用于抗体药物缀合物的接头的制作方法

本申请要求2017年5月24日提交的美国临时专利申请号62/510,505和2018年3月7日提交的美国临时专利申请号62/639,894的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术：

1.技术领域

本公开涉及医学、药理学、化学和肿瘤学的领域。特别地，公开与抗体-药物缀合物(adc)相关的化合物、组合物、治疗方法和合成方法。

2.相关技术

抗体-药物缀合物(adc)是通过化学接头系栓至高度细胞毒性分子(有效载荷)的治疗性单克隆抗体，已经作为一种有希望的治疗形式出现，所述治疗形式可回避癌症化学疗法中源于化学治疗剂的脱靶细胞毒性的严重副作用(polakis,2016；tsuchikama和an,2016)。缀合方法和化学接头是决定adc的药物动力学和稳定性概况的极重要因素(lu等人,2016)。传统缀合方法是赖氨酸酰胺偶合和半胱氨酸顺丁烯二酰亚胺偶合(phillips等人,2008；katz等人,2011)。虽然简单并且最频繁地加以使用，但这些方法产生缀合位点和药物:抗体比率(dar)不同的adc。所述异质adc通常经受增加的清除率(hamblett等人,2004；panowski等人,2013)并且需要严格控制的生产以最小化dar变化(senter等人,2012)。为了克服这一问题，位点特异性缀合已经作为建构均质adc的手段出现。junutula和同事报告了thiomab技术，所述技术利用通过针对接头缀合的基因工程化并入的两个半胱氨酸残基以产生具有规定dar的adc(junutula等人,2008)。通过这种方法获得的adc显示与通过传统半胱氨酸-顺丁烯二酰亚胺偶合制备的异质adc相比改进的pk概况和体内功效。自此，已经开发了用于建构均质adc的其他方法，包括半胱氨酸再桥接(bryden等人,2014；behrens等人,2015；maruani等人,2015；robinson等人,2017)、非天然氨基酸并入(axup等人,2012；tian等人,2014；zimmerman等人,2014；vanbrunt等人,2015)和(化学)酶方法(popp等人,2009；jeger等人,2010；strop等人,2013；zhou等人,2014；vangeel等人,2015)。schibli和同事报告了使用微生物转谷氨酰胺酶(mtg酶)的抗体-接头缀合方法。通过mtg酶介导的转肽作用，这种方法使含有末端伯胺的adc接头共价系栓至人igg重链的谷氨酰胺295(q295)的侧链(图1a)(dennler等人,2014)。

迄今所开发的大多数adc接头仅负载单一有效载荷。可负载多个有效载荷分子的支化接头还有待充分研究。多负载策略允许与传统接头相比用抗体结构的较少化学或酶修饰增加dar。dar的这一增加可能引起有效的adc建构、抗体结构的最小不稳定化和增强的adc功效。据我们所知，先前仅有配备有双重负载接头的adc的少数实例(dubowchik等人,2002；king等人,2002；maruani等人,2016)。最近开发了使得能够进行模块有效载荷安装的基于半胱氨酸缀合的双重负载接头(levengood等人,2017)。因此，仍需要能够递送多种有效载荷的adc。

另外，adc接头结构和抗体-有效载荷缀合形式影响adc均质性、细胞毒性效能、耐受性和药物动力学(pk)。这些关键参数显著地促成总体体内治疗功效(lu等人,2016，hamblett等人,2004，junutula等人,2008，和behrens等人,2015)。因此，细化接头和缀合化学对于最大化adc的治疗潜力和安全性概况至关重要。

技术实现要素：

在一些方面，本公开提供可用于制备抗体药物缀合物的连接基团、使用这些接头制备的抗体药物缀合物和其组合物和治疗方法。

在一些方面，本公开提供下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

a1、a2和a3各自独立地为烷烃二基c1-12、芳烃二基c1-12、杂芳烃二基c1-12、环烷烃二基c1-12、杂环烷烃二基c1-12或其取代形式或经典氨基酸的侧链基团；

x、y和z各自独立地为–[o(ch2)q]–、–[o(chw′)q]–或–[o(cw′w″)q]–；

其中：

w′和w″各自独立地为氨基、羟基、卤基、巯基、烷基c1-12、环烷基c1-12、烯基c1-12、炔基c1-12、芳基c1-12、芳烷基c1-12、杂芳基c1-12、杂芳烷基c1-12、杂环烷基c1-12、酰基c1-12、酰氧基c1-12、烷基氨基c1-12或其取代形式；

q为1-3；

m、n、o和p各自独立地为0-12；

r为1、2或3；

r1、r2和r3各自独立地为–nh2、–nhr4、–nr4r5、–n3或缀合基团；

其中：

r4和r5各自独立地为烷基c1-12、环烷基c1-12、烯基c1-12、炔基c1-12、芳基c1-12、芳烷基c1-12、杂芳基c1-12、杂芳烷基c1-12、杂环烷基c1-12、酰基c1-12、酰氧基c1-12、烷基氨基c1-12或其取代形式或单价氨基保护基；或

r4和r5合在一起并且为二价氨基保护基；

其条件是r1、r2和r3中的至少一者为–nh2并且r1、r2和r3中的至少一者为–n3。

在一些实施方案中，所述化合物进一步被限定为：

在一些实施方案中，所述化合物进一步被限定为：

在一些实施方案中，x为–[o(ch2)q]–或–[o(chw′)q]–。在一些实施方案中，y为–[o(ch2)q]–或–[o(chw′)q]–。在一些实施方案中，z为–[o(ch2)q]–或–[o(chw′)q]–。在一些实施方案中，w′为氨基、羟基、卤基或巯基。在其他实施方案中，w′为烷基c1-12、环烷基c1-12或其取代形式。在一些实施方案中，w′为烷基c1-12或取代的烷基c1-12。在其他实施方案中，w′为酰基c1-12、酰氧基c1-12、烷基氨基c1-12或其取代形式。

在一些实施方案中，r1、r2和r3中的两者为–n3。在一些实施方案中，r1、r2和r3中的一者为–nh2、–nhr4或–nr4r5。在一些实施方案中，r1、r2和r3中的一者为–nh2。在一些实施方案中，q为1。在其他实施方案中，q为2。在其他实施方案中，q为3。

在一些实施方案中，所述化合物进一步被限定为：

另一方面，本公开提供下式的缀合物：

(x1–z1)r-l–a4(iv)

其中：

x1为药物；

l为本文所述的接头；

z1为间隔基团；

r为1-12；并且

a4为细胞靶向部分。

在一些实施方案中，x1为化学治疗药物，如mmaf。在一些实施方案中，z1包含可通过如组织蛋白酶b的细胞内酶裂解的多肽。在一些实施方案中，z1包含自我牺牲型基团。在一些实施方案中，z1是包含炔部分、多肽部分和对氨基苯甲氧基羰基(pabc)部分的间隔基团。在一些实施方案中，所述炔为二苯并环辛炔(dbco)。在一些实施方案中，所述多肽为val-cit。在一些实施方案中，a4是抗体，其抗原为肿瘤相关抗原。

在一些实施方案中，l为连接基团，其中r1、r2和r3中的一者为缀合基团。在一些实施方案中，所述缀合基团连接至第二细胞靶向部分a4′。在一些实施方案中，a4′是与a4不同的细胞靶向部分。在一些实施方案中，所述缀合基团连接至第二间隔基-药物部分–(z1′–x1′)r。在一些实施方案中，–(z1′–x1′)r是与–(z1–x1)r不同的间隔基-药物部分。

在进一步方面，本公开提供下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

x1为共价键、烷烃二基(c≤12)或取代的烷烃二基(c≤12)；

r1为氢、-(och2ch2)n1zr6或取代的-(och2ch2)n1zr6，其中：

n1为0-50；并且

r6为氢、羟基、胺、巯基、羟基胺、肼或叠氮化物；或

烷基(c≤12)、烯基(c≤12)、炔基(c≤12)、烷基肼(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；

包含1至6个甘氨酸单元的聚甘氨酸；或

下式的子结构：

其中：

a1和a2各自独立地不存在或为芳烃二基(c≤12)、取代的芳烃二基(c≤12)、杂芳烃二基(c≤12)或取代的杂芳烃二基(c≤12)，并且形成稠合芳烃(c≤12)、取代的芳烃(c≤12)、杂芳烃(c≤12)或取代的杂芳烃(c≤12)；

a4或a5各自独立地选自共价键、烷烃二基(c≤8)或取代的烷烃二基(c≤8)；

rd、re、re′和rh各自独立地选自氢、卤基、硫酸酯基、甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基、芳基(c≤8)或取代的芳基(c≤8)；

rf为卤基；

rg为胺、肼、烷基氨基(c≤8)、取代的烷基氨基(c≤8)、二烷基氨基(c≤8)、取代的二烷基氨基(c≤8)、烷基肼(c≤8)或取代的烷基肼(c≤8)；

x4为o、n、ch2，或x4为烷烃二基(c≤8)或取代的烷烃二基(c≤8)并且合在一起以形成由3至8个环原子组成的稠合环烷基；

r16为羟基、氨基或氧代；

r17为羧基；或

烷基(c≤12)、酰胺基(c≤12)、芳基(c≤12)、杂芳基(c≤12)、-c(o)nr20r20′或这些基团中任一者的取代形式，其中：

r20和r20′各自独立地为氢；或

烷基(c≤12)、芳基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；

r18和r19各自独立地为羟基、氨基、卤基；或

烷基(c≤12)、芳基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；

z为共价键、烷烃二基(c≤12)、-c(o)-烷烃二基(c≤12)、-c(o)-烷烃二基(c≤12)-c(o)nh-或这些基团中任一者的取代形式；

r2为氢、烷基(c≤12)、取代的烷基(c≤12)、酰基(c≤12)、取代的酰基(c≤12)或单价氨基保护基；

w为共价键或具有2-21个连接点的多价聚合物；

n3为1至20，其条件是当w为共价键时，那么n3为1并且当w为多价聚合物时，那么n3小于或等于连接点的数目减1；

各x独立地为共价键、烷烃二基(c≤12)或取代的烷烃二基(c≤12)；

各x2独立地为烷烃二基(c≤12)或取代的烷烃二基(c≤12)；

各r3独立地为羟基或氨基；或

烷氧基(c≤12)、酰氧基(c≤12)、烷基氨基(c≤12)、二烷基氨基(c≤12)、酰胺基(c≤12)、杂芳基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；或

-x9-c(o)r7，其中：

x9为o、-nrb-或共价键；

rb为氢、烷基(c≤6)、取代的烷基(c≤6)或单价氨基保护基；

r7为羟基或氨基；或

烷氧基(c≤12)、烷基氨基(c≤12)、二烷基氨基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；或

-a3so2nr21r21′、-a3p(o)(oh)or22或–a3so2or22′，其中：

a3为o、-nrc-或共价键；

rc为氢、烷基(c≤6)、取代的烷基(c≤6)或单价氨基保护基；

r21、r21′、r22及r22′各自独立地为氢、烷基(c≤12)、环烷基(c≤12)、芳基(c≤12)、杂芳基(c≤12)、芳烷基(c≤12)、杂芳烷基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；

各r23独立地为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪氨酸的羟基保护形式或色氨酸的氨基保护形式的侧链部分；并且

各r24独立地为丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸或其氨基保护形式的侧链部分；

各q独立地为下式的基团：

其中：

各r5独立地为氢或-c(o)-r8，其中：

r8为化学治疗剂；

各x5独立地为共价键、o、s、-nh-、烷烃二基(c≤12)、取代的烷烃二基(c≤12)、-(och2ch2)n2-或取代的-(och2ch2)n2-，其中：

n2为0-50；或

下式的基团：

其中：

ra和ra′各自独立地为氢、烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；

x6为o或-nr26r26′-，其中：

r26和r26′各自独立地为烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；

x7为共价键、o、s、-nh-、-(och2ch2)n3-或取代的-(och2ch2)n3-，其中：

n3为0-50；或

下式的基团：

其中：

y1为o或s；

y2为o、s、-nh-或-nr27-，其中：

r27为烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；并且

x8为共价键、o、s、-nh-、-(och2ch2)n3-或取代的-(och2ch2)n3-。

在一些实施方案中，w为多价聚合物，如树枝状聚合物。在一些实施方案中，所述多价聚合物具有3个连接点。在一些实施方案中，n3大于1。在其他实施方案中，所述多价聚合物具有2个连接点。在其他实施方案中，w为共价键。在一些实施方案中，x为共价键。在一些实施方案中，x1为烷烃二基(c≤12)或取代的烷烃二基(c≤12)。在进一步实施方案中，x1为烷烃二基(c≤12)，如亚甲基。

在一些实施方案中，r24为瓜氨酸或其氨基保护形式的侧链部分。在进一步实施方案中，r24为瓜氨酸的侧链部分。在一些实施方案中，r23为缬氨酸的侧链部分。在一些实施方案中，x2为烷烃二基(c≤12)。在进一步实施方案中，x2为烷烃二基(c≤6)，如亚甲基或乙烷二基。在一些实施方案中，r3为羟基、氨基、烷氧基(c≤12)、取代的烷氧基(c≤12)、烷基氨基(c≤12)、二烷基氨基(c≤12)、酰胺基(c≤12)或-x9-c(o)r7。在进一步实施方案中，r3为羟基。在其他实施方案中，r3为氨基。在其他实施方案中，r3为烷氧基(c≤12)，如叔丁氧基。在其他实施方案中，r3为-x9-c(o)r7。在一些实施方案中，x9为-nh-或共价键。在进一步实施方案中，x9为共价键。在一些实施方案中，r7为羟基。在其他实施方案中，r7为烷氧基(c≤12)或取代的烷氧基(c≤12)。在进一步实施方案中，r7为烷氧基(c≤12)，如叔丁氧基。

在一些实施方案中，r5为氢。在其他实施方案中，r5为-c(o)-r8，其中r8为化学治疗剂。在进一步实施方案中，所述化学治疗剂为单甲基澳瑞他汀e(mmae)、澳瑞他汀f(mmaf)，或澳瑞他汀、海兔毒素、美登素、倍癌霉素、特吡莱辛(tubulysin)、加利车霉素(chalicheamicin)、吡咯并苯并二氮杂二聚体、蒽环霉素、紫杉醇、长春花碱或鹅膏蕈碱的衍生物。在又进一步实施方案中，所述化学治疗剂为mmaf。在一些实施方案中，x5为下式的基团：

在一些实施方案中，r1为-(och2ch2)n1zr6或取代的-(och2ch2)n1zr6。在一些实施方案中，r6为羟基。在其他实施方案中，r6为下式的子结构：

在一些实施方案中，z为-c(o)-烷烃二基(c≤12)-c(o)nh-或取代的-c(o)-烷烃二基(c≤12)-c(o)nh-。在进一步实施方案中，z为-c(o)-烷烃二基(c≤12)-c(o)nh-，如-c(o)-乙烷二基-c(o)nh-。在一些实施方案中，n1为0-10。在进一步实施方案中，n1为0-5，如3。在又进一步实施方案中，n1不为0。

在其他方面，本公开提供下式的缀合物：

t-l(vi)

其中：

t为细胞靶向部分；并且

l为本公开的接头。在一些实施方案中，l包含化学治疗药物，如mmaf。在一些实施方案中，t为抗体。在进一步实施方案中，所述抗体其抗原为肿瘤相关抗原的抗体。

在其他方面，本公开提供下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

x1为烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；

r2为氢、烷基(c≤12)、取代的烷基(c≤12)、酰基(c≤12)、取代的酰基(c≤12)或单价氨基保护基；

w为共价键或具有2-21个连接点的多价聚合物；

n3为1至20，其条件是当w为共价键时，n3为1并且当w为多价聚合物时，n3小于或等于连接点的数目减1；

各x独立地为共价键、烷烃二基(c≤12)或取代的烷烃二基(c≤12)；

各x2独立地为烷烃二基(c≤12)或取代的烷烃二基(c≤12)；

各r3独立地为羟基或氨基；或

烷氧基(c≤12)、酰氧基(c≤12)、烷基氨基(c≤12)、二烷基氨基(c≤12)、酰胺基(c≤12)、杂芳基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；或

-x9-c(o)r7，其中：

x9为o、-nrb-或共价键；

rb为氢、烷基(c≤6)、取代的烷基(c≤6)或单价氨基保护基；

r7为羟基或氨基；或

烷氧基(c≤12)、烷基氨基(c≤12)、二烷基氨基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；或

-a3so2nr21r21′、-a3p(o)(oh)or22或–a3so2or22′，其中：

a3为o、-nrc-或共价键；

rc为氢、烷基(c≤6)、取代的烷基(c≤6)或单价氨基保护基；

r21、r21′、r22及r22′各自独立地为氢、烷基(c≤12)、环烷基(c≤12)、芳基(c≤12)、杂芳基(c≤12)、芳烷基(c≤12)、杂芳烷基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；

各r23独立地为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪氨酸的羟基保护形式或色氨酸的氨基保护形式的侧链部分；并且

各r24独立地为丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸或其氨基保护形式的侧链部分；

各q独立地为下式的基团：

其中：

各r5独立地为氢或-c(o)-r8，其中：

r8为化学治疗剂；

各x5独立地为共价键、o、s、-nh-、烷烃二基(c≤12)、取代的烷烃二基(c≤12)、-(och2ch2)n2-或取代的-(och2ch2)n2-，其中：

n2为0-50；或

下式的基团：

其中：

ra和ra′各自独立地为氢、烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；

x6为o或-nr26r26′-，其中：

r26和r26′各自独立地为烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；

x7为共价键、o、s、-nh-、-(och2ch2)n3-或取代的-(och2ch2)n3-，其中：

n3为0-50；或

下式的基团：

其中：

y1为o或s；

y2为o、s、-nh-或-nr27-，其中：

r27为烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；并且

x8为共价键、o、s、-nh-、-(och2ch2)n3-或取代的-(och2ch2)n3-。

在一些实施方案中，w为多价聚合物，如树枝状聚合物。在一些实施方案中，所述多价聚合物具有3个连接点。在一些实施方案中，n3大于1。在其他实施方案中，所述多价聚合物具有2个连接点。在其他实施方案中，w为共价键。在一些实施方案中，x为共价键。在一些实施方案中，x1为烷基(c≤12)，如乙基或甲基。在一些实施方案中，r24为瓜氨酸或其氨基保护形式的侧链部分。在进一步实施方案中，r24为瓜氨酸的侧链部分。在一些实施方案中，r23为缬氨酸的侧链部分。在一些实施方案中，x2为烷烃二基(c≤12)。在进一步实施方案中，x2为烷烃二基(c≤6)，如亚甲基或乙烷二基。

在一些实施方案中，r3为羟基、氨基、烷氧基(c≤12)、取代的烷氧基(c≤12)、烷基氨基(c≤12)、二烷基氨基(c≤12)、酰胺基(c≤12)或-x9-c(o)r7。在进一步实施方案中，r3为羟基。在其他实施方案中，r3为氨基。在其他实施方案中，r3为烷氧基(c≤12)，如叔丁氧基。在其他实施方案中，r3为-x9-c(o)r7。在一些实施方案中，x9为-nh-或共价键。在进一步实施方案中，x9为共价键。在一些实施方案中，r7为羟基。在其他实施方案中，r7为烷氧基(c≤12)或取代的烷氧基(c≤12)。在又进一步实施方案中，r7为烷氧基(c≤12)，如叔丁氧基。在一些实施方案中，r5为氢。在其他实施方案中，r5为-c(o)-r8，其中r8为化学治疗剂。在进一步实施方案中，所述化学治疗剂为单甲基澳瑞他汀e(mmae)、澳瑞他汀f(mmaf)，或澳瑞他汀、海兔毒素、美登素、倍癌霉素、特吡莱辛(tubulysin)、加利车霉素(chalicheamicin)、吡咯并苯并二氮杂二聚体、蒽环霉素、紫杉醇、长春花碱或鹅膏蕈碱的衍生物。在又进一步实施方案中，所述化学治疗剂为mmaf。在一些实施方案中，x5为下式的基团：

另一方面，本公开提供包含本文所述的缀合物和赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物是配制用于口服、脂肪内、动脉内、关节内、颅内、皮内、病灶内、肌肉内、鼻内、眼内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、直肠内、鞘内、气管内、肿瘤内、脐内、阴道内、静脉内、囊内、玻璃体内、脂质体、局部、粘膜、肠胃外、直肠、结膜下、皮下、舌下、表面、经颊、经皮、阴道、经由导管、经由灌洗、经由连续输注、经由输注、经由吸入、经由注射、经由局部递送或经由局部灌注施用。

另一方面，本公开提供治疗患者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症，如癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤或精原细胞瘤，或者是膀胱、血液、骨、脑、乳房、中枢神经系统、子宫颈、结肠、子宫内膜、食道、胆囊、胃肠道、生殖器、泌尿生殖道、头、肾、喉、肝、肺、肌肉组织、颈、口腔或鼻粘膜、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、脾、小肠、大肠、胃、睾丸或甲状腺的癌症。

在其他实施方案中，所述疾病或病症是微生物感染。在其他实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫疾病。在其他实施方案中，所述疾病或病症与炎症相关。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用第二疗法。在一些实施方案中，所述患者为哺乳动物，如人。在一些实施方案中，所述缀合物或组合物施用一次。在其他实施方案中，所述缀合物或组合物施用两次或更多次。

通过以下详细描述，本公开的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应理解，虽然指示本发明的具体实施方案，但所述详细描述和具体实施例仅通过说明的方式给出，因为通过这一详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。注意，只是因为特定化合物划归于一个特定通式不意指它无法还属于另一通式。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步证明本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合所述详细描述，可更好地理解本公开。

图1.mtg酶介导的使用直链或支化接头的抗体-药物缀合。含叠氮化物的接头使用mtg酶与igg重链的q295的侧链缀合，随后通过应变促进的叠氮化物-炔环加成安装有效载荷以提供dar为2(直链接头)或4(支化接头)的adc。

图2.弗斯特共振能量转移(fret)分析中的淬灭剂释放速率测定。反映药物(淬灭剂)释放速率的各斜率是使用graphpadprism7软件通过线性回归来计算。支化探针3和4的值加倍用于作图，因为这些探针具有两个淬灭剂部分。所有分析均一式三份执行，并且误差棒表示sem。

图3a和图3b.(a)完整n297a抗her2抗体在280nm下的uv迹线，总离子色谱图，和解卷积质谱。(b)dtt还原的n297a抗her2抗体(重链和轻链)在280nm下的uv迹线，总离子色谱图，和解卷积质谱。

图4a-f.在由schibli和同事(polakis,2016)报告的反应条件(a–c)或在这一文章中报告的最佳条件(d–e)下获得的含有支化接头5(a和d)、6(b和e)或7(c和f)的n297a抗her2抗体缀合物的解卷积质谱。表2中显示的转化率是基于这些解卷积峰的质量强度测定的。

图5a和图5b(a)n297a抗her2抗体-支化接头5缀合物在280nm下的uv迹线，总离子色谱图，和解卷积质谱。(b)dtt还原的n297a抗her2抗体-支化接头5缀合物(重链和轻链)在280nm下的uv迹线，总离子色谱图，和解卷积质谱。

图6a-c(a)n297a抗her2抗体-mmaf缀合物9在280nm下的uv迹线，总离子色谱图，和解卷积质谱。星号峰(152523.82da)指示源于dar-4物质(153294.68da)的离子片段，其对应于约770.86da的损失。(b)n297adtt还原的adc9(重链和轻链)的重链和轻链在280nm下的uv迹线，总离子色谱图，和解卷积质谱。星号峰(52436.27da)指示源于重链-mmaf(53208.63da)的离子片段，其对应于约772.36da的损失。(c)粗物质adc9在纯化之前的sec色谱图(uv：280nm)。在15.552min周围的弱峰是源于高分子量蛋白质(蛋白质聚集物)。这一色谱图清楚地指示adc9是>99％单体。

图7a-d显示支化adc9的合成和表征。(a)通过应变促进的叠氮化物-炔环加成实现的抗体-有效载荷缀合(无铜点击反应)。(b)解卷积esi-质谱。顶部图：n297a抗her2mab。中间图：抗体-支化接头缀合物。抗体-接头二缀合物是主要产物并且检测到极少量的单缀合物。底部图：抗体–mmaf(星形)缀合物9。所述点击反应提供作为主要产物的dar为4的adc和少量具有较小dar(2和3)的adc。星号(*)指示源于dar-4产物的片段离子(参见图3)。(c)adc9的逆相hplc迹线(uv：280nm)。平均dar基于各dar物质的峰面积经测定为3.9。(d)粗物质adc9(在纯化之前)的sec迹线(uv：280nm)。在15.6min处的小峰是源于高分子量蛋白质(蛋白质聚集物)，指示adc9的单体含量是>99％。

图8显示预测的片段。dbco-peg4-val-cit-pabc-mmaf的精确质量为1670.92da并且dbco-peg4-val-cit-pab-oh的精确质量为899.44da。这两者之间的差异为771.48da。这一值与图s5中的离子片段的观察值一致。

图9显示人血浆中的adc9在37℃下的稳定性(一式两份执行)。7天之后未观察到dar的显著减少。

图10显示使用skbr-3(her2阳性，左侧)和mda-mb-231(her2阴性，右侧)细胞系的基于细胞的elisa。测量未缀合n297a抗her2mab(圆形)和adc9(δ)、10(正方形)和11(倒三角形)针对her2的结合亲和力。所有分析均一式三份执行。误差棒表示sem并且圆括号中的值是95％置信区间。所有测试的抗体均显示her2依赖性细胞结合。

图11显示通过基于细胞的elisa获得的饱和度-结合曲线。所有分析均一式三份执行，并且误差棒表示sem。n297a抗her2抗体和adc9–10以可相当的结合亲和力结合于skbr-3细胞(her2阳性，左侧)而非结合于mda-mb-231细胞(her2阴性，右侧)。

图12显示未缀合n297a抗her2mab(圆形)和adc9(δ)、10(正方形)和11(倒三角形)的体外细胞毒性。所有分析均一式三份执行。误差棒表示sem并且圆括号中的值是95％置信区间。支化adc9显示测试的抗体在skbr-3和mda-mb-453两者中的最大细胞杀死效能。测试的抗体均未在mda-mb-231中显示显著细胞杀死。

图13a-13c显示组织蛋白酶b反应性可裂解肽的结构和血浆稳定性。(图13a)基于vcit和evcit的adc接头。vcit接头归因于对于细胞外羧酸酯酶ces1c的易感性在小鼠血浆中不稳定。这种不稳定性通常触发有效载荷在循环期间的过早释放。相比之下，具有高极性的基于vcit的三肽序列(如evcit)可对组织蛋白酶b介导的裂解具反应性，但在小鼠血浆中极其稳定。(图13b)含有vcit(12a)、svcit(12b)、evcit(12c)、dvcit(12d)、kvcit(12e)或羟基-gvcit(12f)可裂解序列的基于芘的小分子探针的结构。(图13c)探针1a-f在37℃下在未稀释balb/c小鼠血浆中的稳定性。evcit和dvcit探针12c-12d显示测试的高血浆稳定性，同时可对组织蛋白酶b介导的裂解具高度反应性。所显示的血浆稳定性数据代表以技术双重复执行的超过两个独立试验。误差棒表示sem并且圆括号中的值是95％置信区间。

图14a和图14b显示(图14a)在37℃下探测的12a-12e的人组织蛋白酶b介导的裂解。左侧图：vcit和svcit探针未完全裂解，因为有限量的组织蛋白酶b用于精确地监测高度反应性evcit、dvcit和kvcit探针。右侧图：vcit和svcit探针几乎由有限条件(左侧图)的10倍多的组织蛋白酶b裂解。(图14b)探针12a-12e在37℃下在人血浆中的稳定性。所有分析均一式两份执行，并且误差棒表示sem。

图15a-15e显示adc14a-c的建构和表征。(图15a)通过mtg酶介导的支化接头缀合并且根据应变促进的叠氮化物-炔环加成实现的adc14a-c的建构(火花：peg间隔基–可裂解接头–mmaf分子)。(图15b)解卷积esi-质谱。顶部图：n297a抗her2mab。第二个图：抗体-支化接头缀合物。第三个图-第五个图：高度均质adc14a-c。星号(*)指示在esi-ms分析中检测的片段离子。(图15c)adc3a-c的尺寸排阻色谱(sec)迹线。(图15d)adc3a-c在生理学条件下(磷酸盐缓冲液，ph7.4)的疏水性相互作用色谱(hic)分析。(图15e)三个hic迹线的覆盖图。dar，药物:抗体比率；dbco，二苯并环辛炔；mmaf，单甲基澳瑞他汀f；mtg酶，微生物转谷氨酰胺酶；pabc，对氨基苯甲氧基羰基；peg，聚乙二醇。

图16a-16c显示(图16a)vcit-、(图16b)svcit-和(图16c)evcit-adc14a-c的逆相hplc迹线(uv：280nm)。

图17a-17d显示不可裂解adc15(分别地，图17a和图17c)和含有evcit16的同型对照adc(非靶向对照)(分别地，图17b和图17d)的hplc和尺寸排阻色谱(sec)迹线。

图18a-18c显示各adc在一个月37℃孵育之后的聚集程度。在任一情况下均未观察到聚集(vcit-adc14a，图18a；svcit-adc14b，图18b；evcit-adc14c，图18c)。

图19显示在37℃下人组织蛋白酶b介导的adc裂解。误差棒表示sem并且圆括号中的值是95％置信区间。

图20a-20e显示血浆稳定性和体外细胞毒性。(图20a)人血浆中的稳定性。(图20b)小鼠血浆中的稳定性。乳癌细胞系kpl-4(图20c)、jimt-1(图20d)和mda-mb-231(图20e)中的细胞杀死效能。未缀合n297a抗her2mab(黑色)、vcit-adc14a、svcit-adc14b、evcit-adc14c、不可裂解adc15和含有evcit16的同型对照adc(非靶向对照)。所有分析均一式四份执行。误差棒表示sem。

图21显示通过基于细胞的elisa获得的s型-结合曲线和饱和度-结合曲线。所有分析均一式三份执行，并且误差棒表示sem。圆括号中的值是95％置信区间。n297a抗her2抗体和adc以可相当的结合亲和力结合于kpl-4细胞(her2阳性，左侧)而非结合于mda-mb-231细胞(her2阴性，右侧)。

图22显示未缀合n297a抗her2mab(星形)和vcit-adc(圆形)、evcit-adc(正方形)、svcit-adc(δ)、不可裂解adc(倒三角形)和非靶向evcit-adc(菱形)的详细体外细胞毒性概况。所有分析均一式三份执行。误差棒表示sem并且圆括号中的值是95％置信区间。

图23a-23f显示体内药物动力学(pk)和抗肿瘤活性。(图23a和图23b)balb/c雌性小鼠(n＝3)中的vcit、evcit和svcitadc14a-c的pk。在所指示的时间点，收集血液以通过夹心elisa定量总抗体(缀合和未缀合，图23a)和adc(仅缀合，图23b)。evcit-adc3c在小鼠中展现大于vcit-和羟基官能化svcitadc14a和14b的稳定性。(图23c和图23d)抗her2adc3a和3c在雌性ncr裸小鼠中的jimt-1(图23c)和kpl-4(图23d)乳房异种移植物模型中的抗肿瘤活性(关于jimt-1模型中的媒介物，n＝4；关于kpl-4模型中的媒介物，n＝3；关于adc，n＝5)。当平均肿瘤体积达到约100mm³时(用黑色箭头指示)，单一剂量的各adc(1或3mg/kg)施用于小鼠。(图23e和图23f)在jimt-1(图23e)和kpl-4(图23f)模型中存活小鼠随时间的百分率的改变。在预定终点处对小鼠实施安乐死(参见方法)。在两种模型中，基于evcit的adc14c(3mg/kg；1mg/kg)发挥比vcit变体14a(3mg/kg)高得多的治疗功效。误差棒表示sem。*p<0.025，**p<0.01，***p<0.005。

图24a-24d显示(图24a)未修饰n297a抗her2mab、(图24b)vcit-adc14a、(图24c)svcit-adc14b和(图24d)evcit-adc14c在雌性balb/c小鼠(n＝3)中的详细体内药物动力学(pk)概况。在所指示的时间点，收集血液以通过夹心elisa定量总抗体(缀合和未缀合，实线)和adc(仅缀合，虚线)的浓度。auc，曲线下面积；cl，清除。

图25a和图25b显示jimt-1(图25a)和kpl-4(图25b)乳房异种移植物模型中的治疗后肿瘤体积的点图(ncr裸小鼠，关于jimt-1模型中的媒介物，n＝4；关于kpl-4模型中的媒介物，n＝3；关于adc，n＝5)。各点表示用媒介物(倒三角形)、3mg/kgvcit-adc14a(圆形)、3mg/kgevcit-adc14c(正方形)或1mg/kg3c(δ)治疗的个别小鼠。当平均肿瘤体积达到约100mm³时(用箭头指示)，单一剂量的各adc(1或3mg/kg)或媒介物静脉内施用于小鼠。每3天监测肿瘤体积和体重，直至第60天。接着每7天监测用3mg/kgevcit-adc14(正方形)治疗的小鼠，直至第148天。当肿瘤体积超过1000mm3，肿瘤尺寸超过2cm直径，观察到大于15％重量损失，或小鼠显示痛苦迹象时，对小鼠实施安乐死。

具体实施方式

本公开提供由支化接头或展现改进的特性的接头建构的adc。这些化合物可用于治疗癌症或其他疾病，其中所述adc用于递送化学有效载荷。在一些方面，所述化合物显示相对于已知adc改进的活性或其他药理学特征。

本文还提供制备具有支化接头的adc的方法，所述方法允许并入多种治疗化合物。使用mtg酶，抗体可能与包含悬垂二叠氮化物官能团的胺偶合。所述叠氮化物部分可能接着通过叠氮化物-炔环加成进一步官能化以并入化学有效载荷。

在其他方面，本公开提供用于建构抗体药物缀合物的接头，所述抗体药物缀合物显示改进的体内治疗概况，如改进的稳定性和增加的由所需肽酶裂解的特异性。抗体药物缀合物通常使用基于肽的接头，所述接头能够体内由肽酶裂解并且通常是基于val-cit二肽。如本文所述，所述基于肽的接头可进一步具有极性侧链的第三氨基酸残基，如谷氨酸或天冬氨酸。所述基于肽的接头的这些改变可导致由所述非靶向肽酶引起的裂解降低并且改进所述抗体药物缀合物的总体稳定性，直至其到达其所需并且治疗有效位置。这些基于肽的接头可用于任何潜在抗体药物缀合物。这些和更多细节描述于本文中。

i.经由adc递送治疗剂

a.用于与多肽缀合的药物

多种药物中的任一者均适合用作与多肽缀合的反应性搭配物，或可经修饰以使得适合用作与多肽缀合的反应性搭配物。药物的实例包括小分子药物和肽药物。因此，本公开提供药物-抗体缀合物。

如本文所用，“小分子药物”是指展现所关注的药物活性并且一般具有800da或更低或2000da或更低的分子量的化合物(例如有机化合物)，但可涵盖高达5kda的分子并且可多达10kda。小无机分子是指不含碳原子的分子，而小有机分子是指含有至少一个碳原子的化合物。

如本文所用，“肽药物”是指含氨基酸的聚合物化合物，并且意图涵盖天然存在和非天然存在的肽、寡肽、环状肽、多肽和蛋白质，以及肽模拟物。所述肽药物可通过化学合成获得或由经基因编码的来源(例如重组来源)产生。肽药物的分子量可变化，并且可为200da至10kda或更大分子量。

预期由本公开化合物建构的adc可用于递送药物。在一些实施方案中，所述药物是癌症化学治疗剂。例如，在所述多肽是对肿瘤细胞具有特异性的抗体(或其片段)的情况下，所述抗体可如本文所述经修饰以包括经修饰氨基酸，所述氨基酸可随后与癌症化学治疗剂缀合。癌症化学治疗剂包括减少癌细胞的增殖的非肽(即，非蛋白质)化合物，并且涵盖细胞毒性剂和细胞抑制剂。化学治疗剂的非限制性实例包括烷基化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。还可以使用肽化合物。

适合的癌症化学治疗剂包括海兔毒素和其活性类似物和衍生物；和澳瑞他汀和其活性类似物和衍生物。参见例如wo96/33212、wo96/14856和u.s.6,323,315。例如，海兔毒素10或澳瑞他汀pe可包括于本公开的抗体-药物缀合物中。适合的癌症化学治疗剂还包括美登素类和其活性类似物和衍生物(参见例如ep1391213；和liu等人1996)；和倍癌霉素和其活性类似物和衍生物(例如，包括合成类似物kw-2189和cb1-tml)。

用于减少细胞增殖的剂为本领域中已知的并且得到广泛使用。所述剂包括烷基化剂，如氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯，包括但不限于二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(cytoxan^tm)、美法仑(l-溶肉瘤素)、卡莫司汀(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)、司莫司汀(甲基-ccnu)、链脲菌素、氯脲霉素、尿嘧啶氮芥、氮芥(chlormethine)、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基密胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。

抗代谢物剂包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷、(cytosar-u)、胞嘧啶阿糖胞苷、氟尿嘧啶(5-fu)、氟尿苷(fudr)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-mp)、喷妥司汀、5-氟尿嘧啶(5-fu)、甲氨蝶呤、lo-炔丙基-5,8-二去氮杂叶酸酯(pddf、cb3717)、5,8-二去氮杂四氢叶酸(ddathf)、甲酰四氢叶酸、磷酸氟达拉滨、喷司他汀和吉西他滨。

适合的天然产品和其衍生物(例如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)包括但不限于ara-c、紫杉醇多烯紫杉醇脱氧柯福霉素、丝裂霉素-c、l-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤；白瑞夸尔；生物碱，例如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛等；鬼臼毒素，例如依托泊苷、替尼泊苷等；抗生素，例如蒽环霉素、盐酸柔红霉素(道诺霉素、红比霉素、柔毛霉素)、伊达比星、多柔比星、表柔比星和吗啉基衍生物等；酚噁腙双环肽(phenoxizonebiscyclopeptide)，例如放线菌素d；碱性糖肽，例如博莱霉素；蒽二酮，例如米托葸醌；氮丙啶吡咯并吲哚二酮，例如丝裂霉素；大环免疫抑制剂，例如环孢霉素、fk-506(他克莫司、普乐可复)、雷帕霉素等；等。

其他抗增殖细胞毒性剂是诺维本(navelbene)、cpt-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨(capecitabine)、雷洛昔芬(reloxafme)、环磷酰胺、异环磷酰胺和卓洛昔芬(droloxafme)。

具有抗增殖活性的微管影响剂也适合使用并且包括但不限于别秋水仙碱(nsc406042)、软海绵素b(nsc609395)、秋水仙碱(nsc757)、秋水仙碱衍生物(例如，nsc33410)、海兔毒素10(nsc376128)、美登素(nsc153858)、根霉菌素(nsc332598)、紫杉醇衍生物、多烯紫杉醇硫代秋水仙碱(nsc361792)、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、天然和合成埃博霉素(包括但不限于埃博霉素a、埃博霉素b、圆皮海绵内酯)；雌莫司汀、诺考达唑等。

适合使用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括但不限于肾上腺皮质类固醇，例如强的松、地塞米松等；雌激素和孕激素，例如己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、雌二醇、克罗米芬、他莫昔芬等；和肾上腺皮质抑制剂，例如氨鲁米特；17a-乙炔雌二醇；二乙基乙烯雌酚、睾酮、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾酮内酯、甲基强的松龙、甲基-睾酮、强的松龙、曲安西龙、氯烯雌酚醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、乙酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺(drogenil)、托瑞米芬(fareston)和雌激素刺激增殖和分化；因此，结合于雌激素受体的化合物用于阻断这一活性。皮质类固醇可抑制t细胞增殖。

其他适合的化学治疗剂包括金属错合物，例如顺铂(cis-ddp)、卡铂等；脲，例如羟基脲；和肼，例如n-甲基肼；表鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂；甲基苄肼；米托葸醌；甲酰四氢叶酸；替加氟；等。其他所关注的抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如霉酚酸、沙利度胺、脱氧精胍菌素、氮杂孢菌素、来氟米特、咪唑立宾、氮杂螺烷(skf105685)；(zd1839，4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)；等。

紫杉烷适合使用。“紫杉烷”包括紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物或前药。“紫杉醇”(其在本文中应理解为包括类似物、制剂和衍生物，例如多烯紫杉醇、taxol^tm、taxotere^tm(多烯紫杉醇的制剂)、紫杉醇的10-脱乙酰基类似物和紫杉醇的3'n-脱苯甲酰基-3'n-叔丁氧基羰基类似物)可使用所属领域的技术人员已知的技术容易地制备(还参见wo94/07882、wo94/07881、wo94/07880、wo94/07876、wo93/23555、wo93/10076；美国专利号5,294,637；5,283,253；5,279,949；5,274,137；5,202,448；5,200,534；5,229,529；和ep590,267)，或者获自多种商业来源，包括例如sigmachemicalco.,st.louis,mo.(t7402，来自taxusbrevifolia；或t-1912，来自taxusyannanensis)。

应理解，紫杉醇不仅是指紫杉醇的常见化学可获得形式，而且是指类似物和衍生物(例如taxotere^tm多烯紫杉醇，如上文所述)和紫杉醇缀合物(例如，紫杉醇-peg、紫杉醇-右旋糖苷或紫杉醇-木糖)。

术语“紫杉烷”内还包括多种已知衍生物，包括亲水性衍生物和疏水性衍生物两者。紫杉烷衍生物包括但不限于描述于国际专利申请号wo99/18113中的半乳糖和甘露糖衍生物；描述于wo99/14209中的哌嗪基和其他衍生物；描述于wo99/09021、wo98/22451和美国专利号5,869,680中的紫杉烷衍生物；描述于wo98/28288中的6-硫基衍生物；描述于美国专利号5,821,263中的亚磺酰胺衍生物；和描述于美国专利号5,415,869中的紫杉醇衍生物。其进一步包括紫杉醇的前药，包括但不限于描述于wo98/58927；wo98/13059；和美国专利号5,824,701中的那些。

适合使用的生物反应修饰剂包括但不限于(1)酪氨酸激酶(rtk)活性的抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性的抑制剂；(3)肿瘤相关抗原拮抗剂，如特异性地结合于肿瘤抗原的抗体；(4)细胞凋亡受体促效剂；(5)白细胞介素-2；(6)ifn-a；(7)ifn-γ；(8)集落刺激因子；和(9)血管生成抑制剂。

b.用于修饰药物以含有反应性搭配物的方法

待与多肽缀合的药物可经修饰以并入用于与所述多肽反应的反应性搭配物。在所述药物是肽药物的情况下，所述反应性部分(例如，氨氧基或酰肼可定位于n端区、n端、c端区、c端或定位于所述肽内部的位置处。例如，方法的一个实施例涉及合成具有氨氧基的肽药物。在这一实施例中，所述肽是由boc保护的前体合成。肽的氨基可与包含羧酸基和氧基-n-boc基团的化合物反应。例如，所述肽的氨基与3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)丙酸反应。包含羧酸基和氧基-n-保护基的化合物的其他变化可包括亚烷基接头上的不同碳数和亚烷基接头上的取代基。所述肽的氨基与包含羧酸基和氧基-n-保护基的化合物之间的反应通过标准肽偶合化学发生。可使用的肽偶合试剂的实例包括但不限于dcc(二环己基碳化二亚胺)、dic(二异丙基碳化二亚胺)、二-对甲苯酰基碳化二亚胺、bdp(1-苯并三唑二乙基磷酸酯-1-环己基-3-(2-吗琳基乙基)碳化二亚胺)、edc(1-(3-二甲基氨基丙基-3-乙基-碳化二亚胺盐酸盐)、三聚氟氰、三聚氯氰、tffh(四甲基氟代甲酰胺六氟磷酸酯)、dppa(叠氮磷酸二苯酯)、bop(苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸酯)、hbtu(o-苯并三唑-1-基-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯)、tbtu(o-苯并三唑-1-基-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯)、tstu(0-(n-丁二酰亚胺基)-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯)、hatu(n-[(二甲基氨基)-1-h-l,2,3-三唑并[4,5,6]-吡啶-1-基亚甲基]--n-甲基甲铵六氟磷酸酯n-氧化物)、bop-c1(双(2-氧代-3-噁唑烷基)膦酰氯)、pybop((1-h-l,2,3-苯并三唑-1-基氧基)-三(吡咯烷基)鏻四氟磷酸酯)、brop(溴三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸酯)、depbt(3-(二乙氧基磷酰氧基)-l,2,3-苯并三嗪-4(3h)-酮)pybrop(溴三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸酯)。作为非限制性实例，hobt和dic可用作肽偶合试剂。

对包含n-保护基的肽执行保护基脱除以暴露氨基-氧基官能团。例如，n-氧基丁二酰亚胺基团的保护基脱除根据针对环状酰胺基团的标准保护基脱除条件发生。保护基脱除条件可发现于greene和wuts,protectivegroupsinorganicchemistry,第3版,1999,johnwiley&sons,ny和harrison等人中。某些保护基脱除条件包括肼试剂、氨基试剂或硼氢化钠。boc保护基的保护基脱除可用tfa发生。用于保护基脱除的其他试剂包括但不限于肼、甲基肼、苯基肼、硼氢化钠和甲胺。产物和中间物可通过如hplc纯化的常规手段来纯化。

普通熟练技术人员应理解，如ph和位阻(即，氨基酸残基与所关注的反应性搭配物反应的可达性)的因素具有重要性，修饰反应条件以提供最佳缀合条件充分地在普通技术人员的技能内，并且在本领域中为常规的。在用存在于活细胞中或活细胞上的多肽进行缀合的情况下，选择条件以便在生理学上可相容。例如，ph可短暂地下降，持续足以允许反应发生但在细胞所耐受的时期内的时间(例如，约30min至1小时)。用于在细胞表面上进行多肽的修饰的生理学条件可类似于具有细胞-表面叠氮化物的细胞的修饰中的酮-叠氮化物反应中所用的那些(参见例如u.s.6,570,040)。

含有或经修饰以含有充当本文所公开的化合物或缀合物的反应性搭配物的亲核基团的小分子化合物也预期用作本公开的多肽-药物缀合物中的药物。本领域中已知用于适用于合成所关注的化合物的化学合成方案和条件的一般方法(参见例如smith和march,march'sadvancedorganicchemistry:reactions,mechanisms,andstructure,第五版,wiley-interscience,2001；或vogel,atextbookofpracticalorganicchemistry,includingqualitativeorganicanalysis,第四版,newyork:longman,1978)。

c.药物

在一些情况下，缀合物包含共价连接的肽。适合的肽包括但不限于细胞毒性肽；血管生成肽；抗血管生成肽；活化b细胞的肽；活化t细胞的肽；抗病毒肽；抑制病毒融合的肽；增加一个或多个淋巴细胞群体的产生的肽；抗微生物肽；生长因子；生长激素释放因子；血管活性肽；抗炎症肽；调节葡萄糖代谢的肽；抗血栓形成肽；抗伤害肽；血管扩张剂肽；血小板聚集抑制剂；止痛剂；等。

在一些实施方案中，所述肽可以化学方式合成以包括可与所述多肽的氨基酸残基或经修饰氨基酸残基反应的基团。适合的合成肽具有5个氨基酸至100个氨基酸或长于100个氨基酸的长度；例如，适合的肽具有5个氨基酸(aa)至10aa、10aa至15aa、15aa至20aa、20aa至25aa、25aa至30aa、30aa至40aa、40aa至50aa、50aa至60aa、60aa至70aa、70aa至80aa、80aa至90aa或90aa至100aa的长度。

在某些实施方案中，肽可经修饰以含有含亲核试剂的部分(例如氨氧基或酰肼部分)，例如可与含fgly的多肽反应以产生缀合物，其中所述多肽和肽分别地通过腙或肟键连接。上文描述合成肽的方法的实例，以致所述合成肽包含可与所述多肽的氨基酸残基或经修饰氨基酸残基反应的反应性基团。

适合的肽包括但不限于hlf-11(乳铁蛋白的11-氨基酸n端片段)，抗微生物肽；颗粒溶素，抗微生物肽；菌丝霉素(nz2114；sar215500)，抗微生物肽；病毒融合抑制剂，如fuzeon(恩夫韦肽)、tri-1249(t-1249；参见例如matos等人,2010)、tri-2635(t-2635；参见例如eggink等人,2009)、t651和tri-1144；c5a受体抑制剂，如pmx-53、jpe-1375和jsm-7717；pot-4，人补体因子c3抑制剂；pancreate(ingap衍生序列、hip-人前胰岛蛋白质)；生长抑素；生长抑素类似物，如debio8609(sanvar)、奥曲肽、奥曲肽(c2l)、奥曲肽qlt、奥曲肽lar、善宁lar、somalar、索马杜林(兰瑞肽)，参见例如deghenghi等人,2001；th9507(tesamorelin，生长激素释放因子)；pol7080(蛋白整合素类似物，抗微生物肽)；松弛素；促肾上腺皮质激素释放因子促效剂，如尾加压素、蛙皮降压肽等；热休克蛋白衍生物，如diapep277；人免疫缺陷病毒进入抑制剂；热休克蛋白-20模拟物，如azx100；凝血酶受体活化肽，如tp508(chrysalin)；尿皮质素2模拟物(例如crf2促效剂)，如尿皮质素-2；免疫活化剂，如zadaxin(胸腺法新；胸腺素-al)，参见例如sjogren(2004)j.gastroenterol.hepatol.19:s69；丙型肝炎病毒(hcv)进入抑制剂e2肽，如hcv3；心房利尿钠肽，如hanp(sun4936；卡培立肽)；膜联蛋白肽；防御素(抗微生物肽)，如hbd2-4；防御素(抗微生物肽)，如hbd-3；防御素(抗微生物肽)，如pmx-30063；组胺素(抗微生物肽)，如组胺素-3、组胺素-5、组胺素-6和组胺素-9；组胺素(抗微生物肽)，如pac-113；吲哚菌素(抗微生物肽)，如mx-594an(omniganin；clsool)；吲哚菌素(抗微生物肽)，如omnigard(mbi-226；cpi-226)；抗微生物肽，如昆虫抗菌肽；抗微生物肽，如乳铁蛋白(重组乳铁蛋白)；ll-37/组织蛋白酶抑制素衍生物(抗微生物肽)，如p60.4(op-145)；蛙皮素(抗微生物肽)，如pexiganan(msi-78；suponex)；蛋白整合素(抗微生物肽)，如ib-367(iseganan)；阿甘肽；β-利尿钠肽，如natrecor或noratak(nesiritide)或乌拉立肽；比伐卢定(angiomax)，凝血酶抑制剂；c肽衍生物；降钙素，如miacalcin(fortical)；脑啡肽衍生物；红细胞生成刺激肽，如hematide；间隙连接调节剂，如danegaptide(zp1609)；胃泌素释放肽；胃饥饿素；胰高血糖素样肽；胰高血糖素样肽-2类似物，如zp1846或zp1848；葡糖胺基胞壁酰二肽，如gmdp；糖肽抗生素，如oritavancin；替考拉宁衍生物，如dalbavancin；促性腺激素释放激素(gnrh)，如zoladex(lupon)或triptorelin；组蛋白脱乙酰基酶(hdac)抑制剂缩酚酸肽，如pm02734(irvalec)；整合素，如依替巴肽；胰岛素类似物，如humulog；卡哈拉利德缩酚酸肽，如pm02734；激肽释放酶抑制剂，如kalbitor(艾卡拉肽)；抗生素，如telavancin；脂肽，如cubicin或mx-2401；黄体激素释放激素(lhrh)，如戈舍瑞林；lhrh合成十肽促效剂类似物，如treistar(双羟萘酸曲普瑞林)；lhrh，如eligard；m2蛋白通道肽抑制剂；美曲普汀；黑素皮质素受体促效剂肽，如布莱黑素肽/pt-141；黑素皮质素；胞壁酰三肽，如mepact(米伐木肽)；髓鞘碱性蛋白肽，如mbp8298(地瑞考肽)；n型电压门控钙通道阻断剂，如ziconotide(prialt)；甲状旁腺激素肽；甲状旁腺类似物，如768974；肽激素类似物，如ugp281；前列腺素f2-a受体抑制剂，如pdc31；蛋白酶抑制剂，如ppl-100；舒发新(surfaxin)；血小板反应素-1(tsp-1)模拟物，如cvx-045或abt510；血管活性肠肽；血管加压素；y2r促效剂肽，如rg7089；奥比肽(obinepeptide)；和tm30339。

ii.接头

在一些方面，本公开提供可用于连接一个或多个不同的药物和/或细胞靶向部分至药物分子的接头。在一些实施方案中，所述接头可为下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

a1、a2和a3各自独立地为烷烃二基c1-12、芳烃二基c1-12、杂芳烃二基c1-12、环烷烃二基c1-12、杂环烷烃二基c1-12或其取代形式或经典氨基酸的侧链基团；

x、y和z各自独立地为–[o(ch2)q]–、–[o(chw′)q]–或–[o(cw′w″)q]–；

其中：

w′和w″各自独立地为氨基、羟基、卤基、巯基、烷基c1-12、环烷基c1-12、烯基c1-12、炔基c1-12、芳基c1-12、芳烷基c1-12、杂芳基c1-12、杂芳烷基c1-12、杂环烷基c1-12、酰基c1-12、酰氧基c1-12、烷基氨基c1-12或其取代形式；

q是1-3；

m、n、o和p各自独立地为0-12；

r为1、2或3；

r1、r2和r3各自独立地为–nh2、–nhr4、–nr4r5、–n3或缀合基团；

其中：

r4和r5各自独立地为烷基c1-12、环烷基c1-12、烯基c1-12、炔基c1-12、芳基c1-12、芳烷基c1-12、杂芳基c1-12、杂芳烷基c1-12、杂环烷基c1-12、酰基c1-12、酰氧基c1-12、烷基氨基c1-12或其取代形式或单价氨基保护基；或

r4和r5合在一起并且为二价氨基保护基；

其条件是r1、r2和r3中的至少一者为–nh2并且r1、r2和r3中的至少一者为–n3。

另一方面，本公开提供可用于连接一个或多个不同的药物和/或细胞靶向部分至药物分子的接头。在一些实施方案中，所述接头可为下式的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

x1为共价键、烷烃二基(c≤12)或取代的烷烃二基(c≤12)；

r1为氢、-(och2ch2)n1zr6或取代的-(och2ch2)n1zr6，其中：

n1为0-50；并且

r6为氢、羟基、胺、巯基、羟基胺、肼或叠氮化物；或

烷基(c≤12)、烯基(c≤12)、炔基(c≤12)、烷基肼(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；

包含1至6个甘氨酸单元的聚甘氨酸；或

下式的子结构：

其中：

a1和a2各自独立地不存在或为芳烃二基(c≤12)、取代的芳烃二基(c≤12)、杂芳烃二基(c≤12)或取代的杂芳烃二基(c≤12)，并且形成稠合芳烃(c≤12)、取代的芳烃(c≤12)、杂芳烃(c≤12)或取代的杂芳烃(c≤12)；

a4或a5各自独立地选自共价键、烷烃二基(c≤8)或取代的烷烃二基(c≤8)；

rd、re、re′和rh各自独立地选自氢、卤基、硫酸酯基、甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基、芳基(c≤8)或取代的芳基(c≤8)；

rf为卤基；

rg为胺、肼、烷基氨基(c≤8)、取代的烷基氨基(c≤8)、二烷基氨基(c≤8)、取代的二烷基氨基(c≤8)、烷基肼(c≤8)或取代的烷基肼(c≤8)；

x4为o、n、ch2，或x4为烷烃二基(c≤8)或取代的烷烃二基(c≤8)并且合在一起以形成由3至8个环原子组成的稠合环烷基；

r16为羟基、氨基或氧代；

r17为羧基；或

烷基(c≤12)、酰胺基(c≤12)、芳基(c≤12)、杂芳基(c≤12)、-c(o)nr20r20′或这些基团中任一者的取代形式，其中：

r20和r20′各自独立地为氢；或

烷基(c≤12)、芳基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；

r18和r19各自独立地为羟基、氨基、卤基；或

烷基(c≤12)、芳基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；

z为共价键、烷烃二基(c≤12)、-c(o)-烷烃二基(c≤12)、-c(o)-烷烃二基(c≤12)-c(o)nh-或这些基团中任一者的取代形式；

r2为氢、烷基(c≤12)、取代的烷基(c≤12)、酰基(c≤12)、取代的酰基(c≤12)或单价氨基保护基；

w为共价键或具有2-21个连接点的多价聚合物；

n3为1至20，其条件是当w为共价键时，那么n3为1并且当w为多价聚合物时，那么n3小于或等于连接点的数目减1；

各x独立地为共价键、烷烃二基(c≤12)或取代的烷烃二基(c≤12)；

各x2独立地为烷烃二基(c≤12)或取代的烷烃二基(c≤12)；

各r3独立地为羟基或氨基；或

烷氧基(c≤12)、酰氧基(c≤12)、烷基氨基(c≤12)、二烷基氨基(c≤12)、酰胺基(c≤12)、杂芳基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；或

-x9-c(o)r7，其中：

x9为o、-nrb-或共价键；

rb为氢、烷基(c≤6)、取代的烷基(c≤6)或单价氨基保护基；

r7为羟基或氨基；或

烷氧基(c≤12)、烷基氨基(c≤12)、二烷基氨基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；或

-a3so2nr21r21′、-a3p(o)(oh)or22或–a3so2or22′，其中：

a3为o、-nrc-或共价键；

rc为氢、烷基(c≤6)、取代的烷基(c≤6)或单价氨基保护基；

r21、r21′、r22及r22′各自独立地为氢、烷基(c≤12)、环烷基(c≤12)、芳基(c≤12)、杂芳基(c≤12)、芳烷基(c≤12)、杂芳烷基(c≤12)或这些基团中任一者的取代形式；

各r23独立地为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪氨酸的羟基保护形式或色氨酸的氨基保护形式的侧链部分；并且

各r24独立地为丙氨酸；或

鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸或其氨基保护形式的侧链部分；

各q独立地为下式的基团：

其中：

各r5独立地为氢或-c(o)-r8，其中：

r8为化学治疗剂；

各x5独立地为共价键、o、s、-nh-、烷烃二基(c≤12)、取代的烷烃二基(c≤12)、-(och2ch2)n2-或取代的-(och2ch2)n2-，其中：

n2为0-50；或

下式的基团：

其中：

ra和ra′各自独立地为氢、烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；

x6为o或-nr26r26′-，其中：

r26和r26′各自独立地为烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；

x7为共价键、o、s、-nh-、-(och2ch2)n3-或取代的-(och2ch2)n3-，其中：

n3为0-50；或

下式的基团：

其中：

y1为o或s；

y2为o、s、-nh-或-nr27-，其中：

r27为烷基(c≤12)或取代的烷基(c≤12)；并且

x8为共价键、o、s、-nh-、-(och2ch2)n3-或取代的-(och2ch2)n3-。

在其他方面，所述接头可进一步包含一个或多个间隔基团。所述间隔基团可包含由体内肽酶识别的氨基酸序列并且导致所述细胞靶向部分从所述药物裂解。在一些实施方案中，所述肽酶为内体或溶酶体肽酶。在其他实施方案中，所述肽酶为细胞外肽酶，如基质金属蛋白酶、thimet寡肽酶或cd10。一个实例为氨基酸序列缬氨酸-瓜氨酸，其可由组织蛋白酶b裂解。可裂解的肽序列的其他非限制性实例包括缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-鸟氨酸、苯丙氨酸-丙氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸和苯丙氨酸-鸟氨酸。另外，预期其他官能部分可添加至所述间隔基团中，其可用于实现所述药物和所述细胞靶向部分的解偶合，包括但不限于腙、二硫键或酯。还预期所述间隔基团可进一步包含一个或多个自我牺牲型基团。如本文所用，自我牺牲型基团是一旦在一个官能团处发生裂解就经历分解的基团。自我牺牲型基团在adc的背景中是众所周知的并且由carl等人,1981；wo81/01145；dubowchik等人,,1999；美国专利号6,214,345；told等人,2002；doronina等人,2003(勘误,第941页)；美国专利号7,691,962；us2008/0279868；wo2008/083312；美国专利号7,375,078b2；us2003/0096743；burke等人,2017；staben等人,2016教导，所述文献的完整内容以引用的方式并入。自我牺牲型基团的一个特定实例是对氨基苯甲醇或对氨基苯甲氧基羰基。

iii.化合物和其制剂

a.化合物

由本公开提供的化合物例如显示于上文发明内容部分中和下文实施例和权利要求书中。其可使用实施例部分中概述的方法制得。本文所述的adc可根据例如描述于下文实施例部分中的方法合成。这些方法可进一步使用如由本领域的技术人员提供的有机化学的原理和技术进行修改和优化。所述原理和技术教导于例如march’sadvancedorganicchemistry:reactions,mechanisms,andstructure(2007)中，所述文献以引用的方式并入本文中。

本文所述的adc可含有一个或多个经不对称取代的碳或氮原子，并且可以光学活性或外消旋形式经分离。因此，除非特定地指示具体立体化学或异构体形式，否则意指化学式的所有手性、非对映异构体、外消旋形式、差向异构体形式和所有几何异构体形式。化合物可作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和个别非对映异构体存在。在一些实施方案中，获得单一非对映异构体。本公开的化合物的手性中心可具有s或r配置。

用于表示本文所述的adc的化学式将典型地仅显示可能存在的数种不同的互变异构体之一。例如，已知多种类型的酮基与对应的烯醇基呈平衡状态存在。同样，多种类型的亚胺基与烯胺基呈平衡状态存在。无论针对既定化合物描述何种互变异构体，并且无论哪一者最普遍，意指既定化学式的所有互变异构体。

本文所述的adc也可具有如下优势，即其可比现有技术中已知的化合物具有更强功效，具有更少毒性，作用时间更长，更有效，产生更少副作用，更容易吸收，和/或具有更好药物动力学概况(例如，更高口服生物可用性和/或更低清除)，和/或具有其他适用的药理学、物理或化学特性，无论是用于本文所陈述的适应症抑或是用于其他情况。

另外，构成本文所述的adc的原子意图包括所述原子的所有同位素形式。如本文所用，同位素包括原子序数相同但质量数不同的那些原子。举例来说并且非限制地，氢的同位素包括氚和氘，并且碳的同位素包括¹³c和¹⁴c。

本文中的adc也可以前药形式存在。由于已知前药增强药物的众多所需品质(例如，溶解度、生物可用性、制造等)，本公开的一些方法中使用的化合物可在必要时以前药形式递送。因此，本公开涵盖本公开化合物的前药以及递送前药的方法。本文所述的adc的前药可通过修饰存在于所述化合物中的官能团以在常规操作中或在体内裂解成母体化合物的方式来制备。因此，前药包括例如其中羟基、氨基或羧基键结至任何基团的本文所述的化合物，当所述前药施用于受试者时，所述基团分别地裂解形成羟基、氨基或羧酸。

应认识到，形成本文所提供的化合物的任何盐形式的一部分的特定阴离子或阳离子不重要，只要所述盐整体是药理学上可接受的。药学上可接受的盐的额外实例和其制备和使用方法呈递于handbookofpharmaceuticalsalts:properties,anduse(2002)中，所述文献以引用的方式并入本文中。

有机化学领域的技术人员应理解，许多有机化合物可与溶剂形成络合物，在所述溶剂中其发生反应或者从中沉淀或结晶。这些络合物称作“溶剂化物”。例如，与水的络合物称作“水合物”。本文所述的adc的溶剂化物是在本公开的范围内。有机化学领域的技术人员还应理解，许多有机化合物可以超过一种晶型存在。例如，晶型可在不同溶剂化物之间变化。因此，本文所述的adc或前体的任何晶型均是在本公开的范围内。

b.制剂

在本公开的一些实施方案中，所述adc包括于药物制剂中。用于制备微球和/或微胶囊的材料为例如生物可降解/生物可侵蚀聚合物，如聚催乳激素、聚-(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟基乙基-l-谷酰胺)和聚(乳酸)。当配制控制释放肠胃外制剂时可使用的生物相容性载体为碳水化合物(例如右旋糖苷)、蛋白质(例如白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于植入物的材料可为不可生物降解的(例如聚二甲基硅氧烷)或生物可降解的(例如，聚(己内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯)或其组合)。

用于口服使用的制剂包括含有活性成分(例如，本文中的adc)与无毒药学上可接受的赋形剂的混合物的片剂。所述制剂是熟练技术人员已知的。赋形剂可为例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、包括马铃薯淀粉在内的淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；造粒和崩解剂(例如，包括微晶纤维素在内的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉在内的淀粉、交联羧甲纤维素钠、褐藻酸盐或褐藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯胶、褐藻酸、褐藻酸钠、明胶、淀粉、预胶凝淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯啶酮或聚乙二醇)；和润滑剂、助流剂和抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅石、氢化植物油或滑石)。其他药学上可接受的赋形剂可为着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。

片剂可未包覆包衣或其可通过已知技术包覆包衣，任选地以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并且由此在较长时期内提供持续作用。包衣可经调适以便以预定模式释放活性药物(例如，以便实现控制释放制剂)，或其可经调适以便不释放活性药物直至通过胃之后(肠溶包衣)。包衣可为糖衣、薄膜包衣(例如，基于羟基丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、羟基丙基-纤维素、羧基甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯-吡咯烷酮)或肠溶包衣(例如，基于甲基丙烯酸共聚物、乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟基丙基甲基纤维素、乙酸丁二酸羟基丙基甲基纤维素、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶和/或乙基纤维素)。此外，可使用时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

iv.适应症

a.过度增生性疾病

虽然过度增生性疾病可与使细胞开始不受控地繁殖的任何疾病相关，但典型实例是癌症。癌症的关键要素之一是细胞的正常细胞凋亡周期中断并且因此，中断细胞生长的剂作为用于治疗这些疾病的治疗剂是重要的。在本公开中，本文所述的adc可用于引起降低的细胞计数并且因而可潜在地用于治疗多种类型的癌症细胞系。在一些方面，预期本文所述的adc可用于有效地治疗任何恶性疾病。

可用本公开化合物治疗的癌细胞包括但不限于来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、胃肠、齿龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、胰腺、睾丸、舌头、子宫颈或子宫的细胞。另外，癌症可特定地具有以下组织学类型，不过其不限于这些：瘤，恶性；癌；癌，未分化性；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；促胃液素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌与胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附属器癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞肿瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；塞尔托利氏细胞癌；莱迪希细胞肿瘤，恶性；脂质细胞肿瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维性组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合性肿瘤，恶性；米勒管混合性肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳肿瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间叶型软骨肉瘤；骨巨细胞肿瘤；尤文氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索癌；神经胶质瘤，恶性；室鼓膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞肿瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡状；蕈样肉芽肿；其他特指非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；原始巨核白血病；髓系肉瘤；和毛细胞白血病。在某些方面，所述肿瘤可包含骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤文肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或白血病。

b.微生物感染

本公开的组合物可向靶微生物提供抗微生物效应并且可用于治疗与靶微生物相关的疾病或感染。抗微生物效应包括抑制靶微生物的生长或杀死，或者干扰靶微生物的任何生物功能。一般来说，本公开的组合物可用于治疗宿主中的任何位置处(例如，包括任何组织或植入物的表面的任何组织处)的疾病或感染。在一个实施方案中，所述组合物用于特定地杀死或抑制体液(例如，血液、唾液)中的细菌性靶微生物。

本公开的组合物可有效抵抗细菌，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性球菌、革兰氏阳性和革兰氏阴性线性、弯曲和螺旋形/类病毒和分支杆菌、鞘细菌、硫氧化细菌、硫或硫酸盐还原细菌、螺旋体、放线菌和相关属、粘细菌、支原体、立克次氏体和衣原体、蓝细菌、古细菌、真菌、寄生虫、病毒和海藻。例如，本公开的靶微生物包括但不限于大肠杆菌、假丝酵母、沙门氏菌、葡萄球菌和假单胞菌、空肠弯曲菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、沙眼衣原体、艰难梭菌、新生隐球菌、流感嗜血杆菌、幽门螺旋杆菌、卡他莫拉菌、淋病奈瑟氏菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、地森志贺菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。另外，所述组合物可用于治疗慢性皮肤溃疡、感染性急性伤口或烧伤伤口、感染性皮肤湿疹、脓疱病、特应性皮炎、痤疮、外耳炎、阴道感染、脂溢性皮炎、口腔感染、牙周炎、结膜炎或肺炎。

本公开的组合物可有效抵抗革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性和革兰氏阴性球菌包括但不限于气球菌、肠球菌、嗜盐球菌、明串珠菌、微球菌、动弯杆菌、卡他莫拉菌、奈瑟球菌(包括淋病奈瑟球菌和脑膜炎奈瑟球菌)、片球菌、消化链球菌、葡萄球菌属(包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性金黄色葡萄球菌和腐生葡萄球菌)、链球菌属(包括酿脓链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、肺炎链球菌、变形链球菌、血链球菌、马链球菌、马肠链球菌、嗜热链球菌、麻疹链球菌、汉氏链球菌、多形链球菌和微细链球菌)和韦荣球菌。

革兰氏阳性和革兰氏阴性线性、弯曲、螺旋形/类病毒和分支杆菌包括但不限于醋酸杆菌、不动杆菌、马驹放线杆菌、气单胞菌、土壤杆菌、产碱杆菌、水螺菌、溶血隐秘杆菌、芽胞杆菌属(包括蜡样芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌)、拟杆菌属(包括脆弱拟杆菌)、巴尔通体菌、博德特氏菌属(包括百日咳博德特氏菌)、环丝菌、布氏杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、肉芽肿荚膜杆菌、弯曲杆菌属(包括空肠弯曲杆菌)、二氧化碳噬纤维菌、柄杆菌、紫花色杆菌、柠檬酸杆菌、梭菌属(包括产气荚膜梭菌、破伤风梭菌和艰难梭菌)、丛毛单胞菌、短小杆菌、爱德华菌、艾肯菌、肠杆菌、欧文氏菌、丹毒丝菌、埃希氏菌属(包括大肠杆菌)、黄杆菌属(包括脑膜炎脓毒性黄杆菌)、弗朗西丝菌属(包括土拉弗朗西斯菌)、梭杆菌(包括具核梭杆菌)、加德纳菌属(包括阴道加德纳菌)、葡萄糖酸菌、嗜血杆菌属(包括流感嗜血杆菌和杜克雷嗜血杆菌)、哈夫尼菌、螺杆菌(包括幽门螺杆菌)、滑柱菌、克雷伯菌属(包括肺炎克雷伯菌)、克吕沃尔菌、乳杆菌、军团菌属(包括嗜肺军团菌)、纤毛菌、李斯特菌属(包括单核细胞李斯特菌)、微杆菌、摩根氏菌、硝化杆菌、亚硝酸菌、巴氏杆菌属(包括多杀性巴氏杆菌)、梳状菌、牙龈卟啉单胞菌、变形杆菌属(包括奇异变形杆菌)、普罗威登斯菌、假单胞菌属(包括绿脓杆菌、鼻疽假单胞菌、假鼻疽假单胞菌和青枯假单胞菌)、拉恩氏菌、鲑肾杆菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺菌、螺菌、链杆菌属(包括念珠状链杆菌)、弧菌属(包括霍乱弧菌和创伤弧菌)、沃廉菌、黄色杆菌、致病杆菌、耶尔森氏菌属(包括鼠疫耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌)、寡养单胞菌和发酵单胞菌。

可用本公开治疗的由革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌引起的临床疾病或感染包括脓肿、菌血症、腹膜透析液污染、心内膜炎、肺炎、脑膜炎、骨髓炎、蜂窝织炎、咽炎、中耳炎、窦炎、猩红热、关节炎、尿道感染、喉气管炎、类丹毒、气性坏疽、破伤风、伤寒热、急性胃肠炎、支气管炎、会厌炎、瘟疫、败血症、软下疳、伤口和烧伤感染、霍乱、鼻疽病、牙周炎、生殖器感染、脓胸、腹股沟肉芽肿、军团病、副伤寒、细菌性痢疾、布鲁斯氏杆菌病、白喉、百日咳、肉毒中毒、中毒休克综合征、乳腺炎、风湿热、囊性纤维化、眼睛感染、牙菌斑和龋齿。其他用途包括猪丹毒、腹膜炎、流产、脑炎、炭疽热、诺卡氏菌病、心包炎、足菌肿、胃溃疡、类鼻疽、哈氏热(haverhiufever)、兔热病、香蕉细菌性枯萎病、瘿(例如，花冠、茎和叶)、毛状根、细菌花腐病、细菌性黑枯病、细菌性褐斑病、细菌性枯萎病、细菌性鳍腐病、水肿、柱状病、巴氏杆菌病、疖病、肠红口病、奥菲弧菌病(vibriosisoffish)和医学器件污垢。

本公开的化合物和组合物可有效抵抗流感病毒、细胞巨化病毒、禽白血病-肉瘤病毒、劳氏肉瘤病毒、哺乳动物c型鼠科动物白血病病毒、猫白血病病毒、猿猴肉瘤病毒、b型小鼠乳腺肿瘤病毒、d型病毒mason-pfizer猴病毒、猿猴艾滋病病毒、人t-细胞白血病病毒、猿猴t-细胞白血病病毒、牛白血病病毒、人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、维斯纳/梅迪病毒、马传染性贫血病毒、山羊关节炎-脑炎病毒、泡沫病毒(spumavirus)、泡沫病毒(foamyvirus)、内源性逆转录病毒、乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、麻疹病毒、树状病毒、柯萨奇病毒、疱疹病毒、汉坦病毒、肝炎病毒、杆状病毒、腮腺炎病毒、圆环病毒、沙粒病毒、轮状病毒、科洛拉多蜱传热ctf病毒、艾奇病毒(eyachvirus)、兰加特病毒、波瓦生病毒、鄂木斯克出血热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、黄热病病毒、脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、屈公病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、萨诺尔森林病病毒、登革热病毒、加利福利亚脑炎病毒、腺病毒、朝鲜出血热病毒、汉坦病毒、阿根廷出血热病毒、鸠宁病毒、奥耶斯基病病毒、假狂犬病病毒、疱疹病毒、屈公病毒、牛痘病毒、埃博拉病毒、甘贾姆病毒、猿猴疱疹病毒、拉沙热病毒、跳跃病病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、马尔堡病毒、米尔科斯根瘤病毒、新城疫病毒、鄂木斯克出血热病毒、羊传染性脓疱病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、假狂犬病、狂犬病病毒、立夫特山谷热病毒、苏联春-夏型脑炎病毒、沙比亚病毒、牛痘病毒、水疱性口炎病毒、西方马脑炎病毒或黄热病病毒。

c.自身免疫疾病

本公开的化合物和组合物可有效治疗或预防自身免疫疾病。自身免疫疾病的非限制性实例包括阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性病、强直性脊柱炎、抗gbm/抗tbm肾炎、抗磷脂综合征(aps)、自身免疫肝炎、自身免疫内耳病(aied)、轴索性和神经元神经病(aman)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、卡斯尔门病(cd)、乳糜泻、南美洲锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(crmo)、churg-strauss、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、耳蜗前庭综合征、冷凝集素病、先天性心脏阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、crest综合征、克罗恩氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征、子宫内膜异位、嗜酸细胞食管炎(eoe)、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合型冷球蛋白血症、伊文氏综合征、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘氏综合征、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯氏病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舒紫癜(hsp)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(pg)、低丙种球蛋白血症、iga肾病、igg4相关硬化病、包涵体肌炎(ibm)、间质性膀胱炎(ic)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(jm)、川崎病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线状iga病(lad)、狼疮、慢性莱姆病、梅尼耳氏病、显微镜下多动脉炎(mpa)、混合型结缔组织病(mctd)、莫伦氏溃疡、穆-哈二氏病、多发性硬化(ms)、重症肌无力、肌炎、嗜眠发作、视神经脊髓炎、嗜中性白血球减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病(pr)、pandas(与链球菌相关的儿童自身免疫性神经精神病症)、副肿瘤性小脑变性(pcd)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、帕罗综合征、睫状体平坦部炎(周边葡萄膜炎)、parsonnage-turner综合征、天疱疮、周围神经病、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血(pa)、poems综合征(多发性神经病、器官肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、皮肤改变)、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、孕酮性皮炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、单纯红细胞再生障碍性贫血(prca)、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、莱特尔氏综合征、复发性多软骨炎、不宁腿综合征(rls)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎(ra)、肉状瘤病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、休格连氏综合征、精子和睾丸自身免疫性、僵人综合征(sps)、亚急性细菌性心内膜炎(sbe)、苏萨克氏综合征、交感性眼炎(so)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(ttp)、tolosa-hunt综合征(ths)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(uc)、未分化型结缔组织病(uctd)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿(现在称作肉芽肿性多血管炎(gpa)。

d.炎症

炎症是向感染性或寄生性生物提供抵抗并且提供受损组织的修复的生物过程。炎症的特征通常在于局部血管舒张、发红、肿胀和疼痛、白血球募集至感染或损伤位点、产生炎症细胞因子(如tnf-α和il-1)和产生活性氧或氮物质(如过氧化氢、超氧化物和过氧亚硝酸盐)。在炎症的后期阶段中，组织重塑、血管生成和瘢痕形成(纤维化)可作为伤口愈合过程的部分发生。在正常情况下，炎症反应受到调节并且为暂时的并且一旦感染或损伤已经得到适当处理，就以安排的方式消退。然而，如果调节机制失效，那么急性炎症可变得过度并且危及生命。或者，炎症可变为慢性并且引起积累组织损伤或全身并发症。

多种严重并且难处理的人疾病涉及炎症过程的失调，包括如癌症、动脉粥样硬化和糖尿病的疾病，其在传统上未被视为炎症病况。在癌症的情况下，炎症过程与肿瘤形成、进展、代谢和对疗法的抵抗有关。现在应理解，长期被视为脂质代谢病症的动脉粥样硬化根本上为炎症病况，其活化在动脉粥样硬化斑块的形成和最终破裂中发挥重要作用的巨噬细胞。炎症信号传导途径的活化也已经显示在胰岛素抵抗的发展中以及在与糖尿病性高血糖相关的周围组织损伤中发挥作用

如肾衰竭、心力衰竭、肝衰竭和慢性阻塞性肺病的慢性器官衰竭与慢性氧化应激和炎症的存在密切相关，导致纤维化发展和器官功能的最终损失。排列主要和次要血管的血管内皮细胞中的氧化应激可导致内皮功能障碍并且相信在全身性心血管疾病、糖尿病并发症、慢性肾病和其他形式的器官衰竭和包括中枢神经系统和视网膜的退行性疾病在内的多种其他年龄相关疾病的发展中是一种重要促成因素。

多种其他病症涉及受影响组织中的氧化应激和炎症，包括炎症性肠病；炎症性皮肤病；与辐射疗法和化学疗法相关的粘膜炎；眼睛疾病，如葡萄膜炎、青光眼、黄斑变性和多种形式的视网膜病；移植失败和排斥；缺血-再灌注损伤；慢性疼痛；骨和关节的退行性病况，包括骨关节炎和骨质疏松症；哮喘和囊性纤维化；发作病症；和神经精神病况，包括精神分裂症、抑郁、双极症、创伤后应激病症、注意力缺陷病症、孤独症谱系病症和进食病症(如神经性厌食症)。相信炎症信号传导途径的失调在包括肌肉萎缩症和多种形式的恶病质在内的肌肉萎缩疾病的病理学中是一种主要因素。

多种危及生命的急性病症也涉及失调的炎症信号传导，包括涉及胰腺、肾、肝或肺的急性器官衰竭、心肌梗死或急性冠状动脉综合征、中风、败血性休克、创伤、严重烧伤和过敏性反应。

多种传染病并发症也涉及炎症反应的失调。尽管炎症反应可杀死侵入的病原体，过度炎症反应也可极具破坏性并且在一些情况下可为受感染组织的主要损伤来源。此外，过度炎症反应也可归因于如tnf-α和il-1的炎症细胞因子的过度产生而导致全身性并发症。相信这在由严重流感、严重急性呼吸综合征和败血症引起的死亡率中是一种因素。

v.细胞靶向部分

在一些方面，本公开提供直接地或通过接头缀合于细胞靶向部分的化合物。在一些实施方案中，所述化合物与细胞靶向部分的缀合增加所述化合物治疗疾病或病症的功效。根据所述实施方案的细胞靶向部分可为例如抗体、生长因子、激素、肽、适体、小分子(如激素、成像剂或辅因子)或细胞因子。已经证明，gp240抗原在多种黑素瘤中而非在正常组织中表达。因此，在一些实施方案中，本公开化合物可用于具有针对由癌细胞而非在正常组织中表达的具体抗原的抗体的缀合物中。

在某些额外实施方案中，设想癌细胞靶向部分结合于多种类型的癌细胞。例如，8h9单克隆抗体和源于它的单链抗体结合于在乳癌、肉瘤和神经母细胞瘤中表达的糖蛋白(onda等人,2004)。另一实例是描述于美国专利公布号2004/005647中和winthrop等人(2003)中的细胞靶向剂，其结合于在多种癌症类型中表达的抗原muc-1。因此，应理解在某些实施方案中，根据所述实施方案的细胞靶向构筑体可针对多种癌症或肿瘤类型经靶向。

另外，某些细胞表面分子在肿瘤细胞中高度表达，包括激素受体，如人绒毛膜促性腺激素受体和促性腺激素释放激素受体(nechushtan等人,1997)。因此，相应激素可在癌症疗法中用作细胞特异性靶向部分。另外，可使用的细胞靶向部分包括辅因子、糖、药物分子、成像剂或荧光染料。已知多种癌细胞过度表达叶酸受体并且因此叶酸或其他叶酸衍生物可用作缀合物以触发本公开的缀合物与细胞之间的细胞特异性相互作用(campbell等人,1991；weitman等人,1992)。

由于大量细胞表面受体已经在多种谱系的造血细胞中得到鉴别，对这些受体具特异性的配体或抗体可用作细胞特异性靶向部分。il-2也可在嵌合蛋白中用作细胞特异性靶向部分以靶向il-2r+细胞。或者，如b7-1、b7-2和cd40的其他分子可用于特异性地靶向经活化t细胞(theleucocyteantigenfactsbook,1993,barclay等人(编),academicpress)。此外，表达cd19、cd40和il-4受体的b细胞和可由结合这些受体的部分，如cd40配体、il-4、il-5、il-6和cd28靶向。如t细胞和b细胞的免疫细胞的消除特别适用于治疗淋巴样肿瘤。

可用于靶向具体细胞子集的其他细胞因子包括白细胞介素(il-1至il-15)、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、肿瘤坏死因子、转化生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子和/或纤维母细胞生长因子(thompson(编),1994,thecytokinehandbook,academicpress,sandiego)。在一些方面，所述靶向多肽是结合于fn14受体的细胞因子，如tweak(参见例如winkles,2008；zhou等人,2011和burkly等人,2007，以引用的方式并入本文中)。

熟练技术人员认识到，存在多种已知细胞因子，包括红细胞生成素(四螺旋束)(如epo(促红细胞生成素)、il-2(t-细胞生长因子)、il-3(多集落csf)、il-4(bcgf-1、bsf-1)、il-5(bcgf-2)、il-6il-4(ifn-□2、bsf-2、bcdf)、il-7、il-8、il-9、il-11、il-13(p600)、g-csf、il-15(t-细胞生长因子)、gm-csf(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、osm(om，制瘤素m)和lif(白血病抑制因子))；干扰素(如ifn-□、ifn-□和ifn-□)；免疫球蛋白超家族(如b7.1(cd80)和b7.2(b70、cd86))；tnf家族(如tnf-□(恶病质素)、tnf-□(淋巴毒素、lt、lt-□)、lt-□、cd40配体(cd40l)、fas配体(fasl)、cd27配体(cd27l)、cd30配体(cd30l)和4-1bbl))；和未指派特定家族的那些(如tgf-□、il1□、il-1□、il-1ra、il-10(细胞因子合成抑制剂f)、il-12(nk细胞刺激因子)、mif、il-16、il-17(mctla-8)和/或il-18(igif，干扰素-□诱导因子))。此外，抗体的重链的fc部分可用于靶向fc受体表达细胞，如使用ige抗体的fc部分来靶向肥大细胞和嗜碱性粒细胞。

此外，在一些方面，所述细胞靶向部分可为肽序列或环状肽。可根据所述实施方案使用的细胞和组织靶向肽的实例提供于例如美国专利号6,232,287；6,528,481；7,452,964；7,671,010；7,781,565；8,507,445；和8,450,278中，所述美国专利各自以引用的方式并入本文中。

因此，在一些实施方案中，细胞靶向部分为抗体或avimer。抗体和avimer可针对实际上任何细胞表面标记物产生，因此提供一种递送grb至实际上任何所关注的细胞群体的靶向方法。用于产生可用作细胞靶向部分的抗体的方法详述于下文中。用于产生结合于给定的细胞表面标记物的avimer的方法详述于美国专利公布号2006/0234299和2006/0223114中，所述美国专利公布各自以引用的方式并入本文中。

另外，预期本文所述的化合物可与纳米粒子或其他纳米材料缀合。纳米粒子的一些非限制性实例包括金属纳米粒子，如金或银纳米粒子；或聚合物纳米粒子，如聚-l-乳酸或聚(乙)二醇聚合物。可与本发明化合物缀合的纳米粒子和纳米材料包括描述于美国专利公布号2006/0034925、2006/0115537、2007/0148095、2012/0141550、2013/0138032和2014/0024610和pct公布号2008/121949、2011/053435和2014/087413中的那些，所述公布各自以引用的方式并入本文中。

vi.疗法

a.药物制剂和施用途径

在预期临床应用的情况下，应有必要制备呈适用于预期应用的形式的药物组合物。在一些实施方案中，预期使用本公开的adc的所述配制。一般来说，这将使得需要制备基本上无热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。

一般将需要使用适当盐和缓冲液来使递送载体稳定并且允许由靶细胞摄取。当重组细胞引入至患者中时，也将使用缓冲液。本公开的水性组合物包含有效量的细胞载体，其溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。所述组合物也称作接种体。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。所述介质和剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或剂与本公开的载体或细胞不相容，否则预期其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可并入组合物中。

本公开的活性组合物可包括经典药物制剂。根据本公开施用这些组合物将经由任何常见途径，只要靶组织可经由那个途径达到。所述途径包括口服、鼻、颊、直肠、阴道或表面途径。或者，施用可通过原位、皮内、皮下、肌肉内、肿瘤内、腹膜内或静脉内注射。所述组合物通常将呈上文所述的药学上可接受的组合物形式施用。

活性化合物也可肠胃外或腹膜内施用。呈游离碱或药理学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液可在适当地与表面活性剂(如羟丙基纤维素)混合的水中制备。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有的情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体至存在可易于注射性的程度。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须在贮存中防止如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物以及植物油。可例如通过使用如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。对微生物作用的防止可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选将包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

无菌可注射溶液是通过将在适当溶剂中的所需量的活性化合物与以上列举的数种其他成分(根据需要)合并，随后进行过滤灭菌来制备。通常，分散液是通过将多种灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加来自其前述无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。所述介质和剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或剂与活性成分不相容，否则预期其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可并入组合物中。

关于口服施用，本文所述的adc可与赋形剂合并，并且呈不可摄取的漱口水和牙膏的形式使用。漱口水可通过在如硼酸钠溶液(多贝耳氏溶液)的适当溶剂中并入所需量的活性成分来制备。或者，活性成分可并入含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的防腐洗液中。活性成分也可分散于牙膏中，包括；凝胶、糊剂、粉末和浆液。活性成分可以治疗有效量添加至可包括水、粘合剂、研磨剂、调味剂、发泡剂和保湿剂的糊状牙膏中。

本公开组合物可以中性或盐形式配制。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，并且所述酸加成盐由例如盐酸或磷酸的无机酸，或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。由游离羧基形成的盐也可衍生自例如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物的无机碱和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。

在配制时，溶液将以可与剂量配制相容的方式并且以如治疗有效的量施用。所述制剂容易以多种剂型，如可注射溶液、药物释放胶囊等施用。关于呈水溶液形式肠胃外施用，举例来说，所述溶液在必要时应适当地经缓冲并且首先用充足生理盐水或葡萄糖使得液体稀释剂等张。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就这一点而言，可使用的无菌水性介质将为本领域的技术人员根据本公开已知的。例如，一个剂量可溶解于1ml等张nacl溶液中并且添加至1000ml皮下输液流体中或者注射于所提出的输注位点处(参见例如“remington'spharmaceuticalsciences,”第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。取决于所治疗受试者的病况，将有必要存在剂量的一些变化。负责施用的个人将在任何情况下决定用于个别受试者的适当剂量。此外，关于人施用，制剂应满足无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准，如由fda的生物制品质量和监管办公室(theofficeofcomplianceandbiologicsquality)的生物标准与质量控制部门所需。

b.治疗方法

特别地，本文公开可用于治疗受试者(例如，人受试者)的疾病或病症(如癌症)的组合物。上述组合物优选地以有效量，即能够在所治疗的受试者中产生所需结果(例如，引起癌细胞的细胞凋亡或杀死微生物)的量施用于哺乳动物(例如，啮齿动物、人、非人灵长类动物、犬科动物、牛、绵羊、马、猫科动物等)。用于本公开方法中的组合物的毒性和治疗功效可通过标准药物程序来测定。如在医学和兽医学领域中众所周知，用于任一动物的剂量取决于许多因素，包括患者的体格、体表面积、体重、年龄、待施用的特定化合物、施用时间和途径、一般健康状况、感染或癌症的临床症状以及目前正在施用的其他药物。如本文所述的组合物典型地以诱导癌细胞的死亡(例如，诱导癌细胞的细胞凋亡)的剂量施用，如通过鉴别血液学参数(全血计数-cbc)或癌细胞生长或增殖的减少所分析。在一些实施方案中，用于诱导癌细胞的细胞凋亡的adc的量经计算为约0.01mg至约10,000mg/天。在一些实施方案中，所述量为约1mg至约1,000mg/天。在一些实施方案中，这些给药量可基于特定患者的生物因素，如增加或降低的所述药物的代谢分解或在口服施用时降低的消化道摄取而减少或增加。另外，所述adc可有更高功效并且因此需要较少剂量来实现相似效应。所述剂量典型地一天施用一次持续数周或直至已经实现癌细胞的充分减少。

本公开的治疗方法(其包括预防性治疗)一般来说包括向有需要的受试者(包括哺乳动物，特别是人)施用治疗有效量的本文所述的组合物。所述治疗将适当地施用于罹患、具有、易经受或处于疾病、病症或其症状的风险中的受试者，特别是人。“处于风险中的”那些受试者的测定可通过利用诊断测试或受试者或卫生保健提供者的意见的主观或客观测定(例如，遗传测试、酶或蛋白质标记物、标记物(如本文所定义)、家族病史等)来进行。

在一些实施方案中，本公开提供一种监测治疗进展的方法。所述方法包括在罹患或易经受与癌症(例如，白血病)相关的病症或其症状的受试者中测定血液学参数的改变水准和/或用细胞表面蛋白作为诊断标记物(其可包括例如但不限于cd34、cd38、cd90和cd117)来进行癌症干细胞(csc)分析或进行诊断性测量(例如，筛检、分析)的步骤，其中所述受试者已经施用治疗量的如本文所述的组合物。在所述方法中测定的标记物水准可与健康的正常对照中或其他患病患者中的已知标记物水准进行比较以建立受试者的疾病状态。在优选实施方案中，所述受试者中的第二标记物水准是在迟于第一水准的测定的时间点处进行测定，并且两个水准进行比较以监测疾病过程或所述疗法的功效。在某些优选实施方案中，所述受试者中的标记物的治疗前水准是在根据本文所述的方法开始治疗之前进行测定；标记物的这一治疗前水准可接着与治疗开始之后所述受试者中的标记物水准进行比较，以测定治疗功效。

c.组合疗法

设想本文所述的adc可与减轻由所述患者经历的一种或多种副作用的一种或多种疗法或化合物一起用于组合疗法中。在医学疗法的领域中组合治疗形式是常见的。以下是可联合本公开的疗法使用的疗法的一般论述。

为了使用本公开的方法和组合物治疗某些疾病或病症，一般将使所述受试者与化合物和至少一种其他疗法接触。这些疗法将以有效实现一种或多种疾病参数的减少的组合量提供。这一过程可涉及使细胞/受试者与两种剂/疗法同时接触，例如使用包括两种剂的单一组合物或药物制剂，或通过使细胞/受试者与两种不同的组合物或制剂同时接触，其中一种组合物包括所述化合物并且另一组合物包括另一剂。

或者，本文所述的adc可在其他治疗之前或之后，时间间隔介于数分钟至数周范围内。一般将确保在每次递送的时间之间有效时间段尚未期满，以致所述疗法仍将能够对细胞/受试者发挥有利的组合作用。在所述情况下，预期将使细胞与两种形式在彼此约12–24小时内，在彼此约6–12小时内，或以仅约1–2小时的延迟时间接触。在一些情况下，可能需要显著地延长治疗的时间段；然而，其中个别施用之间相隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

也可以想到，将需要所述化合物或所述另一疗法的超过一次施用。可使用多种组合，其中本公开的化合物为“a”并且所述另一疗法为“b”，如下文所例示：

还预期其他组合。

vii.定义

当用于化学基团的背景中时：“氢”意指-h；“羟基”意指-oh；“氧代”意指＝o；“羰基”意指-c(＝o)-；“羧基”意指-c(＝o)oh(还写作-cooh或-co2h)；“卤基”独立地意指-f、-cl、-br或-i；“氨基”意指-nh2；“羟基氨基”意指-nhoh；“硝基”意指-no2；亚氨基意指＝nh；“氰基”意指-cn；“异氰酸酯基”意指-n＝c＝o；“叠氮基”意指-n3；在单价背景中，“磷酸酯基”意指-op(o)(oh)2或其去质子化形式；在二价背景中，“磷酸酯基”意指-op(o)(oh)o-或其去质子化形式；“巯基”意指-sh；并且“硫代”意指＝s；“磺酰基”意指-s(o)2-；并且“亚硫酰基”意指-s(o)-。

在化学式的背景中，符号“-”意指单一键，“＝”意指双键，并且“≡”意指三键。符号“----”表示任选的键，其在存在时为单键或双键。符号表示单键或双键。因此，式涵盖例如和并且应理解，没有一个所述环原子形成超过一个双键的部分。此外，应注意共价键符号“-”当连接一个或两个立体生成原子时不指示任何优选的立体化学。反而，其涵盖所有立体异构体以及其混合物。符号当与键正交画线时(例如，针对甲基的)指示所述基团的附接点。应注意，所述附接点典型地仅针对较大基团以这种方式经鉴别以便帮助读者明白地鉴别附接点。符号意指单键，其中附接于楔的粗端的基团是“离开页面”。符号意指单键，其中附接于楔的粗端的基团是“进入页面”。符号意指单键，其中在双键周围的几何学(例如，e或z)未定义。因此，预期两种选项以及其组合。在本申请中显示的结构的原子上的任何未定义价态均表示键结于那个原子的氢原子。碳原子上的粗体点指示附接于那个碳的氢离开所述纸张的平面定向。

当变量被描绘为环系统上的“浮动基团”，例如下式中的基团“r”时，

那么所述变量可置换附接于任何环原子的任何氢原子，包括所描绘的、所暗指的或明确定义的氢，只要形成稳定结构即可。当变量被描绘为稠环系统上的“浮动基团”，例如下式中的基团“r”时，

那么除非另外规定，否则所述变量可置换附接于任一稠环的任何环原子的任何氢。可置换的氢包括所描绘的氢(例如，附接于上式中的氮的氢)、所暗指的氢(例如，未显示但应理解为存在的上式中的氢)、明确定义的氢和任选的氢，所述任选的氢的存在取决于环原子的身份(例如当x等于-ch-时，附接于基团x的氢)，只要形成稳定结构即可。在所描绘的实例中，r可存在于稠环系统的5元或6元环上。在上式中，紧跟在用圆括号围住的r之后的下标字母“y”表示数值变量。除非另外规定，否则这一变量可为0、1、2或大于2的任何整数，仅受环或环系统的可置换的氢原子的最大数限制。

关于化学基团和化合物类别，所述基团或类别中的碳原子的数目是如下文所指示：“cn”定义所述基团/类别中的碳原子的精确数(n)。“c≤n”定义可在所述基团/类别中的碳原子的最大数(n)，其中关于所讨论的基团/类别，最小数尽可能小，例如应理解基团“烯基(c≤8)”或类别“烯烃(c≤8)”中的碳原子的最小数为2。与指明具有1至10个碳原子的烷氧基的“烷氧基(c≤10)”进行比较。“cn-n′”定义所述基团中的碳原子的最小数(n)和最大数(n′)。因此，“烷基(c2-10)”指明具有2至10个碳原子的那些烷基。这些碳数指标可在其所修饰的化学基团或类别之前或之后，并且其可或可不用圆括号围住，不意味含义的任何改变。因此，术语“c5烯烃”、“c5-烯烃”、“烯烃(c5)”和“烯烃c5”均是同义的。当本文所定义的化学基团或化合物类别中的任一者由术语“取代的”修饰时，所述部分中置换氢原子的任何碳原子均未被计数。因此，具有总计七个碳原子的甲氧基己基是取代的烷基(c1-6)的实例。除非另外规定，否则列于请求项集合中的无碳原子限制的任何化学基团或化合物类别均具有小于或等于十二的碳原子限制。

术语“饱和”当用于修饰化合物或化学基团时意指所述化合物或化学基团不具有碳-碳双键并且不具有碳-碳三键，除非如下文所述。当所述术语用于修饰原子时，其意指所述原子不是任何双键或三键的部分。在饱和基团的取代形式的情况下，一个或多个碳氧双键或碳氮双键可存在。并且当所述键存在时，那么未排除可作为酮-烯醇互变异构或亚胺/烯胺互变异构的部分存在的碳-碳双键。当术语“饱和”用于修饰物质的溶液时，其意指那种物质不再可以溶解于那种溶液中。

术语“脂肪族”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时意味着如此修饰的化合物或化学基团是无环或环状的，但非芳香族烃化合物或基团。在脂肪族化合物/基团中，碳原子可在直链、支化或非芳环(脂环族)中接合在一起。脂肪族化合物/基团可为饱和的，其通过单碳-碳键接合(烷烃/烷基)，或为不饱和的，具有一个或多个碳-碳双键(烯烃/烯基)或具有一个或多个碳-碳三键(炔/炔基)。

术语“芳香族”当用于修饰化合物或化学基团时是指在完全共轭环状π系统中具有4n+2个电子的平面不饱和原子环。

术语“烷基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的碳原子、直链或支化无环结构并且不具有除碳和氢以外的原子的单价饱和脂肪族基团。基团-ch3(me)、-ch2ch3(et)、-ch2ch2ch3(n-pr或丙基)、-ch(ch3)2(i-pr、ⁱpr或异丙基)、-ch2ch2ch2ch3(n-bu)、-ch(ch3)ch2ch3(仲丁基)、-ch2ch(ch3)2(异丁基)、-c(ch3)3(叔丁基(tert-butyl)、叔丁基(t-butyl)、t-bu或^tbu)和-ch2c(ch3)3(新戊基)是烷基的非限制性实例。术语“烷烃二基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的一个或两个饱和碳原子、直链或支化无环结构、不具有碳-碳双键或三键并且不具有除碳和氢以外的原子的二价饱和脂肪族基团。基团-ch2-(亚甲基)、-ch2ch2-、-ch2c(ch3)2ch2-和-ch2ch2ch2-是烷烃二基的非限制性实例。术语“亚烷基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指二价基团＝crr′，其中r和r′独立地为氢或烷基。亚烷基的非限制性实例包括：＝ch2、＝ch(ch2ch3)和＝c(ch3)2。“烷烃”是指具有式h-r的化合物类别，其中r为烷基，这一术语定义于上文中。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。以下基团是取代的烷基的非限制性实例：-ch2oh、-ch2cl、-cf3、-ch2cn、-ch2c(o)oh、-ch2c(o)och3、-ch2c(o)nh2、-ch2c(o)ch3、-ch2och3、-ch2oc(o)ch3、-ch2nh2、-ch2n(ch3)2和-ch2ch2cl。术语“卤烷基”是取代的烷基的子集，其中氢原子置换限于卤基(即，-f、-cl、-br或-i)，以致除碳、氢和卤素以外无其他原子存在。基团-ch2cl是卤烷基的非限制性实例。术语“氟烷基”是取代的烷基的子集，其中氢原子置换限于氟，以致除碳、氢和氟以外无其他原子存在。基团-ch2f、-cf3和-ch2cf3是氟烷基的非限制性实例。

术语“环烷基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的碳原子(所述碳原子形成一个或多个非芳环结构的部分)、不具有碳-碳双键或三键并且不具有除碳和氢以外的原子的单价饱和脂肪族基团。非限制性实例包括：-ch(ch2)2(环丙基)、环丁基、环戊基或环己基(cy)。如本文所用，所述术语不排除附接于所述非芳环结构的碳原子的一个或多个烷基(碳数限制允许的情况下)的存在。术语“环烷烃二基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的两个碳原子、不具有碳-碳双键或三键并且不具有除碳和氢以外的原子的二价饱和脂肪族基团。基团是环烷烃二基的非限制性实例。“环烷烃”是指具有式h-r的化合物类别，其中r为环烷基，这一术语定义于上文中。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。

术语“烯基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的碳原子、直链或支化、无环结构、至少一个非芳香族碳-碳双键、不具有碳-碳三键并且不具有除碳和氢以外的原子的单价不饱和脂肪族基团。非限制性实例包括：-ch＝ch2(乙烯基)、-ch＝chch3、-ch＝chch2ch3、-ch2ch＝ch2(烯丙基)、-ch2ch＝chch3和-ch＝chch＝ch2。术语“烯烃二基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的两个碳原子、直链或支化、直链或支化无环结构、至少一个非芳香族碳-碳双键、不具有碳-碳三键并且不具有除碳和氢以外的原子的二价不饱和脂肪族基团。基团-ch＝ch-、-ch＝c(ch3)ch2-、-ch＝chch2-和-ch2ch＝chch2-是烯烃二基的非限制性实例。应注意，虽然烯烃二基是脂肪族，但一旦在两个末端处经连接，不会阻止这一基团形成芳香族结构的部分。术语“烯烃(alkene)”和“烯烃(olefin)”是同义的并且是指具有式h-r的化合物类别，其中r为烯基，这一术语定义于上文中。同样，术语“末端烯烃”和“α-烯烃”是同义的并且是指仅具有一个碳-碳双键的烯烃，其中那个键是所述分子的末端处的乙烯基的部分。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。基团-ch＝chf、-ch＝chcl和-ch＝chbr是取代的烯基的非限制性实例。

术语“炔基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的碳原子、直链或支化无环结构、至少一个碳-碳三键并且不具有除碳和氢以外的原子的单价不饱和脂肪族基团。如本文所用，术语炔基不排除一个或多个非芳香族碳-碳双键的存在。基团-c≡ch、-c≡cch3和-ch2c≡cch3是炔基的非限制性实例。“炔”是指具有式h-r的化合物类别，其中r为炔基。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。

术语“芳基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的芳香族碳原子(所述碳原子形成一个或多个芳环结构的部分)的单价不饱和芳香族基团，其中环原子均为碳，并且其中所述基团未由除碳和氢以外的原子组成。如果存在超过一个环，那么所述环可为稠合的或非稠合的。非稠合环用共价键连接。如本文所用，术语芳基不排除附接于存在的第一芳环或任何额外芳环的一个或多个烷基(碳数限制允许的情况下)的存在。芳基的非限制性实例包括苯基(ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-c6h4ch2ch3(乙基苯基)、萘基和由联苯基(例如，4-苯基苯基)衍生的单价基团。术语“芳烃二基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的两个芳香族碳原子(所述碳原子形成一个或多个六元芳环结构的部分)的二价芳香族基团，其中环原子均为碳，并且其中所述单价基团未由除碳和氢以外的原子组成。如本文所用，术语芳烃二基不排除附接于存在的第一芳环或任何额外芳环的一个或多个烷基(碳数限制允许的情况下)的存在。如果存在超过一个环，那么所述环可为稠合的或非稠合的。非稠合环用共价键连接。芳烃二基的非限制性实例包括：

“芳烃”是指具有式h-r的化合物类别，其中r为芳基，那一术语定义于上文中。苯和甲苯是芳烃的非限制性实例。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。

术语“芳烷基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指单价基团-烷烃二基-芳基，其中术语烷烃二基和芳基各自以与上文所提供的定义一致的方式使用。非限制性实例为：苯基甲基(苯甲基，bn)和2-苯基-乙基。当术语芳烷基与“取代的”修饰语一起使用时，来自烷烃二基和/或芳基的一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。取代的芳烷基的非限制性实例为：(3-氯苯基)-甲基和2-氯-2-苯基-乙-1-基。

术语“杂芳基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的芳香族碳原子或氮原子(所述碳原子或氮原子形成一个或多个芳环结构的部分)的单价芳香族基团，其中环原子中的至少一者为氮、氧或硫，并且其中所述杂芳基未由除碳、氢、芳香族氮、芳香族氧和芳香族硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，那么所述环可为稠合的或非稠合的。非稠合环用共价键连接。如本文所用，术语杂芳基不排除附接于芳环或芳环系统的一个或多个烷基或芳基(碳数限制允许的情况下)的存在。杂芳基的非限制性实例包括呋喃基、咪唑基、吲哚基、吲唑基(im)、异噁唑基、甲基吡啶基、噁唑基、苯基吡啶基、吡啶基(pyridinyl/pyridyl)、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三嗪基、四唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基。术语“n-杂芳基”是指具有作为附接点的氮原子的杂芳基。“杂芳烃”是指具有式h-r的化合物类别，其中r为杂芳基。吡啶和喹啉是杂芳烃的非限制性实例。当这些术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。

术语“杂环烷基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为附接点的碳原子或氮原子(所述碳原子或氮原子形成一个或多个非芳环结构的部分)的单价非芳香族基团，其中环原子中的至少一者为氮、氧或硫，并且其中所述杂环烷基未由除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，那么所述环可为稠合的或非稠合的。如本文所用，所述术语不排除附接于所述环或环系统的一个或多个烷基(碳数限制允许的情况下)的存在。另外，所述术语不排除所述环或环系统中的一个或多个双键的存在，其条件是所得基团保持非芳香族。杂环烷基的非限制性实例包括氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯啶基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、四氢吡喃基、吡喃基、环氧乙烷基和氧杂环丁烷基。术语“n-杂环烷基”是指具有作为附接点的氮原子的杂环烷基。n-吡咯烷基是所述基团的一个实例。当这些术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。

术语“酰基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指基团-c(o)r，其中r为氢、烷基、环烷基或芳基，那些术语定义于上文中。基团-cho、-c(o)ch3(乙酰基，ac)、-c(o)ch2ch3、-c(o)ch(ch3)2、-c(o)ch(ch2)2、-c(o)c6h5和-c(o)c6h4ch3是酰基的非限制性实例。“硫酰基”以类似方式定义，除了基团-c(o)r的氧原子已经硫原子置换，-c(s)r。术语“醛”对应于附接于-cho基团的如上文所定义的烷基。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子(包括直接地附接于可能存在的羰基或硫羰基的碳原子的氢原子)已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。基团-c(o)ch2cf3、-co2h(羧基)、-co2ch3(甲基羧基)、-co2ch2ch3、-c(o)nh2(胺甲酰基)和-con(ch3)2是取代的酰基的非限制性实例。

术语“烷氧基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指基团-or，其中r为烷基，那一术语定义于上文中。非限制性实例包括：-och3(甲氧基)、-och2ch3(乙氧基)、-och2ch2ch3、-och(ch3)2(异丙氧基)、-oc(ch3)3(叔丁氧基)、-och(ch2)2、-o-环戊基和-o-环己基。术语“环烷氧基”、“烯氧基”、“炔氧基”、“芳氧基”、“芳烷氧基”、“杂芳氧基”、“杂环烷氧基”和“酰氧基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指定义为-or的基团，其中r分别地为环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基和酰基。术语“烷基硫基”和“酰基硫基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指基团-sr，其中r分别地为烷基和酰基。术语“醇”对应于如上文所定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经羟基置换。术语“醚”对应于如上文所定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经烷氧基置换。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。

术语“烷基氨基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指基团-nhr，其中r为烷基，那一术语定义于上文中。非限制性实例包括：-nhch3和-nhch2ch3。术语“二烷基氨基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指基团-nrr′，其中r和r′可为相同或不同烷基，或r和r′可合在一起以表示烷烃二基。二烷基氨基的非限制性实例包括：-n(ch3)2和-n(ch3)(ch2ch3)。术语“环烷基氨基”、“烯基氨基”、“炔基氨基”、“芳基氨基”、“芳烷基氨基”、“杂芳基氨基”、“杂环烷基氨基”、“烷氧基氨基”和“烷基磺酰基氨基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指定义为-nhr的基团，其中r分别地为环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基、烷氧基和烷基磺酰基。芳基氨基的非限制性实例为-nhc6h5。术语“酰胺基”(酰基氨基)当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指基团-nhr，其中r为酰基，那一术语定义于上文中。酰胺基的非限制性实例为-nhc(o)ch3。术语“烷基亚氨基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指二价基团＝nr，其中r为烷基，那一术语定义于上文中。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，附接于碳原子的一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。基团-nhc(o)och3和-nhc(o)nhch3是取代的酰胺基的非限制性实例。

术语“杂芳烃二基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为两个附接点的两个芳香族碳原子、两个芳香族氮原子或一个芳香族碳原子和一个芳香族氮原子(所述原子形成一个或多个芳环结构的部分)的二价芳香族基团，其中环原子中的至少一者为氮、氧或硫，并且其中所述二价基团未由除碳、氢、芳香族氮、芳香族氧和芳香族硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，那么所述环可为稠合的或非稠合的。非稠合环用共价键连接。如本文所用，术语杂芳烃二基不排除附接于芳环或芳环系统的一个或多个烷基或芳基(碳数限制允许的情况下)的存在。杂芳烃二基的非限制性实例包括：

术语“杂环烷烃二基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指具有作为两个附接点的两个碳原子、两个氮原子或一个碳原子和一个氮原子(所述原子形成一个或多个环结构的部分)的二价环状基团，其中环原子中的至少一者为氮、氧或硫，并且其中所述二价基团未由除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，那么所述环可为稠合的或非稠合的。非稠合环用共价键连接。如本文所用，术语杂环烷烃二基不排除附接于所述环或环系统的一个或多个烷基(碳数限制允许的情况下)的存在。另外，所述术语不排除所述环或环系统中的一个或多个双键的存在，其条件是所得基团保持非芳香族。杂环烷烃二基的非限制性实例包括：

术语“烷基磺酰基”和“烷基亚硫酰基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时分别地是指基团-s(o)2r和-s(o)r，其中r为烷基，那一术语定义于上文中。术语“环烷基磺酰基”、“烯基磺酰基”、“炔基磺酰基”、“芳基磺酰基”、“芳烷基磺酰基”、“杂芳基磺酰基”和“杂环烷基磺酰基”以类似方式定义。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。

术语“烷基磷酸酯基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指基团-op(o)(oh)(or)，其中r为烷基，那一术语定义于上文中。烷基磷酸酯基的非限制性实例包括：-op(o)(oh)(ome)和-op(o)(oh)(oet)。术语“二烷基磷酸酯基”当在不具有“取代的”修饰语的情况下使用时是指基团-op(o)(or)(or′)，其中r和r′可为相同或不同烷基，或r和r′可合在一起以表示烷烃二基。二烷基磷酸酯基的非限制性实例包括：-op(o)(ome)2、-op(o)(oet)(ome)和-op(o)(oet)2。当这些术语中的任一者与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地经-oh、-f、-cl、-br、-i、-nh2、-no2、-co2h、-co2ch3、-cn、-sh、-och3、-och2ch3、-c(o)ch3、-nhch3、-nhch2ch3、-n(ch3)2、-c(o)nh2、-c(o)nhch3、-c(o)n(ch3)2、-oc(o)ch3、-nhc(o)ch3、-s(o)2oh或-s(o)2nh2置换。

当在权利要求书和/或说明书中联合术语“包含”一起使用时，措辞“一个(a)”或“一个(an)”的使用可意指“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义一致。

在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括器件、用于测定所述值的方法的误差的固有变化，或研究受试者中存在的变化。

“活性成分”(ai)(也称作活性化合物、活性物质、活性剂、药物剂、剂、生物活性分子或治疗化合物)是药用药物或杀虫剂中的生物活性成分。相似术语活性药物成分(api)和主要活性剂也用于医学中，并且术语活性物质可用于杀虫剂制剂。

术语“包含(comprise)”、“具有(have)”和“包括(include)”是开放式连系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有那一个或多个步骤并且还涵盖其他未列出的步骤。

术语“有效”意指适于实现所需、期望或预期的结果，那一术语用于说明书和/或权利要求书中。“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”当用于以化合物治疗患者或受试者的背景中时意指当施用于受试者或患者以治疗或预防疾病时所述化合物的量，所述量是足以实现所述疾病的所述治疗或预防的量。

“赋形剂”是连同药剂、药物组合物、制剂或药物递送系统的活性成分一起进行配制的药学上可接受的物质。赋形剂可用于例如稳定化所述组合物，使所述组合物膨胀(因此当用于这一目的时，通常称作“膨胀剂”、“填充剂”或“稀释剂”)，或赋予最终剂型中的活性成分的治疗增强，如促进药物吸收、减少粘度或增强溶解度。赋形剂包括抗粘剂、粘合剂、包衣、着色剂、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂和媒介物的药学上可接受的形式。充当用于传送所述活性成分的介质的主要赋形剂通常称作媒介物。赋形剂也可用于制造过程，例如以帮助处置活性物质，如通过促进粉末流动性或不粘特性；以及帮助体外稳定性，如在期望的货架期中防止变性或聚集。赋形剂的适用性典型地将视施用途径、剂型、活性成分以及其他因素而变化。

术语“水合物”当用作化合物的修饰语时意指所述化合物具有与各化合物分子(如呈所述化合物的固体形式)缔合的不足一个(例如，半水合物)、一个(例如，单水合物)或超过一个(例如，二水合物)水分子。

如本文所用，术语“ic50”是指作为所获得的最大反应的50％的抑制剂量。这一定量量度指示需要多少特定药物或其他物质(抑制剂)将给定的生物、生物化学或化学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半。

第一化合物的“异构体”是独立化合物，其中各分子含有与所述第一化合物相同的组成原子，但其中那些原子的三维配置不同。

如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物生物，如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，所述患者或受试者是灵长类动物。人患者的非限制性实例为成人、青少年、幼儿和胎儿。

如本文中一般所用，“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内，适于与人和动物的组织、器官和/或体液接触使用而无过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

“药学上可接受的盐”意指本发明化合物的盐，其如上文所定义为药学上可接受的，并且其具有所需的药理学活性。所述盐包括用以下酸形成的酸加成盐：无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸，如1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4,4′-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、乙酸、脂肪族单羧酸和二羧酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、粘康酸、邻(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、经苯基取代的烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、丁二酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。药学上可接受的盐还包括当存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应时可形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、n-甲基葡糖胺等。应认识到，形成本发明的任何盐的一部分的特定阴离子或阳离子不重要，只要所述盐整体是药理学上可接受的。药学上可接受的盐的额外实例和其制备和使用方法呈递于handbookofpharmaceuticalsalts:properties,anduse(p.h.stahl和c.g.wermuth编,verlaghelveticachimicaacta,2002)中。

“药学上可接受的载体”、“药物载体”或简单地“载体”是连同携带、递送和/或运输化学剂时所牵涉的活性成分药剂一起进行配制的药学上可接受的物质。药物载体可用于改进药物的递送和有效性，包括例如控制释放技术以调节药物生物可用性、降低药物代谢和/或减少药物毒性。一些药物载体可增加药物递送至具体靶位点的有效性。载体的实例包括：脂质体、微球(例如，由聚(乳酸-共-乙醇酸)制得)、白蛋白微球、合成聚合物、纳米纤维、蛋白质-dna复合物、蛋白质缀合物、红血球、病毒颗粒和树枝状聚合物。

“药用药物”(还称作药物、药物剂、药物制剂(pharmaceuticalpreparation)、药物组合物、药物制剂(pharmaceuticalformulation)、药物产品、医学产品、药、药剂、药品或简单地药物)是用于诊断、治愈、治疗或预防疾病的药物。活性成分(ai)(定义于上文中)是药用药物或杀虫剂中的生物活性成分。相似术语活性药物成分(api)和主要活性剂也用于医学中，并且术语活性物质可用于杀虫剂制剂。一些药剂和杀虫剂产品可含有超过一种活性成分。与活性成分形成对比，无活性成分通常在药物背景中被称作赋形剂(定义于上文中)。

“多价聚合物”描述含有可用于使不同组分连接在一起的两个或更多个开放价点的连接基团。多价聚合物的一些非限制性实例包括具有能够与所述组分、树枝状聚合物、树枝石或其片段反应的侧链的聚合物。在一个实施方案中，所述多价聚合物是树枝状聚合物或树枝石。

“预防(prevention)”或“预防(preventing)”包括：(1)抑制可处于疾病风险中和/或易患疾病但尚未经历或呈现所述疾病的任何或所有病理学或症状学的受试者或患者的疾病发作，和/或(2)减慢可处于疾病风险中和/或易患疾病但尚未经历或呈现所述疾病的任何或所有病理学或症状学的受试者或患者的疾病的病理学或症状学发作。

“前药”意指可体内代谢转化为根据本发明的抑制剂的化合物。前药本身也可或可不具有关于给定的靶蛋白的活性。例如，包含羟基的化合物可呈酯形式施用，所述酯可通过体内水解转化为所述羟基化合物。可体内转化为羟基化合物的适合的酯包括乙酸酯、柠檬酸酯、乳酸酯、磷酸酯、酒石酸酯、丙二酸酯、草酸酯、水杨酸酯、丙酸酯、丁二酸酯、反丁烯二酸酯、顺丁烯二酸酯、亚甲基-双β-羟基萘甲酸酯、龙胆酸酯、羟乙基磺酸酯、二-对甲苯酰基酒石酸酯、甲烷-磺酸酯、乙烷磺酸酯、苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯、环己基-氨基磺酸酯、奎尼酸酯、氨基酸酯等。同样，包含胺基的化合物可呈酰胺形式施用，所述酰胺可通过体内水解转化为所述胺化合物。

“胺保护基”在本领域中是众所周知的。胺保护基是在修饰所述分子的一些其他部分的反应期间防止胺基的反应性并且可容易地去除以产生所需胺的基团。胺保护基可至少发现于greene和wuts,1999中，所述文献以引用的方式并入本文中。单价氨基保护基的一些非限制性实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基，如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；烷氧基-或芳氧基羰基(其与经保护胺形成氨基甲酸酯)，如苯甲氧基羰基(cbz)、对氯苯甲氧基羰基、对甲氧基苯甲氧基羰基、对硝基苯甲氧基羰基、2-硝基苯甲氧基羰基、对溴苯甲氧基羰基、3,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、2,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、4-甲氧基苯甲氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苯甲氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α--二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基(boc)、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基(alloc)、2,2,2,-三氯乙氧基羰基、2-三甲基硅烷基乙氧基羰基(teoc)、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基(fmoc)、环戊氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己氧基羰基、苯硫基羰基等；芳烷基，如苯甲基、三苯基甲基、苯甲氧基甲基等；和硅烷基，如三甲基硅烷基等。另外，“胺保护基”可为二价保护基，以致伯胺上的两个氢原子经单一保护基置换。在所述情况下，所述胺保护基可为邻苯二甲酰亚胺(phth)或其取代的衍生物，其中术语“取代的”是如上文所定义。在一些实施方案中，卤代邻苯二甲酰亚胺衍生物可为四氯邻苯二甲酰亚胺(tcphth)。当用于本文中时，“经保护氨基”是式pgmanh-或pgdan-的基团，其中pgma是单价胺保护基，其也可描述为“单价保护的氨基”并且pgda是如上文所述的二价胺保护基，其也可描述为“二价保护的氨基”。

“羟基保护基”在本领域中是众所周知的。羟基保护基是在修饰所述分子的一些其他部分的反应期间防止羟基的反应性并且可容易地去除以产生所需羟基的基团。羟基保护基可至少发现于greene和wuts,1999中，所述文献以引用的方式并入本文中。羟基保护基的一些非限制性实例包括酰基，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基，如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；酰氧基，如苯甲氧基羰基(cbz)、对氯苯甲氧基羰基、对甲氧基苯甲氧基羰基、对硝基苯甲氧基羰基、2-硝基苯甲氧基羰基、对溴苯甲氧基羰基、3,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、2,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、4-甲氧基苯甲氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苯甲氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基(boc)、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基(alloc)、2,2,2,-三氯乙氧基羰基、2-三甲基硅烷基乙氧基羰基(teoc)、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基(fmoc)、环戊氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己氧基羰基、苯硫基羰基等；芳烷基，如苯甲基、三苯基甲基、苯甲氧基甲基等；和硅烷基，如三甲基硅烷基等。当用于本文中时，经保护羟基是式pgho-的基团，其中pgh是如上文所述的羟基保护基。

“立体异构体”或“光学异构体”是给定的化合物的异构体，其中相同原子键结至相同的其他原子，但其中那些原子的三维配置不同。“对映异构体”是给定的化合物的立体异构体，其为彼此的镜像，如左手和右手。“非对映异构体”是给定的化合物的立体异构体，其并非对映异构体。手性分子含有手性中心(还称作立体中心或立体生成中心)，所述手性中心是携带基团以致任何两个基团的互换均产生立体异构体的分子中的任何点(不过未必是原子)。在有机化合物中，所述手性中心典型地是碳、磷或硫原子，不过在有机和无机化合物中其他原子也有可能是立体中心。分子可具有多个立体中心，从而使其产生多种立体异构体。在立体异构现象是归因于四面体立体生成中心(例如，四面体碳)的化合物中，假设有可能的立体异构体的总数将不超过2ⁿ，其中n是四面体立体中心的数目。具有对称性的分子通常少于立体异构体的最大可能数。对映异构体的50:50混合物被称为外消旋混合物。或者，对映异构体的混合物可经对映异构体富集，使得一种对映异构体以超过50％的量存在。典型地，对映异构体和/或非对映异构体可使用本领域中已知的技术进行拆分或分离。预期关于尚未定义立体化学的任何立体中心或手性轴，那个立体中心或手性轴可以其r形式、s形式或呈所述r和s形式的混合物(包括外消旋和非外消旋混合物)存在。如本文所用，短语“大体上不含其他立体异构体”意指所述组合物含有≤15％、更优选地≤10％、甚至更优选地≤5％或最优选地≤1％的其他立体异构体。

“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括(1)抑制经历或呈现疾病的病理学或症状学的受试者或患者的所述疾病(例如，遏制所述病理学和/或症状学的进一步发展)，(2)改善经历或呈现疾病的病理学或症状学的受试者或患者的所述疾病(例如，逆转所述病理学和/或症状学)，和/或(3)实现经历或呈现疾病的病理学或症状学的受试者或患者的所述疾病的任何可测量降低。

如本文所用，平均分子量是指通过静态光散射测定的重量平均分子量(mw)。

“重复单元”是某些材料(例如框架和/或聚合物，无论有机、无机或金属-有机)的最简单结构实体。在聚合物链的情况下，重复单元沿着所述链相继连接在一起，如项链的珠子。例如，在聚乙烯-[-ch2ch2-]n-中，重复单元是-ch2ch2-。下标“n”表示聚合程度，即连接在一起的重复单元的数目。当“n”的值保持未定义时或在“n”不存在的情况下，其简单地指明括弧内的式的重复以及所述材料的聚合物性质。重复单元的概念同样适用于重复单元之间的连接性沿三维延伸的情况，如在金属有机框架、经修饰聚合物、热固性聚合物等中。

术语“缀合基团”是指能够在温和条件下与另一化合物的官能团偶合形成共价键并且在生理学条件下稳定的化学基团。在一些实施方案中，所述缀合基团可经由sn2反应、diels-alder反应或共轭加成反应形成共价键。缀合基团的实例包括但不限于二烯基团(如四氢基)、烯基(如反式环辛烯基和降冰片基)和-sh。

上述定义取代以引用的方式并入的任何参考文献中的任何冲突定义。然而，某些术语经定义的事实不应被视为指示未定义的任何术语均是不确定的。反而，相信所用的所有术语均明确地描述本发明，以致本领域的技术人员可理解本发明的范围和实践。

viii.实施例

包括以下实施例以证明本公开的优选实施方案。本领域的技术人员应理解以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的，在本公开实践中发挥良好作用的技术，并且因此可被认为构成本发明实践的优选模式。然而，按照本公开，本领域的技术人员应理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下可在已公开并且仍获得类似或相似结果的具体实施方案中做出许多改变。

实施例1–支化接头的裂解的评估、支化接头的合成以及有效载荷安装和稳定性研究。

a.织蛋白酶b介导的支化接头的裂解的评估

本文中公开，支化可裂解adc接头可通过mtg酶介导的缀合有效地安装于治疗性单克隆抗体上。这一方法使得能够进行有效载荷分子的模块安装和具有增加的dar的均质adc的建构(图1)。在抗原识别和内化至靶癌细胞时，并入我们的支化接头中的组织蛋白酶b反应性肽序列经历溶酶体裂解以每个接头释放两个细胞毒性有效载荷，导致有效细胞杀死。为了鉴别可在靶癌细胞内部释放两个有效载荷的支化adc接头的设计，合成一系列直链和支化荧光探针1–4(方案1和方案3-6)。

方案1.用于fret分析的含有色氨酸(荧光团)和eddnp基团(淬灭剂)的荧光探针1–4的结构(关于合成细节，参见下文实施例)。val–cit序列经历组织蛋白酶b介导的裂解(用箭头描绘)以从所述探针释放eddnp，使得能够进行源于色氨酸的荧光检测(激发：280nm，发射：360nm)。

这些模型接头单元由具有或不具有聚乙二醇(peg)间隔基的组织蛋白酶b可裂解的缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)组成。这个二肽序列已经用于多种成功的adc中，包括fda批准的adc(katz等人,2011)。所述序列在循环中稳定，但在溶酶体中经历组织蛋白酶b介导的裂解，导致有效载荷的细胞内释放(dubowchik等人,2002)。色氨酸和2,4-二硝基苯基乙二胺(eddnp)作为荧光团/淬灭剂对经安装，所述对通常用于弗斯特共振能量转移(fret)分析中。评估在人组织蛋白酶b存在下各合成模型接头单元中的eddnp释放(表1和方案3)。发现直链peg(+)探针2比直链peg(–)1更有效地释放eddnp。支化peg(+)探针4的释放速率可与直链peg(+)探针2的释放速率相当。相比之下，支化peg(–)探针3显示eddnp的边缘释放。不希望受任何特定理论束缚，据推测归因于peg间隔基缺乏的支化探针3的结构拥挤防止组织蛋白酶b接近val-cit部分。这些结果清楚地说明，所述间隔基是用于保持含val-cit接头对组织蛋白酶b介导的裂解的高反应性的组分，尤其在支化接头形式中。

表1.fret分析中组织蛋白酶b介导的直链和支化探针1–4的裂解的速率^a

^a反映淬灭剂释放速率的各斜率是使用graphpadprism7软件通过线性回归方法来计算。所有分析均一式三份执行。rfu，相对荧光单位。

支化接头的合成和缀合。使用现有的合理接头设计，开始含有支化接头的adc的建构。首先，设计并且合成支化接头5–7(方案2)。这些接头含有1)作为分支点的l-赖氨酸骨架，2)peg间隔基，3)用于mtg酶介导的抗体-接头缀合的伯胺，和4)作为用于通过叠氮化物-炔点击反应进行以下有效载荷安装的反应手柄的两个叠氮基(agard等人,2004)(参见下文)。这些接头是通过各组分的依序酰胺偶合建构的(方案7)。所述叠氮化物和伯胺用peg间隔基进行空间隔绝以最小化接头臂的空间拥挤。另外，设想高度亲水性peg间隔基可能帮助减少待建构的adc的疏水性，其可防止蛋白质聚集和体内的快速清除(adem等人,2014)。实际上，安装于所述有效载荷或所述接头上的peg链据报告防止adc形成非共价寡聚物(king等人,2002；lyon等人,2015)。

方案2.支化接头5-7的结构。

接下来，执行所合成的支化接头与抗her2igg1抗体的缀合。在这一研究中，使用工程化抗her2单克隆抗体(mab)，其中重链的天冬酰胺297突变为丙氨酸(n297a)。已经报告这一突变不会改变抗her2mab的her2结合概况(shi等人,2014)。另外，这一突变允许省略天冬酰胺297上的n-聚糖链的去除，所述去除是mtg酶介导的抗体-接头缀合所需的步骤(dennler等人,2014)。根据所报告的方案尝试将支化接头5–7安装于n297a抗her2mab上(接头：80当量，抗体：1.0mg/ml，mtg酶：6.7单位/mg抗体)(dennler等人,2014)。然而，转化速率未能令人满意(50–79％，表2和方案4-5中的条目1–3)，产生略微异质抗体-接头缀合物的混合物。含伯胺分子的庞大通常导致mtg酶介导的蛋白质标记的低效率((dennler等人,2015)。实际上，schibli和同事使用简单直链接头来进行adc建构以实现定量转化(dennler等人,2014)。这一发现促成使庞大支化接头以有效方式附接于n297a抗her2mab的反应条件的优化。因此，使用三者中最具反应性的接头支化接头5来筛检多种反应条件。发现mtg酶的量不显示对转化速率的显著影响(条目4)。相比之下，n297a抗her2mab的较高浓度大体上改进缀合效率(条目5)。另外，增加接头5的量证明了有效用于改进转化速率(条目6和7)。进一步检查多种反应条件，并且最终鉴别使得能够进行几乎定量缀合的有效条件(条目8和9)。在37℃下孵育反应混合物过夜会提供可源于蛋白质变性或与谷酰胺残基而非q295的过度反应的副产物，而所述副反应在室温下未观察到。因此，决定在室温下执行以下部分中的接头缀合。最佳反应条件还使得支化接头6和7能够与n297a抗her2mab高度有效缀合(条目10和11)。这一成功证明了基于mtg酶的转肽作用可在最佳条件下使甚至庞大接头与抗体有效缀合。另外，这一发现是振奋人心的，因为接头结构的额外修饰可用于微调adc物理化学特性并且进一步增加dar。所述结果还指示，mtg酶介导的转肽作用可能更通常用于多种蛋白质修饰。

表2.mtg酶介导的抗体-支化接头缀合

^amtg酶(26.9u/mg抗体)。^b基于解卷积esi-质谱测定。^c3h之后。在过夜孵育之后观察到产物的部分损失，其可能归因于蛋白质变性和/或与谷酰胺残基而非q295的过度反应。

通过点击化学和稳定性研究进行的有效载荷安装。最后，获得n297a抗her2mab–支化接头5缀合物并且偶合有效的抗有丝分裂剂单甲基澳瑞他汀f(mmaf)。使用应变促进的叠氮化物-炔环加成(无铜点击反应)(agard等人,2004)，其中使用含有二苯并环辛炔(dbco)、peg间隔基、val–cit和对氨基苯甲氧基羰基(pabc)的mmaf模块8(图2a)。并入所述pabc以在组织蛋白酶b介导的val–cit裂解时允许mmaf的无痕迹释放。抗her2mab–接头5缀合物(4.0mg/ml)在pbs/4％dmso中与dbco–mmaf8(每个反应位点1.5当量)一起孵育。所述点击反应在1h内达到充分完成以生成几乎均质adc9，其平均dar为3.9(图2b-2c和方案6-7)。两种对照adc也以相同方式制备：含有直链接头(直链adc10，dar：1.9)的n297a抗her2mab–mmaf缀合物(dennler等人,2004)和通过支化接头5(非靶向支化adc11，dar：3.9)与mmaf缀合的n297a非靶向igg。

值得注意的是，尺寸排阻色谱(sec)分析揭露了adc9主要以单体形式存在(图2d)，这可能归因于并入adc骨架内的多个亲水性peg间隔基。此外，安装于adc9上的可裂解支化接头在生理学条件下稳定；在37℃下在人血浆中未观察到所述接头的显著降解持续7天，指示dar在孵育期间未显著改变(方案8)。这些结果支持就药物发展观点来说所述接头设计的有效性。

实施例2–一般方法和材料

除非另外描述，否则所有材料均购自商业供应商(acrosorganics、chem-impexinternational、fisherscientific、sigmaaldrich和tciamerica)并且原样使用。所有无水溶剂均购得并且在氩气氛围下存储于活性分子筛上。

使用硅胶板(merckkieselgel60f254，关于tlc为0.25mm)执行分析型薄层色谱(tlc)并且用紫外光(254nm)或通过茚三酮染色进行肉眼观察。使用硅胶(tciamerica，球形，粒径60μm)执行快速柱色谱。

核磁共振(nmr)谱记录于使用甲醇-d4(cd3od)作为氘化溶剂的brukerdpx谱仪(¹h：300mhz)上。¹hnmr谱中的化学位移(δ)以相对于cd3od的百万分率(ppm)报告(δ＝3.34ppm。所有nmr谱中的耦合常数(j)均以赫兹(hz)报告。

使用由1100hplc和配备有c18逆相柱(50×3mm，2.6微米；accucorec18,thermoscientific)的1946d单四极电喷雾电离(esi)质谱仪组成的agilentlc-ms系统执行分析型逆相高效液体色谱(rp-hplc)。用于有机分子的标准分析条件如下：流动速率＝0.5ml/min；溶剂a＝含有0.1％甲酸的水；溶剂b＝含有0.1％甲酸的乙腈。使用线性梯度分析化合物并且用uv检测在210和254nm下监测。使用配备有c18逆相柱(19×150mm，5.0微米；sunfireprepc18obd,waters)的breezehplc系统(waters)执行制备型hplc。标准纯化条件如下：流动速率＝10ml/min；溶剂a＝含有0.05％三氟乙酸(tfa)的水；溶剂b＝含有0.05％tfa的乙腈。使用线性梯度分析化合物并且用uv检测在210和254nm下监测。在所有情况下，针对纯度确认，使用lc-ms离线分析洗脱份。

使用agilent6530accuratemassq-toflc/ms获得高分辨率质谱。在cytation5细胞成像多模式读取仪(biotek)上测量吸光度和荧光。

实施例3–支化接头化合物表征

方案3.直链探针1的合成。

ac-trp(boc)-lys(n3)-val-cit-ohs1的合成

氯三苯甲基氯树脂(500mg，0.76mmol)和fmoc-瓜氨酸-oh(453mg，1.14mmol)被带入含有n,n-二异丙基乙胺(dipea，397μl，2.28mmol)和二甲基甲酰胺(dmf，3ml)的手动固相反应器中并且搅拌持续2h。甲醇(meoh，600μl，1.52mmol)添加至所述树脂中并且搅拌持续20min，排出溶液并且所述树脂用dmf(5×3ml)和二氯甲烷(dcm，5×3ml)洗涤。为了在每次偶合之后去除fmoc-保护基，所述树脂用哌啶(5ml，20％于dmf中，20min)处理并且用dmf(5×3ml)和dcm(5×3ml)洗涤。经fmoc保护的氨基酸(2当量)使用dmf中的1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(hatu，2当量)和dipea(3当量)预活化持续3min，并且所述混合液添加至所述树脂中。所述树脂在室温下搅拌持续1h。通过kaiser测试来验证偶合的完成。在每个偶合步骤之后，排干偶合混合液并且所述树脂用dmf(5×3ml)和dcm(5×3ml)洗涤。在肽的延伸之后，所述树脂用dmf中的乙酸酐(2当量)和dipea(3当量)处理持续1h并且接着用dmf(5×3ml)和dcm(5×3ml)洗涤。所得的经保护肽树脂在室温下用1％三氟乙酸(tfa)/dcm的混合液处理持续1h。所述溶液在真空中浓缩并且粗肽用冷乙醚(5–6ml)沉淀，随后在500xg下离心持续5min(3次)。所得的粗肽s1在真空中干燥并且接着立即用于下一步骤而无需纯化。

ac-trp(boc)-lys(n3)-val-cit-pabc-pnps2的合成

向肽s1(20mg，0.026mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加hatu(13.0mg，0.034mmol)、dipea(6μl，0.04mmol)和对氨基苯甲醇(paboh，4.9mg，0.04mmol)，并且所述混合物在室温下在暗处搅拌持续1.5h。所述溶液直接地在真空中浓缩并且粗肽用冷乙醚(5–6ml)沉淀，随后在500xg下离心持续5min(3次)。所得的粗肽在真空中干燥持续至少90min并且接着立即用于下一步骤而无需纯化。向这一粗混合物于dmf(2ml)中之溶液中添加双(2,4-二硝基苯基)碳酸酯(40.2mg，0.13mmol)和dipea(23μl，0.13mmol)，并且所述混合物在室温下搅拌过夜。粗肽s2通过制备型rp-hplc纯化以生成分析纯肽s2(10.2mg，38％，2个步骤)。灰白色粉末。hrms(esi)c49h62n12o13na[m+na]⁺计算值：1049.4452。实验值：1049.4462。

ac-trp-lys(n3)-val-cit-pabc-eddnp1的合成

肽s2(4.6mg，0.0045mmol)在室温下用dmf(0.5ml)中的n'-(2,4-二硝基苯基)乙烷-1,2-二胺(eddnp，1.53mg，0.0068mmol)和dipea(1μl，0.0045mmol)处理持续3.5h。所述溶液直接地在真空中浓缩以生成粗肽。所述粗肽接着溶解于dcm(0.5ml)中并且tfa(0.5ml)在0℃下添加至所述溶液中。1h之后，所述溶液直接地在真空中浓缩并且通过制备型rp-hplc纯化以生成分析纯肽1(1.66mg，36％，2个步骤)。黄色粉末。hrms(esi)c46h59n15o12na[m+na]⁺计算值：1036.4360。实验值：1036.4357。

方案4.炔肽s4的合成。

炔-val-cit-ohs3的合成

fmoc-val-cit-树脂以与s1的制备相同的方式合成。在肽的延伸之后，所述树脂用dmf中的4-戊炔酸(2当量)、hatu(2当量)和dipea(3当量)处理持续1h并且接着用dmf(5×1ml)和dcm(5×1ml)洗涤。所得的肽树脂在室温下用1％tfa/dcm的混合液处理持续1h。所述溶液在真空中浓缩并且粗肽用冷乙醚(5–6ml)沉淀，随后在500xg下离心持续5min(3次)。所得的粗肽s3在真空中干燥并且接着立即用于下一步骤而无需纯化。

炔-val-cit-pabc-eddnps4的合成

向肽s3(21.8mg，0.062mmol)于meoh/dcm(1.5ml，1:2)中的溶液中添加paboh(15.3mg，0.12mmol)和n-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(eedq，30.7mg，0.12mmol)，并且所述混合物在室温下在暗处搅拌过夜。所述溶液直接地在真空中浓缩并且粗肽用冷乙醚(5–6ml)沉淀，随后在500xg下离心持续5min(3次)。所得的粗肽在真空中干燥并且接着立即用于下一步骤而无需纯化。

向粗肽于dmf(1ml)中之溶液中添加双(2,4-二硝基苯基)碳酸酯(106mg，0.35mmol)和dipea(36μl，0.21mmol)并且所述混合物在室温下搅拌持续2h。之后，eddnp(31.7mg，0.14mmol)添加至所述混合物中并且所述混合物在室温下搅拌持续3h。添加额外eddnp(55mg，0.25mmol)并且所述混合物进一步在室温下搅拌持续1h。所述反应用15％柠檬酸淬灭并且用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，并且在真空中浓缩。粗肽通过制备型rp-hplc纯化以生成分析纯肽s4(6.7mg，16％，3个步骤)。黄色粉末。hrms(esi)c32h41n9o10na[m+na]⁺计算值：734.2869。实验值：734.2871。

方案5.含有peg间隔基的直链探针2的合成。

ac-trp(boc)-lys(-peg3-n3)-peg3-val-cit-ohs5的合成

ac-trp(boc)-lys(-peg3-n3)-peg3-val-cit-oh以与s1的制备相同的方式合成。所得的肽树脂在室温下用1％tfa/dcm的混合液处理持续1h。所述溶液在真空中浓缩并且粗肽用冷乙醚(5–6ml)沉淀，随后在500xg下离心持续5min(3次)。所得的粗肽s5在真空中干燥并且接着立即用于下一步骤而无需纯化。

ac-trp(boc)-lys(-peg3-n3)-peg3-val-cit-pabc-pnps6的合成

向肽s5(24mg，0.021mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加hatu(10.4mg，0.027mmol)、dipea(4.8μl，0.027mmol)和paboh(3.9mg，0.032mmol)，并且所述混合物在室温下在暗处搅拌持续2h。所述溶液直接地在真空中浓缩并且粗肽用冷乙醚(5–6ml)沉淀，随后在500xg下离心持续5min(3次)。所得的粗肽在真空中干燥持续至少90min并且接着立即用于下一步骤而无需纯化。向这一粗肽于dmf(1ml)中之溶液中添加双(2,4-二硝基苯基)碳酸酯(32mg，0.11mmol)和dipea(18μl，0.11mmol)，并且所述混合物在室温下搅拌过夜。粗肽s6通过制备型rp-hplc纯化以生成分析纯肽s6(4.0mg，14％，2个步骤)。灰白色粉末。hrms(esi)c65h92n14o21na[m+na]⁺计算值：1427.6454。实验值：1427.6454。

ac-trp-lys(-peg3-n3)-peg3-val-cit-pabc-eddnp2的合成

肽s6(3.2mg，0.0023mmol)在室温下用dmf(0.5ml)中的eddnp(0.78mg，0.0035mmol)处理持续2h并且所述溶液直接地在真空中浓缩。所述粗肽接着溶解于dcm(1ml)中并且tfa(1ml)在0℃下添加至所述溶液中。1h之后，所述溶液直接地在真空中浓缩并且粗肽用冷乙醚(5–6ml)沉淀，随后在500xg下离心持续5min(3次)。粗肽通过制备型rp-hplc纯化以生成分析纯肽2(1.1mg，34％，2个步骤)。黄色粉末。hrms(esi)c62h89n17o20na[m+na]⁺计算值：1414.6362。实验值：1414.6349。

方案6.支化探针3和4的合成

fret化合物3的合成

炔肽s4(100μl，10mm于dmso中)和叠氮化物肽于1(130μl，10mm于dmso中)于dmso(620μl)中的混合物用cuso4(50μl，100mm于di水中)和抗坏血酸钠(100μl，100mm于di水中)的混合物处理并且在室温下搅拌过夜。额外炔肽s4(20μl，10mm于dmso中)、cuso4(50μl，100mm于di水中)和抗坏血酸钠(100μl，100mm于di水中)添加至反应混合物中，并且进一步在室温下搅拌持续6.5h。粗肽通过制备型rp-hplc纯化以生成分析纯肽3(970μg，43％)。黄色粉末。hrms(esi)c78h100n24o22na2[m+2na]²⁺计算值：885.3614。实验值：885.3626。

fret化合物4的合成

炔肽s4(135μl，10mm于dmso中)和叠氮化物肽于2(79μl，10mm于dmso中)于dmso(600μl)中的混合物用cuso4(39μl，100mm于di水中)和抗坏血酸钠(79μl，100mm于di水中)的混合物处理并且在室温下搅拌持续8h。粗肽通过制备型rp-hplc纯化以生成分析纯肽4(500μg，30％)。黄色粉末。hrms(esi)c94h130n26o30na[m+na]⁺计算值：2126.9367。实验值：2126.9345。

方案7.支化接头化合物5–7的合成。

fmoc-lys(boc)-peg3-n3s7的合成

dmf(3ml)中的fmoc-lys(boc)-oh(217.5mg，0.46mmol)在室温下用n-羟基丁二酰亚胺(nhs，105.9mg，0.92mmol)和n-(3-二甲基氨基丙基)-n′-乙基碳化二亚胺盐酸盐(edc·hcl，176.4mg，0.92mmol)处理。之后，向这一混合物中添加11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺(130.5mg，0.60mmol)并且在室温下搅拌过夜。所述反应用15％柠檬酸淬灭并且用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，并且浓缩。粗化合物s7无需进一步纯化立即加以使用。

fmoc-lys(peg3-n3)-peg3-n3s8的合成

粗化合物s7溶解于dcm(2ml)中并且tfa(2ml)在室温下添加至所述溶液中。1h之后，浓缩所述混合物并且提供boc保护基脱除的化合物。在另一烧瓶中，制备11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷酸(129mg，0.55mmol)、nhs(127.1mg，1.10mmol)和edc·hcl(211.6mg，1.10mmol)于dmf(1ml)中的混合物并且所述混合物添加至dmf(3ml)和dipea(80μl，0.46mmol)中的boc保护基脱除的化合物中。18h之后，所述反应用15％柠檬酸淬灭并且用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，并且浓缩。粗化合物s8无需进一步纯化立即加以使用。

fmoc-peg3-lys(peg3-n3)-peg3-n3s9的合成

粗化合物s8溶解于dmf(1ml)中并且二乙胺(1ml)在室温下添加至所述溶液中。1h之后，浓缩所述混合物并且提供fmoc保护基脱除的化合物。在另一烧瓶中，制备fmoc-11-氨基-3,6,9-三氧杂十一烷酸(217.3mg，0.51mmol，broadpharm)、nhs(116.5mg，1.01mmol)和edc·hcl(194.0mg，1.01mmol)于dmf(2ml)中的混合物并且所述混合物添加至dmf(2ml)中的fmoc保护基脱除的化合物中。15h之后，所述反应用15％柠檬酸淬灭并且用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，并且浓缩。残留物在硅胶(20g)上用dcm/meoh(50:1至10:1)进行色谱分析以提供s9(186.1mg，42％，5个步骤)。淡黄色油状物。hrms(esi)c45h69n10o14[m+h]⁺计算值：973.4989。实验值：973.4981。¹hnmr(300mhz,cd3od)δ7.80(d,j＝7.7hz,2h),7.65(d,j＝7.5hz,2h),7.39(t,j＝7.0hz,2h),7.31(t,j＝7.5hz,2h),4.45–4.31(m,3h),4.21(t,j＝6.7hz,1h),4.01(s,2h),3.95(s,2h),3.72–3.56(m,27h),3.51(t,j＝5.3hz,3h),3.36(td,j＝4.8,3.2hz,6h),3.22(t,j＝7.0hz,2h),1.90–1.62(m,2h),1.60–1.46(m,2h),1.45–1.32(m,3h),1.29(s,2h),0.97–0.82(m,1h)。

胺-peg3-lys(peg3-n3)-peg3-n35的合成

化合物s9(42.0mg，0.043mmol)溶解于dmf(0.4ml)中并且二乙胺(0.4ml)在室温下添加至所述溶液中。1h之后，浓缩所述混合物并且提供fmoc保护基脱除的化合物。残留物在硅胶(5g)上用dcm/meoh(30:1至5:1)进行色谱分析以提供5(15.6mg，49％)。淡黄色油状物。hrms(esi)c30h59n10o12[m+h]⁺计算值：751.4308。实验值：751.4319。¹hnmr(300mhz,cd3od)δ7.96(s,1h),4.43(dd,j＝8.3,5.6hz,1h),4.06(s,2h),3.98(s,2h),3.78–3.60(m,28h),3.55(t,j＝5.4hz,2h),3.42–3.36(m,6h),3.28–3.21(m,2h),3.19–3.12(m,2h),2.84(d,j＝15.3hz,1h),2.69(d,j＝15.4hz,1h),1.89–1.65(m,2h),1.64–1.50(m,2h),1.46–1.34(m,3h),1.29(s,2h),0.95–0.78(m,1h)。

胺-peg3-peg3-lys(peg3-n3)-peg3-n36的合成

化合物s9(17.1mg，0.018mmol)溶解于dmf(0.4ml)中并且二乙胺(0.4ml)在室温下添加至所述溶液中。1h之后，浓缩所述混合物并且提供fmoc保护基脱除的化合物。在另一烧瓶中，制备fmoc-11-氨基-3,6,9-三氧杂十一烷酸(7.6mg，0.018mmol，broadpharm)、nhs(3.0mg，0.026mmol)和edc·hcl(5.1mg，0.026mmol)于dmf(0.4ml)中的混合物并且所述混合物添加至dmf(0.8ml)中的fmoc保护基脱除的化合物中。16h之后，所述反应用15％柠檬酸淬灭并且用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经过na2so4干燥且浓缩。粗化合物无需进一步纯化立即加以使用。

所述粗化合物溶解于dmf(0.4ml)中并且二乙胺(0.4ml)在室温下添加至所述溶液中。1h之后，浓缩所述混合物并且提供fmoc保护基脱除的化合物。残留物在硅胶(3g)上用dcm/meoh(30:1至5:1)进行色谱分析以提供6(10.8mg，65％，3个步骤)。淡黄色油状物。hrms(esi)c38h73n11o16na[m+na]⁺计算值：962.5129。实验值：962.5129。¹hnmr(300mhz,cd3od)δ4.42(dd,j＝8.5,5.6hz,1h),4.08(s,2h),4.05(s,2h),4.00(s,2h),3.79–3.54(m,42h),3.47(t,j＝5.4hz,3h),3.43–3.37(m,5h),3.27(t,j＝7.1hz,2h),3.17(t,j＝5.0hz,2h),1.91–1.68(m,3h),1.64–1.53(m,2h),1.49–1.33(m,3h),1.32(s,2h),0.99–0.83(m,1h)。

叠氮化物-peg3-lys(boc)-peg3-n3s10的合成

粗化合物s7溶解于dmf(2.5ml)中并且在室温下添加二乙胺(2.5ml)。1h之后，浓缩所述混合物并且提供fmoc保护基脱除的化合物。在另一烧瓶中，制备11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷酸(133.0mg，0.57mmol)、nhs(131.7mg，1.14mmol)和edc·hcl(219.3mg，1.14mmol)于dmf(1.5ml)中的混合物并且所述混合物添加至dmf(3.5ml)中的fmoc保护基脱除的化合物中。21h之后，所述反应用15％柠檬酸淬灭并且用乙酸乙酯萃取。残留物在硅胶(20g)上用dcm/meoh(50:1至20:1)进行色谱分析以提供s10(154.7mg，53％，3个步骤)。淡黄色油状物。hrms(esi)c27h52n9o10[m+h]⁺计算值：662.3832。实验值：662.3836。¹hnmr(300mhz,cd3od)δ8.16(t,j＝5.6hz,1h),7.88(d,j＝8.1hz,1h),4.43(td,j＝8.3,5.6hz,1h),4.06(s,2h),3.78–3.61(m,20h),3.57(t,j＝5.4hz,2h),3.40(t,j＝5.1hz,6h),3.10–2.99(m,2h),1.91–1.65(m,2h),1.59–1.48(m,3h),1.45(s,9h),1.43–1.32(m,2h)。

叠氮化物-peg3-lys-peg3-n37的合成

粗化合物s10(6.7mg，0.010mmol)溶解于dcm(0.4ml)中并且tfa(0.4ml)在室温下添加至所述溶液中。1h之后，浓缩所述混合物并且提供boc保护基脱除的化合物。粗化合物通过制备型rp-hplc纯化以生成分析纯化合物7(4.6mg，81％)。无色油状物。hrms(esi)c22h43n9o8na[m+na]⁺计算值：584.3127。实验值：584.3133。¹hnmr(300mhz,cd3od)δ8.15(t,j＝5.5hz,1h),7.94(d,j＝8.2hz,1h),4.47(td,j＝8.3,5.6hz,1h),4.07(s,2h),3.78–3.61(m,20h),3.58(t,j＝5.4hz,2h),3.45–3.36(m,6h),2.94(t,j＝7.6hz,2h),1.97–1.83(m,1h),1.82–1.60(m,3h),1.58–1.36(m,2h),1.31(s,1h),0.98–0.83(m,1h)。

实施例4–生物学评估和数据

针对抗原结合和细胞毒性评估adc。在基于细胞的elisa分析中使用人乳癌细胞系skbr-3(her2阳性)和mda-mb-231(her2阴性)针对与人表皮生长因子受体2(her2)的结合亲和力和特异性评估抗her2adc9和10(图4和图5)。支化adc9显示与skbr-3的高结合亲和力，可与直链adc10和亲本n297a抗her2mab的那些相当(分别地，kd＝0.98、1.12和0.64nm)。相比之下，非靶向adc11不显示her-2特异性结合。所述adc均不结合于mda-mb-231。这些结果证明了adc9内的支化接头–mmaf部分不影响亲本n297a抗her2mab的抗原识别和特异性。如先前所报告(dennler等人,2014)，fc部分中的缀合位点q295远离fab区中的抗原识别位点，从而允许接头-有效载荷组分在这一位置处的基于mtg酶的缀合，而不会对抗原结合造成有害影响。所公开的结果与这一观察结果一致。

为了研究基于支化接头的缀合如何影响细胞杀死效能，在基于细胞的分析中使用具有变化的her2表达水准的三种人细胞系测试adc9–11和亲本n297a抗her2mab：skbr-3(her2++)、mda-mb-453(her2+)和mda-mb-231(her2-)(图6)。支化adc9(dar：3.9)在skbr-3中发挥大于直链adc10(dar：1.9)的效能(ec50：分别为0.36nm和0.83nm)，而非靶向adc11和297a抗her2mab显示边缘细胞毒性。另外，adc9的最大细胞杀死效应(在5.3nm下，85％细胞杀死)高于adc10的最大细胞杀死效应(在13.3nm下，71％细胞杀死)，具有统计学显著差异(student氏t测试，p<0.005)。有趣的是，adc9和10的ec50值的差异为2.3倍，其大于dar的2倍差异。我们观察到在适度her2阳性细胞系mda-mb-453中通过支化接头策略使adc功效更急剧增强；支化adc9的剂量反应曲线与直链adc10的剂量反应曲线相比清楚地朝向较低浓度侧偏移，导致ec50值分别为0.13nm和0.35nm(2.7倍效能差异)。

在mda-mb-453中所观察到的低于高度her2表达skbr-3中的那些ec50值的ec50值可指示，mda-mb-453对于mmaf比skbr-3更敏感。实际上，已经报告her2表达的最高水准未必导致最大her2靶向性adc细胞杀死效应(chooniedass等人,2016)。在mda-mb-453中的支化adc9的剂量反应曲线比直链adc10的剂量反应曲线更陡(希尔斜率：分别为-3.5和-1.0)，反映了基于支化接头的有效载荷递送的有效性。如所预期，测试的所有adc均未显示对于her2阴性mda-mb-231的细胞毒性。总之，这些结果清楚地证明了通过我们的支化接头获得的增加的dar促进adc功效的增强，而不损害亲本抗体的细胞结合和特异性。

实施例5–具有增加的稳定性的接头的讨论

缬氨酸-瓜氨酸(vcit)二肽接头通常用作用于抗体-药物缀合物(adc)的酶可裂解接头。虽然在人血浆中稳定，但vcit接头归因于对于细胞外羧酸酯酶的易感性在小鼠血浆中不稳定。这一不稳定性通常触发药物在循环期间的过早释放并且使得设计基于vcit的adc而不损害体内稳定性成为一项挑战。本文公开可对组织蛋白酶b介导的裂解具反应性但在小鼠中的循环期间未经历过早裂解的谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(evcit)接头。基于evcit的抗her2adc在异种移植小鼠模型中展现比vcit变体大得多的治疗功效。值得注意的是，稳定adc含有促进任何蛋白酶接近evcit部分的长间隔基，指示evcit接头有可能确保异常体内稳定性，无论暴露程度如何。evcit接头的使用在设计adc时可扩展灵活性，并且最小化临床前研究中归因于接头不稳定性的失效率。

除了酸不稳定腙接头和可还原二硫化物接头以外，连接具有对氨基苯甲氧基羰基(pabc)的有效载荷的缬氨酸-瓜氨酸(vcit)二肽接头也是广泛用于多种成功的adc中的标准可裂解接头，所述adc包括fda批准的adcadcetris(tsuchikama等人,2018，katz等人,2011，和gordon等人,2015)。vcit接头在给定的adc的内化时并且在组织蛋白酶b介导的裂解之后裂解以在靶癌细胞内部释放未修饰的有效载荷(图13a，lu等人,2016)。虽然在食蟹猕猴和人血浆中高度稳定，但据报告在小鼠血浆中发现的细胞外羧基酯酶1c(ces1c)可水解vcit接头，导致毒性有效载荷在到达小鼠模型中的肿瘤之前在循环中过早释放(dorywalska等人,2016)。如使用vcit接头建构的数种adc所证明(dorywalska等人,2016，shen等人,2012，和lhospice等人,2015)，这一接头不稳定性可通过小心地选择抗体内的接头附接位点并且限制所述vcit接头的长度以最小化暴露于细胞外酶的易受攻击的部分来改善。然而，也已经确认在暴露的缀合位点处安装vcit接头和延伸接头结构会导致有效载荷在循环期间的快速过早损失(dorywalska等人,2016，lhospice等人,2015，elgersma等人,2015，dorywalska等人2015，和dalcorso等人,2017)。已知药物发展中的几乎所有临床前研究最初均使用小鼠模型执行，这一不稳定性问题使得评估基于vcit的adc的真实治疗潜力和安全性概况成为一项挑战，并且显著地限制缀合位点选择和接头设计中的灵活性。实际上，使用多负载vcit接头建构的adc在小鼠血浆中不稳定并且在小鼠乳房肿瘤模型中显示不良治疗功效。

本文公开具有高极性的基于vcit的三肽序列，如谷氨酸–vcit(evcit)和天冬氨酸–vcit(evcit)在小鼠和人血浆中提供异常高的稳定性，同时能够在组织蛋白酶b介导的裂解时释放游离有效载荷。本文公开使用酸性evcit接头建构的adc，其在具有人乳癌的异种移植小鼠模型中展现比基于vcit的变体可能展现大得多的体内稳定性和抗肿瘤功效。这些结果指示这些接头、特别是evcit接头的使用在设计adc时可扩展灵活性，并且最小化使用小鼠模型的临床前研究中由接头不稳定性引起的失效率。这些改进的接头也可提供用于增强用于靶向癌症疗法的其他分子类别的药物缀合物的稳定性和功效的广泛适用的解决方法。

实施例6–使用具有改进的稳定性的接头的结果

引入高度极性官能团对血浆稳定性和对于组织蛋白酶b介导的裂解的反应性的影响。在缬氨酸残基的n端(p3位置，图13a)引入化学修饰会显著地影响基于vcit接头的adc的血浆稳定性(dorywalska等人,2016)。已证明，在p3位置处具有如羟基的亲水性基团的vcit接头赋予adc在小鼠血浆中的增加的稳定性，而不损害对于细胞内组织蛋白酶b介导的裂解的反应性。基于这些发现，推测在p3位置处安装高度极性官能团可能进一步增强对ces1c介导的降解的抵抗。

为了测试这一假设，评估一组在p3位置处含有多种氨基酸的肽探针在小分子层面上的血浆稳定性(图13b)。vcit-和三肽探针12a–f首先通过标准固相和液相肽合成并且在氨基甲酸酯形成之后合成。这些模型探针由xvcit–pabc单元组成，其中x是不存在(12a)、丝氨酸(12b)、谷氨酸(12c)、天冬氨酸(12d)、赖氨酸(12e)或羟基乙酰基甘氨酸(12f)。假定丝氨酸和羟基乙酰基甘氨酸将充当由dorywalska等人(dorywalska等人,2016)报告的具有增加的小鼠血浆稳定性的羟基官能化三肽adc接头的模拟物。特别是，探针12f内的2-羟基乙酰胺基团是在其报告中提供最大稳定性的修饰剂。这些接头共价连接至1-芘甲胺，所述1-芘甲胺是在341nm下具有不同uv吸光度的疏水性有效载荷的代替物(vangeel等人,2015)。随后，探针12a–f在未稀释balb/c血浆中在37℃下孵育并且通过hplc监测各探针的量(图13c)。如所预期，vcit探针12a展现极端的半衰期(t1/2＝2.3h)。svcit探针12b比vcit探针12a略微更稳定(t1/2＝3.1h)，但稳定性的增加未如基于先前关于羟基官能化稳定adc接头的报告所预期般显著(dorywalska等人,2016)。有趣的是，evcit和dvcit探针12c和12d显示极大延长的半衰期(分别地，t1/2＝19.1h和14.0h)。相比之下，碱性kvcit探针12e显示所有探针中最短的半衰期(t1/2＝0.9h)。这些结果指示在p3位置处具有高极性的酸性或中性侧链可有效地排斥ces1c的接近。考虑到测试的所有探针均在人血浆中稳定并且2天之后未观察到显著降解(图14a)，在kvcit探针12e中观察到的加速降解可指示在p3位置处的碱性侧链提供与ces1c的额外相互作用，导致快速键裂解。2-羟基乙酰胺探针12f比svcit探针12b略微更稳定(t1/2＝5.0h)，但比evcit和dvcit探针12c,d不稳定得多。因此，在p3位置处的中性羰基的稳定化效应未如带负电的羧酸侧链的稳定化效应般显著。

接下来，针对对于人组织蛋白酶b介导的裂解的反应性测试所有探针(图14b)。svcit探针12b显示可与vcit探针12a的裂解速率相当的裂解速率。相比之下，在evcitdvcit和kvcit探针12c–e中观察到比vcit-和svcit探针12a和12b中快的键裂解。这些结果在小分子层面上证明，极性evcit和dvcit接头系统在小鼠血浆中提供增强的稳定性，而不损害组织蛋白酶b介导的有效载荷释放。

使用vcit、svcit和evcit接头建构均质adc。为了研究上文所提到的观察结果是否适用于adc形式，评估使用基于vcit、基于svcit和基于evcit的可裂解接头建构的adc。抗her2单克隆抗体(mab)–支化接头缀合物首先通过转谷氨酰胺酶介导的缀合根据所报告的方案(图15a和15b，anami等人，2017)加以微小修改制备。用于接头缀合的抗her2mab含有重链内的天冬酰胺297至丙氨酸的突变(n297a，shi等人,2014)，其允许省略n297上的n-聚糖链的去除，所述去除是mtg酶介导的抗体-接头缀合所需的步骤(dennler等人,2014)。所述缀合以高产率提供均质mab–支化接头缀合物。平行地，合成基于evcit和基于svcit的模块，所述模块含有聚乙二醇(peg)间隔基、mmaf和作为用于以下应变促进的叠氮化物-炔点击反应的反应手柄的二苯并环辛炔(dbco)。所述dbco–vcit模块获自商业来源。调节各模块中的peg单元的数目，使得所有mmaf模块的长度相似。各“可点击”模块可能定量地与常见mab–支化接头缀合物缀合以生成高度均质adc，其平均dar为3.9(通过逆相hplc测定，图15b和图16)。不可裂解支化adc15(dar：3.9)和使用evcit-mmaf模块建构的同型对照(16，dar：3.9)也以相同方式制备(图17)。尺寸排阻色谱(sec)分析揭露了产生的所有adc均主要以单体形式存在(图15c)。通过在37℃下在pbs(ph7.4)中孵育各adc持续28天来评估长期稳定性。(图18)。通过sec分析未观察到各adc的显著降解和聚集。

为了评估在p3修饰处的化学修饰如何影响adc亲水性，在生理学条件下(在ph7.4下的磷酸盐缓冲液，图15d)执行疏水性相互作用色谱(hic)分析。高度极性evcit-adc14c以早于vcit-adc14a的保留时间经检测，而svcit-adc14b内的羟基在边缘区影响adc疏水性(图15e)。这些结果证明使用羧基官能化evcit接头建构adc可减小在生理学ph下的adc疏水性。这一特征有利于adc、尤其高daradc，因为已知adc疏水性触发聚集和体内的快速清除(lyon等人,2015)。

体外adc的验证。为了研究adc体外特性如何通过p3位置处的化学修饰加以调节，首先针对组织蛋白酶b介导的裂解评估adc14a-c。各adc在人肝组织蛋白酶b存在下在37℃下孵育。vcit-adc14a、svcit-adc14b和evcit-adc14c的半衰期经测定分别为4.6h、5.4h和2.8h(图7)。这一结果说明与mab缀合的evcit接头对于组织蛋白酶b介导的裂解比vcit和svcit接头更敏感，这与芘探针12a-c的反应性一致(图13b)。接下来，针对人和小鼠血浆中的稳定性评估所述adc。在人血浆中在37℃下孵育孵育1个月之后在所有adc中均未观察到显著降解(图20a)。相比之下，evcit-adc14c即使在未稀释balb/c小鼠血浆中孵育14天之后也几乎不显示接头裂解，而vcit-和svcit-adc14a,b在相同时间段之后分别损失>95％和约70％的缀合的mmaf(图20b)。这一趋势也与小分子探针中观察到的情况一致(图13c)。已知接头骨架内的peg间隔基最有可能促进任何酶接近接头-有效载荷部分，这些结果指示酸性evcit接头不仅提供对于组织蛋白酶b介导的裂解的反应性，而且提供血浆中的高稳定性，无论有效载荷暴露程度如何。

随后，使用人乳癌细胞系kpl-4(her2阳性)和mda-mb-231(her2阴性)针对抗原结合亲和力和特异性测试抗her2adc(图21)。adc14a-c显示对于kpl-4(kd：0.12–0.16nm)而非对于mda-mb-231的高结合亲和力，其可与亲本抗her2mab相当。非靶向对照16显示未结合于任一细胞系。这些结果指示在p3位置处安装谷氨酸或丝氨酸不影响抗原识别和特异性。这些adc也使用her2阳性-(kpl-4、jimt-1、bt-474和skbr-3)和阴性(mda-mb-231)乳癌细胞系针对体外细胞毒性加以评估(图20c-20f和图22)。组织蛋白酶b可裂解的adc14a-c在分析条件下在her2阳性细胞系中展现亚纳摩尔浓度水准的细胞杀死效能，但在her2阴性mda-mb-231中不展现细胞毒性。在所述三种可裂解adc中未观察到细胞杀死效能的显著差异(在kpl-4中的ec50值的范围：0.10–0.12nm；在jimt-1中：0.078–0.10nm；在bt-474中：0.058–0.063nm；和在skbr-3中：0.27–0.34nm，图22)，指示evcitadc14c中略微加速的组织蛋白酶b介导的裂解(图19)不会急剧地影响细胞杀死效能。然而，在接头骨架内缺乏组织蛋白酶b可裂解序列的不可裂解adc15显示比可裂解adc14a高1.8–4.2倍的ec50值(图20c和图20d以及图22)。这些结果表明可裂解机制的存在是最大化使用所述支化接头建构的adc的细胞杀死效能的关键。

体内adc的验证。使用小鼠模型针对体内特性评估所述adc。使用balb/c小鼠评估vcit-、svcit-和evcit-adc14a-c的pk概况。小鼠静脉内注射各adc或亲本n297a抗her2mab(3mg/kg)并且经由尾静脉周期性地收集血液。通过夹心elisa测定血液中的总mab(缀合和未缀合两者)和完整adc(仅缀合)的浓度(图23a和图23b以及图24)。所有adc均显示与所述亲本mab的清除率(t1/2β＝14.9天)相似的清除率，指示在p3位置处安装谷氨酸或丝氨酸不会不利地影响清除概况(图23a)。如所预期，evcit-adc14c几乎不显示由循环期间的过早裂解引起的有效载荷损失(t1/2β＝12.0天，图23b和图24d)。相比之下，vcit-和svcit-adc14a,b快速地损失mmaf(分别地，t1/2β＝2.0天和2.4天)，证明安装于mab–支化接头系统上的vcit和svcit序列在循环中不稳定。

受这一发现激励，在jimt-1和kpl-4异种移植小鼠模型中针对体内治疗功效测试vcit-和evcit-adc14a,c(图23c-23f和图25)因为据报告无胸腺裸小鼠可能快速地清除外源引入的igg(reddy等人,1998)，所以通过静脉内施用人igg(30mg/kg)来预处理携带肿瘤的小鼠以防止待施用的adc的快速清除(stefan等人,2017和nanna等人,2017)。携带肿瘤的小鼠静脉内注射单一剂量的各adc(1或3mg/kg)或媒介物对照并且每3天监测肿瘤体积。3mg/kg的单一剂量的基于evcit的adc14c是完全可治愈的，并且在两种模型研究中在视觉上未观察到肿瘤再生长持续约4个月(在第30天与第148天之间)(图23c-23f)。此外，adc14c在jimt-1模型中即使在较低剂量水准(1mg/kg)下也高度有效并且所有五只小鼠均在研究过程中存活(图23c和图23e)。相比之下，vcit-adc14a仅展现肿瘤生长的部分抑制，即使具有高体外细胞杀死效能，并且几乎所有小鼠均在研究结束之前死亡或达到人道终点(五只小鼠中的四只在jimt-1模型中死亡；所有五只小鼠均在kpl-4模型中死亡)(图23c-23f)。考虑到adc14c的分子结构，这些结果证明evcit可裂解接头系统可在小鼠模型中充分地引出adc的治疗潜力，即使其通过长间隔基与mab空间隔绝。

总之，本文公开具有高度极性的含vcit中性或酸性三肽、特别是酸性evcit三肽序列在小鼠和人血浆中显示增强的稳定性，同时保持易经受细胞内组织蛋白酶b介导的蛋白水解裂解。值得注意的是，基于小分子的稳定性分析清楚地证明了在p3位置处的羧酸侧链提供比2-羟基乙酰胺基团大得多的稳定化效应，所述2-羟基乙酰胺基团是据报告赋予vcit序列在小鼠血浆中的最高稳定性的修饰剂(dorywalska等人,2016)。这些特征使得这一序列成为理想的可裂解adc接头设计，其增加在生理学条件下的亲水性，最大化治疗潜力并且最小化小鼠模型中由有效载荷的过早损失引起的全身性毒性的风险。实际上，使用evcit–pabc接头连同支化接头技术(anami等人,2017)建构的均质抗her2adc展现比配备有传统vcit或svcit的adc的那些高的亲水性和大得多的长期体内稳定性，所述传统vcit或svcit是据报告在小鼠血浆中展现增加的稳定性的羟基官能化三肽adc接头的类似物(dorywalska等人,2016)。另外，稳定evcit-adc在her2阳性乳癌的两种异种移植小鼠模型中引起完全缓解，而不稳定vcit-adc显示不良治疗效应。考虑到两种adc在接头骨架内含有长peg间隔基以充分暴露可裂解肽部分，evcit接头系统有可能在小鼠模型中提供极大降解抵抗，无论暴露程度如何。尽管evcit序列在呈其本发明形式时看来是有希望的，关于evcit序列与小鼠ces1c之间的相互作用的未来结构-活性关系研究可提供对所观察到的体内稳定性的深入见解，从而引起进一步改善的adc接头设计。

evcit或相似肽接头(例如，dvcit、eva、dva)的使用可用作挽救多种类型的adc的简单但强大的解决方法，所述adc先前已经归因于小鼠模型中的接头不稳定性而被放弃。evcit接头的高极性也可能在某种程度上帮助减轻通常面对聚集和快速清除问题的高daradc的疏水性(sun等人,2017)。另外，evcit接头在多种adc的未来设计中可比不可裂解接头优先经选择。不可裂解接头是经设计以抵抗循环期间的蛋白水解降解并且已经成功地用于与mmaf(doronina等人,2006)、单甲基澳瑞他汀d(mmad，strop等人,2015)和美坦新(dm1，lorusso等人,2011和verma等人,2012)一起建构有效adc。然而，不可裂解接头的使用据报告减弱或抵消数种有效载荷类别的adc效能，所述类别包括多柔比星(doronina等人,2006)、单甲基澳瑞他汀e(mmae)(doronina等人,2006和caculitan等人,2017)、mmaf的亲水性衍生物(mendelsohn等人,2017)和吡咯并苯并二氮杂二聚体(pbd，caculitan等人,2017)。这是因为不可裂解接头缺乏确定的裂解机制并且在细胞内蛋白质降解之后的最终活性代谢物仍保持接头组分。尽管已经证明这一缺陷可在一些情况下通过微调所述接头和有效载荷的化学结构来避免(gregson等人,2017和christie等人,2017)，所述努力未必可引起成功，视接头安装位点选择、缀合形式和有效载荷而定。是祭祀，如我们的先前报告(anami等人,2017)和这一报告所证明，支化接头技术需要接头骨架内的适当间隔基(例如，peg3)和可裂解机制以实现最大adc效能；这些组分对于缓解结构拥挤和确保从各接头臂以活性形式进行快速有效载荷释放至关重要。

总之，设想本文所公开的接头技术将通过允许灵活分子设计和最小化临床前阶段中归因于接头不稳定性或不良效能的犯错风险来增强用于开发新一代adc和其他药物缀合物的努力。尽管进一步验证是有必要的，设想这一接头技术可有益于迄今所开发的多种缀合方法和接头系统，包括但不限于赖氨酸或半胱氨酸残基处的常规偶合、溶剂可接近部分处的位点特异性缀合(例如，在抗体重链的c端处的缀合)(rabuka等人2012，beerli等人,2015，和drake等人,2014)和用于异质有效载荷装载的新颖支化adc接头(maruani等人,2015和levengood等人,2017)。此外，考虑到evcit和dvcit探针12c,d的长半衰期，这些接头也可适用于建构用于靶向疗法的基于小分子的药物缀合物(srinivasarao等人,2015和cazzamalli等人,2017)。

实施例7–具有改进的稳定性的接头的合成

方案8.芘探针12a–f的合成。试剂和条件：(a)fmoc-瓜氨酸-paboh，吡啶，55℃，过夜；(b)双(4-硝基苯基)碳酸酯、dipea(关于s12a–c和s12e)或dmap(关于s12d和s12f)，dmf，室温，过夜；(c)肌氨酸-芘s13，dipea，dmap，dmf，37℃，2h；(d)tfa，dcm，tips，室温，关于12b–f为1h；(e)hatu，dipea，dmf，室温，2h，接着50％二乙胺/dmf，室温，1h。

化合物和缀合物的合成。

fmoc-cit-pab-o-树脂的制备。

氯三苯甲基氯树脂(1g，1.6mmol)与fmoc-瓜氨酸-paboh(美国专利号9,487,556，2.4g，4.8mmol)于吡啶(783μl，9.6mmol)、四氢呋喃(thf，30ml)和二甲基甲酰胺(dmf，3ml)中的溶液混合并且在55℃下搅拌过夜。在所述溶液冷却之后，添加甲醇(meoh)并且在室温下搅拌持续30min。排干所述溶液并且所述树脂用dmf(5×5ml)和二氯甲烷(dcm，5×5ml)洗涤。装载速率通过小规模树脂裂解使用1％三氟乙酸(tfa)/dcm测定为10％(0.16mmol/g树脂)。

用于乙酰基封端的化合物(s11a–f)的fmoc固相肽合成(fmocspps)。

为了在每次偶合之后去除fmoc-保护基，树脂(100–150mg)用哌啶(5ml，20％于dmf中)处理持续20min并且用dmf(5×5ml)和dcm(5×5ml)洗涤。经fmoc保护的氨基酸(4当量)通过与dmf中的1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(hatu，4当量)和n,n-二异丙基乙胺(dipea，6当量)混合持续2-5min经预活化，并且所述混合液用于偶合(条件：室温，1h)。通过kaiser测试来验证偶合的完成。在每个偶合步骤之后，排干偶合混合液并且所述树脂用dmf(5×5ml)和dcm(5×5ml)洗涤。在肽延伸完成之后，所述树脂用dmf中的乙酸酐(4当量)和dipea(6当量)处理持续1h并且接着用dmf(5×5ml)和dcm(5×5ml)洗涤。含有经保护肽的乙酰基封端的树脂在室温下用1％tfa/dcm处理持续1h。所述溶液在真空中浓缩并且粗肽用冷乙醚(5–6ml)沉淀，随后在1,000g下离心持续5min(3次)。肽集结粒在真空中干燥并且立即用于下一步骤而无需纯化。

ac-val-cit-pabc-pnp(s12a)。

向粗物质s11a(3.6mg，大约0.008mmol)于dmf(0.3ml)中的溶液中添加双(2,4-二硝基苯基)碳酸酯(12.8mg，0.042mmol)和dipea(4.4μl，0.025mmol)。在室温下混合过夜之后，粗产物在酸性条件下通过制备型rp-hplc纯化以提供肽s12a(2.9mg，总产率：62％，基于树脂装载速率)。纯度在酸性条件下通过lc-ms确认。灰白色粉末。hrms(esi)c27h34n6o9na[m+na]⁺计算值：609.2279。实验值：609.2286。肽s12b–f以类似方式由s11b–f合成。

ac-ser(t-bu)-val-cit-pabc-pnp(s12b)。

3.9mg，总产率：66％(基于装载速率)。灰白色粉末。hrms(esi)c34h47n7o11na[m+na]⁺计算值：752.3226。实验值：752.3240。

ac-glu(t-bu)-val-cit-pabc-pnp(s12c)。

4.8mg，总产率：78％(基于装载速率)。灰白色粉末。hrms(esi)c36h49n7o12na[m+na]⁺计算值：794.3331。实验值：794.3351。

ac-asp(t-bu)-val-cit-pabc-pnp(s12d)。

dmap(2当量)替代dipea使用。6.1mg，总产率：45％(基于装载速率)。灰白色粉末。hrms(esi)c35h48n7o12[m+h]⁺计算值：758.3355。实验值：758.3355。

ac-lys(boc)-val-cit-pabc-pnp(s12e)。

11.1mg，总产率：67％(基于装载速率)。灰白色粉末。hrms(esi)c38h55n8o12[m+h]⁺计算值：815.3934。实验值：815.3931。

t-bu-och2co-gly-val-cit-pabc-pnp(s12f)。

dmap(2当量)替代dipea使用。9.5mg，总产率：61％(基于装载速率)。灰白色粉末。hrms(esi)c33h45n7o11na[m+na]⁺计算值：738.3069。实验值：738.3068。

肌氨酸-芘(s13)

向fmoc-肌氨酸-oh(14.0mg，0.045mmol)于dmf(0.5ml)中的溶液中添加hatu(25.7mg，0.0675mmol)、dipea(12μl，0.0675mmol)和1-芘甲胺(13.3mg，0.0495mmol)。在室温下混合持续2h之后，所述溶液在真空中浓缩并且粗产物溶解于dmf(0.6ml)和二乙胺(0.6ml)中。1h之后，粗混合物经浓缩并且在酸性条件下通过制备型rp-hplc纯化以提供肌氨酸-芘s13(6.7mg，49％，2个步骤)。白色粉末。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.82(t,j＝5.8hz,1h),8.40(d,j＝9.3hz,1h),8.35–8.23(m,4h),8.17(s,2h),8.14–8.02(m,2h),5.08(d,j＝5.6hz,2h),3.49(s,2h),2.88(s,1h),2.43(s,3h)；¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ167.9,132.4,130.8,130.3,130.2,128.1,127.6,127.4,127.1,126.8,126.3,125.3,125.2,124.7,124.0,123.9,123.1,51.6,39.4,34.3；hrms(esi)c20h19n2o[m+h]⁺计算值：303.1492。实验值：303.1492。

ac-val-cit-pabc-sar-芘(12a)。

在微管中混合含ac-val-cit-pabc-pnps12a(6.3mg，10.7μmol)的dmf(1ml)、128.4μl含100mm肌氨酸-芘s13的dmf(12.8μmol)、dipea(2.8μl，16.1μmol)和dmap(10μl，10w/v％于dmf中)。在室温下搅拌持续2h之后，粗产物在酸性条件下通过制备型rp-hplc纯化以提供分析纯产物12a(2.7mg，34％)。白色粉末。hrms(esi)c41h47n7o7na[m+na]⁺计算值：772.3429。实验值：772.3440。

ac-ser-val-cit-pabc-sar-芘(12b)。

在微管中混合含ac-ser(t-bu)-val-cit-pabc-pnps12b(6.6mg，9.1μmol)的dmf(1ml)、108.7μl含100mm肌氨酸-芘s13的dmf(10.9μmol)、dipea(2.4μl，13.7μmol)和dmap(10μl，10w/v％于dmf中)。在室温下搅拌持续2h之后，所述混合物在真空中干燥并且在室温下用tfa、dcm和三异丙基硅烷的溶液(45:50:5，2ml)处理持续3h。在所述溶液经浓缩之后，粗产物在酸性条件下通过制备型rp-hplc纯化以提供分析纯产物12b(2.3mg，30％，2个步骤)。白色粉末。hrms(esi)c44h52n8o9na[m+na]⁺计算值：859.3749。实验值：859.3753。探针12c–f以类似方式由s12c-–f合成。

ac-glu-val-cit-pabc-sar-芘(12c)。

2.6mg，31％，2个步骤。白色粉末。hrms(esi)c46h54n8o10na[m+na]⁺计算值：901.3855。实验值：901.3870。

ac-asp-val-cit-pabc-sar-芘(12d)。

3.1mg，47％，2个步骤。白色粉末。hrms(esi)c45h53n8o10[m+h]⁺计算值：865.3879。实验值：865.3877。

ac-lys-val-cit-pabc-sar-芘(12e)。

3.5mg，47％，2个步骤。白色粉末。hrms(esi)c47h60n9o8[m+h]⁺计算值：878.4559。实验值：878.4553。

hoch2co-gly-val-cit-pabc-sar-芘(12f)。

2.7mg，47％，2个步骤。白色粉末。hrms(esi)c43h50n8o9na[m+na]⁺计算值：845.3593。实验值：845.3589。

方案9.支化接头13的合成。试剂和条件：(a)3-叠氮基丙胺，edc·hcl，nhs，dmf，室温，过夜；(b)50％tfa/dcm，室温，1h，接着3-叠氮基丙酸，edc·hcl，nhs，dipea，dmf，室温，过夜；(c)50％二乙胺/dmf，室温，1h。

boc-lys(fmoc)-n3(s14)。

dmf(2ml)中的boc-lys(fmoc)-oh(120.4mg，0.257mmol)在室温下与n-羟基丁二酰亚胺(nhs，59.2mg，0.514mmol)和n-(3-二甲基氨基丙基)-n′-乙基碳化二亚胺盐酸盐(edc·hcl，98.5mg，0.514mmol)混合。向所述溶液中添加3-叠氮基丙胺(32.8μl，0.334mmol)并且所生成的混合物在室温下搅拌过夜。所述反应用15％柠檬酸淬灭并且用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，并且浓缩。残留物通过柱色谱使用biotageisolera快速纯化系统(0–20％dcm/meoh，20ml/min，snap筒kp-sil10g)纯化以提供s14(178.6mg，97％)。白色粉末。¹hnmr(300mhz,cd3od)δ7.81(d,j＝7.4hz,2h),7.66(d,j＝7.4hz,2h),7.41(t,j＝7.3hz,2h),7.32(t,j＝7.4hz,2h),4.37(d,j＝6.8hz,2h),4.21(t,j＝6.9hz,1h),4.00–3.86(m,1h),3.40–3.34(m,2h),3.27(td,j＝6.6,2.7hz,2h),3.12(t,j＝6.7hz,2h),1.82–1.68(m,3h),1.66–1.48(m,3h),1.44(s,9h),1.40–1.15(m,2h)；¹³cnmr(75mhz,cd3od)δ175.4,159.0,145.4(2个碳),145.3,142.6(2个碳),128.8(2个碳),128.1(2个碳),126.1(2个碳),120.9(2个碳),80.6,67.6,56.3,50.0,48.5,41.3,37.7,32.9,30.5,29.7,28.7(3个碳),24.1；hrms(esi)c29h38n6o5na[m+na]⁺计算值：573.2796。实验值：573.2802。

n3-lys(fmoc)-n3(s15)。

化合物s14(79mg，0.144mmol)溶解于dcm(500μl)中并且接着tfa(500μl)在室温下添加至所述溶液中。1h之后，所述混合物经浓缩并且用于以下反应而无需纯化。向残留物中添加dmf(1ml)中的叠氮基丙酸(21.5mg，0.187mmol，advancedchemblocks)、nhs(33.1mg，0.288mmol)和edc·hcl(55.2mg，0.288mmol)。dipea(50μl，0.288mmol)随后添加至所述混合物中。在室温下搅拌过夜之后，所述反应混合物用15％柠檬酸淬灭并且用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，并且浓缩。残留物通过柱色谱使用biotageisolera快速纯化系统(0–20％dcm/meoh，20ml/min，snap筒kp-sil10g)纯化以提供s15(54.9mg，70％)。白色粉末。¹hnmr(300mhz,cd3od)δ8.18(d,j＝7.3hz,1h),8.03(t,j＝5.8hz,1h),7.80(d,j＝7.5hz,2h),7.64(d,j＝7.4hz,2h),7.39(t,j＝7.1hz,2h),7.31(t,j＝7.4hz,2h),4.35(d,j＝6.8hz,2h),4.32–4.14(m,2h),3.55(t,j＝6.6hz,2h),3.37–3.32(m,2h),3.25(q,j＝6.2hz,2h),3.11(t,j＝6.7hz,2h),2.49(t,j＝6.4hz,2h),1.82–1.69(m,3h),1.67–1.43(m,3h),1.43–1.27(m,2h)；¹³cnmr(75mhz,cd3od)δ174.4,173.0,159.0,145.4(2个碳),142.6(2个碳),128.8(2个碳),128.1(2个碳),126.1(2个碳),120.9(2个碳),67.6,55.0,50.0,48.54,48.51,41.4,37.7,36.0,32.7,30.5,29.6,24.1；hrms(esi)c27h33n9o4na[m+na]⁺计算值：570.2548。实验值：570.2555。

支化接头(13)。

化合物s15(29.2mg，0.053mmol)溶解于dmf(0.3ml)中并且二乙胺(0.3ml)在室温下添加至所述溶液中。1h之后，所述混合物经浓缩并且在酸性条件下通过制备型rp-hplc纯化(uv：195nm)以提供支化接头13(3.9mg，22％)。无色油状物。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.17(d,j＝8.0hz,1h),8.01(t,j＝5.7hz,1h),7.73(s,2h),4.20(td,j＝8.4,5.3hz,1h),3.54–3.49(m,2h),3.34(t,j＝6.8hz,2h),3.12(q,j＝6.5hz,2h),2.84–2.66(m,2h),2.45(t,j＝6.4hz,2h),1.73–1.57(m,3h),1.57–1.43(m,3h),1.41–1.16(m,2h)；¹³cnmr(75mhz,d2o)δ173.9,173.8,48.9,48.6,47.1,39.2,36.6,34.7,30.4,27.6,26.3,22.1；hrms(esi)c12h23n9o2na[m+na]⁺计算值：348.1867。实验值：348.1868。

方案10.dbco-mmaf片段s19a和s19b的合成。试剂和条件：(a)双(4-硝基苯基)碳酸酯，dmap，dmf，室温，2h；(b)mmaf，dipea，hoat，dmf，37℃，过夜；(c)20％tfa/dcm，0℃，4h。

用于dbco封端的化合物(s16a)和(s16b)的fmoc固相肽合成(fmocspps)。

在肽延伸和聚乙二醇化之后，所述树脂用dmf中的dbco酸(2当量，broadpharm)、hatu(2当量)和dipea(3当量)处理持续1h并且接着用dmf(5×5ml)和dcm(5×5ml)洗涤。所述树脂在室温下用1％tfa/dcm处理持续1h。所述溶液在真空中浓缩并且粗肽用冷乙醚(5–6ml)沉淀，随后在1,000xg下离心持续5min(3次)。粗产物在碱性条件下通过制备型rp-hplc纯化。纯度在碱性条件下通过lc-ms确认。

s16a：6.4mg，总产率：27％(基于树脂装载速率)。白色粉末。hrms(esi)c52h70n8o12na[m+na]⁺计算值：1021.5005。实验值：1021.4996。

s16b：7.3mg，总产率：29％(基于树脂装载速率)。白色粉末。hrms(esi)c54h72n8o13na[m+na]⁺计算值：1063.5111。实验值：1063.5131。

dbco-peg3-ser(tbu)-val-cit-pabc-pnp(s17a)。

向s16a(6.2mg，0.0062mmol)于dmf(500μl)中的溶液中添加双(2,4-二硝基苯基)碳酸酯(9.4mg，0.031mmol)和dmap(1.5mg，0.0124mmol)。所得混合物在室温下在ar下搅拌持续2.5h。所述反应用acn中的1％甲酸和数滴meoh淬灭。粗产物通过制备型rp-hplc纯化以提供s17a(2.8mg，38％)。白色粉末。hrms(esi)c59h73n9o16na[m+na]⁺计算值：1186.5067。实验值：1186.5075。肽s17b以类似方式由s16b制备。

dbco-peg3-glu(tbu)-val-cit-pabc-pnp(s17b)。

880μg，84％。白色粉末。hrms(esi)c61h76n9o17[m+h]⁺计算值：1206.5354。实验值：1206.5388。

dbco-peg3-ser(tbu)-val-cit-pabc-mmaf(s18a)。

s17a(2.8mg，0.00238mmol)于dmf(238μl)中的溶液与单甲基澳瑞他汀ftfa盐(3.0mg，0.00357mmol，levenabiopharma)、4.76μl含1mhoat的dmf(0.00476mmol)和dipea(2μl，0.012mmol)混合。所得混合物在37℃下搅拌过夜。粗产物直接地在碱性条件下通过制备型rp-hplc纯化以提供肽s18a(1.1mg，26％)。纯度在碱性条件下通过lc-ms确认。白色粉末。hrms(esi)c92h133n13o21na[m+na]⁺计算值：1778.9631。实验值：1778.9637。肽s18b以类似方式由s17b制备。

dbco-peg3-glu(tbu)-val-cit-pabc-mmaf(s18b)。

1.4mg，33％。纯度在碱性条件下通过lc-ms确认。白色粉末。hrms(esi)c94h135n13o22na[m+na]⁺计算值：1820.9737。实验值：1820.9706。

dbco-peg3-ser-val-cit-pabc-mmaf(s19a)。

tfa(60μl)在0℃下添加至化合物s18a(1.1mg，0.6μmol)的dcm溶液(240μl)中。在0℃下搅拌持续4h之后，所述反应混合物用饱和nh4oh(300μl)淬灭。所得混合物直接地在碱性条件下通过制备型rp-hplc纯化以提供肽s19a(550μg，53％)。纯度在碱性条件下通过lc-ms确认。白色粉末。hrms(esi)c88h125n13o21na[m+na]⁺计算值：1722.9005。实验值：1722.9007。肽s19b以类似方式由s18b制备。

dbco-peg3-glu-val-cit-pabc-mmaf(s19b)。

650μg，47％。纯度在碱性条件下通过lc-ms确认。白色粉末。hrms(esi)c90h127n13o22na[m+na]⁺计算值：1764.9111。实验值：1764.9072。

实施例8–分析方案、生物学数据和分析

使用芘探针的组织蛋白酶b介导的裂解分析。各测试化合物(10mm于dmso中，2μl)与97μlmes缓冲液(25mmmes-na，1mmdtt，ph5.0)和1μl1-芘甲胺(10mm于dmso中，作为内标)混合。所述混合物在37℃下孵育持续10min。mes缓冲液中的人肝组织蛋白酶b(20ng/μl,100μl，emdmillipore)添加至所述混合物中，随后在37℃下孵育。在各时间点(0、0.5、1、3、24和48h)收集等分试样(10μl)。添加含有1％甲酸的冷乙腈(40μl)以使蛋白质沉淀。沉淀的蛋白质通过离心(15,000g，4℃，30min)来分离并且各样品的上清液通过分析型hplc(342nm下的uv吸光度)加以分析以用于定量。各探针的量针对所述内标的峰面积标准化。所有分析均以技术双重复执行至少三次，并且所显示的数据代表重复样品。

使用芘探针的血浆稳定性测试。各测试化合物(10mm于dmso中，2μl)与1μl1-芘甲胺(10mm于dmso中，作为内标)混合并且在37℃下孵育持续10min。汇集的健康人血浆或balb/c小鼠血浆(197μl，innovativeresearch)添加至所述混合物中，随后在37℃下孵育。在各时间点(0、1、6、24、48和96h)收集等分试样(10μl)并且添加40μl含有1％甲酸的冷乙腈以使蛋白质沉淀。获得各样品的上清液并且如上文所述通过分析型hplc加以分析以用于定量。所有分析均以技术双重复执行至少三次，并且所显示的数据代表重复样品。

细胞培养。jimt-1(addexbio)、bt-474(atcc)和skbr-3(atcc)在补充有10％(atlasbiologicals)、1％(corning)、1％丙酮酸钠(corning)和1％青霉素-链霉素(gibco)的rpmi1640(corning)中培养。kpl-4(由kawasakimedicalschool的dr.junichikurebayashi提供，kurebayshi等人,1999)和mda-mb-231(atcc)在补充有10％1％和1％青霉素-链霉素的dmem(corning)中培养。所有细胞均在37℃下在5％co2下培养并且传代，接着变得充分汇合直至10个传代。

单克隆人抗体的表达和纯化。所有抗体均在根据先前报告的程序(anami等人,2017和shi等人,2014)使用之前产生并且进行验证。

mtg酶介导的抗体-接头缀合。具有n297a突变的抗her2igg(291μlpbs中，11.79mg/ml，3.43mg抗体)在室温下与支化接头13(18.3μl，水中的100mm储备液，80当量)和8％activa(77μl，pbs中的40％溶液，ajinomoto，购自modernistpantry)一起孵育持续16–20h。所述反应通过配备有mabpacrp柱(3×50mm，4μm，thermoscientific)的lc-ms进行监测。洗脱条件如下：流动相a＝水(0.1％甲酸)；流动相b＝乙腈(0.1％甲酸)；经6.8min，梯度a:b＝75:25至1:99；流动速率＝0.4ml/min。缀合的抗体通过使用pbs(流动速率＝0.6ml/min)的尺寸排阻色谱(sec，superdex200increase10/300gl，gehealthcare)纯化以提供抗体-接头缀合物(3.15mg，92％产率，通过二辛可宁酸分析加以测定)。

用于有效载荷安装的应变促进的叠氮化物-炔环加成。根据先前所报告的程序(anami等人,2017)执行应变促进的叠氮化物-炔环加成。经纯化的adc在含有0.1％tween80和海藻糖(70mg/ml，dennler等人,2014)的柠檬酸盐缓冲液(20mm柠檬酸钠和1mm柠檬酸，ph6.6)中进行配制并且存储于4℃下。

疏水性相互作用色谱(hic)分析。各adc(1mg/ml，10μlpbs中)使用配备有mabpachic-butyl柱(4.6×100mm，5μm，thermoscientific)的agilent1100hplc系统进行分析。洗脱条件如下：流动相a＝补充有硫酸铵(1.5m)和5％异丙醇(ph7.4)的50mm磷酸钠；流动相b＝补充有20％异丙醇(ph7.4)的50mm磷酸钠；经30min，梯度a:b＝99:1至1:99；流动速率＝0.5ml/min。

长期稳定性测试。pbs中的各adc(1mg/ml，100μl)在37℃下孵育。在各时间点(7、14和28天)采集等分试样(10μl)并且立即存储于-80℃下直至使用。样品使用配备有mabpacsec-1分析柱(4.0×300mm，5μm，thermoscientific)的agilent1100hplc系统进行分析。条件如下：流动速率＝0.2ml/min；溶剂＝pbs。

使用adc的血浆稳定性测试。小鼠血浆中的稳定性：各adc(100μg/ml，1.2μlpbs中)添加至小鼠血浆(118.8μl)中至1μg/ml的最终浓度。在37℃下孵育持续变化的时间之后，采集样品(各15μl)并且存储于-80℃下直至使用。样品通过夹心elisa分析进行分析。用兔抗mmaf抗体(100ng/孔，levenabiopharma)涂布高结合96孔板(corning)。过夜涂布之后，所述板用100μl含有0.05％tween20的pbs(pbs-t)中的2％bsa阻断，同时在室温下搅拌持续1h。随后，去除所述溶液并且各adc样品(100μl含有1％bsa的pbs-t中)添加至所述板的各孔中，并且所述板在室温下孵育持续2h。各孔用100μlpbs-t洗涤三次之后，100μl山羊抗人iggfab-hrp缀合物(1:10,000，jacksonimmunoresearch)添加至各孔中。在室温下孵育持续1h之后，所述板用100μlpbs-t洗涤三次并且添加100μl含tmb底物(0.1mg/ml)的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液/30％h2o2(1:0.0003v/v，ph5)。在显色持续10-30min之后，25μl3n-hcl添加至各孔中并且接着使用板式读取器(biotekcytation5)记录450nm下的吸光度。浓度是基于标准曲线计算。[2]人血浆中的稳定性：使用用于板涂布的人her2(100ng/孔，acrobiosystems)、分别作为二级三级检测抗体的兔抗mmaf抗体(1:5,000)和山羊抗兔igg-hrp缀合物(1:10,000)，以相同方式执行分析。所有分析均一式三份执行。

用于adc的人肝组织蛋白酶b裂解分析。30μlmes缓冲液(10mmmes-na，40μmdtt，ph5.0)中的各adc(1mg/ml)在37℃下孵育持续10min。mes缓冲液(20ng/μl，30μl，emdmillipore)中的人肝组织蛋白酶b添加至所述溶液中并且所述混合物在37℃下孵育。在各时间点(4、12和24h)收集等分试样(20μl)并且使用配备有mabpacrp柱(3×50mm，4μm，thermoscientific)的agilentg1946clc/esi-ms进行分析。分析条件如下：流动相：75:25水(0.1％甲酸):乙腈(0.1％甲酸)；经6.8min，梯度(至1:99水(0.1％甲酸):乙腈(0.1％甲酸)；流动速率＝0.4ml/min。平均dar值是基于uv峰面积计算。

基于细胞的elisa。细胞(kpl-4和mda-mb-231)接种于培养物处理的96-孔透明板中(10,000个细胞/孔，100μl培养基中)并且在37℃下在5％co2下孵育持续24h。聚甲醛(8％，100μl)添加至各孔中并且在室温下孵育持续15min。吸出培养基并且所述细胞用100μlpbs洗涤三次。细胞在室温下在搅拌下用100μl阻断缓冲液(0.2％bsa于pbs中)处理持续2h。弃去所述阻断缓冲液之后，添加连续稀释的样品(100μl含有0.1％bsa的pbs中)并且所述板在4℃下在搅拌下孵育过夜。弃去所述缓冲液并且所述细胞用100μl含有0.25％tween20的pbs洗涤三次。细胞接着用100μl驴抗人igg–hrp缀合物(jacksonimmunoresearch)(1:10,000稀释于含有0.1％bsa的pbs中)孵育，添加并且所述板在室温下孵育持续1h。所述板用含有0.25％tween20的pbs洗涤三次，并且添加100μl含tmb底物(0.1mg/ml)的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液/30％h2o2(1:0.0003v/v，ph5)。在显色持续10-30min之后，25μl3n-hcl添加至各孔中并且接着使用板式读取器(biotekcytation5)记录450nm下的吸光度。浓度是基于标准曲线计算。kd值接着使用graphpadprism7软件计算。所有分析均一式三份执行。

细胞活力分析。细胞接种于培养物处理的96-孔透明板中(5,000个细胞/孔，50μl培养基中)并且在37℃下在5％co2下孵育持续24h。连续稀释的样品(50μl)添加至各孔中并且所述板在37℃下孵育持续72h(kpl-4和skbr-3)或96h(jimt-1、mda-mb-231和bt-474)。在旧培养基用100μl新鲜培养基置换之后，20μlwst-8(1.5mg/ml，caymanchemical)和1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(1-甲氧基pms，100μm，caymanchemical)的混合物添加至各孔中，并且所述板在37℃下孵育持续2h。轻柔地搅拌所述板之后，使用板式读取器记录460nm下的吸光度。ec50值使用graphpadprism7软件计算。所有分析均一式四份执行。

动物实验。所有程序均由德州大学健康科学中心的动物福利委员会批准并且根据动物护理和使用的机构指导方针来执行。

体内药物动力学研究。雌性balb/c小鼠(6-8周龄，n＝3/组，jacksonlaboratory)经由眶后窦静脉注射3mg/kg剂量的各mab或adc样品(100μl)。注射之后，在各时间点(15min、6h、1天、2天、4天、9天和14天)通过尾静脉抽血(5-10μl)并且用5mmedta/pbs处理。血浆样品存储于-80℃下直至使用。所有小鼠均在最后一次血液收集之后进行人道安乐死。血浆样品通过夹心elisa进行分析。关于总抗体浓度(缀合和未缀合两者)的测定，山羊抗人iggfc抗体(500ng/孔)和山羊抗人iggfab-hrp缀合物(1:5,000，均来自jacksonimmunoresearch)分别用于板涂布和检测。关于adc浓度(仅缀合)的测定，以相同方式使用兔抗mmaf抗体(100ng/孔，levenabiopharma)和山羊抗人iggfab–hrp缀合物(1:10,000)。以如上文所述的相同方式执行分析(参见针对adc的血浆稳定性测试的部分)。浓度是基于标准曲线计算。消除相(t1/2β)的曲线下面积(auc，μg天ml^–1)和半衰期使用graphpadprism7来测定。

人乳癌的体内异种移植小鼠模型。为了产生kpl-4或jimt-1肿瘤，用悬浮于50μl1:1bmetype3(trevigen)中的5-7×10⁶个细胞原位注射至雌性ncr裸小鼠(6-8周龄taconicbiosciences的乳腺脂肪垫中。当肿瘤体积达到约100mm³时，小鼠经随机指派至三个或四个组(关于jimt-1模型中的媒介物，n＝4；关于kpl-4模型中的媒介物，n＝3；关于adc，n＝5)并且用经由尾静脉注射的无菌过滤的人igg(30mg/kg，innovativeresearch)预处理(stefan等人,2017和nanna等人,2017)。24h之后，单一剂量的100μlvcit-adc14a(3mg/kg)、evcit-adc14c(1或3mg/kg)或媒介物静脉内施用于小鼠。每3天使用数字卡尺监测肿瘤体积。当肿瘤体积超过1000mm³，肿瘤尺寸超过2cm直径，观察到大于15％重量损失，或小鼠显示痛苦迹象时，对小鼠实施安乐死。

数据报告。未执行统计学分析来测定实验之前的样品尺寸，但针对adc组的样品尺寸根据先前所报告的领域中相似实验来测定。我们在异种移植物研究中使用最小样品尺寸用于媒介物对照，因为我们不打算使用这一组进行统计学分析。调查人在实验期间未盲目进行分配。未从所述研究中排除样品或动物。关于体内pk分析，使用welch氏t-测试(双尾，未配对，不均匀方差)来测定所观察到的差异的统计学显著性。关于异种移植模型研究，使用mann-whitneyu测试(双尾，未配对，非参数)。kaplan-meier存活曲线统计学用对数秩(mantel-cox)测试进行分析。为了用bonferroni校正调节族系误差率，小于[0.05/比较的数目]的p值被视为统计学显著的。

＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

本文所公开和要求的所有组合物和/或方法均可根据本公开在无不当实验的情况下制备和进行。尽管本公开的组合物和方法已经根据优选实施方案加以描述，但对本领域的技术人员显而易见的是在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可使所述组合物和/或方法以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序发生变化。更具体说来，显而易见的是在化学上和生理学上相关的某些剂可取代本文所述的剂，同时将达到相同或相似结果。对本领域的技术人员显而易见的所有所述相似的替代和修改被认为在如由随附权利要求书限定的本公开的精神、范围和概念内。

v.参考文献

以下参考文献特定地以引用的方式并入本文中，在某种程度上，其提供示例性程序或对本文所阐述的那些进行补充的其他细节。

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