrserleuasnglnleuglygluarggln

354045

leuleuservalvallystrpserlysserleuproglypheargasn

505560

leuhisileaspaspglnilethrleuileglntyrsertrpmetser

65707580

leumetvalpheglyleuglytrpargsertyrlyshisvalsergly

859095

glnmetleutyrphealaproaspleuileleuasngluglnargmet

100105110

lysgluserserphetyrserleucysleuthrmettrpglnilepro

115120125

glngluphevallysleuglnvalserglngluglupheleucysmet

130135140

lysvalleuleuleuleuasnthrileproleugluglyleuargser

145150155160

glnthrglnphegluglumetargsersertyrilearggluleuile

165170175

lysalaileglyleuargglnlysglyvalvalserserserglnarg

180185190

phetyrglnleuthrlysleuleuaspasnleuhisaspleuvallys

195200205

glnleuhisleutyrcysleuasnthrpheileglnserargalaleu

210215220

servalglupheproglumetmetsergluvalilealaalaglnleu

225230235240

prolysileleualaglymetvallysproleuleuphehislyslys

245250255

<210>60

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

<400>60

argserglyserglyserglyser

15

<210>61

<211>113

<212>prt

<213>人

<400>61

leuargvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglngln

151015

glyglnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglu

202530

tyraspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglygly

354045

lysproargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleugln

505560

lysasplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglyglu

65707580

argargargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthr

859095

alathrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleupropro

100105110

arg

<210>62

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

<400>62

glyserglyserglyserglyser

15

<210>63

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dap10信号

<400>63

atgatccacctgggacacatcctgtttttgctgctgctgccagtggctgccgcc54

<210>64

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>flag标签

<400>64

gattacaaagacgacgatgataaa24

<210>65

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dap10细胞外结构域

<400>65

cagacaacaccaggcgagagatctagcctgcccgccttctaccctggcaccagcggctct60

tgttctggctgtggcagcctgtctctgccc90

<210>66

<211>72

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd8跨膜结构域

<400>66

atctatatttgggcacccctggctggaacctgcggagtgctgctgctgtctctcgtgatt60

acactgtattgc72

<210>67

<211>126

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>4-1bb共刺激结构域

<400>67

aaaaggggccggaaaaagctgctgtatattttcaaacagccttttatgaggcctgtgcag60

acaacacaggaagaggacggctgtagctgtcggttccccgaagaggaagaggggggctgc120

gaactg126

<210>68

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

<400>68

ggatcaggcagtggctctggcagc24

<210>69

<211>768

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>孕酮受体配体结合结构域

<400>69

gggcaagacattcagctcatacctcctttgataaatttgctgatgtctatagaaccagat60

gtcatatacgctggtcacgacaatacgaaaccggacacatcttcatctttgcttacctct120

ctgaatcaactgggtgaacgacagctcctgagtgttgttaagtggtctaaaagcctcccg180

ggcttcaggaatttgcacatagacgaccaaatcacgctcatccaatattcctggatgagt240

ctcatggtctttggtctcggttggcgcagctataagcacgtctctggccagatgttgtat300

ttcgcaccagacctgatcctgaacgaacagaggatgaaggaatcaagcttttactctctc360

tgcttgactatgtggcaaatcccccaagaattcgtgaaacttcaagtttcccaagaagaa420

ttcctctgcatgaaagtccttcttttgctcaacacgattcccctggaaggcttgaggtct480

caaacgcaattcgaggagatgcggagtagctatatacgcgaactcatcaaggccatcggt540

ttgcggcaaaagggagtggtctctagtagccaacgattttaccagctgactaagctcctt600

gacaaccttcacgatctcgtcaaacaactgcacctgtactgtcttaacacatttatacaa660

tcacgggcactttctgtagagttcccagagatgatgtctgaggtcatcgcagcccaactt720

ccgaaaattcttgcaggaatggtgaagccacttctgttccataagaaa768

<210>70

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

<400>70

ggatctggaagtggctcc18

<210>71

<211>339

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>编码cd3zeta信号传导结构域的序列

<400>71

ctgagagtgaagtttagcagaagcgccgacgcccctgcctatcagcagggacagaaccag60

ctgtataacgagctgaacctgggcaggcgggaagagtacgacgtgctggataagaggcgg120

ggcagggaccctgaaatgggcggcaaacccagacggaagaacccccaggaaggcctgtac180

aacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgag240

cggcggagaggcaagggacatgatggcctgtaccagggcctgtccaccgccaccaaggac300

acctatgacgccctgcacatgcaggccctgcctccaaga339

<210>72

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

<400>72

ggaagtggatctgggagcggctct24

<210>73

<211>720

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mcherry

<400>73

atggtgtctaagggggaagaggacaacatggccatcatcaaagaattcatgcggttcaag60

gtgcacatggaaggctccgtgaatggccacgaattcgagatcgagggggagggcgagggc120

agaccttatgagggaacccagaccgccaagctgaaagtgaccaagggcggacccctgcct180

ttcgcctgggatatcctgtctccccagtttatgtacggcagcaaggcctacgtgaagcac240

cccgccgacatccccgactacctgaagctgagcttccctgagggcttcaagtgggagaga300

gtgatgaatttcgaggacggcggagtcgtgacagtgacccaggatagctctctgcaggac360

ggcgagttcatctacaaagtgaagctgcggggcaccaacttccccagcgacggacccgtg420

atgcagaaaaagaccatgggctgggaggccagctccgagagaatgtacccagaggacggg480

gccctgaagggggagatcaagcagcggctgaaactgaaggatggcggccactacgacgca540

gaagtgaaaaccacctacaaggccaagaaacctgtgcagctgcctggcgcctacaatgtg600

aacatcaagctggacattaccagccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgag660

cgggccgagggcaggcattctacaggcggaatggatgaactgtataagtgcgtgaccgac720

<210>74

<211>480

<212>prt

<213>人

<400>74

metgluargaspgluproproproserglyglyglyglyglyglygly

151015

seralaglypheleugluproproalaalaleuproproproproarg

202530

asnglyphecysglnaspgluleualagluleuaspproglythrile

354045

servalseraspaspargalagluglnargthrcysleuilecysgly

505560

aspargalathrglyleuhistyrglyileilesercysgluglycys

65707580

lysglyphephelysargserilecysasnlysargvaltyrargcys

859095

serargasplysasncysvalmetserarglysglnargasnargcys

100105110

glntyrcysargleuleulyscysleuglnmetglymetasnarglys

115120125

alailearggluaspglymetproglyglyargasnlysserilegly

130135140

provalglnilesergluglugluilegluargilemetserglygln

145150155160

glupheglugluglualaasnhistrpserasnhisglyaspserasp

165170175

hisserserproglyasnargalasergluserasnglnproserpro

180185190

glyserthrleuserserserargservalgluleuasnglyphemet

195200205

alaphearggluglntyrmetglymetservalproprohistyrgln

210215220

tyrileprohisleuphesertyrserglyhisserproleuleupro

225230235240

glnglnalaargserleuaspproglnsertyrserleuilehisgln

245250255

leuleuseralagluaspleugluproleuglythrprometleuile

260265270

gluaspglytyralavalthrglnalagluleuphealaleuleucys

275280285

argleualaaspgluleuleupheargglnilealatrpilelyslys

290295300

leuprophephecysgluleuserilelysasptyrthrcysleuleu

305310315320

serserthrtrpglngluleuileleuleuserserleuthrvaltyr

325330335

serlysglnilepheglygluleualaaspvalthralalystyrser

340345350

proseraspglugluleuhisargpheseraspgluglymetgluval

355360365

ilegluargleuiletyrleutyrhislysphehisglnleulysval

370375380

serasngluglutyralacysmetlysalaileasnpheleuasngln

385390395400

aspileargglyleuthrseralaserglnleugluglnleuasnlys

405410415

argtyrtrptyrilecysglnaspphethrglutyrlystyrthrhis

420425430

glnproasnargpheproaspleumetmetcysleuprogluilearg

435440445

tyrilealaglylysmetvalasnvalproleugluglnleuproleu

450455460

leuphelysvalvalleuhissercyslysthrservalglylysglu

465470475480

<210>75

<211>505

<212>prt

<213>人

<400>75

metglygluthrleuglyaspserproileaspprogluseraspser

151015

phethraspthrleuseralaasnileserglnglumetthrmetval

202530

aspthrglumetprophetrpprothrasnpheglyileserserval

354045

aspleuservalmetgluasphisserhisserpheaspilelyspro

505560

phethrthrvalasppheserserileserthrprohistyrgluasp

65707580

ileprophethrargthraspprovalvalalaasptyrlystyrasp

859095

leulysleuglnglutyrglnseralailelysvalgluproalaser

100105110

proprotyrtyrserglulysthrglnleutyrasnlysprohisglu

115120125

gluproserasnserleumetalaileglucysargvalcysglyasp

130135140

lysalaserglyphehistyrglyvalhisalacysgluglycyslys

145150155160

glyphepheargargthrileargleulysleuiletyraspargcys

165170175

aspleuasncysargilehislyslysserargasnlyscysglntyr

180185190

cysargpheglnlyscysleualavalglymetserhisasnalaile

195200205

argpheglyargmetproglnalaglulysglulysleuleualaglu

210215220

ileserseraspileaspglnleuasnprogluseralaaspleuarg

225230235240

alaleualalyshisleutyraspsertyrilelysserpheproleu

245250255

thrlysalalysalaargalaileleuthrglylysthrthrasplys

260265270

serprophevaliletyraspmetasnserleumetmetglygluasp

275280285

lysilelysphelyshisilethrproleuglngluglnserlysglu

290295300

valalaileargilepheglnglycysglnpheargservalgluala

305310315320

valglngluilethrglutyralalysserileproglyphevalasn

325330335

leuaspleuasnaspglnvalthrleuleulystyrglyvalhisglu

340345350

ileiletyrthrmetleualaserleumetasnlysaspglyvalleu

355360365

ilesergluglyglnglyphemetthrargglupheleulysserleu

370375380

arglyspropheglyaspphemetgluprolysphegluphealaval

385390395400

lyspheasnalaleugluleuaspaspseraspleualailepheile

405410415

alavalileileleuserglyaspargproglyleuleuasnvallys

420425430

proilegluaspileglnaspasnleuleuglnalaleugluleugln

435440445

leulysleuasnhisprogluserserglnleuphealalysleuleu

450455460

glnlysmetthraspleuargglnilevalthrgluhisvalglnleu

465470475480

leuglnvalilelyslysthrgluthraspmetserleuhisproleu

485490495

leuglngluiletyrlysaspleutyr

500505

<210>76

<211>777

<212>prt

<213>人

<400>76

metaspserlysgluserleuthrproglyargglugluasnproser

151015

servalleualaglngluargglyaspvalmetaspphetyrlysthr

202530

leuargglyglyalathrvallysvalseralaserserproserleu

354045

alavalalaserglnseraspserlysglnargargleuleuvalasp

505560

pheprolysglyservalserasnalaglnglnproaspleuserlys

65707580

alavalserleusermetglyleutyrmetglygluthrgluthrlys

859095

valmetglyasnaspleuglypheproglnglnglyglnileserleu

100105110

serserglygluthraspleulysleuleuglugluserilealaasn

115120125

leuasnargserthrservalprogluasnprolysserseralaser

130135140

thralavalseralaalaprothrglulysglupheprolysthrhis

145150155160

seraspvalsersergluglnglnhisleulysglyglnthrglythr

165170175

asnglyglyasnvallysleutyrthrthraspglnserthrpheasp

180185190

ileleuglnaspleuglupheserserglyserproglylysgluthr

195200205

asngluserprotrpargseraspleuleuileaspgluasncysleu

210215220

leuserproleualaglygluaspaspserpheleuleugluglyasn

225230235240

serasngluaspcyslysproleuileleuproaspthrlysprolys

245250255

ilelysaspasnglyaspleuvalleuserserproserasnvalthr

260265270

leuproglnvallysthrglulysgluasppheilegluleucysthr

275280285

proglyvalilelysglnglulysleuglythrvaltyrcysglnala

290295300

serpheproglyalaasnileileglyasnlysmetseralaileser

305310315320

valhisglyvalserthrserglyglyglnmettyrhistyraspmet

325330335

asnthralaserleuserglnglnglnaspglnlysproilepheasn

340345350

valileproproileprovalglysergluasntrpasnargcysgln

355360365

glyserglyaspaspasnleuthrserleuglythrleuasnphepro

370375380

glyargthrvalpheserasnglytyrserserprosermetargpro

385390395400

aspvalserserproproserserserserthralathrthrglypro

405410415

proprolysleucysleuvalcysseraspglualaserglycyshis

420425430

tyrglyvalleuthrcysglysercyslysvalphephelysargala

435440445

valgluglyglnhisasntyrleucysalaglyargasnaspcysile

450455460

ileasplysileargarglysasncysproalacysargtyrarglys

465470475480

cysleuglnalaglymetasnleuglualaarglysthrlyslyslys

485490495

ilelysglyileglnglnalathrthrglyvalserglngluthrser

500505510

gluasnproglyasnlysthrilevalproalathrleuproglnleu

515520525

thrprothrleuvalserleuleugluvalilegluprogluvalleu

530535540

tyralaglytyraspserservalproaspserthrtrpargilemet

545550555560

thrthrleuasnmetleuglyglyargglnvalilealaalavallys

565570575

trpalalysalaileproglypheargasnleuhisleuaspaspgln

580585590

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595600605

glytrpargsertyrargglnserseralaasnleuleucyspheala

610615620

proaspleuileileasngluglnargmetthrleuprocysmettyr

625630635640

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645650655

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660665670

serservalprolysaspglyleulysserglngluleupheaspglu

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ileargmetthrtyrilelysgluleuglylysalailevallysarg

690695700

gluglyasnserserglnasntrpglnargphetyrglnleuthrlys

705710715720

leuleuaspsermethisgluvalvalgluasnleuleuasntyrcys

725730735

pheglnthrpheleuasplysthrmetserileglupheproglumet

740745750

leualagluileilethrasnglnileprolystyrserasnglyasn

755760765

ilelyslysleuleuphehisglnlys

770775

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proserargpropheserglualasermetmetglyleuleuthrasn

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alathrval

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<212>prt

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505560

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hisalaserproproalacysglualailethrsertrpcysleuphe

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leuleuserproleumetserargprogluilelysalaglyaspser

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serglythrglyalaglyglnlysvalleuprolysglyleuserpro

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proargglnleuleuleuprothrserglyseralahistrpprogly

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alaglyvallysproserproglnproalaalaglygluvalgluglu

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asnalaalaseralaalaproglyglyvalthrleuvalprolysglu

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glyprophealaproproargglyserproseralaproserpropro

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serserserglyseralaleuglucysileleutyrlysalaglugly

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alaalaglysercysleuleuproargaspserleuproalaalapro

485490495

alathralaalaalaproalailetyrglnproleuglyleuasngly

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glnglnproserglnproglnseralaproglucyshisprogluarg

100105110

glycysvalprogluproglyalaalavalalaalaglylysglyleu

115120125

proglnglnleuproalaproproaspgluaspaspseralaalapro

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serthrleuserleuleuglyprothrpheproglyleusersercys

145150155160

seralaaspleulysaspileleuserglualaserthrmetglnleu

165170175

leuglnglnglnglnglnglualavalsergluglysersersergly

180185190

argalaargglualaserglyalaprothrserserlysaspasntyr

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leuglyglythrserthrileseraspseralalysgluleucyslys

210215220

alavalservalsermetglyleuglyvalglualaleugluhisleu

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serproglygluglnleuargglyaspcysmettyralaprovalleu

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glyvalproproalavalargprothrprocysalaproleualaglu

260265270

cyslysglyserleuleuaspaspseralaglylysserthrgluasp

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glygluserleuglycysserglyseralaalaalaglysersergly

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thrleugluleuproserthrleuserleutyrlysserglyalaleu

325330335

aspglualaalaalatyrglnserargasptyrtyrasnpheproleu

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alaleualaglyproproproproproproproprohisprohisala

355360365

argilelysleugluasnproleuasptyrglyseralatrpalaala

370375380

alaalaalaglncysargtyrglygluleualaserleuhisglyala

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glyalaalaglyproglyserglyserproseralaalaalaserser

405410415

sertrphisthrleuphethralaglugluglyglnleutyrglypro

420425430

cysglyglyglyglyglyglyglyglyglyglyglyglyglyalagly

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glualaglyalavalalaprotyrglytyrthrargproproglngly

450455460

leualaglyglngluglyaspphethralaproaspvaltrptyrpro

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glyglymetvalserargvalprotyrproserprothrcysvallys

485490495

serglumetglyprotrpmetaspsertyrserglyprotyrglyasp

500505510

metargleugluthralaargasphisvalleuproileasptyrtyr

515520525

pheproproglnlysthrcysleuilecysglyaspglualasergly

530535540

cyshistyrglyalaleuthrcysglysercyslysvalphephelys

545550555560

argalaalagluglylysglnlystyrleucysalaserargasnasp

565570575

cysthrileasplyspheargarglysasncysprosercysargleu

580585590

arglyscystyrglualaglymetthrleuglyalaarglysleulys

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lysleuglyasnleulysleuglnglugluglyglualaserserthr

610615620

thrserprothrglugluthralaglnlysleuthrvalserhisile

625630635640

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645650655

gluproglyvalvalcysalaglyhisaspasnasnglnproaspser

660665670

phealaalaleuleuserserleuasngluleuglygluargglnleu

675680685

valhisvalvallystrpalalysalaleuproglypheargasnleu

690695700

hisvalaspaspglnmetalavalileglntyrsertrpmetglyleu

705710715720

metvalphealametglytrpargserphethrasnvalasnserarg

725730735

metleutyrphealaproaspleuvalpheasnglutyrargmethis

740745750

lysserargmettyrserglncysvalargmetarghisleusergln

755760765

glupheglytrpleuglnilethrproglnglupheleucysmetlys

770775780

alaleuleuleupheserileileprovalaspglyleulysasngln

785790795800

lysphepheaspgluleuargmetasntyrilelysgluleuasparg

805810815

ileilealacyslysarglysasnprothrsercysserargargphe

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tyrglnleuthrlysleuleuaspservalglnproilealaargglu

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leuhisglnphethrpheaspleuleuilelysserhismetvalser

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885890895

<210>97

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<213>人工序列

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<212>prt

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tyrhisthrserargleuhisserglyvalproserargphesergly

859095

serglyserglythrasptyrserleuthrileserasnleuglugln

100105110

gluaspilealathrtyrphecysglnglnglyasnthrleuprotyr

115120125

thrpheglyglyglythrlysleugluilethrglyglyglyglyser

130135140

glyglyglyglyserglyglyglyglysergluvallysleuglnglu

145150155160

serglyproglyleuvalalaproserglnserleuservalthrcys

165170175

thrvalserglyvalserleuproasptyrglyvalsertrpilearg

180185190

glnproproarglysglyleuglutrpleuglyvaliletrpglyser

195200205

gluthrthrtyrtyrasnseralaleulysserargleuthrileile

210215220

lysaspasnserlysserglnvalpheleulysmetasnserleugln

225230235240

thraspaspthralailetyrtyrcysalalyshistyrtyrtyrgly

245250255

glysertyralametasptyrtrpglyglnglythrservalthrval

260265270

serserglyseraspargargglyglyargmetleulyshislysarg

275280285

glnargaspaspglygluglyargglygluvalglyseralaglyasp

290295300

metargalaalaasnleutrpproserproleumetilelysargser

305310315320

lyslysasnserleualaleuserleuthralaaspglnmetvalser

325330335

alaleuleuaspalagluproproileleutyrserglutyrasppro

340345350

thrargpropheserglualasermetmetglyleuleuthrasnleu

355360365

alaasparggluleuvalhismetileasntrpalalysargvalpro

370375380

glyphevalaspleuthrleuhisaspglnvalhisleuleuglucys

385390395400

alatrpleugluileleumetileglyleuvaltrpargsermetglu

405410415

hisproglylysleuleuphealaproasnleuleuleuaspargasn

420425430

glnglylyscysvalgluglymetvalgluilepheaspmetleuleu

435440445

alathrserserargpheargmetmetasnleuglnglyglugluphe

450455460

valcysleulysserileileleuleuasnserglyvaltyrthrphe

465470475480

leuserserthrleulysserleugluglulysasphisilehisarg

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valleuasplysilethraspthrleuilehisleumetalalysala

500505510

glyleuthrleuglnglnglnhisglnargleualaglnleuleuleu

515520525

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thrthrproalaproargproprothrproalaprothrilealaser

580585590

glnproleuserleuargproglualacysargproalaalaglygly

595600605

alavalhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyriletrp

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alaproleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuvalile

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thrleutyrcyslysargglyarglyslysleuleutyrilephelys

645650655

glnprophemetargprovalglnthrthrglnglugluaspglycys

660665670

sercysargpheproglugluglugluglyglycysgluleuargval

675680685

lyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasn

690695700

glnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspval

705710715720

leuasplysargargglyargaspproglumetglyglylysproarg

725730735

arglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplys

740745750

metalaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarg

755760765

glylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlys

770775780

aspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

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aspargvalthrilesercysargalaserglnaspileserlystyr

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serglyserglythrasptyrserleuthrileserasnleuglugln

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<210>105

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<213>人工序列

<220>

<223>接头序列

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glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

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gluvallysleuglngluserglyproglyleuvalalaprosergln

151015

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202530

glyvalsertrpileargglnproproarglysglyleuglutrpleu

354045

glyvaliletrpglysergluthrthrtyrtyrasnseralaleulys

505560

serargleuthrileilelysaspasnserlysserglnvalpheleu

65707580

lysmetasnserleuglnthraspaspthralailetyrtyrcysala

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glythrservalthrvalserser

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asnleutrpproserproleumetilelysargserlyslysasnser

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505560

alagluproproileleutyrserglutyraspprothrargprophe

65707580

serglualasermetmetglyleuleuthrasnleualaaspargglu

859095

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100105110

leuthrleuhisaspglnvalhisleuleuglucysalatrpleuglu

115120125

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valgluglymetvalgluilepheaspmetleuleualathrserser

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180185190

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leulysserleugluglulysasphisilehisargvalleuasplys

210215220

ilethraspthrleuilehisleumetalalysalaglyleuthrleu

225230235240

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<212>prt

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gaa123

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<211>41

<212>prt

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proglugluglugluglyglycysglu

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<400>117

ctgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccag60

ctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgt120

ggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtac180

aatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgag240

cgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggac300

acctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc339

<210>118

<211>113

<212>prt

<213>人

<400>118

leuargvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglngln

151015

glyglnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglu

202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

arg

<210>119

<211>595

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>雌激素受体配体结合结构域

<400>119

metthrmetthrleuhisthrlysalaserglymetalaleuleuhis

151015

glnileglnglyasngluleugluproleuasnargproglnleulys

202530

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290295300

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340345350

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435440445

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465470475480

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530535540

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545550555560

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565570575

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580585590

alathrval

595