包括冷冻和解冻过程的获得百日咳杆菌来源的蛋白质的方法与流程

本发明涉及一种纯化百日咳杆菌(bordetellapertussis)来源的prn蛋白的方法，其包括冷冻和解冻过程。
背景技术：
：百日咳是一种急性呼吸系统疾病，主要发生于婴儿，其特征是咳嗽2周或更长时间。百日咳杆菌是一种革兰氏阴性，好氧的短球杆菌，据报道可引起百日咳。百日咳杆菌以人类为唯一宿主，主要通过呼吸道感染。另外，百日咳杆菌生活在呼吸道粘膜上，并引起人体疾病。在1930年代，一种细胞百日咳疫苗被开发出来，该疫苗被证明对百日咳具有预防作用。此外，在1940年代，百日咳疫苗与破伤风和白喉灭活的四联疫苗联合使用。但是，全细胞百日咳疫苗(whole-cellpertussisvaccine)的不良反应(惊厥、红肿、发烧等)也有所报道。因此，需要开发安全的百日咳疫苗。1950年代，对百日咳杆菌的发病机理进行了研究，且百日咳毒素(pt)、丝状血凝素(fha)、百日咳杆菌粘附素(prn)(pertactin)和菌毛(fim)等成分作为抗原被报道。之后，正在进行涉及分离和纯化这些蛋白质的脱细胞(acelluar)百日咳疫苗的开发。1980年代后，日本首次开发了纯化的百日咳疫苗并进行了疫苗接种。蛋白(例如pt、fha和prn)必须纯化以制备脱细胞百日咳疫苗。传统上，抗原是通过重复硫酸铵沉淀和密度梯度离心同时纯化的。但是，这种方法的缺点是会产生很多杂质，并且难以控制纯化过程。另一种方法是使用物理和化学方法的组合分别纯化每种抗原。韩国公开专利公报第2015-0124973号公开了一种脱细胞百日咳疫苗组合物，其包含pt、fha和2和3型fim。同时，在包含混合三种或四种组分的百日咳疫苗的生产方法中，存在的问题是，甚至一种组分的生产率降低也可能增加整个生产周期。因此，正在寻求一种有效地大量生产prn蛋白的方法，以有效地制备百日咳疫苗。技术实现要素：技术问题鉴于此，发明人在努力寻求能够增加百日咳杆菌prn蛋白的提取量的条件的同时，确定了一种情况，即含有百日咳杆菌的样品在特定条件下进行冷冻(冷击(cold-shock))和解冻步骤，百日咳杆菌prn蛋白的提取量增加，从而完成了本发明。因此，本发明的目的是提供一种获得prn蛋白的方法，该方法可以导致百日咳杆菌的prn蛋白的提取量增加。问题的解决方案为了实现上述目的，本发明提供了一种获得百日咳杆菌来源的prn蛋白的方法，其包括以下步骤：1)冷冻含有百日咳杆菌的样品；2)解冻所述冷冻样品；3)破碎(disrupting)所述解冻的样品；4)纯化所述被破碎的样品。发明的有益效果根据本发明的获得百日咳杆菌的prn蛋白的方法包括，冷冻包含百日咳杆菌的样品并在冷藏温度下解冻该样品，从而使prn蛋白的提取量最大化。与不进行这样的预处理的提取方法相比，通过将在上述条件下进行了预处理的样品进行纯化，从而获得了prn蛋白的情况中，prn蛋白的提取量显著增加。另外，所述获得prn蛋白的方法也可以有效地用于为了生产百日咳疫苗而大量生产的prn蛋白。附图简述图1显示了prn纯化过程的流程图。图2显示了粒料(pellet)制备，解冻以及用尿素处理过程的详细流程图。图3显示了通过对在不同的制备和储存条件下获得的每个粒料进行尿素处理获得的结果。图4a显示了，使用sds-page技术，在通过比较例1至5和实施例1至3的每种方法获得prn蛋白的情况下，pnr蛋白的提取量的差异。图4b显示了，使用sds-page技术，在通过比较例6至10和实施例4和5的每种方法获得prn蛋白的情况下，pnr蛋白的提取量的差异。图4c显示了，使用sds-page技术，在通过比较例11至16和实施例6的每种方法获得prn蛋白的情况下，pnr蛋白的提取量的差异。图5a显示了，使用蛋白质印迹技术(westernblotting)，在通过比较例1至5和实施例1至3中的每种方法获得prn蛋白的情况下，pnr蛋白的提取量的差异。图5b显示了，使用蛋白质印迹技术(westernblotting)，在通过比较例6至10和实施例4和5中的每种方法获得prn蛋白的情况下，pnr蛋白的提取量的差异。图5c显示了，使用蛋白质印迹技术(westernblotting)，在通过比较例11至16和实施例6中的每种方法获得prn蛋白的情况下，pnr蛋白的提取量的差异。图6显示了通过比较例1至7和实施例1至3中的每种方法获得的prn蛋白，在不同的浆料(slurry)和粒料储存条件的情况下的prn蛋白的提取量。图7显示了通过比较例15至17和实施例7中的每种方法获得的prn蛋白，在不同的粒料储存条件的情况下的prn蛋白的提取量。图8显示了在使用不同的粒料解冻条件的情况下pnr蛋白的提取量的差异。具体实施方式实施发明的最佳方式在本发明的一个方面，提供了一种获得百日咳杆菌来源的prn蛋白的方法，其包括以下步骤：1)冷冻含有百日咳杆菌的样品；2)解冻所述冷冻样品；3)破碎所述解冻的样品；4)纯化所述被破碎的样品。第一，进行冷冻含有百日咳杆菌的样品的步骤。在本发明中，“百日咳杆菌”也称为副百日咳杆菌(bordetellaparapertussis)，是小至约0.3–1μm的革兰氏阴性球杆菌，无鞭毛和孢子。prn是百日咳杆菌的主要蛋白质之一，是百日咳杆菌粘附素的缩写，是引起百日咳的百日咳杆菌的致病因子。另外，prn，一种粘附于气管上皮细胞的外膜蛋白，是从百日咳杆菌获得的并且是百日咳疫苗的重要成分之一。在本说明书中，“含有百日咳杆菌的样品”可以是通过培养百日咳杆菌获得的培养物，通过连续离心从培养物中分离出的浆料(slurry)，或者通过高速离心从浆液获得的粒料，优选该粒料。这里，可以将所获得的浆料立即离心以获得粒料。但是，可以将获得的浆料在1-5天后离心以获得粒料。这里，浆料可以在0℃至25℃下存储。然而，本发明不限于此。在本发明的一个实施方案中，通过在改良的染色舒尔特氏菌(mss)(modifiedstainerscholte)培养基中于35℃的温度下培养百日咳杆菌菌株，并在室温下对细胞培养物进行连续离心2小时，并在室温下进行离心分离来制备粒料，将由此获得的浆料在2℃至8℃下以7,000rpm的速度高速离心50分钟。第二，进行解冻冷冻样品的步骤。在冷冻含有百日咳杆菌菌株的样品的步骤中，冷冻可以在-1℃、-2℃、-5℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃或-90℃的温度下进行，或在-1℃至-90℃、-5℃至-85℃、-15℃至-75℃或-30℃至-60℃的温度下进行。冷冻可以进行0.5小时，1小时，2小时，5小时，10小时，20小时，30小时或40小时，或者进行0.5小时至40小时、1小时至30小时、2小时至20小时、或5小时至10小时。另外，冷冻样品通过冷藏保存而缓慢地解冻。此处，解冻可通过在1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、7℃、10℃、15℃、20℃或25℃的温度下进行，或者在1℃至25℃、2℃至18℃、5℃至15℃或7℃至10℃的温度下进行。解冻可以通过冷藏进行0.1小时、1小时、5小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或60小时、或0.1小时至60小时、1小时至55小时、5小时至50小时或12至48小时。在本发明的一个实施方案中，将粒料在-30℃或更低的温度下冷冻保存2小时，并将冷冻的粒料在室温或1℃至7℃的冷藏温度下解冻。这里，冷冻步骤和解冻步骤可以重复执行一次或多次。第三，进行破碎解冻样品的步骤。解冻的样品经过破碎步骤。此处，破碎可以通过例如尿素处理，热处理，胍处理和碘处理来进行。但是，破碎方法不受限制，并且可以应用本领域中已知的各种破碎方法。在通过尿素处理破碎样品的情况下，可以在尿素浓度为0.1m、0.5m、1m、2m、3m、4m、5m、6m、7m、或10m、或尿素浓度为0.1m到10m、1m到8m、3m到7m或4m到5m的情况下进行。用尿素处理可以进行5分钟、10分钟、20分钟、50分钟、80分钟、120分钟、180分钟、240分钟或360分钟、或5分钟至360分钟、20分钟至240分钟或50分钟至180分钟。在本发明的一个实施方案中，通过将解冻的粒料放入4倍于粒料重量的5.0m尿素缓冲液，并进行搅拌3小时，来破碎粒料中的百日咳杆菌的外膜。第四，进行纯化被破碎样品的步骤。离心细胞裂解物(lysate)或细胞培养物后，可以使用各种柱色谱法等去除不必要的细胞碎片(celldebris)。柱色谱法可以包括离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶排阻色谱、凝胶过滤色谱、hplc、反相hplc、亲和色谱等。在本发明的一个实施方案中，在纯化破碎的粒料的步骤中，通过进行离子交换色谱法(iex)(ionexchangechromatography)、疏水相互作用色谱法(hic)(hydrophobicinteractionchromatography)和凝胶过滤色谱法(gfc)(gelfiltrationchromatography)获得prn蛋白。如本文所用，“离子交换色谱”可以使用其中阴离子或阳离子共价键合至作为交换树脂的固定相的离子交换树脂。流动相中带相反电荷的溶质离子通过静电吸引被吸引到固定相。离子交换色谱法基于通过静电力将离子或带电化合物吸附到离子交换剂(ionexchanger)上而达到的平衡。在本发明的一个实施方案中，prn蛋白通过以下方式洗脱，在离子交换色谱柱中使用阴离子交换树脂，并使用tris-hcl溶液作为平衡缓冲液，使用含有nacl溶液的tris-hcl作为洗涤缓冲液，以及使用含有nacl溶液的tris-hcl作为洗脱缓冲液。如本文所用，术语“疏水相互作用色谱”是指使用具有疏水官能团的基质(matrix)和分子之间的疏水相互作用的分离方法。通过修饰亲水性和非活性的琼脂糖可以使基质具有疏水功能。通过使烷基胺与brcn活化的琼脂糖反应获得的改性琼脂糖被广泛使用。疏水相互作用色谱法广泛用于蛋白质的纯分离。此外，在疏水相互作用色谱中，对于蛋白质洗脱，可能会降低离子强度或增加ph值，并且会降低极性的脂肪族胺(aliphaticamine)，醇或非离子型去污剂(例如吐温20和tritonx-100)可能会被使用。在本发明的一个实施方案中，prn蛋白通过以下方式洗脱，使用含有nacl溶液的tris-hcl溶液作为平衡缓冲液，使用含有nacl溶液的tris-hcl溶液作为洗涤缓冲液，以及使用含有nacl溶液的tris-hcl溶液作为洗脱缓冲液。如本文所用，“凝胶过滤色谱”在固定相中使用分子筛，该分子筛为亲水性的sephadex，聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶，因此能够吸收水从而溶胀。在样品分子的大小大于溶胀的凝胶的最大孔的情况下，该分子不穿过凝胶颗粒，因此穿过固定相颗粒中的空间离开柱子。较小的分子进入凝胶颗粒的开孔(openpore)，并根据其大小和形状以不同的速率通过。因此，分子按大小减小的顺序洗脱。在凝胶色谱法中，会考虑样品大小，粘度，离子强度，流速等。在本发明的一个实施方案中，使用含有nacl溶液的磷酸钠作为平衡缓冲液洗脱prn蛋白。实施发明的方式此外，将通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不仅限于此。实施例1获得prn的过程获得prn的过程按以下步骤进行：粒料制备和解冻，用尿素处理，柱色谱(iex，hic和sec)，浓缩和缓冲液交换(uf/df)以及纯化无杂质的prn蛋白。获得prn的过程的流程图如图1所示。实施例1.1培养百日咳杆菌在mss培养基中于35℃的温度下培养百日咳杆菌(韩国国立卫生研究院(koreanationalinstituteofhealth))4天。在培养期间，具体而言，1天进行种子培养，1天进行初级富集培养，1天进行二级富集培养，1天进行主要培养(mainculture)。实施例1.2粒料制备通过在室温下以100l/h和9,500rpm的流速连续离心2小时，将细胞培养物分离为培养物上清液和浆料。将分离出的浆料在5℃±3℃下以7,000rpm高速离心分离50分钟，从而制备粒料。在以下实施例中，在将浆料储存3天的情况下，将浆料在5℃的冷藏温度下储存3天，然后进行高速离心，以制备粒料。实施例1.3冷冻和解冻将制备的粒料在-30℃或更低的温度下储存2小时，然后通过在室温(rt)下储存1天解冻。随后，通过进行以下实施例1.4至1.7的步骤获得prn蛋白。另外，如下面的表1中所示的实施例1至6和比较例1至16中那样，在浆料的储存，冷冻和解冻条件不同的条件下进行实验，然后通过进行以下实施例1.4至1.7的步骤获得prn蛋白。表1实施例1.4用尿素处理向解冻的粒料中加入5.0m尿素缓冲液，其量为粒料重量的4倍。用磁力棒以280rpm的速度搅拌3小时。将已搅拌3小时的尿素处理溶液在5℃±3℃的条件下以7,000rpm(12230rcf)的速度进行高速离心1.5小时。离心后，除去细胞碎片并收集上清液。通过0.22μm的过滤器过滤所收集的上清液。实施例1.2和1.3的粒料制备和解冻以及用尿素处理的详细工艺流程如图2所示。实施例1.5在iex柱上纯化蒸馏水(dw)以3个柱体积(cv)，以100cm/hr的速度流过装有iex树脂的色谱柱，以除去存储溶液。然后，使1nnaoh溶液以40cm/hr流过其中1小时，以进行洗涤。作为平衡缓冲液的tris-hcl溶液以3个柱体积流过其中，以达到平衡。平衡完成后，浓缩液和缓冲液交换1的处理溶液通过iex色谱柱进行吸附。使平衡缓冲液以3个柱体积在其中流过，以除去残留在柱中的溶液。随后，使含有nacl溶液的tris-hcl溶液，即洗涤溶液，以5个柱体积流过其中，以进行洗涤。洗涤完成后，将含有nacl溶液的tris-hcl溶液，即洗脱缓冲液，以5个柱体积流过其中，以洗脱prn蛋白。实施例1.6在hic柱上进行纯化蒸馏水以3个柱体积，以100cm/hr的速度流过装有hic树脂的色谱柱，以除去存储溶液。然后，使1nnaoh溶液以40cm/hr流过其中1小时，以进行洗涤。作为平衡缓冲液的含有nacl溶液的tris-hcl溶液以3个柱体积流过其中，以达到平衡。平衡完成后，使一种溶液流过hic柱进行吸附，该溶液是将在iex柱上纯化过程获得的洗脱液与3.6mnacl以1：1比例混合而获得的。使平衡缓冲液以3个柱体积在其中流过，以除去残留在柱中的溶液。随后，使含有nacl溶液的tris-hcl溶液，即洗涤溶液，以5个柱体积流过其中，以进行洗涤。洗涤完成后，将含有nacl溶液的tris-hcl溶液，即洗脱缓冲液，以5个柱体积流过其中，以洗脱prn蛋白。实施例1.7在gfc柱上进行纯化蒸馏水以3个柱体积，以15cm/hr的速度流过装有gfc树脂的色谱柱，以除去存储溶液。然后，使1nnaoh溶液以15cm/hr流过其中1小时，以进行洗涤。作为平衡缓冲液的含有nacl的磷酸钠溶液以3个柱体积流过其中，以达到平衡。平衡完成后，浓缩液和缓冲液交换2的处理溶液通过gfc色谱柱，以洗脱prn蛋白。实验实施例1(experimentalexamples).确定取决于粒料制备和储存条件的prn提取量的差异为了确定有效增加prn蛋白提取量的条件，在获得实施例1的prn的过程中进行了不同的粒料制备和储存条件实验。粒料制备和储存条件如实施例1.3中的表1所示，在以下实验实施例1.1至1.5中示出了取决于各个条件的实验过程和结果。实验实施例1.1.尿素处理后上清液颜色的变化取决于浆料和粒料的储存条件通过使用如实施例1.3的表1所示的不同的制备和保存条件而获得的每个粒料，用尿素缓冲液进行处理，并进行搅拌。然后，将所得物离心。将通过离心分离得到的上清液用过滤器过滤，并根据各保存条件来识别上清液的色差。在实施例1.4中详细描述了上述过程，并且在图3中示出了实验结果。如图3所示，在将粒料冷冻保存然后冷藏保存的条件下(实施例2和3以及实施例5和6)，上清液显示出深黄色。这意味着在冷冻保存并解冻后，在用尿素处理的情况下，许多粒料破裂。实验实验例1.2.根据粒料储存条件确定蛋白质提取量的差异使用sds-page和蛋白质印迹技术来鉴定取决于粒料储存条件的prn蛋白提取量的差异。此处，在蛋白质印迹技术中，将豚鼠(guineapig)抗prn(younginfrontier)和生物素标记的豚鼠抗prn(younginfrontier)用作抗体。这些结果在图4和5中示出。如图4和图5所示，在将粒料冷冻保存然后冷藏保存的条件下(实施例1至6)，获得了大量的prn蛋白。实验实验例1.3.根据浆料和粒料的储藏条件确定prn蛋白的提取量使用酶联免疫吸附测定(elisa)技术来确定，取决于浆料和粒料储存条件的prn蛋白提取量的差异。结果如图6所示。这里，图6中的图表的底部的项目1至项目11的各自的粒料储存条件如下所示，更详细的条件在下面的表2中显示：1：粒料制备后立即用尿素处理；2：冷冻储存并在室温下解冻1天；3：不冷冻储存在室温下解冻1天；4：冷冻储存并在冷藏下解冻1天；5：冷冻储存并在冷藏下解冻3天；6：不冷冻储存在冷藏下解冻1天；7：不冷冻储存在冷藏下解冻3天；8：冷冻(-30℃)储存1天；9：冷冻(-30℃)储存3天；10：冷冻(-70℃)储存1天；和11：冷冻(-70℃)储存3天。表2浆料，储存0天浆料，储存3天1.粒料制备后立即处理比较例1比较例92.冷冻储存然后室温储存1天实施例1实施例43.在室温下储存1天比较例2比较例104.冷冻储存然后冷藏储存1天实施例2实施例55.冷冻储存然后冷藏储存3天实施例3实施例66.冷藏储存1天比较例3比较例117.冷藏储存3天比较例4比较例128.冷冻(-30℃)储存1，1天比较例5比较例139.冷冻(-30℃)储存1，3天比较例6比较例1410.冷冻(-70℃)储存2，1天比较例7比较例1511.冷冻(-70℃)储存2，3天比较例8比较例16如图6所示，以浆料状态储存0天后制备的粒料，在冷冻保存时，prn蛋白的提取量随着时间而增加(通过实施例2和3的比较)；并且，以浆料状态储存3天后制备的粒料，在冷冻保存时，prn蛋白的提取量随着时间的经过而减少(通过实施例5和实施例6的比较)。另外，与未冷冻保存的粒料相比，冷冻保存的粒料显示出prn蛋白质的提取量增加(实施例1与比较例2的比较，实施例2与比较例3的比较，在实施例3和比较例4的比较)。这意味着，为了增加prn蛋白的提取量，与将浆料原样保存相比，立即将浆料制粒(pelletize)并存储粒料比将浆料原样存储更有效，并且冷冻步骤导致prn蛋白的提取量大大增加。实验实验例1.4.确定取决于粒料解冻的prn蛋白提取量的差异在图6中，冷冻储存的实验组中(实施例1和4，实施例2和5，实施例3和6，比较例5和13，比较例6和14，比较例7和15以及比较例8和16)，冷冻储存并解冻的实验组(实施例1和4，实施例2和5以及实施例3和6)显示出prn蛋白的提取量显著增加。因此，进行了进一步的实验以鉴定prn蛋白的提取量是否根据解冻而变化。这里，在5℃的冷藏温度下进行48小时的粒料解冻。实验结果示于表3和图7。表3条件编号prn浓度(μg/ml)具体的储存条件尿素处理前粒料的状态比较例1539.95浆料，储存3天；粒料，-70℃储存1天冷冻比较例1634.68浆料，储存3天；粒料，-70℃储存3天冷冻比较例1732.31浆料，储存3天；粒料，-70℃储存10天冷冻实施例799.94浆料，储存3天；粒料，-70℃储存10天解冻(5℃，48小时)如表3和图7所示，在用尿素处理之前将粒料解冻的情况下，与冷冻粒料的情况相比，观察到prn蛋白的提取量增加了约3倍。在所有三个对冷冻粒料进行尿素处理的实验组中，prn蛋白的提取量均较低。这意味着在用尿素处理之前，粒料的解冻对prn蛋白的提取有很大的影响。从这些结果中发现，为了有效地增加prn蛋白的提取量，必须在用尿素处理之前将粒料解冻。实验实验例1.5.确定取决于粒料解冻条件的prn蛋白提取量的差异为了确定取决于粒料解冻方法的prn蛋白的提取量的差异，检查了以下情况下prn蛋白的提取量：将粒料冷冻储存之后，冷藏(2天)，室温(1小时)和37℃(15分钟)。这些结果如图8所示出。如图8所示，当进行解冻时，与在高温下快速解冻的情况相比，在冷藏中缓慢解冻的情况下观察到prn蛋白的提取量增加。另外，与在37℃下解冻15分钟的情况相比，在冰箱中解冻2天的情况下观察到prn蛋白的提取量增加了约2倍。从这些结果中发现，为了有效地增加prn蛋白的提取量，粒料冷冻后必须缓慢地冷藏解冻。实验实施例2.确定放大(scale-up)的可能性为了确定是否可以有效地以甚至50l的比例施加实验例1.1至1.5中确定的条件，并在该条件下可以有效地增加prn蛋白的提取量，将浆料立即制粒而不进行储存，将得到的粒料冷冻(-30℃)保存1天，然后在冷藏(5℃)中解冻2天。随后，收集533g的粒料，用1800ml的5.0m尿素缓冲液进行处理，并使用磁力棒搅拌3小时。将搅拌过的经尿素处理的溶液以6,300rpm的速度离心1.5小时。离心后，去除细胞碎片；收集1650ml上清液，并通过过滤器过滤。随后，进行实施例1.5至1.7的步骤。结果如表4所示。表4总体积(ml)prn浓度(μg/ml)总prn量(mg)prn176.3701.98123.76如表4所示，发现在实验例1.1至1.5中确定的条件下，即使在50-l规模下，也可以有效地增加prn蛋白的提取量，可以在200-l规模获下得300mg至400mg的prn蛋白。当前第1页12