本发明涉及用于制备成分的高度选择性方法，该成分包含1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(opo)、存在于人乳中的甘油三酯。本发明还涉及可通过此类方法获得的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(opo)成分，其中opo与poo在总tag中的比率等于或高于90:10。
背景技术：
三酰基甘油(tag)是在人乳中以约39g/l存在的主要脂质，并且它们呈现脂肪酸的独特区域特定分布。tag的区域特定分布有助于人乳的营养有益效果，诸如对于脂肪酸和钙吸收，以及它们的相关有益效果诸如肠道舒适度。
婴儿配方食品(if)成分设计一般是相对于人乳组合物和有益效果的结构和功能同源性。
利用源自植物(植物油)或动物(乳脂肪)的现有成分和当前技术，目前不可能复制人乳的tag组合物。具体地讲，对由纯1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(opo，cas号：1716-07-0)组成的可食用成分或由高纯度1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(由1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油三酯和/或1-棕榈酸甘油三酯-2,3-二油酸(poo)表征)组成的可食用成分的获取目前不可行并且将尤其有利于该目的。
实际上，在婴儿配方食品中使用此类成分将使得能够制备接近人乳脂肪的脂质组合物，具体地讲匹配其在sn-2位置的棕榈酸水平，其在tag中占棕榈酸总量的约70％。
富含opo的可用成分中的选择性opo/poo似乎具有特别的相关性，因为poo物质(poo+oop)几乎不能通过工业上适用的纯化方法去除，并且其存在有助于降低sn-2位置处的棕榈酸的量，从而朝着相反的方向发展。
目前，富含opo的成分已掺入到一些if中。它们是使用酶反应制备的(类似于例如
其它opo合成也是已知的，并且描述于实验室级使用酶反应的文献中。无论如何，这些反应要么不可能在工业水平上提升(由于要进行复杂的纯化步骤以达到期望的opo含量和/或相对于其它tag的选择性)，或者与其它tag相比它们不能够提供具有期望的opo含量和/或选择性的成分。
因此，本发明的一个目标是提供用于制备opo成分的方法，其特征在于相对于其它tag，尤其是相对于poo具有高水平的纯度和/或选择性。
尤其有利的是提供用于制备opo成分的方法，其中opo与poo在总tag中的比率将等于或高于90:10。甚至更有利的是，提供用于制备opo成分的方法将是值得关注的，其特征在于在sn-2位置处的棕榈酸含量高于总棕榈酸含量的70％，并且其中opo与poo在总tag中的比率将等于或高于90:10。
技术实现要素：
已令人惊奇地发现，上述技术问题可通过本发明中所述的方法来解决。
在本发明的一个方面，提供了用于制备opo成分的方法，该方法包括以下步骤：
b)使2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯在包含thf的溶剂体系中在硼氢化钠的存在下进行还原反应，以产生2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯。
在本发明的另一方面，提供了可通过本发明的方法获得的opo成分，这种opo成分的特征在于opo与poo的比率等于或高于90:10。
定义
在本发明的上下文内，术语“opo”是指1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯和/或2-(棕榈酰氧基)丙烷-1,3-二基二油酸酯和/或(2-(棕榈酰氧基)-1,3-丙烷二基(9z,9'z)双(-9-十八碳烯酸酯)(cas号：1716-07-0)
在本发明的上下文内，术语“poo”是指3-(棕榈酰氧基)-1,2-丙烷二基(9z,9'z)双(-9-十八碳烯酸酯)(oop，cas号：14960-35-1)、和/或1-(棕榈酰氧基)-2,3-丙烷二基(9z,9'z)双(-9-十八碳烯酸酯)(poo，cas号：14863-26-4)二者。应当指出的是，当提及“poo”的量时，这也包括存在于成分中的oop的量。
在本发明的上下文内，术语“opo与poo在总tag中的比率”和/或“opo与poo的比率”和/或“配给量opo/poo”和/或“选择性opo与poo”和/或“选择性opo/poo”指示归一化为100份的总tag中opo与poo的量之间的重量比。
对于本领域的技术人员将显而易见的是，据此基于总tag中的假想opo和poo含量来提供此比率/选择性的示例性计算：
总tag中的opo含量：45g/100g总tag
总tag中的poo含量：6g/100g总tag
opo含量归一化为100份：88.2[从45:51＝x:100计算，因此x＝(45/51)×100]
总tag中opo与poo的比率：88.2:11.8
在本发明的上下文内，术语“opo成分”或“opo富集成分”或“1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯成分”或简称“opo”是指包含1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(opo)的可食用成分，其特征在于sn-2位置的棕榈酸含量高于总棕榈酸含量的70％，并且其中opo与poo在总tag中的比率将等于或高于90:10。
在本发明的上下文内，术语“溶剂体系”是指用于进行根据本发明的一个或多个反应步骤的一种或多种溶剂的混合物。
现将在本发明的以下具体实施方式中更详细地描述本发明。
具体实施方式
方法
在一个实施方案中，根据本发明的方法在衍生产物中提供等于或高于90:10的选择性opo与poo。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法提供了opo成分，其特征在于在sn-2位置处的棕榈酸含量高于总棕榈酸含量的70％，并且opo与poo的比率等于或高于90:10。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于制备opo成分的方法，该方法包括以下步骤：
a)使1,3-二羟基丙酮与油酸或油酰氯反应，以产生2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯；
b)使2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯在包含thf的溶剂体系中在硼氢化钠的存在下进行还原反应，以产生2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于制备opo成分的方法，该方法包括以下步骤：
b)使2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯在包含thf的溶剂体系中在硼氢化钠的存在下进行还原反应，以产生2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯；
c)使2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯与棕榈酰氯反应，以产生1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。
方案1报道了根据本发明的一个实施方案的合成反应方案：
方案1
在一个实施方案中，用于制备根据本发明的opo成分的方法基于方案1中所示的合成方法。在本发明的此实施方案中，提供了用于制备opo成分的方法，该方法包括以下步骤：
a)使1,3-二羟基丙酮与油酸或油酰氯反应，以产生2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯；
b)使2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯在包含thf的溶剂体系中在硼氢化钠的存在下进行还原反应，以产生2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯；
c)使2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯与棕榈酰氯反应，以产生1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。
步骤a)：1,3-二羟基丙酮的二酰化
根据本发明的方法可有利地通过1,3-二羟基丙酮与油酸或油酰氯的二酰化开始，以产生2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯。
在本发明的一个实施方案中，该转化可通过通常在室温下使用偶联剂(例如碳二亚胺与dmap)或者在30℃至60℃范围内的温度下使用酶(酯酶，诸如例如
在本发明的另一个实施方案中，可通过在0℃至室温范围内的温度下，例如在0℃的温度下，在吡啶或吡啶衍生物(例如，2,6-卢剔啶)存在下，使1,3-二羟基丙酮与油酰氯反应来进行二酰化。
在本发明的一个实施方案中，可使用若干非质子溶剂来进行步骤a)，诸如例如：dmf、thf、chcl3、ch2cl2、mtbe、mecn。在一个实施方案中，用于进行步骤a)的非质子溶剂为chcl3。
步骤b)：还原成1,3-二(顺-9-十八碳烯酰)甘油(1,3-甘油二油酸酯)
在步骤b)中，在硼氢化钠的存在下，将中间酮(1a)还原成1,3-二(顺-9-十八碳烯酰)甘油。文献中描述的用于这类反应的条件(s.obika等人，biooog.med.chem.2001，9，245-254)导致在最终opo成分中opo与其异构体poo的比率为67％-76％，其起源于步骤b)中获得的低选择性1,3与1,2-甘油二油酸酯(通过hplc–elsd评估)。
本发明人已出乎意料地发现了允许高得多的选择性(如示例中所示的高于95:5)的适当操作条件。据信，步骤b)在测定最终opo成分中的opo/poo选择性方面起到关键作用。
在此类反应步骤的框架中，实际上发生1,3-甘油二油酸酯的形成，这将导致在用棕榈酸残基酰化后产生所期望的opo成分[根据本发明的步骤c)]。无论如何，作为步骤b)的副产物，也可在还原步骤期间通过迁移一个油酸残基来形成1,2-甘油二油酸酯；通过标准色谱技术证明几乎不可能与1,3-甘油二油酸酯分离的此类1,2-甘油二油酸酯物质，是在用棕榈残基酰化后形成不可取的poo杂质的原因。在此基础上，在本发明方法的步骤b)的上下文中，应尽可能避免副产物1,2-甘油二油酸酯的形成。
不受理论的束缚，据信通过使步骤b)中获得的甘油二油酸酯与水接触最小化，可避免此类副产物形成。
在一个实施方案中，步骤b)在无水条件下进行。
在一个实施方案中，步骤b)在thf或thf/meoh或thf/etoh的混合物中进行。
在一个实施方案中，将无水thf单独或与无水meoh或etoh或它们的组合结合来用作步骤b)的溶剂。
在一个实施方案中，步骤b)(还原反应)在低于室温(例如零度)的温度下进行。温度低于室温，例如在零摄氏度。
在另一个实施方案中，步骤b)(后处理)在低于室温(例如零度)的温度下进行。温度低于室温，例如在零摄氏度。
在另一个实施方案中，步骤b)(还原反应和后处理)在低于室温(例如零度)的温度下进行。温度低于室温，例如在零摄氏度。
在一个实施方案中，设计反应的后处理(即，一旦完成期望的反应，试剂骤冷)以避免甘油二油酸酯与酸性水接触。在此实施方案中，将thf(或其与meoh和/或etoh的混合物)部分地去除，并且在向反应混合物中添加酸化水以使硼氢化钠失活之前添加另一种与水不可混溶的溶剂，例如氯仿，然后通过蒸发有机溶剂来分离有机相并回收甘油二油酸酯。
在另一个实施方案中，不对步骤b)中获得的甘油二油酸酯进行纯化。不受理论的束缚，据信这种方法进一步避免了油酸残基迁移的发生以及随后的选择性降低。
在另一个实施方案中，可从步骤b)获得的1,3-甘油二油酸酯的储存在低于或等于室温的温度下(例如在低于0℃的温度下)和/或在不存在直接光照的情况下和/或在不存在氧气的受控气氛中和/或在不延长储存时间(例如，不超过2天)的情况下进行。在另一个实施方案中，可从步骤b)获得的1,3-甘油二油酸酯根据本发明的步骤c)迅速反应。不受理论的束缚，据信这种方法进一步避免了油酸残基迁移的发生以及随后的选择性降低。
步骤c)：制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯
最后，2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯可用棕榈酸残基酰化。
在一个实施方案中，这种转化可通过通常在室温下使用偶联剂(例如碳二亚胺与dmap)或在30℃至60℃范围内的温度下使用酶(酯酶，如
在本发明的另一个实施方案中，可通过在0℃至室温范围内的温度下，例如在0℃或室温的温度下，在吡啶或吡啶衍生物(例如，2,6-卢剔啶)存在下，使甘油二油酸酯与棕榈酰氯反应来进行酰化。
在本发明的一个实施方案中，可使用若干非质子溶剂，诸如例如：dmf、thf、chcl3、ch2cl2、mtbe、mecn、己烷。在一个实施方案中，用于进行步骤c)的非质子溶剂为chcl3。
上述条件可产生opo/poo选择性高于95:5(即poo<5％)的opo。
opo成分
根据本发明的一个实施方案，提供了包含1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(opo)的opo成分，并且其特征在于在sn-2位置处的棕榈酸含量高于总棕榈酸含量的70％，并且opo与poo的比率等于或高于90:10。
在一个实施方案中，对于本发明的opo成分，在sn-2位置处的棕榈酸含量等于或高于总棕榈酸含量的75％，例如等于或高于总棕榈酸含量的80％。
在另一个实施方案中，对于本发明的opo成分，opo与poo的重量比等于或高于92:8，例如等于或高于95:5，例如98:2。
在另一个实施方案中，对于本发明的opo成分，在sn-2位置处的棕榈酸含量等于或高于总棕榈酸含量的75％，例如等于或高于总棕榈酸含量的80％，并且opo与poo的重量比等于或高于92:8，例如等于或高于95:5。
在本发明的一个实施方案中，opo成分可用作食品成分。
对该opo成分的获取允许配制与存在于人乳中并且适于制备婴儿营养产品的脂质组合物非常相似的脂质组合物。
下文提供了本发明的多个实施方案和方面：
a).用于制备opo成分的方法，该方法包括以下步骤：
b)使2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯在包含thf的溶剂体系中在硼氢化钠的存在下进行还原反应，以产生2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯。
b).根据实施方案a)的方法，其还包括：
a)使1,3-二羟基丙酮与油酸或油酰氯反应，以产生所述2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯。
c).根据实施方案a)或b)的方法，其还包括：
c)使2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯与棕榈酰氯反应，以产生1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。
d).根据实施方案a)至c)中的任一项的方法，其中步骤a)通过在0℃至室温范围内的温度下，例如在0℃的温度下，在吡啶或吡啶衍生物(例如，2,6-卢剔啶)存在下，使1,3-二羟基丙酮在氯仿中与油酰氯反应来进行。
e).根据实施方案a)至d)中任一项的方法，其中步骤b)在无水条件下在包含thf的溶剂体系中进行。
f).根据实施方案a)至e)中任一项的方法，其中步骤b)在无水条件下在由thf或thf/meoh或thf/etoh或thf/meoh/etoh组成的溶剂体系中进行。
g).根据实施方案a)至f)中任一项的方法，其中步骤b)在低于室温例如零度的温度下进行。温度低于室温，例如在零摄氏度。
h).根据前述实施方案中任一项的方法，其中在步骤b)的后处理中，将包含thf的溶剂体系部分地去除并用不与水混溶的溶剂例如氯仿替代，向反应混合物中添加酸化水以使硼氢化钠失活，分离有机相，并且通过蒸发有机溶剂回收甘油二油酸酯。
j).根据实施方案a)至c)中的任一项的方法，其中步骤a)通过在0℃至室温范围内的温度下，例如在室温下，在吡啶或吡啶衍生物(例如，2,6-卢剔啶)存在下，使1,3-二羟基丙酮在氯仿中与油酰氯反应来进行。
k).一种opo成分，其特征在于sn-2位置的棕榈酸含量高于总棕榈酸含量的70％，并且opo与poo的比率等于或高于90:10。
l).根据实施方案k)所述的opo成分，其中在sn-2位置处的棕榈酸含量等于或高于总棕榈酸含量的75％，例如等于或高于总棕榈酸含量的80％。
m).根据实施方案k)或l)的opo成分，其中opo与poo的重量比等于或高于92:8，例如等于或高于95:5。
n).根据实施方案k)至n)中的任一项的opo成分，其可通过实施方案a)至j)中任一项所述的方法获得。
实验部分
缩写：
hplc：高效液相色谱法
fwhm：半极大处全宽度
ms：质谱仪
thf＝四氢呋喃
acoet＝乙酸乙酯
meoh＝甲醇
etoh＝乙醇
chcl3＝氯仿
ch2cl2＝二氯甲烷
室温＝rt＝25℃
dmf＝n,n-二甲基甲酰胺
mtbe＝甲基叔丁基醚
mecn＝乙腈
dmap＝4-二甲氨基吡啶
分析方法：
方法a：
该方法利用混合质谱对脂肪、油和成品中tag区域异构体的标测、识别和定量的优点。基于精确质量(优于1ppm)、加合物包络和通过数据依赖性裂解获得的裂解模式，来进行识别。量化基于高分辨率离子色谱图，而sn-1(3)/sn-2区域异构体的相对比率的计算基于广义裂解模式和在产物离子光谱中观察到的相对强度。
样品制备
将油/脂肪样品溶解在正己烷中。接着，将100μl该溶液添加到900μl丙酮：甲醇4:1中。最后，将所得溶液的50μl等分试样连同250μl稳定同位素标记的内部标准溶液(400微摩尔/ml)转移到新的玻璃小瓶中，并且添加700μl丙酮：甲醇4:1。注入10μl等分试样用于分析。
设备
配备agilentporoshell120ec-c18柱的hplc(2.7μm粒度，2.1×250mm，得自瑞士boeckten的bgbanalytix，目录号693775-902)用于分离分析物。使用orbitrapelitevelos混合质谱仪(thermofisherscientific,bremen,germany)进行tag的质量分析、裂解和定量。
hplc条件
溶剂a为1mm甲酸铵和溶解于甲醇中的2μm甲酸钠，而溶剂b为异丙醇：正己烷1：1。
梯度如下：600μl/min时，0-3分钟无梯度100％a；600μl/min时，3-53分钟逐变至70％a；400μl/min时，53-60分钟逐变至5％a；400μl/min时，60-70分钟无梯度5％a；600μl/min时，70-73分钟逐变至100％a；600μl/min时，73-80分钟平衡在100％a。
质谱条件
300℃雾化器温度和5kv毛细管电压下，以正离子模式采用电喷射离子化(esi)以形成离子。雾化器和辅助气体分别为40和20单位的氮气。将管镜片调节至110v，傅立叶变换检测的离子积聚时间为100ms。其它参数为校准期间优化的典型值。轨道阱在m/z100-2000的范围内以30,000fwhm分辨率(半极大处全宽度)运行。根据含有准确质量的氨化tag的包含列表，应用±5ppm的母体质量宽度标准触发数据相关事件。在msofficeexcel中，通过计算tag的元素组成和相应的准确质量，建立了数据相关采集的包含列表标准，该tag通过在甘油主链上组合40个最常见fa获得。这些fa的组合产生大约40,000tag：可使用本文所述的方法检测和识别这些物质。另外的m/z4.95540质量标记(在氨化和钠化加合物之间的差异)在0-100％的母强度范围内应用。强度阈值为100,000cps，ft-ms主扫描的预览模式已启用。在线性离子阱中进行前体离子隔离、裂解和检测。仅将氨化加合物(低质量伴侣)裂解。
母离子聚积时间为50ms，隔离宽度为m/z3，标准碰撞能为30％，活化q值为0.250，活化时间为30ms。请注意，在氨化tag的情况下，上述指定的隔离宽度产生母离子的单元隔离并完全消除同位素。使用动态排除列表和30s排除时间，每两个扫描周期触发十个数据相关事件(每一个扫描周期5个裂解事件)。动态排除参数为：重复计数1；重复持续时间为0s；排除列表大小25；排除持续时间2.5s；排除质量宽度±5ppm。
中间体1a：制备2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯(步骤a)
方法1
将吡啶(9.79ml，121.5mmol)添加到450ml氯仿的1,3-二羟基丙酮(5g，55.5mmol)悬浮液中。5分钟后，在搅拌下于0℃下逐滴添加油酰氯(33.3g，111.1mmol)，然后在室温下滴加48小时。将溶液在450ml氯仿中稀释，用水(500ml)、碳酸氢钠水溶液(500ml)和盐水(500ml)洗涤，在无水硫酸钠上干燥，并且在真空下蒸发溶剂，得到1a的粗残余物。通过重结晶纯化粗产物：将残余物溶解于150ml甲醇(5体积)中，并使其在0℃下静置48小时。滗出过量的甲醇以得到白色固体形式的纯产物(5.3g)。然后将甲醇滤液浓缩，并且应用相同的程序以获得另外4.8g的纯化合物。该第二甲醇滤液仍包含所需产物，但不再重结晶。
方法2
将油酸(3.13g，11.10mmol)和4-dmap(1.36g，11.10mmol)添加到10ml氯仿的1,3-二羟基丙酮(0.5g，5.55mmol)悬浮液中。然后在搅拌下于室温下滴加dcc(11.10mmol)在2ml氯仿中的溶液。在反应完成后(过夜)，通过过滤去除沉淀的二环己基脲，并且在真空下还原溶剂(rotavapor)。通过硅胶柱层析、己烷中8％至10％的etoac纯化残余物，得到2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯(1.7g，49.5％收率)。
中间体1b：制备2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯(步骤b)
2-氧代丙烷-1,3-二基二油酸酯1a(2.0g，3.23mmol)溶解于thf(250ml)中。将反应混合物在20-25℃下冷却，并且小心地部分添加硼氢化钠(0.119g，3.23mmol)。30分钟后，将溶液在30℃于真空下蒸发至一半，并且用100ml氯仿稀释。然后添加水(50ml)。过量硼氢化物通过滴加冰醋酸(约0.5ml，最高至ph5-6)而中和。用水(50ml)、碳酸氢钠水溶液(50ml)和盐水(50ml)洗涤有机层，在无水硫酸钠上干燥，并且在真空下蒸发溶剂，以产生产物1b(2.0g，定量收率)。
实施例1c：制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(步骤c)
方法1
将吡啶(1.29ml，16.1mmol)添加到60ml氯仿的2-羟基丙烷-1,3-二基二油酸酯(2.0g，3.22mmol)悬浮液中。在室温下搅拌5分钟后，滴加棕榈酰氯(4.41g，16.1mmol)。在室温下搅拌反应混合物16小时。然后将溶液在50ml氯仿中稀释，用水(50ml)、稀释的hcl溶液、碳酸氢钠水溶液(25ml)和盐水(50ml)洗涤，在无水硫酸钠上干燥，并且溶剂在真空下蒸发以提供1c的残余物。通过硅胶柱层析(洗脱剂：etoac/己烷1％)纯化残余物，得到产物1c(3.2g，87％收率)。然后用甲醇研磨，得到1.1g的opo。
方法2：
将甘油二油酸酯1b(1.0g，1.61mmol)溶解于5mldcm中。然后在室温下添加edc.hcl(0.37g，1.93mmol)和dmap(40mg，0.32mmol)。在搅拌5分钟后，将棕榈酸(0.54g，1.90mmol)添加到反应混合物。反应完成后，将反应混合物在20mldcm中稀释，用水(50ml)、稀释的hcl溶液、碳酸氢钠水溶液(50ml)和盐水(50ml)洗涤。将有机层在无水硫酸钠上干燥，并且在真空下浓缩，得到1c的残余物。通过硅胶柱层析、2至5％etoac的己烷溶液来纯化残余物，得到opo(1.0g，72％收率)。
方法3：
将甘油二油酸酯(124mg，0.2mmol)和棕榈酸(102mg，0.4mmol)倒入小瓶中，然后用2ml干燥己烷溶解。在搅拌下添加12mg酶(
实施例2：对根据本发明的opo成分的分析表征以及与可商购获得的包含opo的成分的比较
为了评估根据本发明的opo成分中存在的tag和脂肪酸的特性和量，并且将该成分与富含opo的可商购获得的产品进行比较，根据上述方法a进行三个样品的分析表征。
在该实验中获得的结果报告于下表1中：
表1
基于以上报告的结果，根据本发明方法制备的opo成分对于其它可商购获得的富含opo的成分具有明显的区别。值得注意的是，在sn-2位置处的棕榈酸含量显著更高，opo含量和opo:poo选择性也更高。
应当理解，对本文所述的目前优选的实施方案作出的各种变化和修改对于本领域的技术人员将为显而易见的。可在不脱离本发明的实质和范围并在不减少所伴随的优点的情况下作出这些变化和修改。因此，此类变化和修改旨在由所附权利要求书涵盖。