具有D–果糖取代基的阳离子聚合物的制作方法

本发明涉及新型的与d–果糖共轭的阳离子聚合物，其由此可以选择性地与细胞表面上的特异性结构单元相互作用。

背景技术：

已知的阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺(pei)或聚l–赖氨酸(pll)，具有严重的缺点(h.lvetal.(2006):“toxicityofcationiclipidsandcationicpolymersingenedelivery”journalofcontrolledrelease114:100-109)：

-对于细胞具有一般和非特异性的细胞毒性，

-引起血细胞的聚集和溶血。

阳离子聚合物由于其正电荷密度高，具有络合带负电荷的遗传物质例如sirna(小干扰核糖核酸)或pdna(质粒脱氧核糖核酸)的能力。如此产生的在阳离子聚合物与遗传物质之间的加合物称作多聚复合物(polyplex)，借此可以实现遗传物质(例如sirna)在细胞中的转运。

阳离子聚合物已经可以成功地在化妆品应用中在糖表面活性剂的情况下用作改善感觉特性和泡沫感觉的添加剂(专利申请：阳离子生物聚合物改善含有糖表面活性剂的制剂的感觉特性的用途，de19605355a1，joergkahre，rolfwachter)。

此外，阳离子聚合物可以被小的蛋白质序列(例如：rgd肽)官能化，及由此被选择性地影响(c.l.waiteetal.(2009):“pamam-rgdconjugatesenhancesirnadeliverythroughamulticellularspheroidmodelofmalignantglioma”bioconjugatechemistry:20:1908-1916)。确切的机理在此是不清楚的，并且需要存在整合素(动物细胞中的转运膜蛋白)。

阳离子聚合物与糖的共价连接同样是已知的。

聚丙烯亚胺聚合物可以用d–甘露糖进行官能化，并研究了其成功对抗hiv的性质。在此，这一方案仅用于利用凝集素受体靶向性驱动免疫细胞，所谓的巨噬细胞。(t.duttaet.al(2007):“targetingpotentialandanti-hivactivityoflamivudineloadedmannosylatedpoly(propyleneimine)dendrimer”biochimicaetbiophysicaacta(bba)-generalsubjects:1770,681-686)。

描述了d–半乳糖共轭的聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物的合成，其用于转染肝细胞中的遗传物质。这一方案仅适合于具有asgp受体的肝细胞(专利申请：细胞靶向聚乙二醇接枝的聚合物基因载体，wo2003/008555a2，kazyyoshisagara；publikation:k.sagaraetal.(2002)。“anewsynthesisofgalactose-poly(ethyleneglycol)-polyethylenimineforgenedeliverytohepatocytes”journalofcontrolledrelease79(1-3):271-281)。

乳糖和α–环糊精耦联在星形阳离子聚酰胺胺(pamam)枝状化合物上，用于治疗家族性淀粉样多发性神经病。在此，这一方案的目的仅在于在肝细胞中转甲状腺素蛋白-基因表达(y.hayashiet.al(2012):“potentialuseoflactosylateddendrimer(g3)/α-cyclodextrinconjugatesashepatocyte-specificsirnacarriersforthetreatmentoffamilialamyloidoticpolyneuropathy”molecularpharmaceutics:9,1645-1653)。

用d–岩藻糖对阳离子脂质体进行改性，并研究了其对腺病毒诱导的免疫应答的影响。这一方案仅用于为脾和肝巨噬细胞靶向性提供特异性转录因子nf-κb。(h.huangetal.(2009):“suppressiveeffectsofsugar-modifiedcationicliposome/nf-κbdecoycomplexesonadenovirusvector-inducedinnateimmuneresponses”journalofcontrolledrelease:133,139-145)。

描述了基于丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的阳离子聚合物，其具有以糖苷方式键结的糖类。这一方案在此仅描述了此类聚合物的化学组成，在任何方面都没有提及可能的生物学应用。利用在此所述的以糖苷方式键结的糖基也无法实现在细胞膜中与糖-转运蛋白的相互作用(专利申请：新型含糖聚合物、其用途以及用于其制备的单体，us2008/0281064a1，stephaniechiron，marie-pierrelabeau，etiennefleury，davidviet，sylvaincottaz，huguesdriguez，samihalila)。

描述了核酸及其具有阳离子聚合物的多聚复合物。在这一方案中，糖分子在形成多聚复合物时存在于溶液中，但是以非共价方式键结在阳离子聚合物上。因此其没有实现直接的靶向功能。(专利申请：核酸-阳离子聚合物组合物及其制备和使用方法，wo2016/178233a1，abrahamhochberg，jennifergallula)。

技术实现要素：

本发明是基于以下目的，提供新型生物相容性的、可简单地制备的、d–果糖共轭的阳离子聚合物，其对于特定的细胞种类具有提高的选择性。

在此，术语“选择性”一方面是指新型d–果糖共轭的阳离子聚合物与细胞表面上的特定结构单元的相互作用，另一方面是指对于特定细胞型的细胞毒素作用。在此，作为非限制性例子，尤其感兴趣的是对于glut5过表达的细胞型例如大部分乳腺癌细胞型的选择性细胞毒素作用。

为了实现此目的，根据本发明发现了由通式(i)的基本结构组成的具有d–果糖取代基的阳离子聚合物：

阳离子聚合物在此是由n个具有一个或多个正电荷的重复单元组成的大分子化合物(优选n＝10至1000)。

优选的阳离子聚合物的非限制性例子在此可以是聚l–赖氨酸(pll)、聚乙烯亚胺(pei)或葡聚糖，如二乙基氨基乙基-葡聚糖(deae-d)或葡聚糖-精胺(d-spm)或聚甲基丙烯酸酯，如聚(2–二甲基氨基)乙基-甲基丙烯酸酯(pdmaema)和聚二甲基-氨基乙基-甲基丙烯酸酯(pdama)。

连接物在此是使阳离子聚合物与d–果糖单元键结的一个或多个原子或官能基团。适合于此的例如是任意的烷基或芳基、任意的烯基或炔基、醚或硫醚、胺、酯衍生物、酰胺衍生物或其他羧酸衍生物、杂环(例如三唑或马来酰亚胺)、二硫化物、亚胺或酰亚胺。

d–果糖及其衍生物理解为基于d–果糖并且在此以开放或封闭形式保持位置3、4和5的立体化学的所有化学分子。在糖的一个或多个位置(但不是在d–果糖的糖苷c2原子)化学改性，尤其是引入官能基团，例如硫醇基、叠氮化物基、羧酸基及其衍生物和/或氨基，保持位置3、4和5的立体化学，在此同样理解为d–果糖衍生物。

d–果糖具有开链形式的酮官能性，这会完全改变化学性质。其与其他糖相似经由特异性转运蛋白(glut)植入细胞中并进行新陈代谢。对d–果糖负责的转运蛋白是glut5转运蛋白(a.godoyetal.(2006):“differentialsubcellulardistributionofglucosetransportersglut1-6andglut9inhumancancer:ultrastructurallocalizationofglut1andglut5inbreasttumortissues.”journalofcellularphysiology207(3):614-627)。

d–果糖取代的阳离子聚合物p3出人意料地显示为有利的：

与未经改性的阳离子聚合物(例如l-pei)相比，p3具有：

-提高的水溶性；

-对于乳腺癌细胞例如mda-mb-231的细胞毒性；

-对于非癌细胞例如huvec或l929没有细胞毒性；

-大幅减小的对于血细胞的溶血活性；

-不会引起血液成分聚集；

-以及形成具有带负电荷的生物分子例如pdna或sirna的多聚复合物的能力。

下面应当依照d–果糖共轭的阳离子聚合物(基于线性聚乙烯亚胺(l-pei(i))及分支的聚乙烯亚胺(b-pei(ii))的合成阐述本发明。

(i)d–果糖共轭的(非分支的)l-pei的合成

1、在四阶段合成中合成sh-官能化的d–果糖衍生物

1–o–(2–巯基–乙基)–2,3:4,5–二–o–异亚丙基–β–d–吡喃果糖苷的四阶段合成的示意图：a)苯甲基–2–溴乙基醚，nah，thf，rt；b)h2/pd(c)，ch3oh，rt；c)甲基磺酰氯，et3n，4–dmap，ch2cl2，0℃；d)

1、硫脲，丁酮，95℃，2、k2s2o5，ch2cl2/h2o，50℃。

对d–果糖衍生物5进行完全表征，所有的单个步骤可以高产率实施。引入硫醇用于经由光催化的硫醇-烯-点击反应将糖挂在该聚合物上。

2、通过随后在d–果糖与聚合物前体之间的硫醇-烯-点击以及糖单元的去保护来合成嵌段共聚物

合成p(ei-stat-butenox-stat-frubutox)的示意图：a)6mhcl，100℃，回流；b)吡啶，4–dmap，80℃；c)d–果糖衍生物(5)，甲醇，2,2–二甲氧基–2–苯基苯乙酮，25℃，uv＝365nm；d)thf/h2o，2mhcl，40℃。

此共聚物及相应的中间体可以广泛地进行表征。使用由乙烯亚胺(ei)和用双键官能化的ei组成的共聚物作为前体。在最后的步骤中经由光催化的硫醇-烯-点击反应来引入糖衍生物5。通过酸性去保护，产生水溶性聚合物p3。

(ii)d–果糖共轭的分支的聚乙烯亚胺(b-pei)的合成

1、环氧官能化的d–果糖的合成

由可商购获得的异亚丙基保护的d–果糖起始，可以通过利用环氧氯丙烷的williamson醚化，制得环氧官能化的d–果糖。

2、环氧官能化的d–果糖与(分支的)b-pei的耦联

在环氧化物与伯胺之间的一般开环反应的示意图。

分支的聚乙烯亚胺(b-pei)的可能的重复单元的示意图。

通过在室温下在甲醇中搅拌3天，可以用预先合成的d–果糖衍生物通过开环反应使b-pei官能化。制得d–果糖共轭的b-pei，具有14％、23％、28％、39％和76％官能化的伯氨基。

3、消去果糖基上的保护基团

在40℃下多日加热具有键结的d–果糖衍生物的阳离子聚合物之后，使用2mhcl在存在水的情况下酸性消去异亚丙基-保护基团。通过用水透析(纤维素酯，mwco：500-1000da)，产生d–果糖官能化的b-pei。

对聚合物p3实施彻底的生物学评估。

a)细胞毒性和血液相容性

图1所示为利用聚合物p1、p2和p3的阿尔玛蓝试验的取决于细胞型的细胞毒性研究。未经处理的细胞用作100％活力的参照。以给定的聚合物浓度处理细胞24小时。

d–果糖共轭的聚合物p3出人意料地对于乳腺癌细胞系mda-mb-231显示出提高的毒性，而非癌细胞(huvec和l929)则没有显示出细胞活力的显著减小。聚合物p2和p1则根本没有显示出选择性(图1)。

图2a所示为具有给定浓度的聚合物的红血球聚集试验。b-pei用作阳性对照，pbs用作阴性对照。图2b所示为红血球在与具有给定浓度的聚合物孵育之后的溶血试验。tritonx-100用作阳性对照(100％溶血)，pbs用作阴性对照(1.99％)。小于2％溶血的值分级为非溶血的，2至5％分级为轻微溶血的，>5％分级为溶血的。数值表示3次测量的平均值(±标准差)。

不同于p1和p2，聚合物p3没有导致红血球聚集，并且没有显示出溶血(图2)。

b)形成多聚复合物的形成率和稳定性

络合遗传物质的能力是所用的阳离子聚合物的核心要务。为了对其进行检验，测试阳离子聚合物的所有氮原子(n)之和与遗传物质的磷原子(p)的不同的比例(n/p比)。图3a和3b所示为聚合物p1、p2和p3与pdna的多聚复合物构型和稳定性。具体而言，图3a在此所示为在给定的n/p比下的结合亲和力(溴化乙锭淬灭试验)，图3b所示为多聚复合物在n/p比为20时使用肝素(0至60uml^-1)的离解试验。数值反映3次测量的平均±s.d(n＝3)。

d–果糖共轭的聚合物p3显示出在n/p比>15时稳定地形成多聚复合物，此外显示出在存在肝素的情况下迅速释放遗传物质(图3)。

c)多聚复合物的大小

该表显示出在n/p20时在hbg缓冲剂中p1至p3的多聚复合物的大小和zeta电位(借助动力学电泳光散射测得)。

d)细胞吸收

为了支持细胞毒性研究的结果，用不同的染料(cy-5和罗丹明-scn)对聚合物进行标记，所述细胞系与其进行孵育，并利用流式细胞术分析(facs)和共聚焦激光扫描显微分析(clsm)对结果进行评估。

图4所示为细胞吸收研究。聚合物p1至p3的多聚复合物与用yoyo-1标记的pdna和l929细胞、huvec细胞和mda-mb-231细胞进行孵育。所示为所有活细胞与不使用聚合物的pdna对照物相比的相对平均荧光强度(mfi)(点)。数值反映3次测量的平均±s.d(n＝3)。

p1和p2在此在所有被考虑的细胞系中在所有的n/p比下均显示出非特异性吸收(5-60％)。与此不同，p3对于n/p＝50在乳腺癌细胞系mda-mb-231中显示出与p1和p2(20-30％)相比显著提高的吸收(60％)。此外，p3对于n/p＝50在非乳腺癌细胞系l929(20％)以及人的原代细胞系huvec(5％)中显示出明显减小的吸收。在mda-mb-231中的摄取行为在直接前体p2与d–果糖共轭的p3之间的明显区别使得糖分子的成功的靶向功能更加突出。图4中的柱反映细胞通过pdna吸收而总体具有荧光性的百分比。

也利用所述细胞在其与用染料标记的聚合物进行孵育时的共聚焦激光扫描显微分析来观察这些结果。在n/p50时，p3在l929中的荧光强度是低的，而在mda-mb-231细胞中是高的，聚合物p1和p2则与此不同而显示出相反的趋势。在活细胞中的吸收研究的结果与细胞毒性试验的结果一致，并由此显示出d–果糖共轭的聚合物p3的细胞型特异性。