携带转基因的重组腺病毒的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月26日提交的美国临时专利申请第62/511,822号的优先权和权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
关于序列表的陈述
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发明领域
本文所述的发明大体上涉及病毒学、病毒疗法和分子生物学领域。
背景技术：
使用病毒疗法以治疗诸如癌症的包括采用带有治疗基因或转基因的选择性复制病毒。在被开发作为病毒治疗剂的多种感染性病毒物种中，腺病毒已成为最重要之一，这不仅是因为它们对正常的非转化细胞具有最小毒性，还因为它们的基因组包含多个内源基因，容易操作，所述操作通常采取缺失内源基因和插入内源基因的方式。这种操作的缺点是大多数内源基因缺失或外源基因添加减慢或减弱了病毒的复制和感染潜力。(larsonetal.,oncotarget,6(24):19976-89(2015))
携带转基因的病毒在这些区域中的复制效率降低(诸如在溶瘤性病毒用于治疗癌症的情况中)是不理想的，其损害了病毒在肿瘤中繁殖和感染相邻癌细胞的能力，减少了感染细胞中病毒基因组拷贝的数量，因此有可能减少治疗性转基因的转录和增加产生病毒所需的生产培养的大小。因此，需要一种新的方法以改善重组腺病毒在靶标细胞或组织中(诸如在肿瘤中)高水平复制的能力，从而将靶标细胞或组织迅速变为用于生产特定外源基因产物的“工厂”。
通常，为使溶瘤性病毒表达两种或更多种独立的蛋白质或多肽链，需要使用多于一种病毒载体或在两个转基因之间使用连接子，诸如内部核糖体进入位点(ires)。两种方法都有显著缺点。两种或更多种病毒载体可能无法都在单一细胞或组织中良好表达。如本领域所知，ires下游的序列的表达水平比序列上游低得多(mizuguchietal.,mol.ther.1(4):376-82(2000))。另外，非内源的连接子具有免疫原性。因此，需要更有效的病毒载体以表达在单一病毒中表达多于一种肽链。
技术实现要素：
本发明部分基于以下发现：具有插入到病毒基因组的两个病毒转录单元之间的一个或多个核苷酸序列的重组腺病毒可在靶标细胞或组织中有效地复制和表达核苷酸序列，不会显著影响病毒的溶瘤性活性。本发明的载体可有利地用于需要相同水平的两个或更多个转基因时或者用于表达来自双联蛋白的完全天然的链。
在一个方面，本发明提供了一种包含插入到插入位点中的核苷酸序列的重组腺病毒，其中所述插入位点位于第一病毒转录单元的终止密码子和第二病毒转录单元的终止密码子之间，其中与第一病毒转录单元的起始位点距离第二病毒转录单元的终止密码子相比，第一病毒转录单元的终止密码子更靠近第二病毒转录单元的终止密码子，其中与第二病毒转录单元的起始位点距离第一病毒转录单元的终止密码子相比，第二病毒转录单元的终止密码子更靠近第一病毒转录单元的终止密码子和其中在插入核苷酸序列之前，在第一病毒转录单元和第二病毒转录单元之间没有病毒转录单元。
在某些实施方式中，第一病毒转录单元是腺病毒ix基因和第二病毒转录单元是腺病毒iva2基因。在某些实施方式中，第一病毒转录单元是腺病毒纤维基因，第二病毒转录单元是腺病毒e4基因的orf6或orf6/7。在某些实施方式中，重组腺病毒是5型腺病毒(ad5)。在某些实施方式中，重组腺病毒是35型腺病毒(ad35)。
在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到ix-e2插入位点。在某些实施方式中，ix-e2插入位点位于腺病毒ix基因的终止密码子和腺病毒iva2基因的终止密码子之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的约4029到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的4029到4050位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的4050到4070位的核苷酸之间，或对应于ad5基因组(seqidno:1)的4070到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的约3899到3970位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的3899到3920位的核苷酸之间，对应于ad35基因组(seqidno:41)的3920到3940位的核苷酸之间，或对应于ad35基因组(seqidno:41)的3940到3970位的核苷酸之间。
在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到l5-e4插入位点。在某些实施方式中，l5-e4插入位点位于腺病毒纤维基因的终止密码子和腺病毒e4基因的orf6或orf6/7的终止密码子之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的32785到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的32785到32800位的核苷酸之间，ad5基因组(seqidno:1)的32800到32820位的核苷酸之间，ad5基因组(seqidno:1)的32820到32840位的核苷酸之间，ad5基因组(seqidno:1)的32840到32860位的核苷酸之间，ad5基因组(seqidno:1)的32860到32880位的核苷酸之间，ad5基因组(seqidno:1)的32880到32900，或对应于ad5基因组(seqidno:1)的约32901到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的约31799到31821位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的31799到32810位的核苷酸之间，或对应于ad35基因组(seqidno:41)的32810到31821位的核苷酸之间。
在某些实施方式中，前述重组腺病毒进一步包含插入到e1b-19k插入位点、e3插入位点或e4插入位点中的核苷酸序列。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点位于elb-19k的起始位点和elb-55k的起始位点之间。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点位于elb-19k的起始位点和elb-19k的终止密码子之间。在某些实施方式中，e3插入位点位于腺病毒pviii基因的终止密码子和腺病毒纤维基因的起始位点之间。
在某些实施方式中，本发明提供了一种包含插入到ix-e2插入位点中的第一核苷酸序列和插入到l5-e4插入位点中的第二核苷酸序列的重组腺病毒。
在某些实施方式中，第一核苷酸序列被插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的约4029到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一核苷酸序列被插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的4029到4050位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的4050到4070位的核苷酸之间，或对应于ad5基因组(seqidno:1)的4070到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一核苷酸序列被插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的约3899到3970位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一核苷酸序列被插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的3899到3920位的核苷酸之间，对应于ad35基因组(seqidno:41)的3920到3940位的核苷酸之间，或对应于ad35基因组(seqidno:41)的3940到3970位的核苷酸之间。
在某些实施方式中，第二核苷酸序列被插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的32785到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第二核苷酸序列被插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的32785到32800位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32800到32820位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32820到32840位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32840到32860位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32860到32880位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32880到32900位的核苷酸之间，或对应于ad5基因组(seqidno:1)的约32901到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第二核苷酸序列被插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的约31799到31821位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第二核苷酸序列被插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的31799到32810位的核苷酸之间，或对应于ad35基因组(seqidno:41)的32810到31821位的核苷酸之间。
在某些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列包含至少一个转基因。在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含启动子，其中转基因可操作地连接到启动子。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)转基因；(iv)第二聚腺苷酸化信号；和(v)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列(包含一个或多个转基因)插入到第一聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号之间。在一些实施方式中，一个或多个转基因插入到第一聚腺苷酸化信号和第三聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向上。
在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到l5-e4插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是纤维(l5)基因的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒e4基因的orf6或orf6/7的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到ix-e2插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是ix基因的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒iva2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)转基因；(v)第三聚腺苷酸化信号；和(vi)第四聚腺苷酸化信号和转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列(包含一个或多个转基因)插入到第一聚腺苷酸化信号和第四聚腺苷酸化信号之间。在一些实施方式中，一个或多个转基因插入到第一聚腺苷酸化信号和第四聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向上。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向上。
在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到l5-e4插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是纤维(l5)基因的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒e4基因的orf6或orf6/7的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列被插入到ix-e2插入位点中，第一聚腺苷酸化信号是ix基因的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒iva2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，启动子是泛素启动子、组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子。
在某些实施方式中，ix-e2插入位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个核苷酸的缺失。在某些实施方式中、l5-e4插入位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130个核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含共有kozak序列。在某些实施方式中，重组腺病毒包含编码腺病毒死亡蛋白(adp)的核苷酸序列的部分或完全缺失。
在某些实施方式中，前述重组腺病毒进一步包含插入到e1b-19k插入位点、e3插入位点或e4插入位点中的核苷酸序列。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点位于elb-19k的起始位点和elb-55k的起始位点之间。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点位于elb-19k的起始位点和elb-19k的终止密码子之间。在某些实施方式中，e3插入位点位于腺病毒pviii基因的终止密码子和腺病毒纤维基因的起始位点之间。
在某些实施方式中，e1b-19k插入位点在邻近e1b-19k的起始位点处包含约100至约305，约100至约300，约100至约250，约100至约200，约100至约150，约150至约305，约150至约300，约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点在邻近e1b-19k的起始位点处包含约200个核苷酸(例如，202个核苷酸)的缺失。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的核苷酸1714-1917的缺失，或第一治疗性转基因插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的1714和1917位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一治疗性转基因插入到ctgacctc(seqidno:3)和tcaccagg(seqidno:2)之间，例如，重组腺病毒以5’至3’的方向包含ctgacctc(seqidno:3)、第一治疗性转基因和tcaccagg(seqidno:2)。
在某些实施方式中，e3插入位点包含约500至约3185，约500至约3000，约500至约2500，约500至约2000，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约3185，约1000至约3000，约1000至约2500，约1000至约2000，约1000至约1500，约1500至约3185，约1500至约3000，约1500至约2000，约2000至约3185，约2000至约3000，约2000至约2500，约2500至约3185，约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e3插入位点位于e3-10.5k的终止密码子和e3-14.7k的终止密码子之间。在某些实施方式中，e3插入位点在邻近e3-10.5k的终止密码子处包含约500至约1551，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约1551，约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e3插入位点在邻近e3-10.5k的终止密码子处包含约1050个核苷酸的缺失，例如，e3插入位点在邻近e3-10.5k的终止密码子处包含1063个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e3插入位点包含对应于ad5dl309e3缺失的缺失。在某些实施方式中，e3插入位点包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的核苷酸29773-30836的缺失，或第二治疗性转基因插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的29773到30836位的核苷酸之间。在某些实施方式中，e3插入位点包含对应于ad35基因组(seqidno:41)的核苷酸29119-30622的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含具有功能性pea3结合位点的缺失的e1a启动子。例如，病毒可包含对应于e1a起始位点上游的约-300至约-250的核苷酸的缺失，或对应于e1a起始位点上游的约-305至-255的核苷酸的缺失的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的195-244的核苷酸的缺失和/或e1a启动子包含序列ggtgttttgg(seqidno:4)。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含可操作地连接到基因的修饰的基于tata框的启动子和/或可操作地连接至基因的修饰的基于caat框的启动子，其中修饰的基于tata框的启动子缺乏功能性tata框并允许基因在过度增殖细胞中的选择性表达，其中修饰的基于caat框的启动子缺乏功能性caat框并允许基因在过度增殖细胞中的选择性表达。
在某些实施方式中，其中修饰的基于tata框的启动子是早期基因启动子。在某些实施方式中，修饰的基于tata框的启动子是e1a启动子，e1b启动子或e4启动子。在某些实施方式中，修饰的基于tata框的启动子是e1a启动子。
在某些实施方式中，修饰的基于tata框的启动子中所包含的修饰包括整个tata框的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于e1a启动子的-27至-24，-31至-24，-44至+54，或-146至+54的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的472至475，468至475，455至552，或353至552的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：ctaggactg(seqidno:5)，agtgcccg(seqidno:44)，和/或tattcccg(seqidno:45)。
在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子是早期基因启动子。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子是e1a启动子，e1b启动子或e4启动子。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子是e1a启动子。
在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子中所包含的修饰包括整个caat框的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于e1a启动子的-76至-68的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的423至431的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：ttccgtggcg(seqidno:46)。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于ad35基因组(seqidno:41)的477至484的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，插入的核苷酸序列包含含有第一转基因的第一核苷酸序列和包含第二转基因的第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过连接子隔开。在某些实施方式中，连接子编码可由一种蛋白酶或多种蛋白酶切割的肽。在某些实施方式中，连接子编码内部核糖体进入位点(ires)或自切割2a肽。ires可例如选自下组：脑心肌炎病毒ires，手足口病病毒ires和脊髓灰质炎病毒ires。在某些实施方式中，其中核苷酸序列被插入到ix-e2插入或l5-e4插入位点中，其中重组腺病毒进一步包含第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列包含插入到e1b-19k插入位点、e3插入位点或e4插入位点中的第三转基因。
在某些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列中的一个或多个包含一个或多个转基因。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码单体，二聚，三聚，四聚或多聚蛋白质或其部分。在某些实施方式中，转基因、第一转基因和/或第二转基因中的一个或多个编码具有治疗活性的rna。在某些实施方式中，转基因、第一转基因和/或第二转基因中的一个或多个编码包含至少一个结合结构域的融合蛋白。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码免疫调节分子。在某些实施方式中，免疫调节分子是共刺激配体/细胞因子或细胞因子受体。在某些实施方式中，免疫调节分子选自下组：il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-7、il-10、il-10trap、il-10r、il-12a/p35、il-12b/p40、il-15、il-15受体融合蛋白、il-23a/p19、il24、il-27、il-33、il-35、il-15、il-15受体融合蛋白、tgf-β、tgf-βtrap、il-10trap、vegf、吲哚胺-2,3-二氧合酶(ido)、诱导型t细胞共刺激配体(icos-l)、cd80、cd137l、tnf-α、ifn-α、ifn-β、ifn-γ或gm-csf、gitr配体(gitrl)、ox40配体(ox40l)、cd40配体(cd40l)、药物诱导型cd40(icd40)、cd154、cd70、cd86、cd137、cd137l、boris/ctcfl、tnfsf9、fgf、icam、足糖萼蛋白、其功能片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码抗原结合分子。在某些实施方式中，抗原结合分子是抗pd-1抗体、抗tgf-β抗体、抗pd-l1抗体和抗ctla-4抗体或其功能片段。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码抗原或该抗原的配体。在某些实施方式中，抗原选自下组：caix、cea、cd5、cd7、cd10、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd80、cd133、cd138、巨细胞病毒(cmv)感染细胞抗原、4-1bb、egp-2、egp-40、epcam、erbb2、erbb3、erbb4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、kras、hpve6、e7、bing-4、epha3、钙激活氯离子通道-2、细胞周期蛋白b1、9d7、ep-cam、prame、ssx-2、不成熟层粘连蛋白受体、叶酸受体-a、端粒酶、酪氨酸酶、黑色素-a、ny-eso-1、gd2、gd3、htert、il13r-a2、x-轻链、kdr、ley、li细胞粘附分子、mage-a1、mage-a3、mart1、mart2、muc1、间皮素、her-2/neu、egfrviii、nkg2d配体、ny-es0-1、gp100、trp-1/-2、trp-1/-2、p多肽、mc1r、前列腺特异性抗原、braf、雄激素受体、β-连环蛋白、brca1/2、cdk4、cml66、纤连蛋白、p53、tgf-βrii、t细胞受体、癌胚抗原、5t4、psca、psma、ror1、tag-72、vegf-r2、wt-1、其功能片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码毒素。在某些实施方式中，毒素是假单胞菌外毒素、蓖麻毒素或白喉毒素。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码酶。在某些实施方式中，酶选自下组：β-葡糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、酯酶、金属蛋白酶、松弛素、胶原酶、链激酶、精氨酸酶、nos-2、其片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码细胞周期控制剂、生长因子、抗凝剂、前药激活基因、肿瘤抑制基因、凋亡基因、抗血小板剂、凝血因子、囊性纤维化跨膜传导调控(cftr)蛋白质、其片段，或其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码血管抑素、内皮抑素、乙酰胆碱、dkk1/wnt、ox40l、gitrl、分泌鞭毛蛋白、胸苷激酶、其功能片段，或其衍生物。
在某些实施方式中，重组腺病毒是溶瘤性的。在某些实施方式中，重组腺病毒选择性地在过度增殖细胞中复制。在某些实施方式中，重组腺病毒选择性地表达转基因在过度增殖细胞中。在某些实施方式中，过度增殖细胞是肿瘤细胞。
在另一方面，本发明提供了一种分离的核苷酸序列，其包含任何前述重组腺病毒序列，任选地其中核苷酸序列是cdna。在另一方面，本发明提供了一种分离的载体，其包含所述腺病毒核苷酸序列。在另一方面，本发明提供了一种分离的细胞，其包含所述腺病毒核苷酸序列或所述载体。
在另一方面，本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞暴露于有效量的任何前述重组腺病毒以抑制肿瘤细胞的增殖。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者的病症的方法。在一些实施方式中，病症是癌症。所述方法包括对受试者施用有效量的本文所述的重组腺病毒以治疗受试者的癌症疾病。
在另一方面，本发明提供了一种抑制需要其的受试者的肿瘤生长的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒以抑制肿瘤生长。在某些实施方式中，肿瘤选自下组：黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肛门肿瘤、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺肿瘤、肾细胞癌、前列腺肿瘤、胃食管肿瘤、结直肠肿瘤、睾丸肿瘤、膀胱肿瘤、卵巢肿瘤、肝细胞癌、胆管癌、脑肿瘤、子宫内膜肿瘤、神经内分泌肿瘤、默克细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤、和胰腺肿瘤。
在另一方面，本发明提供了一种治疗需要其的受试者的疾病或病症的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒。在某些实施方式中，疾病或病症选自下组：感染、糖尿病性视网膜病、银屑病、类风湿性关节炎、子宫内膜异位症、黄斑变性病症和良性生长障碍、诸如前列腺肥大和脂肪瘤、血管病、心血管病、肝硬化、结缔组织病、肿瘤、血管病变、溃疡病变、炎症、血栓形成和新生内膜形成。
在某些实施方式中，受试者是哺乳动物。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，受试者是儿童。在某些实施方式中，受试者是成人。
在某些实施方式中，重组腺病毒通过以下方式施用：肌内、静脉内、动脉内、瘤内、皮内、吸入、透皮、局部、滴眼、鼻内、透肌肉和/或直肠施用。
在某些实施方式中，前述方法进一步包括对受试者施用选自下组的一种或多种治疗：手术，放疗，化疗，免疫疗法，激素疗法和病毒疗法。
在某些实施方式中，前述方法进一步包含对受试者施用一种或多种检查点调节剂。在某些实施方式中，免疫检查点调节剂是选自下组的一种或多种分子的抑制剂、拮抗剂或激动剂：pd-1、pd-l1、pd-l2、2b4、tigit、lag3、tim3、btla、cd160、gitr、kir、4-1bb和ctla4。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含任何前述重组腺病毒和至少一种可药用载体或稀释剂。
在另一方面，本发明提供了一种用于腺病毒的制剂，其包含：
任何前述重组腺病毒中的一种或多种；
至少一种缓冲剂；
至少一种张力修饰剂；
至少一种糖或至少一种稳定剂或二者；和
其中制剂的ph在约7.0和约9.0范围内。
在某些实施方式中，任何前述制剂的摩尔渗透压浓度为约200mos/l至约800mos/l。在某些实施方式中，任何前述制剂的重组腺病毒浓度为约1x107vp/ml至1x1013vp/ml。
通过以下附图、详细描述和权利要求来说明本发明的这些和其他方面和优点。
附图说明
参考以下附图可更全面地理解本发明。
图1是描绘人ad5基因组结构的图表。在该图上方，基因组以直线表示，其长度标记为距常规左端的kbp。粗箭头表示早期和晚期转录单元(分别为黑色和灰色)。空心框表示主要的内含子。e4基因以直线标度放大，长度为bp。初级转录物显示为5’至3’方向的黑色箭头，每种可能编码的蛋白质显示为空心框；其编码区域被内含子序列分开的蛋白质显示为由线连接的框。
图2描绘了用病毒tav-(e1b-19k)mgmcsf或tav-(l5-e4)mgmcsf感染的或保持为未感染对照的a549、ads-12和wi-38细胞的小鼠gmcsf表达水平。小鼠gmcsf表达在其条件培养基中测量。
图3描绘了用病毒tavix-wtl5-空、tavix-wtl5-il7、tavix-wtl5-gmcsf或tavix-gmcsfl5-il7感染的a549细胞的gmcsf表达水平。gmcsf表达在条件培养基中测量。与从l5-e4表达和表达相比，在从ix-e2表达盒表达gmcsf时可见更高表达。
图4描绘了ix-e2插入位点的初始设计和修订设计。
图5描绘感染a549细胞的病毒(tav-δ19k、tav-hil12-弗林蛋白酶、tav-tav-ixrl5-空、wt-ixrl5-hil12或tav-ixrl5-hil12)，其一式三份，并且在感染后4天用结晶紫染色(将活细胞染色为紫色)。
图6描绘了用病毒(tav-δ19k、tav-hil12-弗林蛋白酶、tav-tav-ixrl5-空、wt-ixrl5-hil12或tav-ixrl5-hil12)感染的a549细胞的il-12表达水平。将a549细胞一式三份用所示病毒感染，在感染后4天用elisa测量条件培养基中的il12。
图7描绘了用tav-(ixr)mil7nopa-(l5sv40wt)kozakmgmcsf(标记为sv40wt)或tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf(标记为hef1a)感染的a549细胞的il-17和gmcsf表达水平。
图8描绘了用adp基因完整的[tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf，标记为+adp]或缺失的[tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf-δadp，标记为δadp]感染的a549细胞的il-17和gmcsf表达水平。在感染后的指定时间收集条件培养基，并以elisas测量gmcsf。
图9描绘了用以下病毒感染的a549细胞中的cd80、cd137l和icam1染色：[tav-mcd80(ires)mcd137l(ires)micam1，标记为ires]，[tav-(19k)mcd80-(ix)mcd137l-(l5)micam1，标记为19k-ix-5]，或对照病毒[tav-(19k)空-(ix)空-(l5)空，标记为空]。
图10描绘了用以下病毒感染的ht29细胞中的cd80、cd137l和icam1染色：[tav-mcd80(ires)mcd137l(ires)micam1，标记为ires]，[tav-(19k)mcd80-(ix)mcd137l-(l5)micam1，标记为19k-ix-5]，或对照病毒[tav-(19k)空-(ix)空-(l5)空，标记为空]。
图11描绘了用以下病毒感染的ads12细胞中的cd80、cd137l和icam1染色：[tav-mcd80(ires)mcd137l(ires)micam1，标记为ires]，[tav-(19k)mcd80-(ix)mcd137l-(l5)micam1，标记为19k-ix-5]，或对照病毒[tav-(19k)空-(ix)空-(l5)空，标记为空]。
图12描绘了用以下病毒感染的f244细胞中的cd80、cd137l和icam1染色：[tav-mcd80(ires)mcd137l(ires)micam1，标记为ires]，[tav-(19k)mcd80-(ix)mcd137l-(l5)micam1，标记为19k-ix-5]，或对照病毒[tav-(19k)空-(ix)空-(l5)空，标记为空]。
图13描绘了在moi为5时病毒tav-ix5-空(标记为“空”)和tav-ix5-mil12(标记为“mil12”)在a549细胞中的溶瘤性活性。在感染后的指定日将孔用结晶紫染色。
图14是病毒tav-ix5-mil12的转基因表达。在moi为5的情况下将a549细胞用tav-ix5-空(标记为“空”)或tav-ix5-mil12(标记为“mil12”)感染，在感染后5日收集条件培养基并将其用于elisa中以测量异二聚小鼠il-12。使用tav-ix5-mil12病毒表达高水平的小鼠il-12，而对照tav-ix5-空病毒则否。柱状图表示一式三份样品的meil-12水平，误差线表示标准偏差。
详细描述
本发明部分基于以下发现：具有插入到病毒基因组的两个病毒转录单元之间的一个或多个核苷酸序列的重组腺病毒能有效地在靶标细胞或组织中复制和表达核苷酸序列。
i.重组腺病毒
腺病毒是由核衣壳和双链线性dna基因组组成的非包膜的二十面体病毒。腺病毒利用宿主的复制机制在哺乳动物细胞核中复制。术语“腺病毒”是指腺病毒属中的任何病毒，包括但不限于人、牛、绵羊、马、犬、猪、鼠和猿猴腺病毒亚属。特别地，人腺病毒包括a-f亚属以及其各个血清型，各个血清型和a-f亚属包括但不限于人腺病毒1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(ad11a和ad11p)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型。术语牛腺病毒包括但不限于牛腺病毒1、2、3、4、7和10型。术语犬腺病毒包括但不限于犬1(病毒株cll、glaxo、ri261、utrect、toronto26-61)和2型。术语马腺病毒包括但不限于马1和2型。术语猪腺病毒包括但不限于猪3和4型。
在一些实施方式中，提供的是来源于人腺病毒5型和35型的重组病毒。术语“病毒载体”和“病毒”在本文中可互换地用于表示不具有蛋白合成或能量产生机制的任何专性胞内寄生物。
腺病毒复制周期有两个阶段：早期阶段，在此阶段中表达转录单元e1a、e1b、e2a、e2b、e3和e4。由这些转录单元内的基因编码的蛋白质主要参与病毒转录调控，病毒dna复制，以及抑制对感染的宿主反应。l1-l5转录单元在病毒复制周期的晚期转录，并且主要编码构成病毒衣壳的部件或参与衣壳组装的蛋白质。l1-l5转录单元主要由主要晚期启动子表达。
成熟腺病毒体的一般结构在不同腺病毒物种之间是保守的。腺病毒衣壳由三种主要蛋白质(ii、iii和iv)和五种次要蛋白质(vi、viii、ix、iiia和iva2)组成。本文所用的“iva2基因”是指编码iva2蛋白、其修饰形式和/或片段的基因。本文所用的“ix基因”是指编码ix蛋白、其修饰形式和/或片段的基因。
在图1中显示了ad5基因组的示意图和e4基因的细节。来自e4的初级转录物经受二择一的拼接事件，并预期其编码7种不同多肽：orf1、orf2、orf3、orf3/4、orf4、orf5、orf6和orf6/7。(leppardetal.,journalofgeneralvirology,78:2131–8(1997))“orf”在本文中用于表示多肽或编码多肽的核苷酸序列，其修饰形式和/或片段。
此外，纤维蛋白(也称为蛋白质iv或spike)形成了从二十面体衣壳的每个定点伸出的刺突。本文所用的“纤维基因”是指编码纤维蛋白的基因(也称为l5基因)，其修饰形式和/或片段。
a.插入位点
在一个方面，本发明提供了一种包含插入到插入位点中的核苷酸序列的重组腺病毒，其中插入位点位于第一病毒转录单元的终止密码子和第二病毒转录单元的终止密码子之间，其中与第一病毒转录单元的起始位点距离第二病毒转录单元的终止密码子相比，第一病毒转录单元的终止密码子更靠近第二病毒转录单元的终止密码子，其中与第二病毒转录单元的起始位点距离第一病毒转录单元的终止密码子相比，第二病毒转录单元的终止密码子更靠近第一病毒转录单元的终止密码子。在一些实施方式中，第一病毒转录单元和第二病毒转录单元在腺病毒基因组之间彼此邻近，例如，在插入核苷酸序列之前，在第一病毒转录单元和第二病毒转录单元之间没有病毒转录单元。
本文所用的术语“病毒转录单元”是指从病毒基因组中的转录起始位点延伸到转录终止位点的核苷酸序列的线性序列。病毒转录单元可为天然的，修饰的，或其片段。术语“病毒转录单元”和“病毒基因”在本文中可互换使用。
在某些实施方式中，重组腺病毒是人腺病毒。在一些实施方式中，重组腺病毒是人腺病毒1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或91型。在一些实施方式中，重组腺病毒是5型腺病毒(ad5)或35型腺病毒(ad35)。
在某些实施方式中，第一病毒转录单元是腺病毒ix基因，第二病毒转录单元是腺病毒iva2基因。在某些实施方式中，第一病毒转录单元是腺病毒纤维基因，第二病毒转录单元是腺病毒e4基因的orf6或orf6/7。
在某些实施方式中，插入位点是ix-e2插入位点。在某些实施方式中，ix-e2插入位点位于腺病毒ix基因的终止密码子和腺病毒iva2基因的终止密码子之间。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的4029到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的4029到4050位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的4051到4070位的核苷酸之间，或对应于ad5基因组(seqidno:1)的4071到4093位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的3899到3970位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的3899到3920位的核苷酸之间，对应于ad35基因组(seqidno:41)的3920到3940位的核苷酸之间，或对应于ad35基因组(seqidno:41)的3940到3970位的核苷酸之间。
在一些实施方式中，ix-e2插入位点与应于ad5基因组(seqidno:1)的4029到4093的核苷酸具有至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少99％的同一性。在一些实施方式中，ix-e2插入位点与对应于ad35基因组(seqidno:41)的3899到3970的核苷酸具有至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少99％的同一性。
在某些实施方式中，插入位点是l5-e4插入位点。在某些实施方式中，l5-e4插入位点位于腺病毒纤维基因的终止密码子和腺病毒e4基因的orf6或orf6/7的终止密码子之间。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的32785到32916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的32785到32800位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32801到32820位位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32821到32840位位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32841到32860位位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32861到32880位位的核苷酸之间，对应于ad5基因组(seqidno:1)的32881到32900，或对应于ad5基因组(seqidno:1)的32901到32916位位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的31799到31821位位的核苷酸之间。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到对应于ad35基因组(seqidno:41)的31799到32810位位的核苷酸之间，或对应于ad35基因组(seqidno:41)的32810到31821位位的核苷酸之间。
在一些实施方式中，l5-e4插入位点与对应于ad5基因组(seqidno:1)的32785到32916的核苷酸具有至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少99％的同一性。在一些实施方式中，l5-e4插入位点与对应于ad35基因组(seqidno:41)的31799到31821的核苷酸具有至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少99％的同一性。
在ix-e2插入位点和/或l5-e4插入位点中具有外源氨基酸序列插入的重组腺病毒先前未见描述。与在正常细胞中相比，这样的重组腺病毒出乎意料地在肿瘤细胞中显示了极好的肿瘤选择性表达。在一个方面，本发明提供了一种表达天然蛋白的方法。在另一方面，本发明提供了一种表达诸如二聚或多聚蛋白之类的天然结构的方法。
在另一方面，本发明提供了一种在靶细胞中表达两种或更多种治疗性转基因的方法。所述方法包括将细胞暴露于有效量的本文所述的重组病毒以表达靶转基因。
在某些实施方式中，核苷酸序列包含至少一个转基因。在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含启动子，其中转基因可操作地连接到启动子。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)转基因；(iv)第二聚腺苷酸化信号；和(v)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列被插入到第一聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到l5-e4插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是纤维(l5)基因的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒e4基因的orf6或orf6/7的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到ix-e2插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是ix基因的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒iva2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)转基因；(v)第三聚腺苷酸化信号；和(vi)第四聚腺苷酸化信号和转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列被插入到第一聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到l5-e4插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是纤维(l5)基因的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒e4基因的orf6或orf6/7的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到ix-e2插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是ix基因的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒iva2基因的聚腺苷酸化信号。
术语“启动子”在本文中以其一般含义用于表示包含dna调控序列的核苷酸区域，其中调控序列来源于能够结合rna聚合酶并启动下游(3’-方向)编码序列的转录的基因。
“可操作地连接”是指如下的元件排列：其中所述的组件被构造成使得执行其通常的功能。因此，可操作地连接至编码序列的控制元件能够影响编码序列的表达。控制元件无需与编码序列连续，只要其起到指导表达的作用即可。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可存在中断未翻译但仍在转录的序列，并且启动子序列仍然可被视为“可操作地连接”至编码序列。
在某些实施方式中，启动子是泛素启动子、组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子。
在一些实施方式中，转基因可操作地连接至泛素启动子，诸如βact启动子、ef1启动子、egr1启动子、eif4a1启动子、ferh启动子、ferl启动子、gapdh启动子、grp78启动子、grp94启动子、hsp70启动子、β-kin启动子、pgk-1启动子、rosa启动子、泛素b启动子、sv40启动子或cmv启动子。在一个实施方式中，高水平的组成型表达将是理想的。可用的组成型启动子的实例包括但不限于：逆转录病毒劳斯氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地带有rsv增强子)，巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地带有cmv增强子)(参见，例如，boshartetal,细胞,41:521-530(1985))，sv40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，β-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(pgk)启动子和ef1α启动子(invitrogen)。由外源供给的化合物调控的诱导型启动子也是可用的，并且包括，锌诱导的羊金属硫因(mt)启动子，地塞米松(dex)-诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子，t7聚合酶启动子系统(wo98/10088)；昆虫蜕皮素启动子(noetal.proc.natl.acad.sci.usa,93:3346-3351(1996))，四环素-阻遏系统(gossenetal,proc.natl.acadsci.usa,89:5547-5551(1992))，四环素-诱导系统(gossenetal,science.268:1766-1769(1995)，也见harveyetal,curr.opin.chem.biol.,2:512-518(1998))，ru486-诱导系统(wangetal,nat.biotech.,15:239-243(1997)和wangetal,genether.,4:432-441(1997))，以及雷帕霉素-诱导系统(magarietal,j.clin.invest.,100:2865-2872(1997))。在本文背景下可用的其它类型的诱导型启动子是通过特定的生理状态(例如，温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)调控的那些。
在另一实施方式中，将使用用于转基因的天然启动子。当理想的是转基因的表达应模仿天然表达时，天然启动子可能是优选的。当必须暂时地或发展地以组织特异性方式或响应于特定转录刺激地调控转基因的表达时，可使用天然启动子。在进一步的实施方式中，其它天然表达控制元件(诸如增强子元件、聚腺苷酸化位点或kozak共有序列)也可用于模拟天然表达。
转基因的另一个实施方式包括可操作地连接至组织特异性启动子的转基因，所述组织特异性启动子诸如b29启动子(b细胞)，cd14启动子(单核细胞)，cd43启动子(白细胞和血小板)，cd45启动子(造血细胞)，cd68启动子(巨噬细胞)，结蛋白启动子(肌肉)，弹性蛋白酶-1启动子(胰腺泡细胞)，内皮糖蛋白启动子(内皮细胞)，内皮糖蛋白启动子(内皮细胞)，flt-1启动子(内皮细胞)，gfap启动子(星形胶质细胞)，gpiib启动子(巨核细胞)，icam-2启动子(内皮细胞)，小鼠inf-β启动子(造血细胞)，mb启动子(肌肉)，nphsi启动子(足细胞)，og-2启动子(成骨质细胞，成牙质细胞)，sp-b启动子(肺)，syn1启动子(神经元)，wasp启动子(造血细胞)，sv40/balb启动子(肝)或sv40/halb启动子(肝)。组织特异性启动子在特定类型的细胞或组织中有活性。例如，如果希望在骨骼肌中表达，应使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼肌α-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2a、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶的启动子以及具有高于天然启动子的活性的合成肌肉启动子(参见lietal.,nat.biotech.,17:241-245(1999))。组织特异性启动子的实例对于以下是已知的：肝(白蛋白，miyatakeetal.j.virol.71:5124-32(1997)；乙肝病毒核心启动子，sandigetal.,genether.,3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(afp)，arbuthnotetal.,hum.genether.,7:1503-14(1996))，骨钙蛋白(steinetal.,mol.biol.rep.,24:185-96(1997))，骨涎蛋白(chenetal.,j.boneminer.rep.,11:654-64(1996))，淋巴细胞(cd2,hansaletal.,j.immumnol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；t细胞受体链)，神经元诸如神经元特异性烯醇酶(nse)启动子(andersenetal.,细胞.mol.neurobiol.,13:503-15(1993))，神经丝轻链基因(picciolietal.,proc.natl.acad.sci.usa,88:5611-5(1991))，以及神经特异性vgf基因(picciolietal.,neuron.15:373-84(1995))，等等。
转基因的另一个实例包括可操作地连接至肿瘤特异性启动子的转基因，所述肿瘤特异性启动子诸如afp启动子(肝细胞癌)，cckar启动子(胰腺癌)，cea启动子(上皮癌)，c-erbb2启动子(乳腺癌和胰腺癌)，cox-2启动子(肿瘤)，e2f-1启动子(肿瘤)，he4启动子(肿瘤)，lp启动子(肿瘤)，muc1启动子(癌细胞)，psa启动子(前列腺和前列腺癌)，生存素启动子(肿瘤)，trp1启动子(黑素细胞和黑素瘤)，tyr启动子(黑素细胞和黑素瘤)，cxcr4启动子(肿瘤)或afp/hafp启动子(肝细胞癌)。肿瘤特异性启动子特异性地在肿瘤细胞中有活性。
在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含共有kozak序列。在某些实施方式中，重组腺病毒包含编码腺病毒死亡蛋白(adp)的核苷酸序列的部分或完全缺失。
在某些实施方式中，本发明提供了一种重组腺病毒，其包含插入到ix-e2插入位点中的第一核苷酸序列和插入到l5-e4插入位点中的第二核苷酸序列。这些实施方式使腺病毒能表达两种或更多种独立的外源转基因。这种方法相对于表达包含由自切割连接子将其连接在一起的两个转基因的融合蛋白的腺病毒具有某些优势，因为切割的连接子可能是潜在免疫原性的。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)包含第一转基因的第一核苷酸序列；(iv)连接子；(v)包含第二转基因的第二核苷酸序列；(vi)第二聚腺苷酸化信号；和(vii)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)包含第一转基因的第一核苷酸序列；(v)连接子；(vi)包含第二转基因的第二核苷酸序列；(vii)第三聚腺苷酸化信号；和(viii)第四聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。
在某些实施方式中，ix-e2插入位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，l5-e4插入位点包含约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130个核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含插入到e1b-19k插入位点、e3插入位点或e4插入位点中的核苷酸序列。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点位于elb-19k的起始位点和elb-55k的起始位点之间。在某些实施方式中，e3插入位点位于腺病毒pviii基因的终止密码子和腺病毒纤维基因(l5)的起始位点之间。在某些实施方式中，e4插入位点位于腺病毒e4基因的orf1的起始密码子到orf6/7的终止密码子之间。
在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含插入到ix-e2插入位点中的第一核苷酸序列和插入到e1b-19k插入位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含插入到ix-e2插入位点中的第一核苷酸序列和插入到e3插入位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含插入到ix-e2插入位点中的第一核苷酸序列和插入到e4插入位点中的第二核苷酸序列。
在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含插入到l5-e4插入位点中的第一核苷酸序列和插入到e1b-19k插入位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含插入到l5-e4插入位点中的第一核苷酸序列和插入到e3插入位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含插入到l5-e4插入位点中的第一核苷酸序列和插入到e4插入位点中的第二核苷酸序列。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含插入到ix-e2插入位点中的第一核苷酸序列和插入到l5-e4插入位点中的第二核苷酸序列以及插入到e1b-19k插入位点、e3插入位点或e4插入位点中的第三核苷酸序列。
腺病毒elb-19k基因主要用作抗凋亡基因，并且是细胞抗凋亡基因bcl2-2的同系物。由于在子代病毒粒子成熟之前宿主细胞死亡将会限制病毒复制，elb-19k作为el盒的一部分表达以防止成熟前细胞死亡，从而允许感染进行和得到成熟病毒体。因此，在某些实施方式中，提供了包含elb-19k插入位点的重组病毒，例如，腺病毒具有插入到elb-19k插入位点中的外源核苷酸序列。在某些实施方式中，插入位点位于elb-19k的起始位点和elb-19k的终止密码子之间。
在某些实施方式中，e1b-19k插入位点在邻近e1b-19k的起始位点处包含约100至约305，约100至约300，约100至约250，约100至约200，约100至约150，约150至约305，约150至约300，约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点在邻近e1b-19k的起始位点处包含约200个核苷酸(例如，202个核苷酸)的缺失。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的核苷酸1714-1917的缺失，或者编码转基因的外源核苷酸序列插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的1714和1917位的核苷酸之间。在某些实施方式中，编码转基因的外源核苷酸序列插入到ctgacctc(seqidno:3)和tcaccagg(seqidno:2)之间，例如，重组腺病毒以5’至3’的方向包含ctgacctc(seqidno:3)、编码转基因的外源核苷酸序列和tcaccagg(seqidno:2)。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点包含对应于ad35基因组(seqidno:41)的核苷酸1611-2153或1611-1915的缺失。
在某些实施方式中，e1b-19k插入位点在邻近e1b-19k的起始位点处包含约100至约305，约100至约300，约100至约250，约100至约200，约100至约150，约150至约305，约150至约300，约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点在邻近e1b-19k的起始位点处包含约200个核苷酸(例如，202个核苷酸)的缺失。在某些实施方式中，e1b-19k插入位点包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的核苷酸1714-1917的缺失，或第一治疗性转基因插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的1714和1917位位的核苷酸之间。在某些实施方式中，第一治疗性转基因插入到ctgacctc(seqidno:3)和tcaccagg(seqidno:2)之间，例如，重组腺病毒以5’至3’的方向包含，ctgacctc(seqidno:3)、第一治疗性转基因和tcaccagg(seqidno:2)。
在某些实施方式中，e3插入位点包含约500至约3185，约500至约3000，约500至约2500，约500至约2000，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约3185，约1000至约3000，约1000至约2500，约1000至约2000，约1000至约1500，约1500至约3185，约1500至约3000，约1500至约2000，约2000至约3185，约2000至约3000，约2000至约2500，约2500至约3185，约2500至约3000或约3000至约3185个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e3插入位点位于e3-10.5k的终止密码子和e3-14.7k的终止密码子之间。在某些实施方式中，e3插入位点在邻近e3-10.5k的终止密码子处包含约500至约1551，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约1551，约1000至约1500或约1500至约1551个核苷酸缺失。在某些实施方式中，e3插入位点在邻近e3-10.5k的终止密码子处包含约1050个核苷酸的缺失，例如，e3插入位点在邻近e3-10.5k的终止密码子处包含1063个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e3插入位点包含对应于ad5dl309e3缺失的缺失。在某些实施方式中，e3插入位点包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的核苷酸29773-30836的缺失，或第二治疗性转基因插入到对应于ad5基因组(seqidno:1)的29773到30836位位的核苷酸之间。在某些实施方式中，e3插入位点包含对应于ad35基因组(seqidno:41)的核苷酸27199-30622的缺失。
在某些实施方式中，e4插入位点包含e4基因的任一个orf，即，位于orf1的起始密码子到orf6/7的终止密码子之间。例如，核苷酸序列可插入到e4orf1和/或e4orf2。在某些实施方式中，可缺失部分或整个e4区域。在某些实施方式中，在任何前述病毒中，重组腺病毒进一步包含e4缺失。在某些实施方式中，e4缺失位于e4-orf6/7的起始位点(即，编码e4-orf6/7的起始密码子的核苷酸序列，例如，对应于seqidno:1的核苷酸34075-34077)到右侧反向末端重复序列(itr；例如，对应于seqidno:1的核苷酸35836-35938)之间。在某些实施方式中，e4缺失位于e4-orf6/7的起始位点和e4-orf1的起始位点(即，编码e4-orf1的起始密码子的核苷酸序列，例如，对应于seqidno:1的核苷酸35524-35526)之间。在某些实施方式中，e4缺失包含位于e4-orf6/7的起始位点和e4-orf1的起始位点之间的核苷酸序列的缺失。在某些实施方式中，e4缺失包含约500至约2500，约500至约2000，约500至约1500，约500至约1000，约1000至约2500，约1000至约2000，约1000至约1500，约1500至约2500，约1500至约2000，或约2000至约2500个核苷酸缺失。在某些实施方式中，e4缺失在邻近e4-orf6/7的起始位点处包含约250至约1500，约250至约1250，约250至约1000，约250至约750，约250至约500，from500至约1500，约500至约1250，约500至约1000，约500至约750，from750至约1500，约750至约1250，约750至约1000，约1000至约1500或约1000至约1250个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e4缺失在邻近e4-orf6/7的起始位点处包含约1450个核苷酸的缺失，例如，e4缺失在邻近e4-orf6/7的起始位点处包含约1449个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e4缺失包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的核苷酸34078-35526或34083-35541的缺失。在某些实施方式中，e4缺失包含对应于ad35基因组(seqidno:41)的核苷酸33004-34422或31827-34415的缺失。
b.修饰的转录控制区域
先前开发的溶瘤性病毒包括在pct公开第wo2010/101921号中被称为tav-255的溶瘤性血清型5腺病毒(ad5)，其在正常细胞中转录减弱，但在癌细胞中转录活性。据信tav-255载体实现这种肿瘤选择定的机理是通过针对转录因子pea3和e2f的三个转录因子(tf)结合位点的靶向缺失，所述转录因子pea3和e2f是调控e1a腺病毒表达的蛋白质，e1a是在病毒进入宿主细胞之后通过结合到特定dna序列而最早转录的基因。这三种pea3和e2f缺失在生长停滞的正常细胞中减弱复制，但在恶性细胞中则否，表明这些dna序列仅可用于癌细胞转录调控和生长。
在某些实施方式中，任何前述重组腺病毒包含修饰的e1a调控序列。在某些实施方式中，重组腺病毒包含具有功能性pea3结合位点的缺失的e1a启动子。例如，病毒可包含对应于e1a起始位点上游约-300至约-250的核苷酸的缺失或对应于e1a起始位点上游-305至-255的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的195-244的核苷酸的缺失，和/或e1a启动子包含序列ggtgttttgg(seqidno:4)。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含可操作地连接至基因的修饰的基于tata框的启动子和/或可操作地连接至基因的修饰的基于caat框的启动子，其中修饰的基于tata框的启动子缺乏功能性tata框并允许基因在过度增殖细胞中的选择性表达，其中修饰的基于caat框的启动子缺乏功能性caat框并允许基因在过度增殖细胞中的选择性表达。
在某些实施方式中，其中修饰的基于tata框的启动子是早期基因启动子。在某些实施方式中，修饰的基于tata框的启动子是e1a启动子，e1b启动子或e4启动子。在某些实施方式中，修饰的基于tata框的启动子是e1a启动子。
在某些实施方式中，修饰的基于tata框的启动子中所包含的修饰包括整个tata框的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含e1a启动子的对应于-27至-24，-31至-24，-44至+54或-146至+54的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的472至475，468至475，455至552，或353至552的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于ad35基因组(seqidno:41)的477至484的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：ctaggactg(seqidno:5)，agtgcccg(seqidno:44)，和/或tattcccg(seqidno:45)。
在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子是早期基因启动子。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子是e1a启动子，e1b启动子或e4启动子。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子是e1a启动子。
在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子中所包含的修饰包括整个caat框的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于e1a启动子的-76至-68的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的423至431的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，重组腺病毒包含导致包含以下序列的病毒的多核苷酸缺失：ttccgtggcg(seqidno:46)。在某些实施方式中，重组腺病毒包含对应于ad35基因组(seqidno:41)的477至484的核苷酸的缺失。
在某些实施方式中，本发明提供了一种表达两种治疗性转基因的方法，当表达时，产生单个多肽链，其在转录后被切割为两个多肽链。在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含如下的核苷酸序列：其包含含有第一转基因的第一核苷酸序列和包含第二转基因的第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过连接子隔开。在某些实施方式中，连接子编码可由一种蛋白酶或多种蛋白酶切割的肽。在某些实施方式中，连接子编码内部核糖体进入位点(ires)。ires可例如选自下组：脑心肌炎病毒ires，手足口病病毒ires，和脊髓灰质炎病毒ires。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到ix-e2插入位点或l5-e4插入位点中，其中重组腺病毒进一步包含插入到e1b-19k插入位点、e3插入位点或e4插入位点中的第三核苷酸序列。
在某些实施方式中，病毒具有对调控序列或启动子的一个或多个修饰。对调控序列或启动子的修饰包含与调控序列或启动子的野生型序列相比的缺失、取代或添加的一个或多个核苷酸。
在一个实施方式中，调控序列或启动子的修饰包括修饰转录因子结合位点的序列以减少对转录因子的亲和力，例如，通过缺失其一部分或者向结合位点中插入单个点突变。在某些实施方式中，额外的修饰调控序列在癌细胞中增强表达，但在正常细胞减表达。
ela调控序列包含针对转录因子pea3的五个结合位点，被称为pea3i、pea3ii、pea3iii、pea3iv和pea3v，其中pea3i是最接近ela起始位点的pea3结合位点，pea3v是最远的。ela调控序列还包含针对转录因子e2f的结合位点，在这里称为e2fi和e2fii，其中e2fi是最接近ela起始位点的e2f结合位点，e2fii是更远的。从ela起始位点，结合位点如下排列：pea3i、e2fi、pea3ii、e2fii、pea3iii、pea3iv和pea3v。
在一个实施方式中，这七个结合位点或功能性结合位点中的至少一个缺失。如本文所用，“功能性结合位点”是指能够结合到相应的结合伴侣(例如，转录因子)的结合位点，例如，具有相应的野生型结合位点序列的结合活性的至少100％，至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，至少50％，或至少40％的结合位点。如本文所用，“非功能性结合位点”是指具有例如相应的野生型结合位点序列的结合活性的少于30％，少于20％，少于10％，或0％的结合位点。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含具有功能性pea3结合位点的缺失的e1a启动子，例如，缺失整个pea3结合位点。如本文所用，“功能性pea3结合位点”是指能够结合到其相应的转录因子(例如，pea3)的pea3结合位点，例如，具有相应的野生型pea3结合位点序列的pea3结合活性的至少100％，至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，至少50％，或至少40％的pea3结合位点。如本文所用，“非功能性pea3结合位点”是指具有相应的野生型pea3结合位点序列的pea3结合活性的例如少于30％，少于20％，少于10％，或0％的pea3结合位点。测定pea3结合位点是否结合到pea3的检测方法在本领域中已知。示例性的结合检测方法包括电泳迁移率变动分析，染色质免疫共沉淀分析，和dna酶足迹分析。
在一个实施方式中，缺失了至少一个pea3结合位点或功能性pea3结合位点。缺失的pea3结合位点可以是pea3i，pea3ii，pea3iii，pea3iv，和/或pea3v。在一个实施方式中，缺失的pea3结合位点是pea3ii，pea3iii，pea3iv，和/或pea3v。在另一实施方式中，缺失的pea3结合位点是pea3iv和/或pea3v。在另一实施方式中，缺失的pea3结合位点是pea3ii和/或pea3iii。在另一实施方式中，缺失的pea3结合位点是pea3ii和pea3iii。在另一实施方式中，pea3i结合位点或功能性pea3i结合位点被保留。
在一个实施方式中，缺失了至少一个e2f结合位点或功能性e2f结合位点。在另一实施方式中，至少一个e2f结合位点或功能性e2f结合位点被保留。在一个实施方式中，保留的e2f结合位点是e2fi和/或e2fii。在另一实施方式中，保留的e2f结合位点是e2fii。在另一实施方式中，总缺失基本由pea3ii，pea3iii，pea3iv，和/或pea3v中的一个或多个组成。在一个实施方式中，病毒具有位于e1a起始位点上游-305至-255的50个碱基对区域的缺失，例如，对应于ad5基因组(seqidno:1)的195-244，在下文中称为tav-255缺失。在某些实施方式中，tav-255缺失导致包含序列ggtgttttgg(seqidno:4)的启动子。
在一个实施方式中，重组腺病毒具有与溶瘤性血清型5腺病毒(ad5)中相同或相似的e1a修饰，其在pct公开第wo2010101921号和美国公开第20160017294a1号中被称为tav-255，上述每篇文献通过引用以其整体并入本文。据信tav-255载体实现这种肿瘤选择定的机理是通过针对转录因子pea3和e2f的三个转录因子(tf)结合位点的靶向缺失，所述转录因子pea3和e2f是调控e1a腺病毒表达的蛋白质，e1a是在病毒进入宿主细胞之后通过结合到特定dna序列而最早转录的基因。这三种pea3和e2f缺失在生长停滞的正常细胞中减弱复制，但在恶性细胞中则否，表明这些dna序列仅可用于癌细胞转录调控和生长。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含具有一个或多个功能性pea3结合位点缺失的e1a启动子。在某些实施方式中，缺失包含对应于e1a起始位点上游约-300至约-250的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，其中缺失包含对应于e1a起始位点上游-305至-255的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的195-244的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，e1a启动子包含序列ggtgttttgg(seqidno:4)。
在一个实施方式中，重组腺病毒包含一个或多个pea3转录结合位点缺失，但没有e1a区域中的一个或多个e2f转录结合位点缺失。在其它实施方式中，重组腺病毒包含一个或多个e2f转录结合位点缺失，但没有e1a区域中的一个或多个pea3转录结合位点缺失。
在某些实施方式中，重组溶瘤性腺病毒包含可操作地连接至基因的修饰的基于tata框的启动子，其中修饰的基于tata框的启动子缺乏功能性tata框并允许基因在过度增殖和/或非生长停滞细胞中的选择性表达。如本文所用，“功能性tata框”是指能够结合到tata框结合蛋白(tbp)的tata框，例如，具有相应的野生型tata框序列的tbp结合活性的至少100％，至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，至少50％，或至少40％的tata框。如本文所用，“非功能性tata框”是指例如具有相应的野生型tata框序列的tbp结合活性的少于30％，少于20％，少于10％，或0％的tata框。用于检测tbp是否结合到tata框的检测方法在本领域中已知。示例性的结合检测方法包括电泳迁移率变动分析，染色体免疫共沉淀分析和dna酶足迹分析。
如本文所用，“修饰的tata框”是指相对于野生型tata框序列具有缺失、取代或添加的一个或多个核苷酸的tata框。
例如，病毒可包含对应于e1a起始位点上游-29至-26，-33至-26，-44至+52或-148至+52的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，缺失包含对应于ad5基因组(seqidno:1)的353-552的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，tata框缺失导致包含如下序列的e1a启动子：ctaggactg(seqidno:5)，agtgcccg(seqidno:44)，和/或tattcccg(seqidno:45)。
在某些实施方式中，重组溶瘤性腺病毒包含可操作地连接至基因的修饰的基于caat框的启动子，其中修饰的基于caat框的启动子缺乏功能性caat框并允许基因在过度增殖和/或非生长停滞细胞中的选择性表达。基于tata框的启动子和基于caat框的启动子可为相同启动子(例如，ad5e1a启动子)或可为不同启动子。
如本文所用，“caat框”是指能够结合到c/ebp或nf-y蛋白的核苷酸序列。caat框通常包含共有序列gg(t/c)caatct。
如本文所用，“修饰的caat框”是指相对于野生型caat框序列具有缺失、取代或添加的一个或多个核苷酸的caat框。
如本文所用，“功能性caat框”是指能够结合到c/ebp或nf-y蛋白的caat框，例如，具有相应的野生型caat框序列的c/ebp或nf-y结合活性的至少100％，至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，至少50％，或至少40％的caat框。如本文所用，“非功能性caat框”是指例如具有相应的野生型caat框序列的c/ebp或nf-y结合活性的少于30％，少于20％，少于10％，或0％的caat框。用于检测c/ebp或nf-y蛋白是否结合到caat框的尖峰方法在本领域中已知。示例性的结合检测方法包括电泳迁移率变动分析，染色体免疫共沉淀分析和dna酶足迹分析。
如本文所用，“基于caat框的启动子”是指包含的caat框任何基因启动子。
如本文所用，“修饰的基于caat框的启动子”是指相对于野生型的基于caat框的启动子通过缺失、取代或添加一个或多个核苷酸来修饰的基于caat框的启动子。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子中所包含的修饰包括野生型的基于caat框的启动子序列的一个或多个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子中所包含的修饰由野生型的基于caat框的启动子序列的一个或多个核苷酸的缺失组成。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子中所包含的修饰包括野生型的基于caat框的启动子序列整个caat框的缺失。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子中所包含的修饰由野生型的基于caat框的启动子序列的整个caat框的缺失组成。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子中所包含的修饰包括整个基于caat框的启动子的缺失。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子中所包含的修饰由整个基于caat框的启动子的缺失组成。在某些实施方式中，修饰的基于caat框的启动子中所包含的修饰不包含添加单独的功能性启动子序列或用其取代。
编码病毒基因的核酸可通过常规转染或转化技术加入到质粒中和引入宿主细胞中。具体的生产和纯化条件将取决于所采用的病毒和生产系统而不同。对于腺病毒，产生病毒粒子的传统方法是共转染，然后是后续的穿梭质粒(通常包含腺病毒基因组的一小部分，并任选地包含潜在的转基因表达盒)与腺病毒辅助质粒(包含整个腺病毒基因组的大部分)的体内重组。另一种生产腺病毒的技术包括利用细菌人工染色体(bac)系统，利用包含互补腺病毒序列的两个质粒在reca+细菌菌株中进行体内细菌重组，以及酵母人工染色体系统(yac)系统.
在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒是溶瘤性病毒，例如，显示肿瘤选择性复制和/或病毒介导的溶解的病毒。在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒显示了治疗性转基因在过度增殖细胞(例如，癌细胞、肿瘤细胞)中相对于非过度增殖细胞的选择性表达。在某些实施方式中，治疗性转基因在非过度增殖细胞中的表达为基因在过度增殖细胞中的表达的约90％，约80％，约70％，约60％，约50％，约40％，约30％，约20％，约10％，或约5％。在某些实施方式中，病毒显示治疗性转基因在非过度增殖细胞中没有可检测的表达。治疗性转基因表达可通过本领域已知的任何合适方法测定，例如，我们sternblot或elisa。过度增殖细胞可为癌细胞，例如，癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、肺癌、胃肠道癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、甲状腺癌、间皮瘤、肝癌、肾癌、皮肤癌、头颈部癌或脑癌细胞。
c.转基因
本文所公开的重组腺病毒包括插入到任何前述插入位点(例如，ix-e2插入位点、l5-e4插入位点、e1b-19k插入位点、e3插入位点中或e4插入位点)中的一个或多个外源核苷酸序列。
在某些实施方式中，核苷酸序列包含至少一个转基因。在某些实施方式中，核苷酸序列进一步包含启动子，其中转基因可操作地连接到启动子。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)转基因；(iv)第二聚腺苷酸化信号；和(v)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列被插入到第一聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到l5-e4插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是l5转录单元的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是e4转录单元的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到ix-e2插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是ix转录单元的聚腺苷酸化信号，第二聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第三聚腺苷酸化信号是腺病毒iva2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，重组腺病毒以5’至3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)转基因；(v)第三聚腺苷酸化信号；和(vi)第四聚腺苷酸化信号和转基因可操作地连接到启动子。在一些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列被插入到第一聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号之间。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到l5-e4插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是l5转录单元的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是e4转录单元的聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，核苷酸序列插入到ix-e2插入位点中，并且第一聚腺苷酸化信号是ix转录单元的聚腺苷酸化信号，第三聚腺苷酸化信号是转基因的聚腺苷酸化信号，并且第四聚腺苷酸化信号是腺病毒iva2基因的聚腺苷酸化信号。
在某些实施方式中，重组腺病毒进一步包含核苷酸序列包含含有第一转基因的第一核苷酸序列和包含第二转基因的第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过连接子隔开。
在某些实施方式中，核苷酸序列以5’到3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)启动子；(iii)包含第一转基因的第一核苷酸序列；(iv)连接子；(v)包含第二转基因的第二核苷酸序列；(vi)第二聚腺苷酸化信号；和(vii)第三聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，核苷酸序列以5’到3’的方向包含：(i)第一聚腺苷酸化信号；(ii)第二聚腺苷酸化信号；(iii)启动子；(iv)包含第一转基因的第一核苷酸序列；(v)连接子；(vi)包含第二转基因的第二核苷酸序列；(vii)第三聚腺苷酸化信号；和(viii)第四聚腺苷酸化信号；其中转基因可操作地连接到启动子。在某些实施方式中，其中第二聚腺苷酸化信号在第一聚腺苷酸化信号的相反转录方向。在某些实施方式中，其中第四聚腺苷酸化信号在第三聚腺苷酸化信号的相反转录方向。
在某些实施方式中，连接子编码可由一种蛋白酶或多种蛋白酶切割的肽。在某些实施方式中，连接子编码内部核糖体进入位点(ires)或自切割2a肽。ires可例如选自下组：脑心肌炎病毒ires，手足口病病毒ires和脊髓灰质炎病毒ires。在某些实施方式中，其中核苷酸序列被插入到ix-e2插入位点或l5-e4插入位点中，其中重组腺病毒进一步包含插入到e1b-19k插入位点、e3插入位点或e4插入位点中的第三核苷酸序列。
在某些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列中的一个或多个包含一个或多个转基因。
在某些实施方式中，核苷酸序列、第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列中的一个或多个包含：
a)转录起始区；
b)包含转基因的核苷酸序列，其中转基因在转录起始区的转录控制下；和
c)转录种植区。
在一些实施方式中，转录起始区包含启动子。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码单体，二聚，三聚，四聚或多聚蛋白质或其部分。在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码具有治疗活性的rna。在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码包含至少一个结合结构域的融合蛋白。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码免疫调节分子。在某些实施方式中，免疫调节分子是共刺激配体，细胞因子或细胞因子受体在某些实施方式中，免疫调节分子选自下组：il-1，il-2，il-3，il-4，il-5，il-6，il-7，il-8，il-9，il-7，il-10，il-10trap，il-10r，il-12a/p35，il-12b/p40，il-15，il-23a/p19，il-24，il-27，il-33，il-35，il-15，il-15受体融合蛋白，tgf-β，tgf-βtrap，il-10trap，vegf，vegftrap，吲哚胺-2,3-二氧合酶(ido)，诱导型t细胞共刺激配体(icos-l)，cd80，cd137l，tnf-α，ifn-α，ifn-β，ifn-γ，gm-csf，gitr配体(gitrl)，ox40配体(ox40l)，cd40配体(cd40l)/cd154，cd70，cd86，cd137，cd137l，boris/ctcfl，骨形态发生蛋白(bmp)，tnfsf9，fgf，icam，足糖萼蛋白，其功能片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因编码以n-末端到c-末端的方向包含以下部分的融合蛋白：细胞因子受体胞外结构域的可溶部分；氨基酸连接子；免疫球蛋白(ig)铰链区；和免疫球蛋白(ig)fc结构域。在一些实施方式中，细胞因子受体是tgfβii型(tβrii)受体。
在某些实施方式中，编码cd80或其功能性片段的核苷酸序列被插入到ix-e2插入位点中，和编码cd137l或其功能性片段的核苷酸序列被插入到l5-e4插入位点。在某些实施方式中，编码cd137l或其功能性片段的核苷酸序列被插入到ix-e2插入位点中，编码cd80或其功能性片段的核苷酸序列被插入到l5-e4插入位点中。
在某些实施方式中，重组腺病毒包含编码il-12a/p35或其功能性片段的核苷酸序列、编码il-12b/p40或其功能性片段的核苷酸序列和编码ifn-α或其功能性片段的核苷酸序列。这些核苷酸序列可被插入到ix-e2插入位点、l5-e4插入位点、e1b-19k插入位点、e3插入位点和/或e4插入位点中。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和/或第二转基因中的一个或多个编码抗原结合分子。在某些实施方式中，抗原结合分子是抗pd-1抗体、抗tgf-β抗体、抗pd-l1抗体和抗ctla-4抗体或其功能片段。示例性的抗pd-1抗体包括纳武单抗(bristol-myerssquibbco.)，派姆单抗(
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码抗原或该抗原的配体。在某些实施方式中，抗原选自下组：caix，cea，cd5，cd7，cd10，cd19，cd20，cd22，cd30，cd33，cd34，cd38，cd41，cd44，cd49f，cd56，cd74，cd80，cd133，cd135(flt3)，flt3i，cd138，巨细胞病毒(cmv)感染细胞抗原，4-1bb，egp-2，egp-40，epcam，erbb2，erbb3，erbb4，fbp，胎儿乙酰胆碱受体，kras，hpve6，e7，bing-4，epha3，钙激活氯离子通道-2，细胞周期蛋白b1，9d7，sap-1，prame，ssx-2，不成熟层粘连蛋白受体，叶酸受体-a，端粒酶，酪氨酸酶，黑色素-a，ny-eso-1，gd2，gd3，htert，il13r-a2，x-轻链，kdr，ley，li细胞粘附分子，mage-a1，mage-a3，mart1，mart2，muc1，间皮素，her-2/neu，egfrviii，nkg2d配体，ny-es0-1，gp100，trp-1/-2，trp-1/-2，p多肽，mc1r，前列腺特异性抗原，braf，雄激素受体，β-连环蛋白，brca1/2，cdk4，cml66，纤连蛋白，p53，tgf-βrii，t细胞受体，癌胚抗原，5t4，psca，psma，ror1，tag-72，vegf-r2，wt-1，其功能片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码毒素。在某些实施方式中，毒素是假单胞菌外毒素，蓖麻毒素或白喉毒素。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码酶。在某些实施方式中，酶选自下组：β-葡糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶，羧肽酶，β-内酰胺酶，酯酶，金属蛋白酶，松弛素，胶原酶，链激酶，精氨酸酶，nos-2，其片段，及其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码细胞周期控制剂，生长因子，抗凝剂，前药激活基因，肿瘤抑制基因，凋亡基因，抗血小板剂，凝血因子，囊性纤维化跨膜传导调节(cftr)蛋白质，其片段，或其衍生物。
在某些实施方式中，转基因、第一转基因和第二转基因中的一个或多个编码血管抑素，内皮抑素，乙酰胆碱，dkk1/wnt，ox40l，gitrl，分泌鞭毛蛋白，胸苷激酶，其功能片段，或其衍生物。
ii.治疗方法
在另一方面，本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞暴露于有效量的任何前述重组腺病毒以抑制肿瘤细胞的增殖。
在另一方面，本发明提供了一种抑制需要其的受试者的肿瘤生长的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒以抑制肿瘤生长。在一些实施方式中，肿瘤是her2/neu阳性的肿瘤，并且其中重组腺病毒包含具有不多于一个功能性pea3结合位点缺失的e1a启动子。在一些实施方式中，her2/neu阳性的肿瘤选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌或非小细胞肺癌(nsclc)。
在某些实施方式中，肿瘤选自下组：黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肛门肿瘤、宫颈癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺肿瘤、肾细胞癌、前列腺肿瘤、胃食管肿瘤、结直肠肿瘤、睾丸肿瘤、膀胱肿瘤、卵巢肿瘤、肝细胞癌、胆管癌、脑肿瘤、子宫内膜肿瘤、神经内分泌肿瘤、默克细胞癌、胃肠道间质瘤、肉瘤和胰腺肿瘤。
本文公开的重组腺病毒可用于治疗多种医学适应症，例如，癌症。如本文所用，“治疗(treat、treating和treatment)”表示受试者(例如，人)的疾病的治疗。这包括：(a)抑制疾病，即，停滞其发展；和(b)缓解疾病，即，引起疾病状态的逆转。如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指通过本文所述方法和组合物治疗的生物体。这样的生物体优选包括但不限于：哺乳动物(例如，鼠、猿猴、马、牛、猪、犬、猫等)，更优选包括人。
在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的过度增殖疾病的方法。所述方法包括对受试者施用有效量的本文所述的重组病毒以治疗受试者的过度增殖疾病。受试者在某些实施方式中，过度增殖疾病选自下组：癌症、动脉硬化、类风湿性关节炎、银屑病、狼疮、特发性肺纤维化、硬皮病和硬化症。在某些实施方式中，过度增殖疾病是癌症。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法。所述方法包括对受试者施用有效量的本文所述的重组腺病毒以治疗受试者的癌症。
癌症的实例包括实体肿瘤、软组织肿瘤、造血系统肿瘤和转移病变。造血系统肿瘤的实例包括：白血病，急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(all)，b-细胞、t-细胞或faball，急性髓细胞性白血病(aml)，慢性髓性白血病(cml)，慢性淋巴细胞性白血病(cll)，例如，转化型cll，弥漫型大b-细胞淋巴瘤(dlbcl)，滤泡性淋巴瘤，毛细胞白血病，骨髓增生异常综合征(mds)，淋巴瘤，霍奇金氏病，恶性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，多发性骨髓瘤，或richter’s综合征(richter’s转化)。实体肿瘤的实例包括恶性肿瘤，例如，肉瘤，腺癌，以及多种器官系统的癌症，诸如影响头颈部(包括咽部)，甲状腺，非(小细胞或非小细胞肺癌(nsclc))，乳腺，淋巴，胃肠道(例如，口、食管、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)，生殖器和泌尿生殖道(例如，肾，尿道上皮，膀胱，卵巢，子宫，宫颈，子宫内膜，前列腺，睾丸)，cns(例如，神经或神经胶质细胞，例如，成神经细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如，黑素瘤)的那些癌症。
在某些实施方式中，癌症选自黑素瘤，皮肤鳞状细胞癌，基底细胞癌，头颈部癌，乳腺癌，肛门肿瘤，宫颈癌，非小细胞肺癌，间皮瘤，小细胞肺癌，肾细胞癌，前列腺癌，胃食管癌，结直肠癌，睾丸癌，膀胱癌，卵巢癌，肝细胞癌，胆管癌，脑癌，子宫内膜癌，神经内分泌癌和胰腺癌.
在某些实施方式中，癌症选自鼻炎癌，基底细胞癌，滑膜癌，肝细胞癌，肾癌，结缔组织癌，黑素瘤，肺癌，肠癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，脑癌，喉癌，口腔癌，肝癌，骨癌，胰腺癌，绒毛癌，胃泌素瘤，神经内分泌瘤，嗜铬细胞瘤，泌乳素瘤，t-细胞白血病/淋巴瘤，神经瘤，希佩尔-林道病，佐林格-埃利森综合征，肾上腺癌，肛门肿瘤，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，脑癌，少突神经胶质瘤，成神经细胞瘤，脑膜瘤，几岁肿瘤，骨癌，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，未知原发未知的癌症，良性肿瘤，胃肠道良性肿瘤，纤维肉瘤，乳腺癌，佩吉特氏病，宫颈癌，结直肠癌，直肠癌，食道癌癌，胆囊癌，头部肿瘤，咽部肿瘤，颈部肿瘤，肾癌，威尔姆氏瘤，肝癌，卡波济氏肉瘤，前列腺癌，肺癌，睾丸癌，霍奇金氏病，非霍奇金氏淋巴瘤，口腔癌，皮肤癌，间皮瘤，多发性骨髓瘤，卵巢癌，内分泌胰腺癌，胰高血糖素瘤，胰腺癌，副甲状腺癌，阴茎癌，脑垂体肿瘤，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，甲状腺癌，滋养层癌，葡萄胎，子宫癌，子宫内膜癌，阴道癌，外阴癌，听神经瘤，蕈样肉芽肿，胰岛瘤，类癌瘤综合征，生长抑素瘤，牙龈癌，心脏癌，唇癌，脑膜癌，口癌，神经癌，颚癌，腮腺癌，腹膜癌，舌咽癌，胸膜癌，唾液腺癌，舌癌和扁桃体癌。
在一些方面，本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞暴露于有效量的任何前述重组腺病毒。
在另一方面，本发明提供了一种抑制需要其的受试者的肿瘤生长的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒。在某些实施方式中，肿瘤选自下组：黑素瘤，皮肤鳞状细胞癌，基底细胞癌，头颈部肿瘤，乳腺肿瘤，肛门肿瘤，宫颈癌，非小细胞肺癌，间皮瘤，小细胞肺肿瘤，肾细胞癌，前列腺肿瘤，胃食管肿瘤，结直肠肿瘤，睾丸肿瘤，膀胱肿瘤，卵巢肿瘤，肝细胞癌，胆管癌，脑肿瘤，子宫内膜肿瘤，神经内分泌肿瘤，默克细胞癌，胃肠道间质瘤，肉瘤，和胰腺肿瘤。
在另一方面，本发明提供了一种治疗需要其的受试者的疾病或病症的方法，其中所述方法包括对受试者施用有效量的任何前述重组腺病毒在某些实施方式中，疾病或病症选自下组：感染，糖尿病性视网膜病，银屑病，类风湿性关节炎，子宫内膜异位症，黄斑变性病症和良性生长障碍，诸如前列腺肥大和脂肪瘤，血管病，心血管病，感染，肝硬化，结缔组织病，肿瘤，血管病变，溃疡病变，炎症，血栓形成，和新生内膜形成。
在某些实施方式中，受试者是哺乳动物。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，受试者是儿童。在某些实施方式中，受试者是成人.
在某些实施方式中，重组腺病毒通过肌内、静脉内、动脉内或瘤内注射施用。在某些实施方式中，重组腺病毒通过皮内、吸入、透皮、局部、滴眼、鼻内、透粘膜和直肠施用来施用。
在某些实施方式中，前述重组腺病毒与选自下组的一种或多种治疗组合施用给受试者：手术，放疗，化疗，免疫疗法，激素疗法和病毒疗法。
在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒与酪氨酸激酶抑制剂(例如，埃罗替尼)组合施用。
在某些实施方式中，本发明的重组腺病毒与一种或多种检查点调节剂组合施用。在某些实施方式中，免疫检查点调节剂是选自下组的一种或多种分子的抑制剂、拮抗剂或激动剂：pd-1，pd-l1，pd-l2，2b4，tigit，lag3，tim3，btla，cd160，gitr，kir，4-1bb，和ctla4。在一些实施方式中，免疫检查点调节剂是以下的抗体：pd-1，pd-l1，pd-l2，2b4，tigit，lag3，tim3，btla，cd160，gitr，kir，4-1bb，和/或ctla4。示例性的抗pd-1抗体包括纳武单抗(bristol-myerssquibbco.)，派姆单抗(
药物制剂优选地为无菌的。可通过任何合适的方法实施灭菌，流入，通过无菌过滤膜过滤。当组合物被冻干时，可在冻干和复液之前或之后进行过滤灭菌。
如本文所用，术语“有效量”是指足以引起有益或理想结果的活性组分的量(例如，本发明的重组病毒的量)。有效量可在一次或多次施用、应用或剂量中施用，而且并非意图限制于特定制剂或施用途径。
在某些实施方式中，活性组分的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg范围内，例如，1mg/kg至100mg/kg，1mg/kg至10mg/kg。在某些实施方式中，重组病毒的治疗有效量在如下范围内：102-1015空斑形成单位(pfus)，例如，102-1010，102-105，105-1015，105-1010或1010-1015空斑形成单位。施用量将取决于诸如以下的变量：要被治疗的疾病或适应症的类型和程度，患者的总体健康，抗体的体内效力，药物制剂，以及施用途径。初始剂量可被增加到上限水平之外以迅速达到所需的血液水平或组织水平。可替代地，初始剂量可以小于最佳剂量，并且在治疗过程中每日剂量可逐渐增加。可对人的剂量进行优化，例如在设计为从0.5mg/kg进行到20mg/kg的常规i期剂量递增研究中。给药频率可根据以下因素而不同：诸如施用途径、剂量、病毒的血清半衰期和要被治疗的疾病。示例性的给药频率是每日1次，每周1次，和每两周1次。一种施用途径是肠胃外，例如，静脉输注。基于病毒的药物的配制在本领域一般技术范围内。在某些实施方式中，重组病毒被冻干，并且随后在施用时在缓冲盐水中复液。
如本文所用，术语“组合”施用被理解为表示在受试者患病过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，使得对患者的治疗效果在某个时间点上重叠。在某些实施方式中，当第二种治疗的递送开始时，第一种治疗的递送仍在发生，以使得在施用上存在重叠。这在本文中有时称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方式中，由于组合给药，治疗更有效。例如，与如果在不存在第一种治疗的情况下施用第二种治疗所看到的相比，或者与使用第一种治疗所看到的类似情况相比，第二种治疗更有效，例如，使用更少的第二种治疗可看到相同的效果，或者第二种治疗更大程度地减少症状。在某些实施方式中，递送使得与递送一种治疗而不存在另一种的情况下所看到的相比更多地减少了症状或与病症相关的其他参数。两种治疗的效果可部分加成、完全加成或大于加成。递送可使得所递送的第一种治疗的作用在递送第二种时仍然可检测到。
iii.药物组合物/制剂
本公开还提供了一种药物组合物，其包含任何前述重组腺病毒和至少一种可药用载体或稀释剂。如本文所用，“可药用载体”表示与合理的利益/风险比相称的适合用于接触人和动物的组织而没有过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或适应症的缓冲剂、载体和赋形剂。载体在与制剂的其他成分相容的意义上应当是“可接受的”，并且对接受者无害。可药用载体包括于药物施用相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和延迟吸收剂等。.
包含本文公开的重组腺病毒的药物组合物和制剂可被配制为与其意图施用的途径相容。施用途径的实例是肌内、静脉内、动脉内或瘤内、皮内、吸入、透皮、局部、透粘膜和直肠施用。
在一个方面，本公开提供了用于稳定和存储重组腺病毒的腺病毒制剂。在一些实施方式中，本发明提供了一种用于腺病毒的制剂，其包含：
一种或多种任何前述重组腺病毒；
至少一种缓冲剂；
至少一种张力修饰剂；
至少一种糖或至少一种稳定剂或二者；和
其中制剂的ph在约7.0至约9.0之间。
在某些实施方式中，稳定剂是甘油。在某些实施方式中，稳定剂是约2％至约5％(v/v)。
在某些实施方式中，缓冲剂是tris(包括tris-hcl和/或单-tris)、tes、hepes、四水合番木鳖碱、epps、三甲基甘氨酸或组氨酸。在某些实施方式中，缓冲剂的浓度为约1mm至约30mm。
在一些实施方式中，张力修饰剂是mgcl2、mncl2、cacl2、zncl2、nacl或kcl。在一个实施方式中，张力修饰剂是nacl。在一个实施方式中，张力修饰剂的浓度为约0.1mm至约5mm。在一个实施方式中，张力修饰剂的浓度为约10mm至约250mm。在一个实施方式中，张力修饰剂的浓度为约25mm至约100mm。在一个实施方式中，张力修饰剂的浓度为约25mm。
在某些实施方式中，制剂包含第一张力修饰剂和第二张力修饰剂，其中第一张力修饰剂是一价阳离子，和其中第二张力修饰剂是二价阳离子。在某些实施方式中，一价阳离子是nacl或kcl。在某些实施方式中，二价阳离子是mgcl2、mncl2、cacl2或zncl2。在某些实施方式中，张力修饰剂或二价阳离子的浓度为约0.1mm至约5mm。
在一些实施方式中，糖是蔗糖或海藻糖。在一个实施方式中，糖是蔗糖。在一个实施方式中，糖的重量比体积百分比为约2％至约8％。在一个实施方式中，糖的重量比体积百分比为约3％至约5％。在一个实施方式中，糖的重量比体积百分比为约5％。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个非离子表面活性剂。在某些实施方式中，非离子表面活性剂是聚山梨糖醇-80或聚山梨糖醇-40。在一个实施方式中，非离子表面活性剂的浓度为约0.001％至约1％。在一个实施方式中，非离子表面活性剂的浓度为约0.02％。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个自由基氧化抑制剂。在某些实施方式中，自由基氧化抑制剂是edta。在一个实施方式中，自由基氧化抑制剂的浓度为约0.01mm至约5mm。在一个实施方式中，自由基氧化抑制剂的浓度为约0.05mm至约2mm。在一个实施方式中，自由基氧化抑制剂的浓度为约0.1mm。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个冷冻保护剂。在某些实施方式中，冷冻保护剂是etoh。在一些实施方式中，冷冻保护剂的浓度是约0.01％至5％。在一些实施方式中，冷冻保护剂的浓度是约0.1％至2％。在一个实施方式中，冷冻保护剂的浓度为约0.5％。
在一些实施方式中，制剂的摩尔渗透压浓度为约200mos/l至约800mos/l。在一些实施方式中，制剂的摩尔渗透压浓度为约300mos/l至约600mos/l。在一些实施方式中，制剂的摩尔渗透压浓度为约400mos/l至约500mos/l。
在某些实施方式中，重组溶瘤性腺病毒在任何前述制剂的浓度为约1x107vp/ml至1x1013vp/ml。
在某些实施方式中，制剂包含约20mmtris、约25mmnacl、约2.5％甘油，并且其中制剂的ph为约8.0。在某些实施方式中，制剂包含约20mmtris、约25mmnacl、约3-5％蔗糖，并且其中制剂的ph为约8.0。在某些实施方式中，制剂包含约10mmtris、约75mmnacl、约5％蔗糖、约0.02％聚山梨糖醇-80、约1mmmgcl2、约0.1mmedta、约0.5％etoh，并且其中制剂的ph为约8.0。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个免疫佐剂。在某些实施方式中，免疫佐剂选自：1)明矾，2)皂苷，3)非离子聚合物表面活性剂s，4)单磷酰脂质a，5)胞壁酰二肽，和6)细胞因子。
在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一种染料。在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含至少一个可逆型蛋白酶抑制剂。在某些实施方式中，可逆型蛋白酶抑制剂是l3/p23半胱氨酸蛋白酶的抑制剂。在某些实施方式中，任何前述制剂进一步包含抗氧化剂。在某些实施方式中，抗氧化剂是维生素a、维生素c、维生素e、维生素b6、维生素b12、叶酸(folicacid)或叶酸盐(folate)。
应理解除非从上下文和使用另有理解，表达“至少一个”独立地包含在该表达之后阐述的客体中的每一个以及所述客体中两个或多个的各种组合。除非从上下文中另有理解，与三个或更多个客体相关联的表达“和/或”应理解为具有相同含义。
除非从上下文中另有理解，使用术语“包含(include,includes,including)”、“具有(has,having)”或“含有(contain,contains,containing)”，包括其语法上的等同形式，通常应被理解为开放式和非限制式的，例如，不排除其他未述及的元件或步骤。
除非另有说明，否则在定量值之前使用术语“约”时，本发明还包含该特定定量值本身。如本文所用，除非另有说明或推断，术语“约”是指与标称值相差±10％。
应理解，只要本发明保持可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序就无关紧要。而且，两个或多个步骤或动作可同时进行。
在本文中使用任何和所有实例或示例性的语言，例如，“诸如”或“包括”仅旨在更好地说明本发明，并且除非要求，其不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何非要求保护的要素对于实施本发明必不可少。
实施例
以下工作实施例是说明性的，并且并非旨在限制，本领域技术人员将会容易理解可实施其他实施方式。
实施例1
示例性的ix-e2插入位点的核苷酸序列(根据ncbi参考序列ac_000008.1(seqidno:1)的核苷酸4029至4093编号)如下。腺病毒ix基因的终止密码子(左侧的“taa”；seqidno:8)和腺病毒iva2基因的终止密码子(右侧的“tta”；seqidno:9)以下划线示出。
taaaacataaataaaaaaccagactctgtttggatttggatcaagcaagtgtcttgctgtcttta(seqidno:6)
实施例2
示例性的l5-e4插入位点的核苷酸序列(根据ncbi参考序列ac_000008.1(seqidno:1)的核苷酸32785到32916编号)如下。腺病毒纤维基因的终止密码子(左侧的“taa”；seqidno:8)和腺病毒e4基因的orf6/7的终止密码子(右侧的“tca”；seqidno:10)以下划线示出。
taaagaatcgtttgtgttatgtttcaacgtgtttatttttcaattgcagaaaatttcaagtcatttttcattcagtagtatagccccaccaccacatagcttatacagatcaccgtaccttaatcaaactca(seqidno:7)
实施例3
为产生带有克隆到l5-e4位点中的表达盒中的转基因的病毒，通过向l5-e4位点插入带有sv40启动子和具有插入的swai限制性内切位点(“atttaaat”seqidno:11)的终止子的表达盒来修饰带有腺病毒核苷酸序列(其包含ridα、ridβ和e3区域中14.7k基因和e4区域中orf1-orf4基因的缺失)的质粒。该修饰的核苷酸序列从l5转录单元的聚腺苷酸化信号(“aataaa”seqidno:12)到e4转录单元的聚腺苷酸化信号(“tttatt”seqidno:13)为：
seqidno:14[l5初始空]
aataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctttgcaaagatttaaataacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggtgtttatt
在seqidno:14中，l5和e4转录单元的聚腺苷酸化信号和swai限制性内切位点的核苷酸以下划线示出。
随后将编码小鼠gmcsf的转基因克隆到swai位点，产生以下序列：
seqidno:15[l5初始mgmcsf]
在seqidno:15中，l5和e4转录单元的聚腺苷酸化信号和swai限制性内切位点的残余核苷酸以下划线示出，编码小鼠gmcsf的转基因以粗体示出。
产生带有以下修饰的病毒tav-(l5-e4)mgmcsf(相比于腺病毒5型的dl309病毒株)：ela启动子的tav-255缺失以提供癌细胞中的选择性复制，病毒e1b-19k基因5’端的缺失(其不会延伸到病毒e1b-55k基因中)，e3ridα、ridβ和14.7k基因的缺失(seqidno:15序列)和e4orf1-orf4基因的缺失。
为检测mgmcsf表达：a549细胞(人癌细胞系)、ads-12细胞(小鼠癌细胞系)和wi38细胞(人正常细胞系)用tav-(l5-e4)mgmcsf在moi(感染复数)为5的情况下感染。作为对照，将另外的细胞在不感染的情况下培养或用病毒tav-(e1b-19k)mgmcsf感染，所述病毒tav-(e1b-19k)mgmcsf相比于腺病毒5型的dl309病毒株带有以下修饰：ela启动子的tav-255缺失和复制e1b-19k基因的5’端而不破坏e1b-55k基因的mgmcsf基因。在感染后4天，在elisa中使用条件培养基以测量小鼠gmcsf表达。结果在图2中显示：两种病毒均在a549细胞给出高水平表达，在ads-12细胞中给出中等水平表达，在wi38细胞中低水平表达。
实施例4
为研究ix-e2位点处的表达盒插入，最初，我们插入了带有巨细胞病毒立即早期启动子(cmv启动子)和牛生长激素转录终止子(bgh终止子)的表达盒，该表达盒在启动子和终止子之间包含noti限制性内切位点(“gcggccgc”seqidno:16)以有利于转基因的插入。其从ix聚腺苷酸化信号(“aataaa”seqidno:12)到e2转录单元的聚腺苷酸化信号(“tttatt”seqidno:13)的核苷酸序列为：
seqidno:17[ix初始空]
aataaaaaaccagactctgtttggatttggatcaagcaagtgtcttgctgtcttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccgcggccgcctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggtttatt
ix和e2转录物的聚腺苷酸化信号和noti限制性内切位点以下划线示出。
病毒tavix-wtl5-空携带ela启动子的tav-255缺失、ix-e2位点中的野生型病毒序列和序列seqidno:14(l5-e4位点中的空表达盒)。病毒tavix-wtl5-il7携带克隆到seqidno:14的l5-e4盒中的ela启动子的tav-255缺失、ix-e2位点中的野生型病毒序列和序列seqidno:18(参见下文，大写字母表示小鼠il-7基因，小写字母表示来自l5-e4表达盒的侧翼核苷酸，所述l5-e4表达盒包括带下划线的来自swai限制性内切位点的残留核苷酸)。
seqidno:18[l5mil7]
gctttgcaaagatttatgttccatgtttcttttagatatatctttggaattcctccactgatccttgttctgctgcctgtcacatcatctgagtgccacattaaagacaaagaaggtaaagcatatgagagtgtactgatgatcagcatcgatgaattggacaaaatgacaggaactgatagtaattgcccgaataatgaaccaaacttttttagaaaacatgtatgtgatgatacaaaggaagctgcttttctaaatcgtgctgctcgcaagttgaagcaatttcttaaaatgaatatcagtgaagaattcaatgtccacttactaacagtatcacaaggcacacaaacactggtgaactgcacaagtaaggaagaaaaaaacgtaaaggaacagaaaaagaatgatgcatgtttcctaaagagactactgagagaaataaaaacttgttggaataaaattttgaagggcagtatataaaaataacttgtttattgcag
病毒tavix-wtl5-gmcsf携带ela启动子的tav-255缺失，ix-e2位点中的野生型病毒序列和克隆到seqidno:14的l5-e4盒中的序列seqidno:19(大写字母表示小鼠gmcsf基因，小写字母代表来自l5-e4表达盒的侧翼核苷酸，所述l5-e4表达盒带下划线的来自swai限制性内切位点的核苷酸)。该病毒携带野生型小鼠gmcsf，并且不是在seqidno:15中所示的病毒tav-(l5-e4)mgmcsf中使用的小鼠gmcsf的密码子优化形式。
seqidno:19[l5wtmgmcsf]
gctttgcaaagatttatgtggctgcagaatttacttttcctgggcattgtggtctacagcctctcagcacccacccgctcacccatcactgtcacccggccttggaagcatgtagaggccatcaaagaagccctgaacctcctggatgacatgcctgtcacgttgaatgaagaggtagaagtcgtctctaacgagttctccttcaagaagctaacatgtgtgcagacccgcctgaagatattcgagcagggtctacggggcaatttcaccaaactcaagggcgccttgaacatgacagccagctactaccagacatactgccccccaactccggaaacggactgtgaaacacaagttaccacctatgcggatttcatagacagccttaaaacctttctgactgatatcccctttgaatgcaaaaaaccaggccaaaaatgaaaataacttgtttattgcag
病毒tavix-gmcsfl5-il7携带ela启动子的tav-255缺失，克隆到seqidno:17的ix-e2盒中的序列seqidno:20(大写字母表示小鼠gmcsf基因，小写字母代表ix-e2表达盒的侧翼核苷酸，所述ix-e2表达盒的包含带下划线的来自noti限制性内切位点残留核苷酸)，和如所描绘seqidno:18和seqidno:14中克隆到l5-e4盒中的小鼠il-7。小鼠的gmcsf序列在病毒tavix-wtl5-gmcsf和tavix-gmcsfl5-il7中相同，但是插入到一个病毒的ix-e2表达盒和另一个病毒的l5-e4表达盒中。
seqidno:20[ixwtmgmcsf]
atagggagacccgcggccatgtggctgcagaatttacttttcctgggcattgtggtctacagcctctcagcacccacccgctcacccatcactgtcacccggccttggaagcatgtagaggccatcaaagaagccctgaacctcctggatgacatgcctgtcacgttgaatgaagaggtagaagtcgtctctaacgagttctccttcaagaagctaacatgtgtgcagacccgcctgaagatattcgagcagggtctacggggcaatttcaccaaactcaagggcgccttgaacatgacagccagctactaccagacatactgccccccaactccggaaacggactgtgaaacacaagttaccacctatgcggatttcatagacagccttaaaacctttctgactgatatcccctttgaatgcaaaaaaccaggccaaaaatgaggccgctgtgccttctagt
为检测这些病毒的转基因表达，将a549细胞在moi为5的情况下用病毒感染，在4天后收集条件培养基并用在用于il-7和gmcsf的elisas中。用于gmcsf的elisa显示了由cmv启动子驱动的ix-e2位点的盒中的表达显著高于由sv40驱动的l5-e4位点的盒中的表达，如图3所示。
实施例5
在初始ix-e2设计的病毒中(图4)，我们猜想可通过阻断cmv启动子在与预期相反的方向驱动转录的任何可能性来进一步优化病毒生长(seilaetal.,science.(2008)322(5909):1849-51)。我们因此改进了该位点中的插入物，以使得插入物的5’和3’端均包含聚腺苷酸化信号，该信号针对多腺苷酸转录物，既从正常病毒基因进入插入片段，又从插入片段向正常病毒基因延伸。参见图4中改进的ix-e2设计。
改进型插入物的核苷酸序列从ix转录物的聚腺苷酸化信号到e2转录物的聚腺苷酸化信号是：
seqidno:21[ix改进空]
aataaaatacaccttttttcgattgtacgtatttttatttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccgcggccgctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaaaaccagactctgtttggatttggatcaagcaagtgtcttgctgtctttatt
每个正向聚腺苷酸化信号(“aataaa”seqidno:12)和反向腺苷酸化信号(“tttatt”seqidno:13)以及noti位点(“gcggccgc”seqidno:16)，以下划线示出。携带具有改进型ix-e2设计的表达盒比带有初始ix-e2设计的病毒更有效率地生长。
实施例6
病毒tav-ixrl5-空携带病毒e1a启动子中的tav-255缺失，seqidno:21(改进型ix-e2设计的空表达盒)，和seqidno:14(l5-e4位点中的空表达盒)。病毒tav-ixrl5-hil12携带病毒e1a启动子中的tav-255缺失，编码改进型ix-e2表达盒中的人il12a链的基因(在seqidno:22中描绘)，和编码l5-e4表达盒中的人il12b链的基因(在seqidno:23描绘)。在seqidno:22中，每个正向聚腺苷酸化信号(“aataaa”seqidno:12)和反向聚腺苷酸化信号(“tttatt”seqidno:13)以及noti位点的残留核苷酸以下划线示出，和编码人il12a链的基因以粗体示出。在seqidno:23中，l5和e4转录单元的聚腺苷酸化信号和swai限制性内切位点的残留核苷酸以下划线示出，和编码人il12b链的基因以粗体示出。seqidno:22[ix改进hil12a]
seqidno:23[l5初始hil12b]
产生与tav-ixrl5-hil12相同的基因组结构的病毒wt-ixrl5-hil12，不同之处在于其携带野生型e1a启动子而不是携带ela启动子的tav-255缺失。这些病毒中的每个还具有e3ridα、ridβ和14.7k基因的缺失和e4orf1-orf4基因的缺失。
为比较这种设计方法与将il12整合到溶瘤性腺病毒中的另一种策略，我们检测了携带编码通过被携带在e1b-19k位点中的弗林蛋白酶切割位点连接的人il12a和il12b链的基因的腺病毒(氨基酸rakr；seqidno:24)。当通过细胞合成融合蛋白时，弗林蛋白酶位点在rakr序列的最后一个r和下一个氨基酸(成熟il12a的第一个氨基酸)之间通过golgi中的弗林蛋白酶被切割。我们先前发现使用弗林蛋白酶切割位点作为连接子导致异二聚il12蛋白质的高水平表达。该融合基因(字母大写)的核苷酸序列、用于克隆的侧翼sali和xhoi限制性内切位点(以下划线示出)和表明在腺病毒基因组中的插入位点的腺病毒核苷酸(小写字母)是：
seqidno:25[hil12弗林蛋白酶]
atctgacctcgtcgacatgtgtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctcgtggccatatgggaactgaagaaagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggatgcccctggagaaatggtggtcctcacctgtgacacccctgaagaagatggtatcacctggaccttggaccagagcagtgaggtcttaggctctggcaaaaccctgaccatccaagtcaaagagtttggagatgctggccagtacacctgtcacaaaggaggcgaggttctaagccattcgctcctgctgcttcacaaaaaggaagatggaatttggtccactgatattttaaaggaccagaaagaacccaaaaataagacctttctaagatgcgaggccaagaattattctggacgtttcacctgctggtggctgacgacaatcagtactgatttgacattcagtgtcaaaagcagcagaggctcttctgacccccaaggggtgacgtgcggagctgctacactctctgcagagagagtcagaggggacaacaaggagtatgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgcccagctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtatgaaaactacaccagcagcttcttcatcagggacatcatcaaacctgacccacccaagaacttgcagctgaagccattaaagaattctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgacacctggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggcaagagcaagagagaaaagaaagatagagtcttcacggacaagacctcagccacggtcatctgccgcaaaaatgccagcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagcgaatgggcatctgtgccctgcagtcgtgctaagcgaagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcctaataactcgagtcaccaggcg
病毒tav-hil12-弗林蛋白酶携带ela启动子的tav-255缺失和e1b-19k区域中的seqidno:25。对照病毒tav-δ19k携带ela启动子的tav-255缺失和e1b-19k区域的缺失。
为检测溶瘤性活性和il12表达，a549细胞用tav-δ19k、tav-hil12-弗林蛋白酶、tav-tav-ixrl5-空和tav-ixrl5-hil12在moi为5的情况下一式三份地感染。在感染后4天，收集条件培养基，并在elisa中测量il12，其仅检测组装的il12a-il12b异二聚体，和剩余的细胞用用结晶紫染色。如图5中所示，tav-hil12-弗林蛋白酶的溶解略少于相应的对照病毒tav-δ19k，这与在将转基因插入到e1b-19k区域中时我们的一般经验是相符的，而tav-ixrl5-hil12与tav-ixrl5-空和tav-δ19k的溶解相同。这证明了在ix-e2和l5-e4区域插入表达盒对病毒适应度有最小影响，并且在这方面可由于将转基因插入e1b-19k区域中。
如图6所示，tav-hil12-弗林蛋白酶比使用ix-e2和l5-e4盒的病毒表达更高水平的il12。这表明两个表达盒中的至少一个可能不是最佳的，并且促使进一步研究以改进涉及。然而，从tav-hil12-弗林蛋白酶产生的il12蛋白质在il12b链的c-末端包含非天然rakr序列(剩余的弗林蛋白酶识别位点)，这可能会导致不理想的体内效果，诸如针对转基因或针对天然il12的免疫原性，但由tav-ixrl5-hil12产生的il12的优点在于其是全天然的。
实施例7
基于观察到的l5-e4盒相比于ix-e2盒的相对低的表达，我们假设l5-e4盒是il-12异二聚体低表达的诱因。我们改进l5-e4区域以在两端包含双向聚腺苷酸化信号，类似于对ix-e2区域所用的方法。
将核苷酸序列seqidno:26克隆到l5-e4区域，示出l5和e4转录物在5’和3’端的聚腺苷酸化信号，所有聚腺苷酸化信号s和swai限制性内切位点以下划线示出。
seqidno:26[l5改进sv40]
aataaaaggtttattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctttgcaaagatttaaataacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacgtgtttatt
制备病毒tav-(ixr)空-(l5r)空，使其带有e1a启动子中的tav-255缺失，如seqidno:21中所示的在ix-e2区域中没有转基因的改进型ix-e2盒，如seqidno:26所示的在l5-e4区域中没有转基因的改进型l5-e4盒。
病毒tav-(ixr)mil7-(l5r)mgmcsf包含：ela启动子的tav-255缺失，如seqidno:21所示的带有如seqidno:20所示的克隆到noti位点中的小鼠gmcsf基因的改进型ix-e2盒，和如seqidno:18所示的带有如seqidno:19所示的克隆到swai位点中的小鼠il-7基因的改进型l5-e4盒。
病毒tav-(ixr)mgmcsf-(l5r)mil7包含：ela启动子的tav-255缺失，如seqidno:21所示的带有如seqidno:27所示的克隆到noti位点中的小鼠il-7基因的改进型ix-e2盒，和如seqidno:26所示的带有如seqidno:19所示的克隆到swai位点中小鼠gmcsf基因的改进型l5-e4盒。因此，病毒tav-(ixr)mgmcsf-(l5r)mil7和tav-(ixr)mil7-(l5r)mgmcsf的区别仅在于il-7和gmcsf的基因被插入到哪个位点中：改进型ix-e2或改进型l5-e4位点。
seqidno:27[ixmil7]
atagggagacccgcggccatgttccatgtttcttttagatatatctttggaattcctccactgatccttgttctgctgcctgtcacatcatctgagtgccacattaaagacaaagaaggtaaagcatatgagagtgtactgatgatcagcatcgatgaattggacaaaatgacaggaactgatagtaattgcccgaataatgaaccaaacttttttagaaaacatgtatgtgatgatacaaaggaagctgcttttctaaatcgtgctgctcgcaagttgaagcaatttcttaaaatgaatatcagtgaagaattcaatgtccacttactaacagtatcacaaggcacacaaacactggtgaactgcacaagtaaggaagaaaaaaacgtaaaggaacagaaaaagaatgatgcatgtttcctaaagagactactgagagaaataaaaacttgttggaataaaattttgaagggcagtatataaggccgctgtgccttctagt
为检测这些病毒的转基因表达，a549细胞用每种病毒在moi为5的情况下一式三份地感染。4日后收集条件培养基，并在elisas中测量gmcsf和il-7。对于il-7和gmcsf二者，在改进型ix-e2位点中携带基因的病毒的表达均高于在改进型l5-e4位点中携带基因的表达。这证实了先前的发现，即在ix-e2处使用cmv启动子表达盒与在l5-e4处使用sv40启动子的表达盒相比表达更高水平，其不受将l5-e4位点改进为包含双向聚腺苷酸化信号的影响。
实施例8
我们接下来研究进一步改进l5-e4位点中的启动子。最初使用的sv40启动子在主要转录起始位点具有g(在野生型sv40序列中)到t(在l5-e4插入物中)的点突变，由此我们产生了如seqidno:28中所示的核苷酸变回野生型g的l5-e4插入物，先前突变的核苷酸、聚腺苷酸化信号和swai限制性内切位点以下划线示出。我们还研究了使用不同启动子和产生了人ef1a启动子而不是sv40启动子的l5-e4插入物。seqidno:29示出了使用人ef1a启动子的l5-e4插入物，从来自l5转录物的聚腺苷酸化信号到e4的聚腺苷酸化信号显示，其中聚腺苷酸化信号和swai限制性内切位点以下划线示出。
seqidno:28[l5改进sv40wt空]
aataaaaggtttattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctttgcaaagatttaaataacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacgtgtttatt
seqidno:29[l5改进ef1a空]
aataaaaggtttattaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaatttaaataacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacgtgtttatt
为检测这些改进的l5-e4中的表达盒，我们产生了携带在ix-e2位点中的小鼠il-7基因和在新的l5-e4位点中的小鼠gmcsf基因的病毒。在ix-e2位点中使用的小鼠il-7基因通过如下方式修饰：在靠近具有可被加工为聚腺苷酸化信号的序列aataaa的基因的3’末端的两个区域中引入沉默突变以导致表达减少，替换不改变编码蛋白质序列但将消除内部aataaa序列的同义序列；seqidno:30示出了带有编码il-7的核苷酸(大写)和突变(以下划线示出)的核苷酸序列，以及带有来自noti(以下划线示出)的残留核苷酸的ix-e2盒(小写字母)的侧翼核苷酸。为尝试改进小鼠gmcsf基因在l5-e4位点中的表达，将共有kozak序列(核苷酸gccacc)包含在swai位点的残留核苷酸和gmcsf基因的起始密码子之间；seqidno:31示出了带有小鼠gmcsf基因和kozak序列(大写)的核苷酸序列，kozak序列以下划线示出，带有来自swai位点的残留核苷酸的l5-e4盒(小写)的侧翼核苷酸以下划线示出。
seqidno:30[mil7nopoly-a]
atagggagacccgcggccatgttccatgtttcttttagatatatctttggaattcctccactgatccttgttctgctgcctgtcacatcatctgagtgccacattaaagacaaagaaggtaaagcatatgagagtgtactgatgatcagcatcgatgaattggacaaaatgacaggaactgatagtaattgcccgaataatgaaccaaacttttttagaaaacatgtatgtgatgatacaaaggaagctgcttttctaaatcgtgctgctcgcaagttgaagcaatttcttaaaatgaatatcagtgaagaattcaatgtccacttactaacagtatcacaaggcacacaaacactggtgaactgcacaagtaaggaagaaaaaaacgtaaaggaacagaaaaagaatgatgcatgtttcctaaagagactactgagagaaatcaaaacttgttggaacaaaattttgaagggcagtatataaggccgctgtgccttctagt
seqidno:31[mgmcsfkozak]
atttgccaccatgtggctgcagaatttacttttcctgggcattgtggtctacagcctctcagcacccacccgctcacccatcactgtcacccggccttggaagcatgtagaggccatcaaagaagccctgaacctcctggatgacatgcctgtcacgttgaatgaagaggtagaagtcgtctctaacgagttctccttcaagaagctaacatgtgtgcagacccgcctgaagatattcgagcagggtctacggggcaatttcaccaaactcaagggcgccttgaacatgacagccagctactaccagacatactgccccccaactccggaaacggactgtgaaacacaagttaccacctatgcggatttcatagacagccttaaaacctttctgactgatatcccctttgaatgcaaaaaaccaggccaaaaatgaaaataacttgtttattgcag
病毒tav-(ixr)mil7nopa-(l5sv40wt)kozakmgmcsf包含：ela启动子的tav-255缺失，如seqidno:21所示的改进型ix-e2插入物(其具有如seqidno:30所示的克隆到noti位点中的小鼠il-7基因，所述小鼠il-7具有在可能的内部聚腺苷酸化位点处的同义突变)，和带有野生型sv40启动子的l5-e4插入物(其如seqidno:28所示的克隆到swai位点中的包含共有kozak序列的小鼠gmcsf基因)。病毒tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf包含：ela启动子的tav-255缺失，如seqidno:21所示的改进型ix-e2插入物(其具有如seqidno:3所示的克隆到noti位点中的小鼠il-7基因，所述小鼠il-7基因在可能的内部聚腺苷酸化位点处具有同义突变)，和带有如seqidno:29所示的人ef1a启动子的l5-e4插入物(其带有如seqidno:31所示的克隆到swai位点中的包含共有kozak序列的小鼠gmcsf基因)。
为检测这些病毒的转基因表达，a549细胞用两种病毒在moi为5的情况下一式三份地感染。4天后，收集条件培养基并用于elisas中以测量il-7和gmcsf表达。结果在图7中显示。人ef1a启动子具有中等较高的表达，并且被选择用于进一步开发。通过如下方式将病毒tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf制备为用于小鼠实验的药物剂：在sf-bmadr281细胞(来源于a549细胞)的无血清悬浮液培养物中倍增病毒，溶解细胞，用色谱纯化病毒，并在缓冲剂(包含25mmnacl，20mmtris，2.5％甘油，ph为8)中透析。由此制备的病毒的病毒粒子浓度为5.8x1011vp/ml，感染滴度为3.0x1010iu/ml。
实施例9
我们进一步研究了缺失腺病毒死亡蛋白(adp)是否能改善转基因的表达。adp在病毒复制晚期表达，并且溶解宿主细胞以释放子代病毒体，因此其移除可允许细胞存活并在其被杀死之前更久地表达转基因。seqidno:32中显示了在tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf病毒中使用e3ridα、ridβ和14.7k缺失的背景下的adp基因的核苷酸序列，其中核苷酸编码adp大写，e3ridα、ridβ和14.7k缺失的位点显示为连字符，侧翼腺病毒核苷酸小写。为产生δadp缺失，缺失seqidno:32中带下划线的核苷酸。
seqidno:32[adp]
gaaaatgccttaatttactaagttacaaagctaatgtcaccactaactgctttactcgctgcttgcaaaacaaattcaaaaagttagcattataattagaataggatttaaaccccccggtcatttcctgctcaataccattcccctgaacaattgactctatgtgggatatgctccagcgctacaaccttgaagtcaggcttcctggatgtcagcatctgactttggccagcacctgtcccgcggatttgttccagtccaactacagcgacccaccctaacagagatgaccaacacaaccaacgcggccgccgctaccggacttacatctaccacaaatacaccccaagtttctgcctttgtcaataactgggataacttgggcatgtggtggttctccatagcgcttatgtttgtatgccttattattatgtggctcatctgctgcctaaagcgcaaacgcgcccgaccacccatctatagtcccatcattgtgctacacccaaacaatgatggaatccatagattggacggactgaaacacatgttcttttctcttacagtatgataataaaaaaaaataataaagca
用与tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf相同的基因组创建病毒tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf-δadp，不同之处在于其还包含adp基因的核苷酸缺失，如seqidno:32中下划线所示。
为检测adp缺失是否导致更长期和更高的转基因表达，a549细胞用tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf和tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf-δadp在moi为5的情况下感染，在感染后每三日收集条件培养基以在elisa中测量il-7和gmcsf。结果在图8中显示。在两种病毒之间没有令人信服的转基因表达水平差异，尽管在试验过程中观察到细胞并且细胞死亡延迟约3天(在用tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf感染之后)到约9天(在用tav-(ixr)mil7nopa-(l5ef1a)kozakmgmcsf-δadp感染之后)。因此尽管在该试验中可溶性细胞因子的表达没有被增强，但是对于一些应用(诸如在感染细胞的表面上表达共刺激分子)，缺失adp可能是有利的，因为细胞能存活更久，并且其表面上的共刺激分子能长时间激活靶细胞。
实施例10
我们随后使用ix-e2和l5-e4位点作为表达三种转基因的病毒的设计的一部分：共刺激分子cd80和cd137l和粘附分子icam1。我们先前创建了携带这些转基因中的全部三种而不是病毒e1b-19k基因的5’端的病毒，并且在三种转基因中的每个之间均具有ires。e1b-19k区域中的该病毒的核苷酸序列在seqidno:33中显示，其具有5’侧翼腺病毒核苷酸序列和用于克隆的sali限制性内切位点(小写)，小鼠cd80(大写)，来自脑心肌炎病毒的ires(小写)，小鼠cd137l(大写)，来自手足口病病毒的ires(小写)，小鼠icam1(大写)和包括用于克隆的xhoi限制性内切位点的3’侧翼腺病毒核苷酸序列。该病毒，tav-mcd80(ires)mcd137l(ires)micam1，包含：ela启动子的tav-255缺失，e1b-19k位点中的seqidno:33，和e3区域adp、ridα、ridβ和14.7k基因以及e4区域orf1-4基因的缺失。
seqidno:33[costimires]
atctgacctcgtcgacatggcttgcaattgtcagttgatgcaggatacaccactcctcaagtttccatgtccaaggctcattcttctctttgtgctgctgattcgtctttcacaagtgtcttcagatgttgatgaacaactgtccaagtcagtgaaagataaggtattgctgccttgccgttacaactctcctcatgaagatgagtctgaagaccgaatctactggcaaaaacatgacaaagtggtgctgtctgtcattgctgggaaactaaaagtgtggcccgagtataagaaccggactttatatgacaacactacctactctcttatcatcctgggcctggtcctttcagaccggggcacatacagctgtgtcgttcaaaagaaggaaagaggaacgtatgaagttaaacacttggctttagtaaagttgtccatcaaagctgacttctctacccccaacataactgagtctggaaacccatctgcagacactaaaaggattacctgctttgcttccgggggtttcccaaagcctcgcttctcttggttggaaaatggaagagaattacctggcatcaatacgacaatttcccaggatcctgaatctgaattgtacaccattagtagccaactagatttcaatacgactcgcaaccacaccattaagtgtctcattaaatatggagatgctcacgtgtcagaggacttcacctgggaaaaacccccagaagaccctcctgatagcaagaacacacttgtgctctttggggcaggattcggcgcagtaataacagtcgtcgtcatcgttgtcatcatcaaatgcttctgtaagcacagaagctgtttcagaagaaatgaggcaagcagagaaacaaacaacagccttaccttcgggcctgaagaagcattagctgaacagaccgtcttcctttagtaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggaccagcacacacttgatgtggaggataccgcggatgccagacatccagcaggtacttcgtgcccctcggatgcggcgctcctcagagataccgggctcctcgcggacgctgcgctcctctcagatactgtgcgccccacaaatgccgcgctccccacggatgctgcctaccctgcggttaatgttcgggatcgcgaggccgcgtggccgcctgcactgaacttctgttcccgccacccaaagctctatggcctagtcgctttggttttgctgcttctgatcgccgcctgtgttcctatcttcacccgcaccgagcctcggccagcgctcacaatcaccacctcgcccaacctgggtacccgagagaataatgcagaccaggtcacccctgtttcccacattggctgccccaacactacacaacagggctctcctgtgttcgccaagctactggctaaaaaccaagcatcgttgtgcaatacaactctgaactggcacagccaagatggagctgggagctcatacctatctcaaggtctgaggtacgaagaagacaaaaaggagttggtggtagacagtcccgggctctactacgtatttttggaactgaagctcagtccaacattcacaaacacaggccacaaggtgcagggctgggtctctcttgttttgcaagcaaagcctcaggtagatgactttgacaacttggccctgacagtggaactgttcccttgctccatggagaacaagttagtggaccgttcctggagtcaactgttgctcctgaaggctggccaccgcctcagtgtgggtctgagggcttatctgcatggagcccaggatgcatacagagactgggagctgtcttatcccaacaccaccagctttggactctttcttgtgaaacccgacaacccatgggaatgaggtttccacaactgataaaactcgtgcaacttgaaactccgcctggtctttccaggtctagaggggttacactttgtactgtgctcgactccacgcccggtccactggcgggtgttagtagcagcactgttgtttcgtagcggagcatggtggccgtgggaactcctccttggtgacaagggcccacggggccgaaagccacgtccagacggacccaccatgtgtgcaaccccagcacggcaacttttactgcgaacaccaccttaaggtgacactggtactggtactcggtcactggtgacaggctaaggatgcccttcaggtaccccgaggtaacacgggacactcgggatctgagaaggggattgggacttctttaaaagtgcccagtttaaaaagcttctacgcctgaataggcgaccggaggccggcgcctttccattacccactactaaatccatggcttcaacccgtgccaagcccacgctacctctgctcctggccctggtcaccgttgtgatccctgggcctggtgatgctcaggtatccatccatcccagagaagccttcctgccccagggtgggtccgtgcaggtgaactgttcttcctcatgcaaggaggacctcagcctgggcttggagactcagtggctgaaagatgagctcgagagtggacccaactggaagctgtttgagctgagcgagatcggggaggacagcagtccgctgtgctttgagaactgtggcaccgtgcagtcgtccgcttccgctaccatcaccgtgtattcgtttccggagagtgtggagctgagacctctgccagcctggcagcaagtaggcaaggacctcaccctgcgctgccacgtggatggtggagcaccgcggacccagctctcagcagtgctgctccgtggggaggagatactgagccgccagccagtgggtgggcaccccaaggaccccaaggagatcacattcacggtgctggctagcagaggggaccacggagccaatttctcatgccgcacagaactggatctcaggccgcaagggctggcattgttctctaatgtctccgaggccaggagcctccggactttcgatcttccagctaccatcccaaagctcgacacccctgacctcctggaggtgggcacccagcagaagttgttttgctccctggaaggcctgtttcctgcctctgaagctcggatatacctggagctgggaggccagatgccgacccaggagagcacaaacagcagtgactctgtgtcagccactgccttggtagaggtgactgaggagttcgacagaaccctgccgctgcgctgcgttttggagctagcggaccagatcctggagacgcagaggaccttaacagtctacaacttttcagctccggtcctgaccctgagccagctggaggtctcggaagggagccaagtaactgtgaagtgtgaagcccacagtgggtcgaaggtggttcttctgagcggcgtcgagcctaggccacccaccccgcaggtccaattcacactgaatgccagctcggaggatcacaaacgaagcttcttttgctctgccgctctggaggtggcgggaaagttcctgtttaaaaaccagaccctggaactgcacgtgctgtatggtcctcggctggacgagacggactgcttggggaactggacctggcaagaggggtctcagcagactctgaaatgccaggcctgggggaacccatctcctaagatgacctgcagacggaaggcagatggtgccctgctgcccatcggggtggtgaagtctgtcaaacaggagatgaatggtacatacgtgtgccatgcctttagctcccatgggaatgtcaccaggaatgtgtacctgacagtactgtaccactctcaaaataactggactataatcattctggtgccagtactgctggtcattgtgggcctcgtgatggcagcctcttatgtttataaccgccagagaaagatcaggatatacaagttacagaaggctcaggaggaggccataaaactcaagggacaagccccacctccctgactcgagtcaccaggcg
我们发现与ires未启动翻译的基因相比，ires之后的基因表达通常较差，因此我们研究了使用ix-e2和l5-e4位点作为替代策略。我们产生了病毒tav-(19k)mcd80-(ix)mcd137l-(l5)micam1，该病毒携带在e1b-19k位点中的小鼠cd80(如seqidno:34所示)(cd80基因大写，侧翼腺病毒序列和限制性内切位点小写)(其使用bsu36i限制性内切位点而不是其他病毒中所用的sali和xhoi限制性内切位点)，seqidno:21的在ix-e2位点中的小鼠cd137l基因(其带有插入到noti位点的cd137l基因，如seqidno:35所示)(cd137l基因大写，侧翼表达盒序列和残留的noti限制性内切位点小写)，和seqidno:29的在l5-e4位点中的小鼠icam1基因(其带有插入到swai位点中的icam1基因，如seqidno:36所示)(icam1基因大写，侧翼表达盒序列和残留的swai位点小写)。该病毒还包含：ela启动子的tav-255缺失，e3区域adp、ridα、ridβ和14.7k基因的缺失，和e4区域orf1-4基因的缺失。
seqidno:34[19kmcd80]
atctgacctcatggcttgcaattgtcagttgatgcaggatacaccactcctcaagtttccatgtccaaggctcattcttctctttgtgctgctgattcgtctttcacaagtgtcttcagatgttgatgaacaactgtccaagtcagtgaaagataaggtattgctgccttgccgttacaactctcctcatgaagatgagtctgaagaccgaatctactggcaaaaacatgacaaagtggtgctgtctgtcattgctgggaaactaaaagtgtggcccgagtataagaaccggactttatatgacaacactacctactctcttatcatcctgggcctggtcctttcagaccggggcacatacagctgtgtcgttcaaaagaaggaaagaggaacgtatgaagttaaacacttggctttagtaaagttgtccatcaaagctgacttctctacccccaacataactgagtctggaaacccatctgcagacactaaaaggattacctgctttgcttccgggggtttcccaaagcctcgcttctcttggttggaaaatggaagagaattacctggcatcaatacgacaatttcccaggatcctgaatctgaattgtacaccattagtagccaactagatttcaatacgactcgcaaccacaccattaagtgtctcattaaatatggagatgctcacgtgtcagaggacttcacctgggaaaaacccccagaagaccctcctgatagcaagaacacacttgtgctctttggggcaggattcggcgcagtaataacagtcgtcgtcatcgttgtcatcatcaaatgcttctgtaagcacagaagctgtttcagaagaaatgaggcaagcagagaaacaaacaacagccttaccttcgggcctgaagaagcattagctgaacagaccgtcttcctttagtcaggtgaatctgggtcacc
seqidno:35[ixmcd137l]
atagggagacccgcggccatggaccagcacacacttgatgtggaggataccgcggatgccagacatccagcaggtacttcgtgcccctcggatgcggcgctcctcagagataccgggctcctcgcggacgctgcgctcctctcagatactgtgcgccccacaaatgccgcgctccccacggatgctgcctaccctgcggttaatgttcgggatcgcgaggccgcgtggccgcctgcactgaacttctgttcccgccacccaaagctctatggcctagtcgctttggttttgctgcttctgatcgccgcctgtgttcctatcttcacccgcaccgagcctcggccagcgctcacaatcaccacctcgcccaacctgggtacccgagagaataatgcagaccaggtcacccctgtttcccacattggctgccccaacactacacaacagggctctcctgtgttcgccaagctactggctaaaaaccaagcatcgttgtgcaatacaactctgaactggcacagccaagatggagctgggagctcatacctatctcaaggtctgaggtacgaagaagacaaaaaggagttggtggtagacagtcccgggctctactacgtatttttggaactgaagctcagtccaacattcacaaacacaggccacaaggtgcagggctgggtctctcttgttttgcaagcaaagcctcaggtagatgactttgacaacttggccctgacagtggaactgttcccttgctccatggagaacaagttagtggaccgttcctggagtcaactgttgctcctgaaggctggccaccgcctcagtgtgggtctgagggcttatctgcatggagcccaggatgcatacagagactgggagctgtcttatcccaacaccaccagctttggactctttcttgtgaaacccgacaacccatgggaatgaggccgctgtgccttctagt
seqidno:36[l5micam1]
cgccagaacacatttatggcttcaacccgtgccaagcccacgctacctctgctcctggccctggtcaccgttgtgatccctgggcctggtgatgctcaggtatccatccatcccagagaagccttcctgccccagggtgggtccgtgcaggtgaactgttcttcctcatgcaaggaggacctcagcctgggcttggagactcagtggctgaaagatgagctcgagagtggacccaactggaagctgtttgagctgagcgagatcggggaggacagcagtccgctgtgctttgagaactgtggcaccgtgcagtcgtccgcttccgctaccatcaccgtgtattcgtttccggagagtgtggagctgagacctctgccagcctggcagcaagtaggcaaggacctcaccctgcgctgccacgtggatggtggagcaccgcggacccagctctcagcagtgctgctccgtggggaggagatactgagccgccagccagtgggtgggcaccccaaggaccccaaggagatcacattcacggtgctggctagcagaggggaccacggagccaatttctcatgccgcacagaactggatctcaggccgcaagggctggcattgttctctaatgtctccgaggccaggagcctccggactttcgatcttccagctaccatcccaaagctcgacacccctgacctcctggaggtgggcacccagcagaagttgttttgctccctggaaggcctgtttcctgcctctgaagctcggatatacctggagctgggaggccagatgccgacccaggagagcacaaacagcagtgactctgtgtcagccactgccttggtagaggtgactgaggagttcgacagaaccctgccgctgcgctgcgttttggagctagcggaccagatcctggagacgcagaggaccttaacagtctacaacttttcagctccggtcctgaccctgagccagctggaggtctcggaagggagccaagtaactgtgaagtgtgaagcccacagtgggtcgaaggtggttcttctgagcggcgtcgagcctaggccacccaccccgcaggtccaattcacactgaatgccagctcggaggatcacaaacgaagcttcttttgctctgccgctctggaggtggcgggaaagttcctgtttaaaaaccagaccctggaactgcacgtgctgtatggtcctcggctggacgagacggactgcttggggaactggacctggcaagaggggtctcagcagactctgaaatgccaggcctgggggaacccatctcctaagatgacctgcagacggaaggcagatggtgccctgctgcccatcggggtggtgaagtctgtcaaacaggagatgaatggtacatacgtgtgccatgcctttagctcccatgggaatgtcaccaggaatgtgtacctgacagtactgtaccactctcaaaataactggactataatcattctggtgccagtactgctggtcattgtgggcctcgtgatggcagcctcttatgtttataaccgccagagaaagatcaggatatacaagttacagaaggctcaggaggaggccataaaactcaagggacaagccccacctccctgaaaataacttgtttattgcag
为测试这两种病毒的表达：a549细胞、ht29细胞、ads12细胞和f244细胞在moi为3的情况下用tav-mcd80(ires)mcd137l(ires)micam1、tav-(19k)mcd80-(ix)mcd137l-(l5)micam1或对照病毒tav-(19k)空-(ix)空-(l5)空(其具有与tav-(19k)mcd80-(ix)mcd137l-(l5)micam1相同的结构但没有转基因)感染。2天后，对cd80、cd137l和icam1进行细胞染色，结果显示在图9-图12中。尽管当在ireses之后在tav-mcd80(ires)mcd137l(ires)micam1中表达时cd137l和icam1基因的表达较差，但具有tav-(19k)mcd80-(ix)mcd137l-(l5)micam1的ix-e2和l5-e4位点稳健表达那些基因。
实施例11
尽管上述实验使用了基于人腺病毒5型的腺病毒，其他腺病毒具有类似结构并且具有与上述ix-e2和l5-e4位点相同的明确可鉴定位点。例如，人腺病毒35型在ix-e2位点中具有如seqidno:37中所示的序列，并且具有在l5-e4位点中具有如seqidno:38中所示的序列，其中在每个序列中聚腺苷酸化信号以下划线示出。
seqidno:37[ad35wtix-e2]
aataaaaaaaattccagaatcaatgaataaataaacgagcttgttgttgatttaaaatcaagtgtttttatt
seqidno:38[ad35wtl5-e4]
aataaagtttaagtgtttttatt
为测定表达盒是否可被插入到这些位点中，ix-e2位点用与seqidno:39中所示的腺病毒5型改进型ix-e2位点相同的序列修饰(表达盒被插入到腺病毒5型的相反方向，所以小写字母的侧翼病毒序列常规标注的反向互补，如seqidno:37中所示)，并且l5-e4位点用与seqidno:40所示的带有ef1a启动子的腺病毒5型中所用的相同序列来修饰。携带位点ix-e2和l5-e4中那两种表达盒以及缺失e3ridα、ridβ和14.7k基因和e4orf1-4基因的腺病毒35型被补救，证明这些位点可用于插入腺病毒的其他血清型的表达盒中。将表达盒插入面向彼此的带有多核苷酸化位点的两个相邻的转录单元的种类原则上不限于腺病毒，并且也有可能应用于其他病毒。
seqidno:39[ad35ix-e2盒]
tcgagatcggtggtccagggcataccgtgcgcgaaaaatgaaataaaatacaccttttttcgattgtacgtatttttatttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccgcggccgctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaaacacttgattttaaatcaacaacaagctcgtttatttat
seqidno:40[ad35l5-e4盒]
tttcttttcttacattacagaagacgacaactaaaataaaaggtttattaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaatttaaataacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagtttaagtgtttttatttaaaatcacaaaattcg
实施例12
我们使用了改进型ix-e2和l5-e4位点以产生携带小鼠il12a和il12b基因的病毒以用作临床前试验中的模型。将小鼠il12a的基因克隆到带有如seqidno:21中所示的改进型ix-e2位点的noti限制性内切位点以产生seqidno:42的序列，带有noti限制性内切位点的残留核苷酸以下划线示出。将小鼠il12b的基因克隆到带有seqidno:29中所示的ef1a启动子的表达盒的l5-e4位点的swai限制性内切位点中以产生seqidno:43的序列，swai限制性内切位点的残留核苷酸以下划线示出。
seqidno:42
ctatagggagacccgcggccatgtgtcaatcacgctacctcctctttttggccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctagacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgcctgaggccgctgtgccttctagtt
seqidno:43
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产生携带以下的病毒tav-ix5-空：ela启动子的tav-255缺失，没有seqidno:21中所示的转基因的ix-e2表达盒，和没有seqidno:29中所示的转基因的l5-e4表达盒。产生携带以下的病毒tav-ix5-mil12：ela启动子的tav-255缺失，包含seqidno:42的小鼠il12a基因的ix-e2表达盒，和包含seqidno:43的小鼠il12b基因的l5-e4表达盒。
为检测这些病毒的溶瘤作用，将a549细胞用tav-ix5-空或tav-ix5-mil12病毒在moi为5的情况下感染，或保持为未感染对照，在感染后每2天用结晶紫将孔看色。如图13所示，空对照病毒和携带小鼠il-12的病毒均在4-6天内溶解。
为检测转基因表达，将a549细胞用tav-ix5-空或tav-ix5-mil12病毒在moi为5的情况下一式三份地表达，在感染后4天收集条件培养基以测量小鼠il-12，使用elisa，仅检测同时具有小鼠il12a和小鼠il12b链的异二聚体。如图14所示，tav-ix5-mil12诱导了il-12异二聚体的高水平表达。
人腺病毒5，全基因组
ncbi参考序列：ac_000008.1(seqidno:1)
>ac_000008.1人腺病毒5，全基因组
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人腺病毒35，全基因组
ncbi参考序列：ac_000019.1(seqidno:41)
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参考文献的引入
本文所提到的每篇专利文献和科学论文的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
等效范围
本发明可以其他具体形式实施而不背离其精神或基本特征。因此前述实施方式被认为在所有方面都是说明性的，而非限制本文所述发明。本发明的范围因此由所附权利要求而不是前述说明书表明，并且进入权利要求的含义和等效范围内的所有变化均意图涵盖其中。
序列表
<110>epicentrx,inc.
larson,christopher
oronsky,bryan
reid,tonyr.
<120>携带转基因的重组腺病毒
<130>eprx-002/01wo330096-2019
<150>us62/511,822
<151>2017-05-26
<160>46
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>35938
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>1
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tagcttatacagatcaccgtaccttaatcaaactcacagaaccctagtattcaacctgcc32940
acctccctcccaacacacagagtacacagtcctttctccccggctggccttaaaaagcat33000
catatcatgggtaacagacatattcttaggtgttatattccacacggtttcctgtcgagc33060
caaacgctcatcagtgatattaataaactccccgggcagctcacttaagttcatgtcgct33120
gtccagctgctgagccacaggctgctgtccaacttgcggttgcttaacgggcggcgaagg33180
agaagtccacgcctacatgggggtagagtcataatcgtgcatcaggatagggcggtggtg33240
ctgcagcagcgcgcgaataaactgctgccgccgccgctccgtcctgcaggaatacaacat33300
ggcagtggtctcctcagcgatgattcgcaccgcccgcagcataaggcgccttgtcctccg33360
ggcacagcagcgcaccctgatctcacttaaatcagcacagtaactgcagcacagcaccac33420
aatattgttcaaaatcccacagtgcaaggcgctgtatccaaagctcatggcggggaccac33480
agaacccacgtggccatcataccacaagcgcaggtagattaagtggcgacccctcataaa33540
cacgctggacataaacattacctcttttggcatgttgtaattcaccacctcccggtacca33600
tataaacctctgattaaacatggcgccatccaccaccatcctaaaccagctggccaaaac33660
ctgcccgccggctatacactgcagggaaccgggactggaacaatgacagtggagagccca33720
ggactcgtaaccatggatcatcatgctcgtcatgatatcaatgttggcacaacacaggca33780
cacgtgcatacacttcctcaggattacaagctcctcccgcgttagaaccatatcccaggg33840
aacaacccattcctgaatcagcgtaaatcccacactgcagggaagacctcgcacgtaact33900
cacgttgtgcattgtcaaagtgttacattcgggcagcagcggatgatcctccagtatggt33960
agcgcgggtttctgtctcaaaaggaggtagacgatccctactgtacggagtgcgccgaga34020
caaccgagatcgtgttggtcgtagtgtcatgccaaatggaacgccggacgtagtcatatt34080
tcctgaagcaaaaccaggtgcgggcgtgacaaacagatctgcgtctccggtctcgccgct34140
tagatcgctctgtgtagtagttgtagtatatccactctctcaaagcatccaggcgccccc34200
tggcttcgggttctatgtaaactccttcatgcgccgctgccctgataacatccaccaccg34260
cagaataagccacacccagccaacctacacattcgttctgcgagtcacacacgggaggag34320
cgggaagagctggaagaaccatgtttttttttttattccaaaagattatccaaaacctca34380
aaatgaagatctattaagtgaacgcgctcccctccggtggcgtggtcaaactctacagcc34440
aaagaacagataatggcatttgtaagatgttgcacaatggcttccaaaaggcaaacggcc34500
ctcacgtccaagtggacgtaaaggctaaacccttcagggtgaatctcctctataaacatt34560
ccagcaccttcaaccatgcccaaataattctcatctcgccaccttctcaatatatctcta34620
agcaaatcccgaatattaagtccggccattgtaaaaatctgctccagagcgccctccacc34680
ttcagcctcaagcagcgaatcatgattgcaaaaattcaggttcctcacagacctgtataa34740
gattcaaaagcggaacattaacaaaaataccgcgatcccgtaggtcccttcgcagggcca34800
gctgaacataatcgtgcaggtctgcacggaccagcgcggccacttccccgccaggaacca34860
tgacaaaagaacccacactgattatgacacgcatactcggagctatgctaaccagcgtag34920
ccccgatgtaagcttgttgcatgggcggcgatataaaatgcaaggtgctgctcaaaaaat34980
caggcaaagcctcgcgcaaaaaagaaagcacatcgtagtcatgctcatgcagataaaggc35040
aggtaagctccggaaccaccacagaaaaagacaccatttttctctcaaacatgtctgcgg35100
gtttctgcataaacacaaaataaaataacaaaaaaacatttaaacattagaagcctgtct35160
tacaacaggaaaaacaacccttataagcataagacggactacggccatgccggcgtgacc35220
gtaaaaaaactggtcaccgtgattaaaaagcaccaccgacagctcctcggtcatgtccgg35280
agtcataatgtaagactcggtaaacacatcaggttgattcacatcggtcagtgctaaaaa35340
gcgaccgaaatagcccgggggaatacatacccgcaggcgtagagacaacattacagcccc35400
cataggaggtataacaaaattaataggagagaaaaacacataaacacctgaaaaaccctc35460
ctgcctaggcaaaatagcaccctcccgctccagaacaacatacagcgcttccacagcggc35520
agccataacagtcagccttaccagtaaaaaagaaaacctattaaaaaaacaccactcgac35580
acggcaccagctcaatcagtcacagtgtaaaaaagggccaagtgcagagcgagtatatat35640
aggactaaaaaatgacgtaacggttaaagtccacaaaaaacacccagaaaaccgcacgcg35700
aacctacgcccagaaacgaaagccaaaaaacccacaacttcctcaaatcgtcacttccgt35760
tttcccacgttacgtaacttcccattttaagaaaactacaattcccaacacatacaagtt35820
actccgccctaaaacctacgtcacccgccccgttcccacgccccgcgccacgtcacaaac35880
tccaccccctcattatcatattggcttcaatccaaaataaggtatattattgatgatg35938
<210>2
<211>8
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>2
tcaccagg8
<210>3
<211>8
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>3
ctgacctc8
<210>4
<211>10
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的ela启动子
<400>4
ggtgttttgg10
<210>5
<211>9
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的ela启动子
<400>5
ctaggactg9
<210>6
<211>65
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>6
taaaacataaataaaaaaccagactctgtttggatttggatcaagcaagtgtcttgctgt60
cttta65
<210>7
<211>132
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>7
taaagaatcgtttgtgttatgtttcaacgtgtttatttttcaattgcagaaaatttcaag60
tcatttttcattcagtagtatagccccaccaccacatagcttatacagatcaccgtacct120
taatcaaactca132
<210>8
<211>3
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>8
taa3
<210>9
<211>3
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>9
tta3
<210>10
<211>3
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>10
tca3
<210>11
<211>8
<212>dna
<213>未知
<220>
<223>swai限制性内切位点
<400>11
atttaaat8
<210>12
<211>6
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>12
aataaa6
<210>13
<211>6
<212>dna
<213>人腺病毒5
<400>13
tttatt6
<210>14
<211>530
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>l5初始空
<400>14
aataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgga60
aagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagca120
accaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctc180
aattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgccc240
agttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgag300
gccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggc360
ttttgcaaaaagctttgcaaagatttaaataacttgtttattgcagcttataatggttac420
aaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagt480
tgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggtgtttatt530
<210>15
<211>956
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>l5初始mgmcsf
<400>15
aataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgga60
aagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagca120
accaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctc180
aattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgccc240
agttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgag300
gccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggc360
ttttgcaaaaagctttgcaaagatttatgtggctgcagaacctgctgttcctgggcatcg420
tggtgtacagcctgagcgcccccaccagatcccccatcaccgtgaccagaccctggaagc480
acgtggaagccatcaaagaggccctgaacctgctggacgacatgcccgtgaccctgaacg540
aagaggtggaagtggtgtccaacgagttcagcttcaagaaactgacctgcgtgcagacca600
gactgaagatcttcgagcagggcctgagaggcaacttcaccaagctgaagggcgctctga660
acatgaccgccagctactaccagacctactgccctcccacacccgagacagactgcgaga720
cacaggtcacaacctacgccgacttcatcgacagcctgaaaaccttcctgaccgacatcc780
ccttcgagtgcaagaaacccggccagaagtgaaaataacttgtttattgcagcttataat840
ggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcat900
tctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggtgtttatt956
<210>16
<211>8
<212>dna
<213>未知
<220>
<223>noti限制性内切位点
<400>16
gcggccgc8
<210>17
<211>858
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>ix初始空
<400>17
aataaaaaaccagactctgtttggatttggatcaagcaagtgtcttgctgtcttacggta60
aatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtat120
gttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacgg180
taaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgac240
gtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggacttt300
cctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttgg360
cagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccacccc420
attgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgt480
aacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatata540
agcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacg600
actcactatagggagacccgcggccgcctgtgccttctagttgccagccatctgttgttt660
gcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaat720
aaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtgggg780
tggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcgg840
tgggctctatggtttatt858
<210>18
<211>500
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>l5mil7
<400>18
gctttgcaaagatttatgttccatgtttcttttagatatatctttggaattcctccactg60
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agtaattgcccgaataatgaaccaaacttttttagaaaacatgtatgtgatgatacaaag240
gaagctgcttttctaaatcgtgctgctcgcaagttgaagcaatttcttaaaatgaatatc300
agtgaagaattcaatgtccacttactaacagtatcacaaggcacacaaacactggtgaac360
tgcacaagtaaggaagaaaaaaacgtaaaggaacagaaaaagaatgatgcatgtttccta420
aagagactactgagagaaataaaaacttgttggaataaaattttgaagggcagtatataa480
aaataacttgtttattgcag500
<210>19
<211>461
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>l5wtmgmcsf
<400>19
gctttgcaaagatttatgtggctgcagaatttacttttcctgggcattgtggtctacagc60
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gtcgtctctaacgagttctccttcaagaagctaacatgtgtgcagacccgcctgaagata240
ttcgagcagggtctacggggcaatttcaccaaactcaagggcgccttgaacatgacagcc300
agctactaccagacatactgccccccaactccggaaacggactgtgaaacacaagttacc360
acctatgcggatttcatagacagccttaaaacctttctgactgatatcccctttgaatgc420
aaaaaaccaggccaaaaatgaaaataacttgtttattgcag461
<210>20
<211>463
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>ixwtmgmcsf
<400>20
atagggagacccgcggccatgtggctgcagaatttacttttcctgggcattgtggtctac60
agcctctcagcacccacccgctcacccatcactgtcacccggccttggaagcatgtagag120
gccatcaaagaagccctgaacctcctggatgacatgcctgtcacgttgaatgaagaggta180
gaagtcgtctctaacgagttctccttcaagaagctaacatgtgtgcagacccgcctgaag240
atattcgagcagggtctacggggcaatttcaccaaactcaagggcgccttgaacatgaca300
gccagctactaccagacatactgccccccaactccggaaacggactgtgaaacacaagtt360
accacctatgcggatttcatagacagccttaaaacctttctgactgatatcccctttgaa420
tgcaaaaaaccaggccaaaaatgaggccgctgtgccttctagt463
<210>21
<211>760
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>ix改进空
<400>21
aataaaatacaccttttttcgattgtacgtatttttatttacggtaaatggcccgcctgg60
ctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaac120
gccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccactt180
ggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaa240
atggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagta300
catctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgg360
gcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgg420
gagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcccc480
attgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctg540
gctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactataggga600
gacccgcggccgctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgc660
cttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaaaaccagactct720
gtttggatttggatcaagcaagtgtcttgctgtctttatt760
<210>22
<211>1526
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>ix改进的hil12a
<400>22
aataaaatacaccttttttcgattgtacgtatttttatttacggtaaatggcccgcctgg60
ctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaac120
gccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccactt180
ggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaa240
atggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagta300
catctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgg360
gcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgg420
gagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcccc480
attgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctg540
gctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactataggga600
gacccgcggccatgtggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcgg660
ccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtc720
cagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggcca780
gaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaa840
acctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacc900
cttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtgg960
aggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacct1020
ctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgt1080
gccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatg1140
caaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagtta1200
ttgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctccc1260
ttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttca1320
gaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcctaaggccgct1380
gtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctg1440
gaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaaaaccagactctgtttggatttggat1500
caagcaagtgtcttgctgtctttatt1526
<210>23
<211>1517
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>l5初始hil12b
<400>23
aataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgga60
aagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagca120
accaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctc180
aattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgccc240
agttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgag300
gccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggc360
ttttgcaaaaagctttgcaaagatttatgtgtcaccagcagttggtcatctcttggtttt420
ccctggtttttctggcatctcccctcgtggccatatgggaactgaagaaagatgtttatg480
tcgtagaattggattggtatccggatgcccctggagaaatggtggtcctcacctgtgaca540
cccctgaagaagatggtatcacctggaccttggaccagagcagtgaggtcttaggctctg600
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aggccaagaattattctggacgtttcacctgctggtggctgacgacaatcagtactgatt840
tgacattcagtgtcaaaagcagcagaggctcttctgacccccaaggggtgacgtgcggag900
ctgctacactctctgcagagagagtcagaggggacaacaaggagtatgagtactcagtgg960
agtgccaggaggacagtgcctgcccagctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatgg1020
tggatgccgttcacaagctcaagtatgaaaactacaccagcagcttcttcatcagggaca1080
tcatcaaacctgacccacccaagaacttgcagctgaagccattaaagaattctcggcagg1140
tggaggtcagctgggagtaccctgacacctggagtactccacattcctacttctccctga1200
cattctgcgttcaggtccagggcaagagcaagagagaaaagaaagatagagtcttcacgg1260
acaagacctcagccacggtcatctgccgcaaaaatgccagcattagcgtgcgggcccagg1320
accgctactatagctcatcttggagcgaatgggcatctgtgccctgcagttagaaataac1380
ttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaat1440
aaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttat1500
catgtctggtgtttatt1517
<210>24
<211>4
<212>prt
<213>未知
<220>
<223>furin切割位点
<400>24
argalalysarg
1
<210>25
<211>1625
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>hil12furin
<400>25
atctgacctcgtcgacatgtgtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttt60
tctggcatctcccctcgtggccatatgggaactgaagaaagatgtttatgtcgtagaatt120
ggattggtatccggatgcccctggagaaatggtggtcctcacctgtgacacccctgaaga180
agatggtatcacctggaccttggaccagagcagtgaggtcttaggctctggcaaaaccct240
gaccatccaagtcaaagagtttggagatgctggccagtacacctgtcacaaaggaggcga300
ggttctaagccattcgctcctgctgcttcacaaaaaggaagatggaatttggtccactga360
tattttaaaggaccagaaagaacccaaaaataagacctttctaagatgcgaggccaagaa420
ttattctggacgtttcacctgctggtggctgacgacaatcagtactgatttgacattcag480
tgtcaaaagcagcagaggctcttctgacccccaaggggtgacgtgcggagctgctacact540
ctctgcagagagagtcagaggggacaacaaggagtatgagtactcagtggagtgccagga600
ggacagtgcctgcccagctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatggtggatgccgt660
tcacaagctcaagtatgaaaactacaccagcagcttcttcatcagggacatcatcaaacc720
tgacccacccaagaacttgcagctgaagccattaaagaattctcggcaggtggaggtcag780
ctgggagtaccctgacacctggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgt840
tcaggtccagggcaagagcaagagagaaaagaaagatagagtcttcacggacaagacctc900
agccacggtcatctgccgcaaaaatgccagcattagcgtgcgggcccaggaccgctacta960
tagctcatcttggagcgaatgggcatctgtgccctgcagtcgtgctaagcgaagaaacct1020
ccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgct1080
gagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcac1140
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tttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcat1260
aactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttag1320
tagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagct1380
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gctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaaga1500
accggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcg1560
ggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcctaataactcgagtcacc1620
aggcg1625
<210>26
<211>445
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>l5改进的sv40
<400>26
aataaaaggtttattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctcc60
ccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaag120
tccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaacc180
atagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattct240
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>使用ef1a启动子克隆到具有表达盒的l5-e4位点
的swai限制性内切位点的小鼠il12br
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<223>修饰的tata框
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<213>人工序列
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<223>修饰的tata框
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