本发明涉及稳定化的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物。
背景技术：
蛋白质脱酰胺酶是分配ec3.5.1.44作为ec编号的酶，其将蛋白质中的谷氨酰胺、天冬酰胺的酰胺基水解，变换为谷氨酸、天冬氨酸而使氨游离。蛋白质脱酰胺酶可应用于提高蛋白质的功能性(溶解性、乳化特性、泡末特性、凝胶特性等)，提高小麦面筋的面团的延展性，降低小麦过敏原诱发性，提高来自农产品的蛋白质的提取效率，提高蛋白质溶液中的钙溶解性等各种用途，是产业上的利用性高的酶。
蛋白质脱酰胺酶广泛存在于自然界。作为最知名的酶，可举出专利文献1、2中记载的来自微生物的蛋白质谷氨酰胺酶。非专利文献1报告存在从发芽中的小麦、四季豆、南瓜种子中将蛋白质中的谷氨酰胺残基进行脱酰胺的酶。另外，在非专利文献2中报告在细菌(bacilluscirculans)的菌体内将肽中的谷氨酰胺残基进行脱酰胺化的酶即肽谷氨酰胺酶的存在。此外，非专利文献2中记载了蛋白质脱酰胺酶溶液的ph稳定性为ph5至9。
应予说明，作为作用于酰胺基的酶，比蛋白质脱酰胺酶更早知道的酶，可举出谷氨酰胺转移酶。已知谷氨酰胺转移酶是分配ec2.3.2.13作为ec编号的酰基转移酶，蛋白质脱酰胺酶在结构和特性等方面是与谷氨酰胺转移酶完全不同的酶。
在将酶用作产业用酶剂的情况下，保存稳定性变得重要。作为用于维持充分的保存稳定性的手段，可举出因突变导致的酶自身性质的改性、以及稳定剂的添加等。
例如，在专利文献3中记载了为了改良稳定性而在蛋白质脱酰胺酶中导入特定的突变的突变型蛋白质脱酰胺酶的设计。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2000-50887号公报
专利文献2：日本特开2001-218590号公报
专利文献3：国际公开第2010/029685号
非专利文献
非专利文献1：vaintraub,i.a.,kotova,l.v.&shaha,r.(1996)proteindeamidasesfromgerminatingseeds.physiol.plantarum.96,662-666.
非专利文献2：kikuchi,m.,hayashida,h.,nakano,e.&sakaguchik.(1971)peptidoglutaminase.enzymesforselectivedeamidationofγ-amidoofpeptide-boundglutamine.biochemistry10,1222-1229.
技术实现要素：
(发明要解决的课题)
关于蛋白质脱酰胺酶，如专利文献3所示已知通过向酶自身导入突变来改良稳定性。然而，尚不知道通过在酶组合物的组成上的研究来改良蛋白质脱酰胺酶的稳定性的方法。
因此，本发明的目的在于提供一种通过在酶组合物的组成上的研究来提高蛋白质脱酰胺酶组合物的稳定性的技术。
(用于解决课题的技术方案)
本发明人对在酶组合物中使蛋白质脱酰胺酶提高稳定性的稳定剂进行了研究，其结果，发现在提高蛋白质酰胺酶自身的稳定性方面，将蛋白质脱酰胺酶制成干燥组合物且配合氯化镁，或者，将蛋白质脱酰胺酶制成干燥组合物且调整为溶解时的ph小于5是有效的。本发明是基于这些发现而完成的发明。
本发明包括以下发明。
方案1.一种稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物，其包含蛋白质脱酰胺酶和氯化镁。
方案2.根据方案1记载的稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物，其中，所述氯化镁的含量为1.0～10.0重量％。
方案3.根据方案1记载的稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物，其中，所述氯化镁的含量为1.0～6.0重量％。
方案4.根据方案1记载的稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物，其中，所述氯化镁的含量为0.01～2.0mg/u。
方案5.一种稳定性提高方法，其在包含蛋白质脱酰胺酶的干燥酶组合物中，提高所述蛋白质脱酰胺酶的稳定性，
在干燥酶组合物中，使氯化镁与所述蛋白质脱酰胺酶共存。
方案6.一种稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物，其中，以成为1w/v％的方式溶解于水中时的ph为2以上且小于5。
方案7.一种稳定性提高方法，其中，在包含蛋白质脱酰胺酶的干燥酶组合物中，提高所述蛋白质脱酰胺酶的稳定性，
将干燥酶组合物以成为1w/v％的方式溶解于水时的ph调整为2以上且小于5。
方案8.一种稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的制造方法，其包括以下工序，准备包含ph为2以上且小于5的蛋白质脱酰胺酶的酶液的工序，以及使所述酶液干燥的工序。
(发明效果)
根据本发明，可提供一种通过干燥酶组合物的组成上的研究而提高蛋白质脱酰胺酶组合物的稳定性的技术。
(用于实施发明的方式)
[1.蛋白质脱酰胺酶干燥组合物]
本发明提供包含蛋白质脱酰胺酶和氯化镁的稳定化的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物以及以规定浓度使其溶解于水时的ph为2以上且小于5的稳定化的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物。应予说明，在以规定浓度溶解于水的情况下的ph为2以上且小于5的稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物中，可以包含氯化镁，也可以不包含氯化镁。
[1-1.蛋白质脱酰胺酶]
本发明中的蛋白质脱酰胺酶也被称为蛋白质谷氨酰胺酶，其是作用于蛋白质的侧链的酰胺基而水解为侧链羧基和氨的酶。最适温度例如为60℃附近，最适ph例如为ph6附近。作为蛋白质脱酰胺酶作用的具有侧链的酰胺基的氨基酸残基，可举出天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基，但并不限定于这些。另外，作为蛋白质脱酰胺酶的底物的蛋白质可举出分子量5000以上，优选为10000～2000000的蛋白质，但也包括分子量小于5000的多肽(包含二肽)。进而，作为蛋白质脱酰胺酶的底物的蛋白质的形式可以是仅由氨基酸残基构成的蛋白质单体的形式，也可以是与糖、脂质等复合而成的复合蛋白质的形式。
应予说明，本发明中的蛋白质酰胺酶即使作用于蛋白质的侧链的酰胺基，也不具有谷氨酰胺转移酶活性。谷氨酰胺转移酶活性如在谷氨酰胺转移酶中可见的那样，是催化蛋白质的谷氨酰胺残基与赖氨酸残基之间的异肽形成的活性。另外，本发明中的蛋白质脱酰胺酶也不具有蛋白酶活性。蛋白酶活性如各种蛋白酶中可见的那样，是水解蛋白质的肽键的活性。
本发明中的作为蛋白质脱酰胺酶的来源的生物只要能够产生作用于蛋白质中的侧链的酰胺基、且具有不伴有肽键的切断和蛋白质的交联的脱酰胺的活性的酶，则没有特别限定。作为蛋白质脱酰胺酶的来源的生物，例如可举出分类为噬纤维菌目(cytophagales)、放线菌属(actinomycetes)和黄杆菌科(flavobacteriaceae)的细菌，更具体而言，可举出属于金黄杆菌(chryseobacterium)属、黄杆菌(flavobacteium)属、稳杆菌(empedobacter)属、鞘氨醇杆菌(sphingobacterium)属、金杆菌(aureobacterium)属和类香味菌(myroides)属的微生物，优选可举出属于金黄杆菌(chryseobacterium)属的微生物，更优选可举出属于金黄杆菌(chryseobacterium)属的新菌金黄杆菌(chryseobacteriumsp.)no.9670(fermbp-7351)。
本发明中的蛋白质脱酰胺酶的氨基酸序列只要作用于蛋白质中的侧链的酰胺基，且具有不伴随肽键的切断和蛋白质的交联的脱酰胺的活性，则没有特别限定。从更优选地得到稳定性提高效果的观点出发，优选举出具有序列号1表示的氨基酸序列(1-135为前原序列(pre-pro-sequences)、136～320为成熟体序列)的蛋白质，由在序列号2表示的氨基酸序列(序列号1表示的氨基酸序列的成熟体序列)以及序列号1或2表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，且作用于蛋白质中的侧链的酰胺基，具有不伴随肽键的切断和蛋白质的交联的脱酰胺的活性的蛋白质，更优选举出具有序列号1或2表示的氨基酸序列的蛋白质。此外，只要具有该活性，则蛋白质脱酰胺酶的氨基酸序列可以是与序列号1或2所示的氨基酸序列的例如具有70％以上，优选为80％以上，更优选为90以上，进一步优选为95％以上的同源性的氨基酸序列。应予说明，同源性是指在该技术领域使用公知的数学算法使2个氨基酸序列进行排列时的最佳的对比(为了得到最佳的对比，该算法优选为考虑到在序列的一侧或双侧导入缺口而得到算法)中的相同氨基酸残基相对于重叠的全部氨基酸残基的比例(％)。
作为蛋白质脱酰胺酶的分子量(基于sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量)，例如可举出18000～22000，优选为20000左右。作为蛋白质脱酰胺酶的最适ph，例如可举出5～7，优选为5.5～6.5，更优选为6左右。该最适ph可通过将底物溶液(包含10mmol/l的z-gln-gly)100μl[40mmol/lbritton-robinson缓冲液(ph3～12)]在各ph在37℃预热5分钟后，添加包含0.32μg的蛋白质脱酰胺酶的酶液10μl，在37℃反应60分钟，测定酶活性而得到。作为蛋白质脱酰胺酶的最适温度，例如可举出50～70℃，优选为55～65℃，更优选为60℃左右。该最适温度可通过在底物溶液(包含10mmol/l的z-gln-gly)100μl[176mmol/l磷酸缓冲液(ph6.5)]中添加包含1.21μg的蛋白质脱酰胺酶的酶溶液10μl，在各温度反应60分钟，测定酶活性而得到。作为蛋白质脱酰胺酶的ph稳定性，例如可举出5～9。该ph稳定性可通过将包含0.75μg的蛋白质脱酰胺酶的酶溶液22μl[40mmol/lbritton-robinson缓冲液(ph3～12)]在30℃处理18小时之后，测定残留的酶活性而得到。作为蛋白质脱酰胺酶的温度稳定性，可举出50℃以下。该温度稳定性可通过将包含1.76μg的蛋白质脱酰胺酶的酶溶液43μl[50mmol/l磷酸缓冲液(ph7.0)]在各温度下放置10分钟后，测定残留的酶活性而得到。
蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(100重量％)中的蛋白质脱酰胺酶的含量没有特别限定，例如可举出0.1重量％以上，优选为0.2重量％以上，更优选为0.3重量％以上，进一步优选为0.5重量％以上，例如可举出20重量％以下，优选为10重量％以下，更优选为5.0重量％以下，进一步优选为2.5重量％以下。
[1-2.氯化镁]
本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物中可包含氯化镁。氯化镁可作为蛋白质脱酰胺酶的稳定剂使用。通过使用氯化镁作为稳定剂，本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物可具备优异的稳定性。
氯化镁的含量没有特别限定，从优选得到稳定性提高效果的观点出发，作为相对于蛋白质脱酰胺酶干燥组合物整体的重量(100重量％)的比例，例如可举出1.0～10.0重量％。从更优选得到稳定性提高效果的观点出发，作为相对于上述的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物整体的重量的比例的范围下限，可举出优选为1.5重量％以上，更优选为2.0重量％以上，进一步优选为2.5重量％以上，进一步优选为3.0重量％以上，更进一步优选为3.5重量％以上，特别优选为4.0重量％以上，作为该比例的范围上限，可举出优选为9.0重量％以下、更优选为7.0重量％以下、进一步优选为6.5重量％以下。作为具体的氯化镁的含量的范围，可举出1.0～9.0重量％、1.0～7.0重量％、1.0～6.5重量％、1.5～10.0重量％、1.5～9.0重量％、1.5～7.0重量％、1.5～6.5重量％、2.0～10.0重量％、2.0～9.0重量％、2.0～7.0重量％、2.0～6.5重量％、3.0～10.0重量％、3.0～9.0重量％、3.0～7.0重量％、3.0～6.5重量％、3.5～10.0重量％、3.5～9.0重量％、3.5～7.0重量％、3.5～6.5重量％、4.0～10.0重量％。4.0～9.0重量％、4.0～7.0重量％、4.0～6.5重量％。
此外，除了稳定性提高效果以外，从良好地得到蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的粉末特性(例如对凝结和/或潮解的抑制性)的观点出发，作为相对于蛋白质脱酰胺酶干燥组合物整体的重量的比例，例如可举出1.0～6.0重量％。从更良好地得到蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的粉末特性(例如对凝结和/或潮解的抑制性)的观点出发，作为相对于上述蛋白质脱酰胺酶干燥组合物整体的重量的比例范围的上限，可举出优选为5.5重量％以下，更优选为5.0重量％以下，进一步优选为4.5重量％以下，进一步优选为4.0重量％以下。除了稳定性提高效果以外考虑蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的粉末特性的情况下，作为具体的氯化镁的含量范围，可举出1.0～5.5重量、1.0～5.0重量％、1.0～4.5重量％、1.0～4.0重量％。
此外，从优选地得到稳定性提高效果的观点出发，氯化镁的含量以蛋白质脱酰胺酶的单位活性的量计例如可举出0.01～2.0mg/u。从更优选地得到稳定性提高效果的观点出发，作为上述的蛋白质脱酰胺酶的单位活性的量的范围的更优选的下限，可举出0.02mg/u以上，优选为0.03mg/u以上，更优选为0.04mg/u以上，进一步优选为0.05mg/u以上，进一步优选为0.06mg/u以上，更进一步优选为0.07mg/u以上，特别优选为0.08mg/u以上，作为该蛋白质脱酰胺酶的单位活性的量的范围的更优选的上限，可举出1.0mg/u以下，优选为0.50mg/u以下，更优选为0.20mg/u以下，进一步优选为0.18mg/u以下，进一步优选为0.14mg/u以下，特别优选为0.13mg/u以下。作为具体的氯化镁的含量范围，可举出0.01～1.0mg/u、0.01～0.50mg/u、0.01～0.20mg/u、0.01～0.18mg/u、0.01～0.14mg/u、0.01～0.13mg/u、0.02～2.0mg/u、0.02～1.0mg/u、0.02～0.50mg/u、0.02～0.20mg/u、0.02～0.18mg/u、0.02～0.14mg/u、0.02～0.13mg/u、0.03～2.0mg/u、0.03～1.0mg/u、0.03～0.50mg/u、0.03～0.20mg/u、0.03～0.18mg/u、0.03～0.14mg/u、0.03～0.13mg/u、0.04～2.0mg/u、0.04～1.0mg/u、0.04～0.50mg/u、0.04～0.20mg/u、0.04～0.18mg/u、0.04～0.14mg/u、0.04～0.13mg/u、0.05～2.0mg/u、0.05～1.0mg/u、0.05～0.50mg/u、0.05～0.20mg/u、0.05～0.18mg/u、0.05～0.14mg/u、0.05～0.13mg/u、0.06～2.0mg/u、0.06～1.0mg/u、0.06～0.50mg/u、0.06～0.20mg/u、0.06～0.18mg/u、0.06～0.14mg/u、0.06～0.13mg/u、0.07～2.0mg/u、0.07～0.20mg/u、0.07～1.0mg/u、0.07～0.50mg/u、0.07～0.18mg/u、0.07～0.14mg/u、0.07～0.13mg/u、0.08～2.0mg/u、0.08～1.0mg/u、0.08～0.50mg/u、0.08～0.20mg/u、0.08～0.18mg/u、0.08～0.14mg/u、0.08～0.13mg/u。
此外，除了稳定性提高效果以外，从良好地得到蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的粉末特性(例如对凝结和/或潮解的抑制性)的观点出发，作为蛋白质脱酰胺酶的单位活性的量，例如可举出0.02～0.12mg/u。从更良好地得到蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的粉末特性(例如对凝结和/或潮解的抑制性)的观点出发，作为上述蛋白质脱酰胺酶的单位活性的量的范围的更优选的上限，可举出0.12mg/u以下，优选为0.11mg/u以下，更优选为0.10mg/u以下，进一步优选为0.09mg/u以下，进一步优选为0.08mg/u以下。除了稳定性提高效果以外考虑蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的粉末特性的情况下，作为具体的氯化镁的含油量的范围，可举出0.02～0.11mg/u、0.02～0.10mg/u、0.02～0.09mg/u、0.02～0.08mg/u。
[1-3.氯化钙]
本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物还可以包含氯化钙。氯化钙可作为粉末特性提高剂和/或稳定助剂使用。通过将氯化钙与氯化镁并用，本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物可具备更优异的粉末特性(例如对凝结和/或潮解的抑制性)。
氯化钙的含量没有特别限定，从优选地提高蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的粉末特性的观点出发，作为相对于蛋白质脱酰胺酶干燥组合物整体的重量的比例，例如可举出1.0重量％以上、优选为2.0重量％以上、更优选为2.5重量％以上，例如可举出10.0重量％以下、优选为8.0重量％以下、更优选为6.5重量％以下、进一步优选为6.0重量％以下、进一步优选为5.5重量％以下。作为具体的氯化钙的含量的范围，可举出1.0～10.0重量％、1.0～8.0重量％、1.0～6.5重量％、1.0～6.0重量％、1.0～5.5重量％、2.0～10.0重量％、2.0～8.0重量％、2.0～6.5重量％、2.0～6.0重量％、2.0～5.5重量％、2.5～10.0重量％、2.5～8.0重量％、2.5～6.5重量％、2.5～6.0重量％、2.5～5.5重量％。
此外，从优选提高蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的粉末特性的观点出发，作为氯化镁和氯化钙的相对于总量100重量份的量，例如可举出15重量份以上，优选为30重量份以上，更优选为35重量份以上，例如可举出95重量份以下，优选为90重量份以下，更优选为85重量份以下，进一步优选为70重量份以下，进一步优选为65重量份以下。作为氯化镁和氯化钙的相对于总量100重量份的量的具体的范围，可举出15～95重量份、15～90重量份、15～85重量份、15～70重量份、15～65重量份、30～95重量份、30～90重量份、30～85重量份、30～70重量份、30～65重量份、35～95重量份、35～90重量份、35～85重量份、35～70重量份、35～65重量份。
[1-4.其它成分]
本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物中，除了上述成分以外，还可以包含其它成分。作为其它成分，例如可以包含糊精、难消化性糊精、淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、海藻糖等糖赋形剂；氯化钠、氯化钙等盐类；对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苄醇等防腐剂；抗氧化剂；乳蛋白质、大豆蛋白质、小麦蛋白质等各种蛋白质(不包括蛋白质脱酰胺酶)；肽；氨基酸；乳酸菌；维生素；矿物质(不包括上述盐类)；油脂；各种提取物(肉提取物、酵母提取物等)；核酸等。
[1-5.溶解于水时的ph]
在本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物为包含蛋白质脱酰胺酶和氯化镁的稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的情况下，作为使蛋白质脱酰胺干燥组合物以成为1w/v％的浓度的方式溶解于水时的ph(25℃的ph，以下相同)，没有特别限定，例如可举出2以上，可举出8以下，作为具体范围，可举出2～8。此时，从更有效地得到与不含氯化镁的情况相比的氯化镁导致的稳定性提高效果的观点出发，溶解于水时的ph优选为4以上，优选为8以下，作为具体的范围，可举出4～8。
在本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物是以规定浓度溶解于水时的ph为2以上且小于5的稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的情况下，作为使蛋白质脱酰胺干燥组合物以成为1w/v％的浓度的方式溶解于水中时的ph(25℃的ph，以下相同)，从在蛋白质脱酰胺酶干燥组合物中得到稳定性提高效果的观点出发，为2以上且小于5。从更优选地得到稳定性提高效果的观点出发，该ph的范围的上限优选为4以下，更优选为3以下。作为具体的ph的范围，可举出2～4(2以上且4以下)、2～3。在液体状态的蛋白质脱酰胺酶组合物中，在ph5～9是稳定的，但在本发明的蛋白质脱酰胺酶组合物中，通过将干燥状态且溶解于水时的ph设为2以上且小于5，与将溶解于水时的ph设为5～9的情况相比，可提高蛋白质脱酰胺酶的稳定性。溶解于水时的ph为2以上且小于5的本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物即使不含上述氯化镁，也可得到蛋白质脱酰胺酶的稳定性提高效果。
[1-6.形态]
作为本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的形态，只要是干燥状态就没有特别限定，例如可举出粉末状、颗粒状等，优选举出粉末状。此外，本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物可举出喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物等形态的组合物，优选举出喷雾干燥物和冷冻干燥物。
[1-7.制造方法]
蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的制造方法包括以下工序，准备蛋白质脱酰胺酶的工序，制备包含蛋白质脱离酶的酶液的工序，以及使该酶液干燥的工序。
[1-7-1.制备蛋白质脱酰胺酶的工序]
在准备蛋白质脱酰胺酶的工序中，蛋白质脱酰胺酶可以由本领域技术人员从上述的“1-1.蛋白质脱酰胺酶”中记载的来源生物利用公知的培养方法适当制造。作为培养方法，可举出固体培养法和液体培养法等培养法，优选利用液体培养法。
作为培养基，只要是使用的微生物能够生长的培养基，就没有特别限定。作为可使用的培养基，只要是生产蛋白质脱酰胺酶的微生物可生长且可生产蛋白质脱酰胺酶的培养基，则可以是任意的培养基。例如，可使用添加有葡萄糖、蔗糖、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，以及硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵、或者蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、肉提取物等氮源，以及钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。
将培养基的ph调整为例如约3～9，优选为约5.0～8.0左右，培养温度通常约为10～50℃，优选约为20～37℃左右，在需氧的条件下培养12小时～20天，优选为1～7天左右。作为培养法，例如可使用振荡培养法、利用发酵罐的需氧性深液培养法。
利用通常的方法从得到的培养液分离蛋白质脱酰胺酶，可得到本发明的蛋白质脱酰胺酶。例如从培养液中分离精制蛋白质脱酰胺酶时，可将离心分离、uf浓缩、盐析、离子交换树脂等各种层析法组合，通过常规方法进行处理，可得到精制的蛋白质脱酰胺酶。
另外，也可以将市售的蛋白质脱酰胺酶(例如天野酶株式会社所提供的protein-glutaminase“amano”500等)用于起始原料。
[1-7-2.制备酶溶液的工序]
在制备酶液的工序中，在制造包含蛋白质脱酰胺酶和氯化镁的稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的情况下，蛋白质脱酰胺酶可制备为包含氯化镁，以及根据需要选自氯化钙和上述其它成分中的成分的酶液。在酶液的制备中，例如可以使氯化镁相对于材料的总重量(干燥重量换算)例如为1.0～10.0重量％，或者，以蛋白质脱酰胺酶的单位活性的量计例如为0.01～2.0mg/u。更具体而言，可以以上述的“1-2.氯化镁”记载的量含有。另外，此时，酶液的ph没有特别限定，例如可举出2以上，可举出8以下。此外，从更有效地得到与不包含氯化镁的情况相比的氯化镁导致的稳定性提高效果的观点出发，酶液的ph优选调整为4以上，优选调整为8以下。更具体而言，可举出上述的“1-5.溶解于水中时的ph”记载的ph。另外，在含有氯化钙的情况下，能够以相对于材料的干燥重量的总量的比例计，例如为1.0重量％以上且10.0重量％以下，或者氯化镁和氯化钙的相对于总量100重量份的量为15重量份以上且85重量份以下的量包含氯化钙。更具体而言，能够以上述的“1-2.氯化钙”记载的量含有。
在制备酶液的工序中，在制造以规定浓度使其溶解于水使的ph为2以上且小于5的稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的情况下，酶液的ph可以调节为2以上且小于5，从在蛋白质脱酰胺酶干燥组合物中优选地得到稳定性提高效果的观点出发，能够调整为优选2～4、更优选2～3。
[1-7-3.使酶液干燥的工序]
在使酶液干燥的工序中，使在上述工序得到的酶液干燥。作为干燥的方法，例如可举出冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等。由此，可得到蛋白质脱酰胺酶干燥组合物。
[1-8.用途]
本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物通过作用于各种蛋白质，能够将蛋白质中的酰胺基直接脱酰胺。其结果，所产生的脱酰胺化蛋白质伴随负电荷的增加，也带来了pi的降低、水合力的上升、静电斥力的上升。进而，由于蛋白质的高阶结构的变化，可带来表面疏水性的上升。通过这些效果，可带来可溶性·分散性的提高、起泡性·泡沫稳定性的提高、乳化性·乳化稳定性的提高等蛋白质的功能性的改善。
因此，本发明的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物在食品领域可以广泛使用。具体而言，可举出在通常的食品的ph范围即弱酸性条件环境中提高植物性蛋白质的可溶性、分散性、乳化性等的用途(例如，咖啡伴侣(coffeewhitener)、果汁等酸性饮料，调味品(dressing)、蛋黄酱、奶油的制造用途)；植物性难溶解性蛋白质的可溶性、分散性的增大化(例如，使用了小麦面筋的天妇罗粉等的制造用途)；制作面包·制作糕点时的面团的改性用途(例如，薄脆饼干(cracker)、饼干、曲奇、比萨饼、或酥皮饼的饼皮(piecrust)的制造用途)；除去或减少食品中的过敏性蛋白质中的过敏原的用途(例如，小麦过敏患者用食品的制造用途)；使蛋白质的矿物质敏感性降低，提高包含蛋白质和矿物质的液体中的可溶性矿物质含量，提高矿物质在人体中的吸收性的用途(例如，含有高矿物质(例如钙)的饮料、矿物质(例如钙)的吸收促进剂的制造用途)；使苦味降低的用途、提高蛋白酶的蛋白质分解率的用途和/或增强谷氨酸含量的用途(例如，氨基酸系调味料(动物性蛋白质的水解物(hap)、植物性蛋白质的水解物(hvp))、味噌·酱油的制造用途)等。
[2.稳定性提高方法]
本发明还提供一种在包含蛋白质脱酰胺酶的干燥酶组合物中提高蛋白质脱酰胺酶的稳定性的方法。具体而言，本发明的稳定性提高方法的特征在于，在干燥酶组合物中，使氯化镁与蛋白质脱酰胺酶共存。或者，本发明的稳定性提高方法的特征在于，将包含蛋白质脱酰胺酶的干燥酶组合物以成为1w/v％的方式溶解于水时的ph调整为2以上且小于5(具体而言，如上述的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的制造方法中的制备酶液的工序中记载的那样，可通过将酶液的ph调整为2以上且小于5来进行)。
应予说明，如后述实施例记载所示，稳定性例如可利用规定条件下的保存后的残留活性等进行测定。稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的稳定性只要是与不实施稳定性提高方法的情况相比提高的稳定性就没有特别限定，例如可举出在40℃下保存1个月后的残留活性为60％以上，优选为65％以上，更优选为70％以上，进一步优选为75％以上，更进一步优选为80％以上。另外，在上述中，不实施稳定性提高方法的情况是指在特征在于使氯化镁与蛋白质脱酰胺酶共存的方式中不共存氯化镁的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物，也是指在特征在于将干燥酶组合物以成为1w/v％的方式溶解于水时的ph调整为2以上且小于5为特征的方式中将该ph调整为5以上的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物。
在本发明的稳定性提高方法中，关于使用的成分的种类、含量、溶解于水时的ph、干燥酶组合物的制造方法和方式等，如上述的“1.蛋白质脱酰胺酶干燥组合物”一栏记载所述。
实施例
以下，举出实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
[蛋白质脱酰胺酶的准备]
在以下试验例中，作为蛋白质脱酰胺酶，使用天野酶株式会社制蛋白质脱酰胺酶制剂“protein-glutaminase“amano”500”(来自金黄杆菌属)、500u/g。“protein-glutaminase“amano”500”是除蛋白质脱酰胺酶以外还包含糊精，且活性被调整为500u/g的酶制剂。另外，蛋白质脱酰胺酶也可以通过以下方法获得。将金黄杆菌no.9670(chryseobacteriumsp.no.9670)按照专利文献2记载的方法利用lbbase培养基(gibco公司制)在25℃振荡培养2～7天，其后得到离心上清。培养结束后，将培养液进行离心分离(12000rpm、4℃、20分钟)，得到上清作为粗酶液，利用超滤(uf)浓缩(sep-0013)、盐析、苯基琼脂糖、sephacryls-100进行处理，对酶进行精制。
[含有蛋白质脱酰胺酶的组合物中的蛋白质脱酰胺酶活性的测定法]
在以下试验例中，含有蛋白质脱酰胺酶的组合物中的蛋白质脱酰胺酶活性按照以下方式进行测定。应予说明，以下，作为底物的z-gln-gly表示n-苄氧基羰基-l-谷氨酰胺酰基甘氨酸。
1.在含有30mm的z-gln-gly的0.2m磷酸缓冲液(ph6.5)1.0ml中添加使用含有0.002％triton-x的0.2m磷酸缓冲液(ph6.5)进行适当稀释的试样溶液0.1ml，在37℃培养10分钟后，添加0.4m三氯乙酸1.0ml，停止反应。
2.利用氨检测试剂盒(wako纯药)定量游离氨量。
具体而言，将0.2ml反应液与0.8ml精制水混合后，添加显色试液a(0.43m苯酚、0.5m五氰基亚硝酰基铁(iii)酸钠二水合物溶液)1.0ml并混合，进一步添加显色试液b(0.89m氢氧化钾水溶液)0.5ml并混合，在其中添加显色试液c(碳酸钾、次氯酸钠水溶液)1.0ml并混合后，在37℃培养20分钟。其后，测定波长630nm处的吸光度(a1)。
3.作为空白，在试样溶液0.1ml中添加0.4m三氯乙酸1.0ml后，混合含有30mm的z-gln-gly的0.2m磷酸缓冲液(ph6.5)1.0ml而成的溶液也进行同样的显色操作，测定吸光度(a2)。
4.将1分钟内生成1μmol的氨的酶量设为1u，由下式算出蛋白质脱酰胺酶活性(pg活性)。
pg活性(u/g)＝f×(a1-a2)×(1/17.03)×(2.1/0.1)×(1/10)×n
f：通过制作氨标准曲线计算得到的常数
17.03：氨分子量
2.1：反应液总量
0.1：试样添加量
10：反应时间(分钟)
n：稀释倍数
[试验例1：氯化镁导致的稳定性提高效果的验证-1]
(1)蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的制备
将“protein-glutaminase“amano”500”(天野酶株式会社制)(500u/g)溶解于水，以成为表1所示的配合量(相对于包含蛋白质脱酰胺酶、糊精、氯化镁的蛋白质脱酰胺酶制剂的总重量(干燥重量换算)的重量比例、以及蛋白质脱酰胺酶单位活性的蛋白质脱酰胺酶制剂的重量)的方式溶解氯化镁，得到酶液。此外，作为比较例，将不包含氯化镁(无添加)的酶液、以及将氯化镁置换为半胱氨酸或氯化钙的酶液也同样地以表1所示的配合量(相对于包含蛋白质脱酰胺酶和糊精的蛋白质脱酰胺酶制剂、以及包含蛋白质脱酰胺酶、糊精以及半胱氨酸或氯化钙的蛋白质脱酰胺酶制剂的总重量(干燥重量换算)的重量比例、以及蛋白质脱酰胺酶单位活性的重量)进行制备。这些酶液使用1m盐酸和1m氢氧化钠调整为ph6.0(25℃)。
利用喷雾干燥器(eyelaspraydryersd-1000)将酶液(ph调整后)粉末化，作为喷雾干燥品得到蛋白质脱酰胺酶干燥组合物。
(2)稳定性评价
将得到的喷雾干燥品分别放入gx薄膜袋(凸版印刷株式会社)，通过热封进行密封后，分别在-20℃和60℃的温度条件下保存2天。测定保存后的蛋白质脱酰胺酶活性，作为相对于-20℃的蛋白质脱酰胺酶活性的60℃的蛋白质脱酰胺酶活性以百分率计导出残留活性(％)。
将结果示于表1。包含氯化镁的情况(实施例1)与不包含氯化镁的情况(比较例1)、包含半胱氨酸代替氯化镁的情况(比较例2)、以及包含氯化钙代替氯化镁的情况(比较例3)相比，稳定性提高。如此，确认氯化镁对蛋白质脱酰胺酶干燥组合物发挥优异的稳定化效果。
[表1]
[试验例2：氯化镁导致的稳定性提高效果的验证-2]
(1)蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的制备
将氯化镁的重量比例设为2.5重量％，除此以外，与试验例1相同，制备蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(实施例2)作为喷雾干燥品，供于以下稳定评价试验。此外，对于试验例1得到的无添加的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(比较例1)以及该重量比例为6.5重量％的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(实施例1)，也供于以下稳定性评价试验。
(2)稳定性评价
将得到的喷雾干燥品分别放入gx薄膜袋(凸版印刷株式会社)，通过热封进行密封后，分别在-20℃和40℃的温度条件下保存1个月。测定保存后的蛋白质脱酰胺酶活性，作为相对于-20℃的蛋白质脱酰胺酶活性的40℃的蛋白质脱酰胺酶活性以百分率计导出残留活性(％)。
将无添加的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(比较例1)以及该重量比例分别为2.5重量％和6.5重量％的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(实施例2和实施例1)的稳定性评价的结果示于表2。如表2所示，在任一实施例的情况下，均确认蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的稳定化效果。如此，确认氯化镁对蛋白质脱酰胺酶干燥组合物发挥优异的稳定化效果。
[表2]
[试验例3：氯化镁和氯化钙的并用导致的粉体特性提高效果的验证]
(1)蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的制备
将“protein-glutaminase“amano”500”(天野酶株式会社制)(500u/g)溶解于水，使氯化镁，或者氯化镁和氯化钙以成为表3所示的配合量(相对于包含蛋白质脱酰胺酶、糊精和氯化镁的，或者进一步包含氯化钙的蛋白质脱酰胺酶制剂的总重量(干燥重量换算)的重量比例，以及蛋白质脱酰胺酶单位活性的蛋白质脱酰胺酶制剂的重量)的方式溶解，得到酶液。酶液使用1m盐酸和1m氢氧化钠调整为ph6(25℃)。
利用喷雾干燥器(eyelaspraydryersd-1000)将酶液(ph调整后)粉末化，作为喷雾干燥品得到蛋白质脱酰胺酶干燥组合物。
(2)稳定性评价
将得到的喷雾干燥品分别放入gx薄膜袋(凸版印刷株式会社)中，利用热密封进行密封后，分别在-20℃和40℃的温度条件下保存1个月。测定保存后的蛋白质脱酰胺酶活性，作为相对于-20℃的蛋白质脱酰胺酶活性的40℃的蛋白质脱酰胺酶活性以百分率计导出残留活性(％)。
(3)粉末特性评价
将得到的喷雾干燥品分别放入gx薄膜袋(凸版印刷株式会社)，通过热封进行密封后，在40℃的温度条件下保存1个月后，目视观察粉末的外观，基于以下的基准评价粉末特性。
○：未观察到凝结和潮解。
△：观察到轻度的凝结或潮解。
×：观察到重度的凝结或潮解。
将结果示于表3。在单独氯化镁的情况(实施例1)中观察到无添加的情况(比较例1)中未观察到的轻度凝结，但为作为酶干燥组合物可接受的程度。将单独氯化镁的情况(实施例1)和将氯化钙与氯化镁并用的情况(实施例3～5)进行比较，可确认稳定性存在降低趋势，但维持了优异的稳定性水平，除此之外，蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的凝结被抑制，粉末特性提高。
[表3]
[试验例4：溶液的ph对干燥组合物的稳定性产生的影响的验证]
(1)蛋白质脱酰胺酶干燥组合物的制备
将“protein-glutaminase“amano”500”(天野酶株式会社制)(500u/g)溶解于水，使氯化镁和氯化钙以成为表4所示的配合量(相对于包含蛋白质脱酰胺酶、糊精、氯化镁和氯化钙的蛋白质脱酰胺酶制剂的总重量(干燥重量换算)的重量比例，以及蛋白质脱酰胺酶单位活性的蛋白质脱酰胺酶制剂的重量)的方式溶解，得到酶液。应予说明，表4中记载了“无添加”的示例中得到不包含氯化镁和氯化钙的酶液。这些酶液使用1m盐酸和/或1m氢氧化钠将ph(25℃)调整为2、3、4、5、6、7和8。
利用喷雾干燥器(eyelaspraydryersd-1000)将酶液(ph调整后)粉末化，作为喷雾干燥品得到蛋白质脱酰胺酶干燥组合物。
应予说明，如果使得到的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(分别由ph2、3、4、5、6、7和8的酶液得到的物质)再次以成为1w/v％的方式再溶解于水时，再溶解后的ph(25℃)分别为2、3、4、5、6、7和8。
(2)稳定性评价
将得到的喷雾干燥品分别放入gx薄膜袋(凸版印刷株式会社)，通过热封进行密封后，分别在-20℃和40℃的温度条件下保存1个月。测定保存后的蛋白质脱酰胺酶活性，作为相对于-20℃的蛋白质脱酰胺酶活性的40℃的蛋白质脱酰胺酶活性以百分率计导出残留活性(％)。
将结果示于表4。在不包含氯化镁和氯化钙的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物中，酶液时的ph为2～4的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(实施例6～8)与酶液时的ph为5～8的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(比较例4～7)相比可确认高的稳定性。特别可确认酶液时的ph为2～3的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(实施例6～7)的稳定性显著高。另一方面，在含有氯化镁和氯化钙的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(实施例9～15)中，在以相同的酶液时的ph进行比较时，与无添加的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物(实施例6～8及比较例4～7)相比稳定性均提高。与无添加的蛋白质脱酰胺酶干燥组合物相比时的稳定性的提高的程度特别是在ph4～8的情况下显著。
[表4]
[试验例5：液态品的情况]
(1)蛋白质脱酰胺酶液态组合物的制备
将“protein-glutaminase“amano”500”(天野酶株式会社制)(500u/g)以brix成为25％的方式溶解于水，使氯化镁和氯化钙以成为表5所示的量(相对于蛋白质脱酰胺酶、糊精、氯化镁和氯化钙的总重量(干燥重量换算)的量、以及制成干燥制剂时的蛋白质脱酰胺酶单位活性的重量)的方式溶解，得到酶液。应予说明，在表6中记载为“无添加”的示例中得到不含氯化镁和氯化钙的酶液。酶液通过使用1m盐酸和/或1m氢氧化钠将ph(25℃)调整为6和7，由此得到蛋白质脱酰胺酶液组合物。
(2)稳定性评价
将得到的液态品放入聚丙烯管中，盖上盖子后，在40℃保存1个月。测定保存后的蛋白质脱酰胺酶活性，作为相对于保存前的蛋白质脱酰胺酶活性的保存后的蛋白质脱酰胺酶活性以百分率计导出残留活性(％)。
将结果示于表5。在液态组合物中，在无添加的液态组合物(比较例8～9)以及包含氯化镁和碳酸钙的液态组合物(比较例10～11)的任一者中，如果ph低，则稳定性降低。另一方面，如上述表4所示，在粉末组合物中，酶液时的ph越小则稳定性反而越高。即，确认在液态组合物和粉末组合物中，ph对稳定性产生的影响完全不同。
此外，包含氯化镁和氯化钙的液态组合物(比较例10～11)中，在以相同的ph进行比较时，与无添加的液态组合物(比较例8～9)相比，稳定性均降低。另一方面，如上述表1～表4所示，在粉末组合物中，与无添加的情况相比，包含氯化镁的情况或者包含氯化镁和氯化钙的情况的稳定性反而高。即，确认在液态组合物和干燥组合物中氯化镁和氯化钙对稳定性产生的影响完全不同。
[表5]
本发明优选的实施方式如上述所示，但本发明并不仅限定于这些实施方式，还可实施不脱离本发明的主旨的各种实施方式。
序列表
<110>天野酶制品株式会社
<120>稳定化蛋白质脱酰胺酶干燥组合物
<130>18058wo
<150>jp2017-171774
<151>2017-09-07
<160>2
<170>patentin3.5版本
<210>1
<211>320
<212>prt
<213>金黄杆菌
<400>1
metlysasnleupheleusermetmetalaphevalthrvalleuthr
151015
pheasnsercysalaaspserasnglyasnglngluileasnglylys
202530
glulysleuservalasnaspserlysleulysasppheglylysthr
354045
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505560
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65707580
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<211>185
<212>prt
<213>金黄杆菌
<400>2
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151015
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