结合剂的制作方法
本发明涉及与cd47(分化簇47，也称为整合素相关蛋白[iap])特异性结合的抗体分子及其医学用途。
背景技术：
cd47(也称为整合素相关蛋白[iap])是一种跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族并且与多种已知的伴侣结合，包括：膜整合素、血小板反应蛋白1(tsp-1)和信号调节蛋白α(sirpα)。cd47与一系列细胞过程相关，包括细胞的凋亡、增殖、粘附和迁移，重要的是，其在免疫和血管生成反应中起关键作用。cd47-sirpα信号传导是关键的分子相互作用，抑制巨噬细胞吞噬作用和其它髓样细胞的激活。这促进了肿瘤细胞的存活，因此充当了髓系谱系特异性免疫检查点。
临床前证据表明，在多种血液学和实体恶性肿瘤实验模型中，阻断cd47-sirpα信号传导可增强巨噬细胞的吞噬活性并抑制异种移植物的生长。由于巨噬细胞活性也是被认可为与炎症相关的组织重塑(例如组织纤维化和动脉粥样硬化斑块形成)的生物学因素，因此cd47-sirpα信号传导轴在非癌性疾病中也具有相当大的治疗潜力。因此，抗cd47mab具有在癌症和其它环境中充当免疫治疗剂和增强目前确立的疗法的有效性的潜力。
当前批准的大多数抗体治疗剂均来自免疫的啮齿动物。这些抗体中的许多已经经历了通过将鼠cdr“移植”到人v基因框架序列中的被称为“人源化”的过程(参见nelson等人,2010,natrevdrugdiscov9:767-774)。该过程通常是不精确的，并导致所得抗体的靶结合亲和力降低。为了返回原始抗体的结合亲和力，通常在接受移植的v结构域的可变结构域框架中的关键位置引入鼠残基(也称为“回复突变”)。
尽管已证明通过cdr移植和回复突变而人源化的抗体与具有完全鼠v结构域的抗体相比在临床上诱导较低的免疫应答率，但由于潜在的物理不稳定性和仍然存在于接受移植的cdr环中的免疫原性基序，使用这种基础移植方法人源化的抗体仍然具有重大的临床开发风险。靶向免疫细胞上的受体并且其药理学作用是通过抗原呈递来刺激免疫应答的抗体(例如cd47抑制剂)具有高的引起抗药物抗体应答的风险。患者体内的这些抗药物抗体应答会降低临床使用期间的药物半衰期、效力和安全性。由于蛋白质免疫原性的动物测试通常不能预测人中的免疫反应，因此用于治疗用途的抗体工程的重点在于使纯化的蛋白质中预测的人t细胞表位含量、非人种系氨基酸含量和聚集潜力最小化。
因此，理想的人源化拮抗性抗cd47抗体在v结构域中会具有尽可能多的与在充分表征的人种系序列的框架和cdr中发现的残基相同的残基。townsend等人(2015；pnas112:15354-15359)描述了一种产生抗体的方法，其中将源自大鼠、兔和小鼠抗体的cdr移植到优选的人框架中，然后进行称为“增强二元替代(augmentedbinarysubstitution)”的人种系化方法。尽管该方法在原始抗体互补位上显示出基本的可塑性，但在缺乏高度准确的抗体-抗原共晶体结构数据的情况下，仍然无法可靠地预测任何给定抗体的cdr环中的哪些残基可以转化对人类种系，以及以何种组合。
因此，cdr种系化是一个复杂的多因素问题，因为应优选保持分子的多种功能特性，包括在这种情况下：靶标结合特异性，对来自人和动物测试物种(例如食蟹猴，也称为食蟹猕猴，即macacafascicularis)二者的cd47的亲和力，v-结构域生物物理稳定性和/或igg表达产量。抗体工程研究表明，关键cdr中甚至单个残基位置的突变都可能对所有这些期望的分子特性产生显著影响。
wo2014/093678a2描述了称为“vxp037”的拮抗性鼠抗cd47igg分子，以及vxp037的人源化形式的制备。vxp037的那些人源化形式是使用经典的人源化技术产生的，即通过将kabat定义的鼠cdr移植到人重链和轻链框架序列中，其中一些人框架残基可能被回复突变为相应定位的vxp037鼠残基。由于上述原因，wo2014/093678a2中描述的vxp037的人源化形式不是理想的。
本发明提供了多种优化的抗cd47抗体及其医学用途。
技术实现要素：
根据本发明的一个方面，提供了与人cd47并且任选地还与食蟹猴cd47和/或小鼠cd47特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分，其中所述抗体分子或抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区具有：
hcdr1，该hcdr1在序列中具有以下顺序的氨基酸：g-y-t或任何氨基酸(例如s、n或r)-f-t或t的保守替换-n或n的保守替换-y-y-i或i的保守替换-f或任何氨基酸(例如v或g)(seqidno:1)；
hcdr2，该hcdr2在序列中具有以下顺序的氨基酸：m或m的保守替换-g-i或任何氨基酸(例如n、v或d)-i-n或任何氨基酸(例如y)-p-v或任何氨基酸(例如g或f)-d或d的保守替换-g或g的保守替换-d-t-n或n的保守替换(例如r)-y或y的保守替换-n或n的保守替换(例如s)-p-s-f-q-g(seqidno:2)；和
hcdr3，该hcdr3在序列中具有以下顺序的氨基酸：g-g-y或任何氨基酸(例如h、i、q或f)-t或任何氨基酸(例如v或i)-m或任何氨基酸(例如t、r、p、a或l)-d或任何氨基酸(例如g)-r或任何氨基酸(例如q、n、y、s、w、k、a、e、f、h、i、l、m、t或v)(seqidno:3)。
在本发明的一些方面，抗体分子或抗原结合部分的hcdr1可以排除序列gytftnyyvf(seqidno:4)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体hcdr1)和/或抗体分子或抗原结合部分的hcdr3分子可以排除序列ggytmdy(seqidno:5)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体hcdr3)。
抗体分子或抗原结合部分可进一步包含轻链可变区，所述轻链可变区具有：
lcdr1，该lcdr1在序列中具有以下顺序的氨基酸：r-s-s-q或q的保守替换-s-l或l的保守替换-l或l的保守替换-h-s-n或任何氨基酸(例如q、s、t、a或g)或n的保守替换(例如q、s、t或g)-g或g的保守替换(例如a)-y或任何氨基酸(例如n或s)-t或t的保守替换(例如n)-y-l-h或任何氨基酸(例如d)(seqidno:6)；
lcdr2，该lcdr2在序列中具有以下顺序的氨基酸：k或任何氨基酸(例如l或m)-v或任何氨基酸(例如g)-s-n或任何氨基酸(例如y)-r-l或任何氨基酸(例如f、a或s)-s(seqidno:7)；和
lcdr3，该lcdr3在序列中具有以下顺序的氨基酸：f或任何氨基酸(例如l、m、s、t或v)-q-q或任何氨基酸(例如n、a、t或s)-t或任何氨基酸(例如l、m或i)-h或h的保守替换-t或任何氨基酸(例如v、i、a或f)-p或任何氨基酸(例如l)-r或任何氨基酸(例如w)-t(seqidno:8)。
在本发明的一些方面，抗体分子或抗原结合部分的lcdr1可以排除序列rssqslvhsngntylh(seqidno:9)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr1)和/或抗体分子或抗原结合部分的lcdr2可以排除序列kvsyrfs(seqidno:10)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr2)和/或抗体分子或抗原结合部分的lcdr3可以排除序列sqnthvprt(seqidno:11)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr3)。
上文的cdr序列是使用“统一(unified)”定义进行定义的，如表1所示并在下文进行描述。替代地，本发明中的cdr序列可以使用较短的“aho”定义(参见表1)来定义，该定义基于结构生物学并且旨在统一所有免疫球蛋白v结构域的命名法。
使用较短的“aho”cdr定义，本发明一方面提供了与人cd47并且任选地还与食蟹猴cd47和/或小鼠cd47特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分，其中所述抗体分子或抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区具有：
hcdr1，该hcdr1在序列中具有以下顺序的氨基酸：g-s-g-y-t或任何氨基酸(例如s、n或r)-f-t或t的保守替换-n或n的保守替换-y-y(seqidno:12)；
hcdr2，该hcdr2在序列中具有以下顺序的氨基酸：i-n或任何氨基酸(例如y)-p-v或任何氨基酸(例如g或f)-d或d的保守替换-g或g的保守替换-d-t-n或n的保守替换(例如r)-y或y的保守替换-n或n的保守替换(例如s)-p-s-f-q-g(seqidno:13)；和
hcdr3，该hcdr3在序列中具有以下顺序的氨基酸：g-g-y或任何氨基酸(例如h、i、q或f)-t或任何氨基酸(例如v或i)-m或任何氨基酸(例如t、r、p、a或l)-d或任何氨基酸(例如g)(seqidno:14)。
使用aho定义，抗体分子或抗原结合部分的hcdr1可以排除序列gsgytftnyy(seqidno:15)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体hcdr1)和/或抗体分子或抗原结合部分的hcdr3可以排除序列ggytmd(seqidno:16)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体hcdr3)。
抗体分子或抗原结合部分可进一步包含轻链可变区，所述轻链可变区具有使用aho定义所定义的如下所示的cdr：
lcdr1，lcdr1在序列中具有以下顺序的氨基酸：s-s-q或q的保守替换-s-l或l的保守替换-l或l的保守替换-h-s-n或任何氨基酸(例如q、s、t、a或g)或n的保守替换(例如q、s、t或g)-g或g的保守替换(例如a)-y或任何氨基酸(例如n或s)-t或t的保守替换(例如n)-y(seqidno:17)；
lcdr2，该lcdr2在序列中具有以下顺序的氨基酸：k或任何氨基酸(例如l或m)-v或任何氨基酸(例如g)-s-n或任何氨基酸(例如y)-r-l或任何氨基酸(例如f、a或s)-s(seqidno:7)；和
lcdr3，该lcdr3在序列中具有以下顺序的氨基酸：q或任何氨基酸(例如n、a、t或s)-t或任何氨基酸(例如l、m或i)-h或h的保守替换-t或任何氨基酸(例如v、i、a或f)-p或任何氨基酸(例如l)-r或任何氨基酸(例如w)(seqidno:18)。
使用aho定义，在本发明的一些方面，抗体分子或抗原结合部分的lcdr1可以排除序列ssqslvhsngnty(seqidno:19)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr1)，和/或抗体分子或抗原结合部分的lcdr2可以排除序列kvsyrfs(seqidno:10)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr2)和/或抗体分子或抗原结合部分的lcdr3可以排除序列nthvpr(seqidno:20)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr3)。
根据本发明还提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包含与治疗剂连接的如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分。
在另一个方面，本发明提供了编码如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分的核酸分子。
还提供了包含本发明核酸分子的载体。
还提供了包含如本文所限定的本发明的核酸分子或载体的宿主细胞。
在另一个方面，提供了产生抗cd47抗体和/或其抗原结合部分的方法，该方法包括在导致抗体和/或其抗原结合部分表达和/或产生的条件下培养本发明的宿主细胞，和从宿主细胞或培养物中分离抗体和/或其抗原结合部分。
在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，该药物组合物包含如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的免疫缀合物、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体。
还提供了用于增强受试者中的免疫应答的方法，该方法包括施用有效量的如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的免疫缀合物、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体、或如本文所限定的本发明的药物组合物。
在另一个方面，提供了用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法包括施用有效量的如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的免疫缀合物、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体、或如本文所限定的本发明的药物组合物。
本发明还提供如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的免疫缀合物、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体、或如本文所限定的本发明的药物组合物，用于在治疗癌症中使用。
在另一个方面，本发明提供了如本文所限定使用的抗体分子、或其抗原结合部分、或免疫缀合物、或核酸分子、或载体，或者本发明的治疗方法，用于在与第二治疗剂(例如抗癌剂)的组合中分开、顺序或同时使用。
在另一个方面，提供了如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的免疫缀合物、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体、或如本文所限定的本发明的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中的缺血再灌注损伤、自身免疫疾病或炎性疾病的方法，该方法包括施用有效量的如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物。
在所有方面，自身免疫疾病或炎性疾病可选自由关节炎、多发性硬化症、银屑病、克罗恩病、炎性肠病、狼疮、格雷夫斯病和桥本甲状腺炎和强直性脊柱炎组成的组。
在所有方面，缺血再灌注损伤可能发生在器官移植、急性肾脏损伤、心肺转流术、肺动脉高压、镰状细胞病、心肌梗死、卒中、手术切除和重建手术、附件或其它身体部位的重新附着、皮肤移植或外伤。
还提供了如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物，用于在治疗缺血再灌注损伤、自身免疫疾病或炎性疾病中使用。
还提供了如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物在制备用于治疗缺血再灌注损伤、自身免疫疾病或炎性疾病的药物中的用途。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中的心血管疾病或纤维化疾病的方法，该方法包括施用有效量的如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物。
还提供了如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物，用于在治疗心血管疾病或纤维化疾病中使用。
还提供了如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物在制备用于治疗心血管疾病或纤维化疾病的药物中的用途。
本发明任何方面的心血管疾病可以例如是冠心病或动脉粥样硬化。
本发明任何方面的纤维化疾病可以选自由心肌梗死、心绞痛、骨关节炎、肺纤维化、囊性纤维化、支气管炎和哮喘组成的组。
本发明还提供了产生与人cd47并且还与食蟹猴cd47和/或小鼠cd47特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将来自非人来源的抗cd47cdr移植到人v结构域框架中，以产生人源化的抗cd47抗体分子或其抗原结合部分；
(2)产生在cdr中包含一个或多个突变的人源化抗cd47抗体分子或其抗原结合部分的克隆的噬菌体文库；
(3)筛选所述噬菌体文库与人cd47并且任选地还与食蟹猴cd47和/或与小鼠cd47的结合；
(4)从筛选步骤(3)中选择对人cd47并且任选地还对食蟹猴cd47和/或对小鼠cd47具有结合特异性的克隆；和
(5)从由步骤(4)选择的克隆产生与人cd47并且任选地还与食蟹猴cd47和/或与小鼠cd47特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分。
所述方法可以进一步包括基于步骤(4)中选择的克隆例如基于步骤(4)中选择的克隆的cdr中特定位置的进一步探索性诱变产生另外的克隆的步骤，以对于步骤(5)中产生的抗体分子或其抗原结合部分增强人源化和/或最小化人t细胞表位的含量和/或改善制备特性。
所述方法可以进一步包括以下步骤：评估步骤(4)中选择的克隆或步骤(5)中产生的抗体分子中一个或多个v结构域的免疫原性，并且任选地产生一个或多个另外的突变(例如在cdr和框架区中)以降低免疫原性。免疫原性可以通过鉴定t细胞表位的位置来评估，例如使用本文所述的计算机模拟技术。
附图说明
图1.文库来源的抗cd47scfv对人和小鼠cd47-fc蛋白的直接结合elisa。克隆来自3个独立的噬菌体选择分支(a显示分支aperiprepelisa，b显示分支bperiprepelisa，并且c显示分支cperiprepelisa)，其中在每轮中在生物素化的人、小鼠和/或食蟹猴cd47-fc蛋白上选择噬菌体群。在每轮选择后，利用人和小鼠cd47-fc筛选文库来源的克隆(黑色圆圈)。每轮的平均值±sd值用灰色条表示。在每个图中，x轴显示选择轮(“r”)，其中“h”表示人，而“m”表示小鼠，并且y轴显示结合信号(od450nm)。
图2.对于种系突变的cdr残基耐受性的分析。分别对于vh(a)和vl(b)结构域显示了854个独特的scfv克隆的elisa阳性群体的cdr中鼠氨基酸保留频率的图。除hcdr3中外，仅绘制了人/鼠残基诱变靶向的那些残基。在每个图中，cdr残基显示在x轴上，并且y轴显示每个鼠残基的保留百分比。在x轴上的括号中记录的cdr残基与用于移植的人种系(igkv2-28和ighv5-51)中发现的那些相同。hcdr2中那些不在括号中但其值设定为0的残基在移植过程中突变为人种系。在两个图中，75％处的灰色虚线表示人种系替代鼠残基的耐受性的截止值。
图3.与人、小鼠和食蟹猴cd-47蛋白结合的igg的直接滴定elisa。在直接结合elisa中用人、小鼠和食蟹猴cd47-fc蛋白滴定(以μg/ml计)人igg1null形式的嵌合抗cd47(mvh/mvl)、文库来源的克隆(a-h)。mvh/mvl、文库来源的克隆和设计者克隆mh显示出对cd47的所有3种直系同源物的结合活性。克隆vh-a1/vl-b1结合人和食蟹猴cd47，但不结合小鼠cd47。克隆ttp几乎失去了所结合功能。在每个图中，x轴显示igg浓度(以μg/ml计)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。
图4.基于elisa的cd47-fc-sirpα竞争测定。在经滴定的竞争者文库来源的先导(igg1null形式的a-d5、g-b6、d-h3和vh-a1/vl-b1)、作为阴性对照的同种型igg1和作为阳性对照的igg1null形式的mvh/mvl存在下，检测了人(a)、食蟹猴(b)和小鼠(c)cd47-fc蛋白与板结合的人sirpα的elisa结合信号。所有文库来源的igg和mvh/mvl都显示出与人、小鼠和食蟹猴cd47-fc蛋白结合的浓度依赖性降低，表明维持了共有的表位。值得注意的是，与mvh/mvl相比，克隆a-d5在小鼠cd47的中和中显示出显著增强的效力，并且vh-a1/vl-b1未表现出中和鼠cd47活性的能力。设计者克隆mh和ttp均未显示任何中和信号，为清楚起见，这里未作图。在每个图中，x轴显示抗体浓度(以nm计)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。在图例中，“ic”是指同种型对照。
图5.优先的先导克隆的结合特异性分析。通过每个x轴上标记的cd47-fc直系同源物和一组14种人免疫球蛋白超家族蛋白(“b”是指空白)的直接elisa，检查了igg1(a)和igg1null(b)形式的mvh/mvl以及igg1null形式的文库来源的先导a-d5(c)、vh-a1/vl-b1(d)、f-e7(e)、d-h3(f)和g-b6(g)的脱靶同源物结合风险。以1μg/ml的igg浓度进行与人、食蟹猴和鼠cd47-fc(h/c/mcd47-fc)的结合。以10μg/ml的igg浓度进行与所有其它蛋白质的结合。在每个图中，y轴显示结合信号(od450nm)。对于几乎所有的igg，观察到仅与hcd47-fc、mcd37-fc和ccd47-fc结合。对于任何其它人蛋白质，未观察到高于背景的结合。值得注意的是，克隆vh-a1/vl-b1再次不显示对鼠cd47的反应性。
图6.与人和食蟹猴cd47+cho-k1细胞的流式细胞术结合。检查了商业抗cd47抗体ms1991、人igg1(“iigg1”)和igg4(“iigg4”)同种型对照、igg1null(“igg1n”)和igg4(s228p)形式的先导文库来源的igg与食蟹猴转染cho-k1细胞(a)、人转染cho-k1细胞(b)和野生型(wt，即未转染)cho-k1细胞(c)的特异性结合。以24-100,000ng/ml范围的浓度测试igg。对于所有cd47特异性抗体观察到与人和食蟹猴细胞系的浓度依赖性结合，但对于同种型对照没有。对于大部分抗体观察到与野生型cho-k1细胞的高于背景的低水平结合信号，对于mvh/mvl来源的igg的显著更强的信号和对于vh-a1/vl-b1igg的特别低的信号。在每个图中，x轴显示每种测试的igg及其浓度(以ng/ml计)，并且y轴显示平均荧光强度(mfi)。
图7.与人hl60细胞结合的流式细胞术测试。检查了商业抗cd47抗体ms1991、人igg1和igg4同种型对照(分别为“iigg1”和“iigg4”)、igg1null(“igg1n”)和igg4(s228p)形式的先导文库来源的igg与hl60细胞上的特异性结合。以24-100000ng/ml范围的浓度测试igg。对于除了同种型对照以外的所有克隆均观察到浓度依赖性结合。在每个图中，x轴显示每种测试的igg及其浓度(以ng/ml计)，并且y轴显示平均荧光强度(mfi)。
图8.开发风险elisa。该测定表明，igg1null形式的a-d5、g-b6、d-h3、vh-a1/vl-b1和mvh/mvl抗体表现为对于带负电荷的生物分子胰岛素(a)、双链dna(dsdna)(b)和单链dna(ssdna)(c)几乎不结合或不结合。在每个图中，x轴显示igg浓度(μg/ml)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。如对于bococizumab和briakinumab类似物所观察到的与这些分子的强脱靶结合是治疗性抗体的临床性能较差的高风险指标。
图9.与人、小鼠和食蟹猴cd47-fc蛋白结合的设计者igg的直接滴定elisa。在直接结合elisa中用人(a)、食蟹猴(b)和小鼠(c)cd47-fc蛋白滴定(以μg/ml计)人igg1null形式的嵌合抗cd47(mvh/mvl)、设计者a-d5来源的克隆。在每个图中，x轴显示igg浓度(以μg/ml计)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。大部分克隆对cd47的所有三种直系同源物表现出结合活性，但是克隆a-d5.7对食蟹猴cd47仅显示出弱结合，并且克隆a-d5.10失去了对小鼠cd47的几乎所有结合功能。在图例中，“igg1ni”是指igg1null同种型。
图10.设计者igg的基于elisa的cd47-fc-sirpα竞争测定。在igg1null形式的经滴定的竞争者设计者igg、加上作为阴性对照的同种型igg1(通过“igg1ni”表示)和作为阳性对照的igg1null形式的mvh/mvl的存在下，检查了人(a)、食蟹猴(b)和小鼠(c)cd47-fc蛋白与板结合的人sirpα的elisa结合信号。在每个图中，x轴显示igg浓度(以nm计)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。值得注意的是，与mvh/mvl相比，数个a-d5来源的克隆再次显示出显著增强的中和小鼠cd47的效力。设计者克隆a-d5.7和a-d5.10对各直系同源物均未显示任何中和信号，对这些直系同源物它们显示出弱elisa结合信号，并且为清楚起见，此处未作图。
图11.与人、小鼠和食蟹猴cd47-fc蛋白结合的a-d5.4来源的设计者igg的直接滴定elisa。在直接结合elisa中用人(a)、食蟹猴(b)和小鼠(c)cd47-fc滴定(以μg/ml计)人igg1null形式的嵌合抗cd47(mvh/mvl)、设计者a-d5.4来源的克隆。在每个图中，x轴显示igg浓度(以μg/ml计)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。所有克隆对cd47的所有三种直系同源物表现出结合活性。在图例中，“igg1ni”是指igg1null同种型。
图12.设计者igg的基于elisa的cd47-fc-sirpα竞争测定。在igg1null形式的经滴定的竞争者设计者igg、加上作为阴性对照的同种型igg1(由“igg1ni”表示)和作为阳性对照的igg1null形式的mvh/mvl的存在下，检查了人(a)、食蟹猴(b)和小鼠(c)cd47-fc蛋白与板结合的人sirpα的elisa结合信号。在每个图中，x轴显示igg浓度(以nm计)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。值得注意的是，与mvh/mvl相比，数个a-d5.4来源的克隆再次显示出显著增强的中和小鼠cd47的效力。
图13.设计者克隆a-d5.4和a-d5.16的结合特异性分析。通过cd47-fc直系同源物和一组14种人免疫球蛋白超家族蛋白(如每个x轴上标记的，“b”是指空白)的直接elisa，检查了igg1null形式的a-d5.4(a)和a-d5.16(b)的脱靶同源物结合风险。以10μg/ml的igg浓度进行所有蛋白质的结合。在每个图中，y轴显示结合信号(od450nm)。对于两种igg，观察到仅与hcd47-fc、mcd37-fc和ccd47-fc结合。对于任何其它人蛋白质，未观察到高于背景的结合。
图14.设计者克隆a-d5.4和a-d5.16的开发风险elisa。该测定表明，igg1null形式的a-d5.4和a-d5.16表现出对于带负电荷的生物分子胰岛素(a)、双链dna(dsdna)(b)和单链dna(ssdna)(c)的低(低于阴性对照尤特克单抗)结合。在每个图中，x轴显示igg浓度(以μg/ml计)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。如对于bococizumab和briakinumab类似物所观察到的与这些分子的强脱靶结合是治疗性抗体的临床性能较差的高风险指标。
图15.文库来源的、设计者igg与cho-k1细胞的流式细胞术结合。检查了商业抗cd47抗体ms1991、人igg1和igg4同种型对照(分别由“iigg1”和“iigg4”表示)、以及igg1null和igg4形式的先导igga-d5、a-d5.4和a-d5.16与野生型(即未转染的)cho-k1细胞的特异性结合。以24-25,000ng/ml范围的浓度测试igg。对于igg1null和igg4两种形式的亲本mvh/mvl抗体观察到了浓度依赖性结合，但对于同种型对照、ms1991和两种igg形式的igga-d5、a-d5.4和a-d5.16观察到仅弱结合或没有结合。在每个图中，x轴显示igg浓度(以ng/ml计)，并且y轴显示mfi。
图16.与人hl60细胞结合的流式细胞术测试。检查了商业抗cd47抗体ms1991、人igg1和igg4同种型对照(分别由“iigg1”和“iigg4”表示)、igg1null和igg4(s228p)两种形式的先导igg与hl60细胞上的特异性结合。以24-100000ng/ml范围的浓度测试igg对于除了同种型对照以外的所有克隆均观察到浓度依赖性结合。在每个图中，x轴显示igg浓度(以ng/ml计)，并且y轴显示mfi。
图17.先导抗体v结构域中的t细胞表位肽含量。检查了mvh/mvl、a-d5、a-d5.4、a-d5.16和a-d5.16-di抗体的v结构域中种系(ge)表位、高亲和力外来(haf)表位、低亲和力外来(laf)表位和tced+t细胞受体表位的存在。发现mvh/mvl的vh和vl结构域两者均包含多个高风险人t细胞表位和很少的种系表位。在所有先导克隆中，高风险表位含量显著降低，并且种系表位含量显著提高。
图18.与人、小鼠和食蟹猴cd47-fc蛋白结合的a-d5.16和a-d5.16-di设计者igg的直接滴定elisa。在直接结合elisa中用人(a)、食蟹猴(b)和小鼠(c)cd47-fc蛋白滴定(以μg/ml计)人igg1null形式的嵌合抗cd47(mvh/mvl)、设计者a-d5.16和a-d5.16-di克隆。所有克隆对cd47的所有三种直系同源物表现出结合活性。在每个图中，x轴显示igg浓度(以μg/ml计)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。
图19.设计者igg的基于elisa的cd47-fc-sirpα竞争测定。在igg1null形式的经滴定的竞争者设计者igg、加上作为阴性对照的同种型igg1和作为阳性对照的igg1null形式的mvh/mvl的存在下，检查了人(a)、食蟹猴(b)和小鼠(c)cd47-fc蛋白与板结合的人sirpα的elisa结合信号。在每个图中，x轴显示抗体浓度(以nm计)，并且y轴显示结合信号(od450nm)。
图20.流式细胞术吞噬作用分析。(a)对于igg4(s228p)形式的克隆a-d5、a-d5.4、a-d5.16和mvh/mvl以及另外的igg1null形式的a-d5(由“igg1a-d5n”表示)，在多种浓度(如x轴所示)下进行人cd14+巨噬细胞对csfe标记的hl60细胞的吞噬作用的流式细胞术分析。x轴显示抗体浓度(μg/ml)，并且y轴显示cfse+且cd14+的细胞％。(b)然后对于10μg/ml的标准浓度的igg4形式的a-d5和mvh/mvl，对多个人巨噬细胞供体重复进行分析。x轴显示供体数，并且y轴显示cfse+和cd14+的细胞％。“v”表示溶媒。
具体实施方式
根据本发明的第一方面，提供了与人cd47并且任选地还与食蟹猴cd47和/或小鼠cd47特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分，其中所述抗体分子或抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区具有：
hcdr1，该hcdr1在序列中具有以下顺序的氨基酸：g-y-t或任何氨基酸(例如s、n或r)-f-t或t的保守替换-n或n的保守替换-y-y-i或i的保守替换-f或任何氨基酸(例如v或g)(seqidno:1)；
hcdr2，该hcdr2在序列中具有以下顺序的氨基酸：m或m的保守替换-g-i或任何氨基酸(例如n、v或d)-i-n或任何氨基酸(例如y)-p-v或任何氨基酸(例如g或f)-d或d的保守替换-g或g的保守替换-d-t-n或n的保守替换(例如r)-y或y的保守替换-n或n的保守替换(例如s)-p-s-f-q-g(seqidno:2)；和
hcdr3，该hcdr3在序列中具有以下顺序的氨基酸：g-g-y或任何氨基酸(例如h、i、q或f)-t或任何氨基酸(例如v或i)-m或任何氨基酸(例如t、r、p、a或l)-d或任何氨基酸(例如g)-r或任何氨基酸(例如q、n、y、s、w、k、a、e、f、h、i、l、m、t或v)(seqidno:3)。
在本发明的一些方面，抗体分子或抗原结合部分的hcdr1可以排除序列gytftnyyvf(seqidno:4)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体hcdr1)和/或抗体分子或抗原结合部分的hcdr3分子可以排除序列ggytmdy(seqidno:5)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体hcdr3)。
根据本发明的抗体分子或其抗原结合部分可进一步包含轻链可变区，所述轻链可变区具有：
lcdr1，该lcdr1在序列中具有以下顺序的氨基酸：r-s-s-q或q的保守替换-s-l或l的保守替换-l或l的保守替换-h-s-n或任何氨基酸(例如q、s、t、a或g)或n的保守替换(例如q、s、t或g)-g或g的保守替换(例如a)-y或任何氨基酸(例如n或s)-t或t的保守替换(例如n)-y-l-h或任何氨基酸(例如d)(seqidno:6)；
lcdr2，该lcdr2在序列中具有以下顺序的氨基酸：k或任何氨基酸(例如l或m)-v或任何氨基酸(例如g)-s-n或任何氨基酸(例如y)-r-l或任何氨基酸(例如f、a或s)-s(seqidno:7)；和
lcdr3，该lcdr3在序列中具有以下顺序的氨基酸：f或任何氨基酸(例如l、m、s、t或v)-q-q或任何氨基酸(例如n、a、t或s)-t或任何氨基酸(例如l、m或i)-h或h的保守替换-t或任何氨基酸(例如v、i、a或f)-p或任何氨基酸(例如l)-r或任何氨基酸(例如w)-t(seqidno:8)。
在本发明的一些方面，抗体分子或抗原结合部分的lcdr1可以排除序列rssqslvhsngntylh(seqidno:9)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr1)和/或抗体分子或抗原结合部分的lcdr2可以排除序列kvsyrfs(seqidno:10)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr2)和/或抗体分子或抗原结合部分的lcdr3可以排除序列sqnthvprt(seqidno:11)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr3)。
上文的cdr序列是使用“统一”定义进行定义的，如表1所示。替代地，本发明中的cdr序列可以使用较短的“aho”定义(参见表1)来定义，该定义基于结构生物学并且旨在统一所有免疫球蛋白v结构域的命名法。
使用较短的“aho”定义，本发明一方面提供了与人cd47并且任选地还与食蟹猴cd47和/或小鼠cd47特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分，其中所述抗体分子或抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区具有：
hcdr1，该hcdr1在序列中具有以下顺序的氨基酸：g-s-g-y-t或任何氨基酸(例如s、n或r)-f-t或t的保守替换-n或n的保守替换-y-y(seqidno:12)；
hcdr2，该hcdr2在序列中具有以下顺序的氨基酸：i-n或任何氨基酸(例如y)-p-v或任何氨基酸(例如g或f)-d或d的保守替换-g或g的保守替换-d-t-n或n的保守替换(例如r)-y或y的保守替换-n或n的保守替换(例如s)-p-s-f-q-g(seqidno:13)；和
hcdr3，hcdr3在序列中具有以下顺序的氨基酸：g-g-y或任何氨基酸(例如h、i、q或f)-t或任何氨基酸(例如v或i)-m或任何氨基酸(例如t、r、p、a或l)-d或任何氨基酸(例如g)(seqidno:14)。
使用aho定义，抗体分子或抗原结合部分的hcdr1可以排除序列gsgytftnyy(seqidno:15)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体hcdr1)和/或抗体分子或抗原结合部分的hcdr3可以排除序列ggytmd(seqidno:16)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体hcdr3)。
抗体分子或抗原结合部分可进一步包含轻链可变区，所述轻链可变区具有：
lcdr1，lcdr1在序列中具有以下顺序的氨基酸：s-s-q或q的保守替换-s-l或l的保守替换-l或l的保守替换-h-s-n或任何氨基酸(例如q、s、t、a或g)或n的保守替换(例如q、s、t或g)-g或g的保守替换(例如a)-y或任何氨基酸(例如n或s)-t或t的保守替换(例如n)-y(seqidno:17)；
lcdr2，该lcdr2在序列中具有以下顺序的氨基酸：k或任何氨基酸(例如l或m)-v或任何氨基酸(例如g)-s-n或任何氨基酸(例如y)-r-l或任何氨基酸(例如f、a或s)-s(seqidno:7)；和
lcdr3，该lcdr3在序列中具有以下顺序的氨基酸：q或任何氨基酸(例如n、a、t或s)-t或任何氨基酸(例如l、m或i)-h或h的保守替换-t或任何氨基酸(例如v、i、a或f)-p或任何氨基酸(例如l)-r或任何氨基酸(例如w)(seqidno:18)。
使用aho定义，在本发明的一些方面，抗体分子或抗原结合部分的lcdr1可以排除序列ssqslvhsngnty(seqidno:19)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr1)，和/或抗体分子或抗原结合部分的lcdr2可以排除序列kvsyrfs(seqidno:10)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr2)和/或抗体分子或抗原结合部分的lcdr3可以排除序列nthvpr(seqidno:20)(wo2014/093678a2中公开的vxp037鼠/人源化抗体lcdr3)。
如本文所述，本发明人首次成功使用源自wo2014/093678a2中公开的鼠抗cd47抗体vxp037的cdr序列产生了许多优化的抗cd47抗体分子。在本发明的一些实施方案中，已选择了对人cd47以及食蟹猴cd47并且对于一些克隆还对小鼠cd47具有结合特异性的这些抗体分子(以有利于在动物测试物种中的研究)。本文所述的优化抗体分子的进一步提炼提供了与cd47的小鼠直系同源物的结合改善，中和小鼠cd47-sirpα信号传导的效力改善，可变结构域稳定性改善，高表达产量和/或免疫原性降低。例如，我们在本文中证明，鼠抗cd47抗体vxp037的祖细胞分子在lcdr1和lcdr2中具有通过经典的人源化技术(例如wo2014/093678a2中所使用的)带来的两个主要的免疫原性风险，但是在本文所述的优化抗体分子中得以改善。
与包含seqidno:4(hcdr1)、123(hcdr2)、5(hcdr3)、9(lcdr1)、10(lcdr2)和11(lcdr3)的cdr序列的抗体分子相比，本发明的抗体分子或抗原结合部分可以具有改善的计算机模拟免疫原性。
与包含seqidno:4(hcdr1)、123(hcdr2)、5(hcdr3)、9(lcdr1)、10(lcdr2)和11(lcdr3)的cdr序列的抗体分子相比，本发明的抗体分子或抗原结合部分可以不表现出与仓鼠cd47的结合，或表现出与仓鼠cd47的结合降低。例如，与包含seqidno:4(hcdr1)、123(hcdr2)、5(hcdr3)、9(lcdr1)、10(lcdr2)和11(lcdr3)的cdr序列的抗体相比，本发明的抗体分子或抗原结合部分可以不表现出与cho细胞结合(如通过流式细胞术测量的)，或者表现出与cho细胞的结合降低(如通过流式细胞术测量的)。如图15所示，本发明的代表性抗体分子与cho细胞几乎没有或没有交叉反应性，而igg1null或igg4形式的克隆mvh/mvl的原始鼠v结构域驱动强烈的浓度依赖性的与cho细胞的结合。
本发明优选的优化的抗cd47抗体分子不一定在相应的鼠cdr或其它(例如框架)氨基酸位置具有最大数目的人种系替换。如在下文实验部分详述的，我们发现就抗cd47结合特征和/或其它期望特征而言，“最大人源化的”抗体分子未必是“最大优化的”。
本发明包括对如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分的氨基酸序列的修饰。例如，本发明包括包含不会显著影响其性质的功能等同的可变区和cdr的抗体分子及其相应的抗原结合部分，以及具有增强或降低的活性和/或亲和力的变体。例如，可以使氨基酸序列突变以获得对cd47具有期望结合亲和力的抗体。设想了插入，插入包括氨基末端和/或羧基末端的长度从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽的融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有n-末端甲硫氨酰残基的抗体分子或与表位标签融合的抗体分子。抗体分子的其它插入变体包括酶或多肽与抗体的n-或c-末端的融合，这提高了抗体在血液循环中的半衰期。
本发明的抗体分子或抗原结合部分可包含糖基化和非糖基化多肽，以及具有其它翻译后修饰的多肽，例如，利用不同糖的糖基化、乙酰化和磷酸化。可以使本发明的抗体分子或抗原结合部分突变以改变这种翻译后修饰，例如通过添加、去除或替换一个或多个氨基酸残基以形成或去除糖基化位点。
可以例如通过氨基酸替换对本发明的抗体分子或抗原结合部分进行修饰以去除抗体中潜在的蛋白水解位点。
在抗体分子或其抗原结合部分中，hcdr1可以具有氨基酸序列：g-y-t/s/n/r-f-t/n-n/s-y-y-i/v-f/v/g(seqidno:21)；hcdr2可以具有氨基酸序列：m/i-g-v/n/i/d-i-n/y-p-v/g/f-n/d-g/s-d-t-n/r/k-f/y-n/s-p-s-f-q-g(seqidno:22)；并且hcdr3可以具有氨基酸序列：g-g-f/h/i/q/y-t/v/i-m/t/r/p/a/l-d/g-y/q/n/r/s/w/k/a/e/f/h/i/l/m/t/v(seqidno:23)。或者，使用aho定义，在抗体分子或其抗原结合部分中，hcdr1可以具有氨基酸序列：g-s-g-y-t/s/n/r-f-t/n-n/s-y-y(seqidno:24)；hcdr2可以具有氨基酸序列：i-n/y-p-v/g/f-n/d-g/s-d-t-n/r/k-f/y-n/s-p-s-f-q-g(seqidno:25)；并且hcdr3可以具有氨基酸序列：g-g-f/h/i/q/y-t/v/i-m/t/r/p/a/l-d/g(seqidno:26)。
例如，hcdr1可以具有氨基酸序列：g-y-t/s-f-t-n-y-y-i-f(seqidno:27)；hcdr2可以具有氨基酸序列：m/i-g-i/d-i-n-p-v-n/d-g-d-t-n/r-f/y-n/s-p-s-f-q-g(seqidno:28)；并且hcdr3可以具有氨基酸序列：g-g-f/y-t-m/p-d-y/r/k/i(seqidno:29)。或者，使用aho定义，hcdr1可以具有氨基酸序列：g-s-g-y-t/s-f-t-n-y-y(seqidno:30)；hcdr2可以具有氨基酸序列：i-n-p-v-n/d-g-d-t-n/r-f/y-n/s-p-s-f-q-g(seqidno:31)；并且hcdr3可以具有氨基酸序列：g-g-f/y-t-m/p-d(seqidno:32)。
在抗体分子或其抗原结合部分中，lcdr1可以具有氨基酸序列：r-s-s-q/h-s-f/l-l/v-h-s-n/q/a-g/a-y/n/s-n/t-y-l-h/d(seqidno:33)；lcdr2可以具有氨基酸序列：l/k/m-v/g-s-n/y-r-a/f/l/s-s(seqidno:34)；并且lcdr3可以具有氨基酸序列：f/l/m/s/t/v-q-q/n/a/t/s-t/l/m/i-q/h-t/v/i/a/f-p/l-r/w-t(seqidno:35)。或者，使用aho定义，在抗体分子或其抗原结合部分中，lcdr1可以具有氨基酸序列：s-s-q/h-s-f/l-l/v-h-s-n/q/a-g/a-y/n/s-n/t-y(seqidno:36)；lcdr2可以具有氨基酸序列：l/k/m-v/g-s-n/y-r-a/f/l/s-s(seqidno:34)；并且lcdr3可以具有氨基酸序列：q/n/a/t/s-t/l/m/i-q/h-t/v/i/a/f-p/l-r/w(seqidno:37)。
例如，lcdr1可以具有氨基酸序列：r-s-s-q-s-l-l/v-h-s-n/q/a-g-y/n-n/t-y-l-h/d(seqidno:38)；lcdr2可以具有氨基酸序列：l/k-v/g-s-n/y-r-a/f/l-s(seqidno:39)；并且lcdr3可以具有氨基酸序列：f/s-q-q/n/a-t/l-q/h-t/v-p-r-t(seqidno:40)。或者，使用aho定义，lcdr1可以具有氨基酸序列：s-s-q-s-l-l/v-h-s-n/q/a-g-y/n-n/t-y(seqidno:41)；lcdr2可以具有氨基酸序列：l/k-v/g-s-n/y-r-a/f/l-s(seqidno:39)；并且lcdr3可以具有氨基酸序列：q/n/a-t/l-q/h-t/v-p-r(seqidno:42)。
在本发明的一些具体实施方案中，如使用统一cdr所定义的，抗体分子或抗原结合部分可包含：
(a)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgdinpvngdtnyspsfqg(seqidno:44)(hcdr2)、ggytpdy(seqidno:45)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、kgsnrfs(seqidno:47)(lcdr2)和sqnlhvprt(seqidno:48)(lcdr3)[克隆d-h3]；或
(b)氨基酸序列gytftnyyif(seqidno:49)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngytylh(seqidno:52)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5]；或
(c)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、igdinpvngdtnfspsfqg(seqidno:55)(hcdr2)、ggytmdk(seqidno:56)(hcdr3)、rssqslvhsngytylh(seqidno:57)(lcdr1)、kgsyras(seqidno:58)(lcdr2)和sqntqtprt(seqidno:59)(lcdr3)[克隆g-b6]；或
(d)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvngdtnynpsfqg(seqidno:60)(hcdr2)、ggytmgk(seqidno:61)(hcdr3)、rssqslvhsngntyld(seqidno:62)(lcdr1)、kgsyrfs(seqidno:63)(lcdr2)和sqathtprt(seqidno:64)(lcdr3)[克隆f-e7]；或
(e)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggftmdy(seqidno:66)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、kgsnras(seqidno:67)(lcdr2)和sqnthtprt(seqidno:68)(lcdr3)[克隆vh-a1/vl-b1]；或
(f)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、igiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:69)(hcdr2)、ggytmdi(seqidno:70)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、lgsnrfs(seqidno:71)(lcdr2)和sqntqtprt(seqidno:59)(lcdr3)[克隆mh]；或
(g)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggytmdi(seqidno:70)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、lgsnras(seqidno:72)(lcdr2)和sqatqtprt(seqidno:73)(lcdr3)[克隆ttp]；或
(h)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngytylh(seqidno:52)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.1]；或
(i)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtrynpsfqg(seqidno:74)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngytylh(seqidno:52)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.2]；或
(j)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngytylh(seqidno:52)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.3]；或
(k)氨基酸序列gytftnyyif(seqidno:49)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.4]；或
(l)氨基酸序列gytftnyyif(seqidno:49)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、kgsnrls(seqidno:75)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.5]；或
(m)氨基酸序列gytftnyyif(seqidno:49)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、kgsnrls(seqidno:75)(lcdr2)和fqntqtprt(seqidno:76)(lcdr3)[克隆a-d5.6]；或
(n)氨基酸序列gytftnyyif(seqidno:49)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、lgsnrls(seqidno:77)(lcdr2)和fqntqtprt(seqidno:76)(lcdr3)[克隆a-d5.7]；或
(o)氨基酸序列gytftnyyif(seqidno:49)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsqgytylh(seqidno:78)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.8]；或
(p)氨基酸序列gytftnyyif(seqidno:49)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngytylh(seqidno:52)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqqthtprt(seqidno:79)(lcdr3)[克隆a-d5.9]；或
(q)氨基酸序列gytftnyyif(seqidno:49)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsqgytylh(seqidno:78)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqqthtprt(seqidno:79)(lcdr3)[克隆a-d5.10]；或
(r)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.11]；或
(s)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtrynpsfqg(seqidno:74)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.12]；或
(t)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngynylh(seqidno:46)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.13]；或
(u)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhssgynylh(seqidno:80)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.14]；或
(v)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsggynylh(seqidno:81)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.15]；或
(w)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsagynylh(seqidno:82)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.16]；或
(x)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhstgynylh(seqidno:83)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.17]；或
(y)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsnaynylh(seqidno:84)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.18]；或
(z)氨基酸序列gysftnyyif(seqidno:43)(hcdr1)、mgiinpvdgdtryspsfqg(seqidno:65)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsagynylh(seqidno:82)(lcdr1)、kvsnrfs(seqidno:85)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5.16-di]；或
(z.1)氨基酸序列gytftnyyif(seqidno:49)(hcdr1)、mgiinpvdgdtnynpsfqg(seqidno:50)(hcdr2)、ggytmdr(seqidno:51)(hcdr3)、rssqsllhsngytylh(seqidno:52)(lcdr1)、kvsnrfs(seqidno:85)(lcdr2)和fqnthtprt(seqidno:54)(lcdr3)[克隆a-d5-di]。
在本发明的上述具体实施方案中，cdr可替代地使用ahocdr定义来定义，使得抗体分子或抗原结合部分包含：
(a)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvngdtnyspsfqg(seqidno:87)(hcdr2)、ggytpd(seqidno:88)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、kgsnrfs(seqidno:47)(lcdr2)和nlhvpr(seqidno:90)(lcdr3)[克隆d-h3]；或
(b)氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyty(seqidno:92)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5]；或
(c)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvngdtnfspsfqg(seqidno:94)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqslvhsngyty(seqidno:95)(lcdr1)、kgsyras(seqidno:58)(lcdr2)和ntqtpr(seqidno:96)(lcdr3)[克隆g-b6]；或
(d)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvngdtnynpsfqg(seqidno:97)(hcdr2)、ggytmg(seqidno:98)(hcdr3)、ssqslvhsngnty(seqidno:19)(lcdr1)、kgsyrfs(seqidno:63)(lcdr2)和athtpr(seqidno:99)(lcdr3)[克隆f-e7]；或
(e)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggftmd(seqidno:101)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、kgsnras(seqidno:67)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆vh-a1/vl-b1]；或
(f)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、lgsnrfs(seqidno:71)(lcdr2)和ntqtpr(seqidno:96)(lcdr3)[克隆mh]；或
(g)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、lgsnras(seqidno:72)(lcdr2)和atqtpr(seqidno:102)(lcdr3)[克隆ttp]；或
(h)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyty(seqidno:92)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.1]；或
(i)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtrynpsfqg(seqidno:103)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyty(seqidno:92)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.2]；或
(j)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyty(seqidno:92)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.3]；或
(k)氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.4]；或
(l)氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、kgsnrls(seqidno:75)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.5]；或
(m)氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、kgsnrls(seqidno:75)(lcdr2)和ntqtpr(seqidno:96)(lcdr3)[克隆a-d5.6]；或
(n)氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、lgsnrls(seqidno:77)(lcdr2)和ntqtpr(seqidno:96)(lcdr3)[克隆a-d5.7]；或
(o)氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsqgyty(seqidno:104)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.8]；或
(p)氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyty(seqidno:92)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和qthtpr(seqidno:105)(lcdr3)[克隆a-d5.9]；或
(q)氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsqgyty(seqidno:104)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和qthtpr(seqidno:105)(lcdr3)[克隆a-d5.10]；或
(r)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.11]；或
(s)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtrynpsfqg(seqidno:103)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.12]；或
(t)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyny(seqidno:89)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.13]；或
(u)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhssgyny(seqidno:106)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.14]；或
(v)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsggyny(seqidno:107)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.15]；或
(w)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsagyny(seqidno:108)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.16]；或
(x)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhstgyny(seqidno:109)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.17]；或
(y)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsnayny(seqidno:110)(lcdr1)、kvsnrls(seqidno:53)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.18]；或
(z)氨基酸序列gsgysftnyy(seqidno:86)(hcdr1)、inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsagyny(seqidno:108)(lcdr1)、kvsnrfs(seqidno:85)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5.16-di]；或
(z.1)氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)(hcdr1)、inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)(hcdr2)、ggytmd(seqidno:16)(hcdr3)、ssqsllhsngyty(seqidno:92)(lcdr1)、kvsnrfs(seqidno:85)(lcdr2)和nthtpr(seqidno:93)(lcdr3)[克隆a-d5-di]。
本发明的抗体分子或抗原结合部分(使用aho定义所定义)可包含：
hcdr1，该hcdr1具有氨基酸序列gsgytftnyy(seqidno:15)或gsgysftnyy(seqidno:86)；
hcdr2，该hcdr2具有氨基酸序列inpvdgdtnynpsfqg(seqidno:91)或inpvdgdtryspsfqg(seqidno:100)；和
hcdr3，该hcdr3具有氨基酸序列ggytmd(seqidno:16)，并且任选地进一步包含：
lcdr1，该lcdr1具有氨基酸序列ssqsllhsngyny(seqidno:89)或ssqsllhsngyty(seqidno:92)或ssqsllhsagyny(seqidno:108)；
lcdr2，该lcdr2具有氨基酸序列kvsnrls(seqidno:53)或kvsnrfs(seqidno:85)；和
lcdr3，该lcdr3具有氨基酸序列nthtpr(seqidno:93)。
上述抗体分子或抗原结合部分可替代地使用本文公开的等效统一cdr定义来定义。
在本发明的一些具体实施方案中，抗体分子或抗原结合部分可包含如上定义的克隆a-d5、克隆a-d5.4或克隆a-d5.16或克隆a-d5.16-di或克隆a-d5-di的六个cdr序列，或来自这些克隆中的每一个的cdr序列的合适组合。
例如，在使用统一cdr定义所定义的抗体分子或抗原结合部分中，hcdr1可以具有氨基酸序列：g-y-t/s-f-t-n-y-y-i-f(seqidno:27)；hcdr2可以具有氨基酸序列：m-g-i-i-n-p-v-d-g-d-t-n/r-y-n/s-p-s-f-q-g(seqidno:111)；hcdr3可以具有氨基酸序列：g-g-y-t-m-d-r(seqidno:51)；lcdr1可以具有氨基酸序列：r-s-s-q-s-l-l-h-s-n/a-g-y-n/t-y-l-h(seqidno:112)；lcdr2可以具有氨基酸序列：k-v-s-n-r-l/f-s(seqidno:113)；并且lcdr3可以具有氨基酸序列：f-q-n-t-h-t-p-r-t(seqidno:54)。
或者，在使用aho定义所定义的抗体分子或抗原结合部分中，hcdr1可以具有氨基酸序列：g-s-g-y-t/s-f-t-n-y-y(seqidno:30)；hcdr2可以具有氨基酸序列：i-n-p-v-d-g-d-t-n/r-y-n/s-p-s-f-q-g(seqidno:114)；hcdr3可以具有氨基酸序列：g-g-y-t-m-d(seqidno:16)；lcdr1可以具有氨基酸序列：s-s-q-s-l-l-h-s-n/a-g-y-n/t-y(seqidno:115)；lcdr2可以具有氨基酸序列：k-v-s-n-r-l/f-s(seqidno:113)；并且lcdr3可以具有氨基酸序列：n-t-h-t-p-r(seqidno:93)。
如本文所限定的抗体分子或抗原结合部分可包含一个或多个替换、缺失和/或插入，其去除翻译后修饰(ptm)位点，例如糖基化位点(n-连接或o-连接)、脱酰胺位点、磷酸化位点或异构化/片段化位点。
已知超过350种类型的ptm。ptm的关键形式包括磷酸化、糖基化(n-和o-连接的)、类泛素化(sumoylation)、棕榈酰化、乙酰化、硫酸化、豆蔻酰化、异戊烯化和甲基化(k和r残基)。鉴定负责特定ptm的推定氨基酸位点的统计学方法是本领域熟知的(参见zhou等人,2016,natureprotocols1:1318-1321)。考虑了通过例如替换、缺失和/或插入而去除这样的位点，然后任选地(以实验方式和/或以理论方式)测试(a)结合活性和/或(b)ptm的损失。
例如，已经鉴定出vxp037鼠lcdr1(如本文所限定，即氨基酸序列rssqslvhsngntylh(seqidno:9))在残基10(n)和/或12(n)处具有推定的脱酰胺位点。设想了例如通过保守替换(例如s、a、q或d)去除在本发明的lcdr1中等效位置的这两个位点中的任一个(例如在表3和4中的克隆a-d5.8、克隆a-d5和其它克隆，或表5中的克隆a-d5.11至a-d5.18)。
类似地，已经鉴定出vxp037鼠lcdr3(如本文所限定，即氨基酸序列sqnthvprt(seqidno:11))在残基3(n)处具有推定的脱酰胺位点。设想了例如通过保守或非保守替换(例如a、s、h、d、t、k、g、e、q或r)去除在本发明的lcdr3中等效位置的该位点(例如在表3和4中的克隆f-e7和其它克隆中)。
类似地，已鉴定出vxp037鼠hcdr3(如本文所限定，即氨基酸序列ggytmdy(seqidno:5))在残基5(m)处具有推定的氧化位点。设想了例如通过保守或非保守替换(例如p、a、t、s、l、f、w、v、i、y或r)去除在本发明的hcdr3中等效位置的该位点(例如，在表3和4中的克隆d-h3和其它克隆中)。
抗体分子或其抗原结合部分可以是人的、人源化的或嵌合的。
抗体分子或其抗原结合部分可以包含其中已插入了cdr的一个或多个人可变结构域框架支架。
抗体分子或其抗原结合部分可以包含其中已插入了相应的hcdr序列的ighv5-51人种系支架。
抗体分子或其抗原结合部分可以包含其中已插入了相应的lcdr序列的igkv2-28人种系支架。
抗体分子或其抗原结合部分可包含免疫惰性恒定区。
抗体分子或其抗原结合部分可以是fab片段、f(ab)2片段、fv片段、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体(例如，二价抗体)、单结构域抗体(例如，鲨鱼抗体[vnar抗体]或其片段，或骆驼科动物抗体[vhh抗体]或其片段)、单克隆抗体或融合蛋白。抗体分子及其构建和使用方法描述于例如holliger和hudson(2005,naturebiotechnol.23(9):1126-1136)中。
在本发明的另一个方面，提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包含与治疗剂连接的如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分。
合适的治疗剂的实例包括细胞毒素、放射性同位素、化学治疗剂、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂以及细胞抑制剂和溶细胞酶(例如rna酶)。其它治疗剂包括治疗性核酸，例如编码免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂或促凋亡剂的基因。这些药物叙述不是相互排斥的，因此可以使用一个或多个上述术语描述治疗剂。
用于在免疫缀合物中使用的合适治疗剂的实例包括紫杉烷、美登素、cc-1065和倍癌霉素(duocarmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)和其它烯二炔(enediyne)，和奥利斯他汀(auristatin)。其它实例包括抗叶酸、长春花生物碱和蒽环类。植物毒素、其它生物活性蛋白质、酶(即adept)、放射性同位素、光敏剂也可用于免疫缀合物中。另外，可以使用第二载体作为细胞毒性剂(例如脂质体或聚合物)制备缀合物。合适的细胞毒素包括抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的试剂。代表性的细胞毒素包括抗生素，微管蛋白聚合的抑制剂，结合和破坏dna的烷化剂，以及破坏蛋白质合成或必需细胞蛋白质(例如蛋白激酶、磷酸酶、拓扑异构酶、酶和细胞周期蛋白)的功能的试剂。
代表性的细胞毒素包括但不限于多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、表柔比星(epirubicin)、卡柔比星(carubicin)、诺加霉素(nogalamycin)、美诺立尔(menogaril)、吡柔比星(pitarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、三氟尿嘧啶(trifluridine)、安西他滨(ancitabine)、依诺他滨(enocitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、脱氧氟尿苷(doxifluhdine)、喷司他丁(pentostatin)、溴尿苷(broxuhdine)、卡培他滨(capecitabine)、克拉屈滨(cladhbine)、地西他滨(decitabine)、氟尿苷(floxuhdine)、氟达拉滨(fludarabine)、谷氏菌素(gougerotin)、嘌呤霉素(puromycin)、替加氟(tegafur)、噻唑呋林(tiazofuhn)、阿霉素(adhamycin)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博来霉素(bleomycin)、氮芥(mechlorethamine)、泼尼松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧啶(flurouracil)、依托泊苷(etoposide)、紫杉醇(taxol)、紫杉醇类似物、铂(例如顺铂和卡铂)、丝裂霉素(mitomycin)、塞替派(thiotepa)、紫杉烷(taxane)、长春新碱、柔红霉素、表柔比星、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、伊达比星、海兔毒素/奥利斯他汀(dolastatin/auristatin)、哈米特林(hemiasterlin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)和美登素类化合物(maytansinoids)。
合适的免疫调节剂包括阻断对肿瘤的激素作用的抗激素，以及抑制细胞因子产生、下调自身抗原表达或掩蔽mhc抗原的免疫抑制剂。
还提供了编码如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分的核酸分子。
还提供了包含如本文所限定的本发明的核酸分子的载体。
还提供了包含如本文所限定的本发明的核酸分子或载体的宿主细胞。
在另一个方面，提供了产生抗cd47抗体和/或其抗原结合部分的方法，包括在导致抗体和/或其抗原结合部分表达和/或产生的条件下培养本发明的宿主细胞，和从宿主细胞或培养物中分离抗体和/或其抗原结合部分。
在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，该药物组合物包含如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体。
还提供了用于增强受试者中的免疫应答的方法，该方法包括施用有效量的如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的免疫缀合物、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体、或如本文所限定的本发明的药物组合物。
在另一个方面，提供了用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法包括施用有效量的如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的免疫缀合物、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体、或如本文所限定的本发明的药物组合物。
癌症可以例如选自由胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤和血液组织癌组成的组。
本发明还提供了如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的免疫缀合物、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体、或如本文限定的本发明的药物组合物，用于在治疗癌症中使用。
在另一个方面，本发明提供了如本文所限定使用的抗体分子、或其抗原结合部分、或免疫缀合物、或核酸分子、或载体，或者本发明的治疗方法，用于在与第二治疗剂(例如抗癌剂)的组合中分开、顺序或同时使用。
在另一个方面，提供了如本文所限定的本发明的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的本发明的免疫缀合物、或如本文所限定的本发明的核酸分子、或如本文所限定的本发明的载体、或如本文所限定的本发明的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中的缺血再灌注损伤、自身免疫疾病或炎性疾病的方法，该方法包括施用有效量的如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物。
在所有方面，缺血再灌注损伤可能发生在器官移植、急性肾损伤、心肺转流术、肺动脉高压、镰状细胞病、心肌梗死、卒中、手术切除和重建手术、附件或其它身体部位的重新附着、皮肤移植或外伤。
自身免疫疾病或炎性疾病可选自由关节炎、多发性硬化症、银屑病、克罗恩病、炎性肠病、狼疮、格雷夫斯病和桥本甲状腺炎和强直性脊柱炎组成的组。
还提供了如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物，用于在治疗缺血再灌注损伤、自身免疫疾病或炎性疾病中使用。
还提供了如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物在制备用于治疗缺血再灌注损伤、自身免疫疾病或炎性疾病的药物中的用途。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中的心血管疾病或纤维化疾病的方法，该方法包括施用有效量的如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物。
还提供了如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物，用于在治疗心血管疾病或纤维化疾病中使用。
还提供了如本文所限定的抗体分子或其抗原结合部分、或如本文所限定的免疫缀合物、或如本文所限定的核酸分子、或如本文所限定的载体、或如本文所限定的药物组合物在制备用于治疗心血管疾病或纤维化疾病的药物中的用途。
本发明任何方面的心血管疾病可以例如是冠心病或动脉粥样硬化。
本发明任何方面的纤维化疾病可以选自由心肌梗死、心绞痛、骨关节炎、肺纤维化、哮喘、囊性纤维化和支气管炎组成的组。
本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是进入药物组合物的化合物或化合物的组合，它们不会引起继发反应并且例如允许促进抗cd47抗体分子的施用，提高其寿命和/或其在体内的效力，或增加其在溶液中的溶解度。这些药学上可接受的溶媒是众所周知的，并且本领域技术人员将根据抗cd47抗体分子的施用方式进行调整。
在一些实施方案中，抗cd47抗体分子可以以冻干形式提供，用于在施用前重构。例如，冻干的抗体分子可以在向个体施用之前在无菌水中重构并与生理盐水混合。
抗cd47抗体分子通常以药物组合物的形式施用，除抗体分子外，药物组合物可以还包含至少一种组分。因此，除抗cd47抗体分子外，药物组合物可以还包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它材料。这些材料应该是无毒的并且不应干扰抗cd47抗体分子的功效。载体或其它材料的确切性质将取决于施用途径，其可以通过如下所述的推注、输注、注射或任何其它合适的途径。
对于肠胃外(例如皮下或静脉内)施用，例如通过注射，包含抗cd47抗体分子的药物组合物可以是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗溶媒制备合适的溶液，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液。可根据需要使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂，包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双铵(hexamethoniumchloride)；苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)；苯索氯铵(benzethoniumchloride)；苯酚、丁基醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3’-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如tweentm，pluronicstm或聚乙二醇(peg)。
包含抗cd47抗体分子的药物组合物可以单独施用或与其它治疗组合施用，根据待治疗的病症同时或顺序地进行。
如本文所述的抗cd47抗体分子可用于治疗人体或动物体的方法，包括预防性或预防性治疗(例如在个体中病症发作之前进行治疗以降低个体中病症发生的风险；延迟其发作；或在发作后降低其严重程度)。治疗方法可包括向有此需要的个体施用抗cd47抗体分子。
施用通常以“治疗有效量”，其足以显示对患者的益处。这样的益处可以是至少一种症状的至少改善。施用的实际量、施用的比率和时间过程将取决于所治疗病症的性质和严重程度，所治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，疾病的原因，组合物的递送部位，施用方法，施用方案和医师已知的其它因素。治疗的处方(例如关于剂量等的决定)由全科医生和其它医生负责，并且可能取决于症状的严重程度和/或所治疗疾病的进展。抗体分子的合适剂量是本领域熟知的(ledermannj.a.等人,1991,int.j.cancer47:659-664；bagshawek.d.等人,1991,antibody,immunoconjugatesandradiopharmaceuticals4:915-922)。具体剂量可以在本文中或在physician'sdeskreference(2003)中指出，适合于可以使用所施用的药物类型。抗体分子的治疗有效量或合适剂量可以通过比较其体外活性和在动物模型中的体内活性来确定。用于将小鼠和其它试验动物中的有效剂量外推至人类的方法是已知的。精确剂量将取决于许多因素，包括抗体是用于预防还是用于治疗，待治疗区域的大小和位置，抗体的确切性质(例如完整抗体、片段)以及与抗体连接的任何可检测标签或其它分子的性质。
典型的抗体剂量对于全身应用为100μg至1g，并且对于局部应用为1μg至1mg。可以施用首次较高的负荷剂量，然后施用一次或多次较低剂量。通常，抗体是完整抗体，例如igg1或igg4同种型。这是针对成年患者的单次治疗的剂量，其可以针对儿童和婴儿按比例调整，并且还针对与分子量成比例的其它抗体形式进行调整。治疗可以每天、每周两次、每周或每月的间隔重复，这由医生决定。个体的治疗方案可取决于抗体组合物的药代动力学和药效学特性、施用途径和所治疗病症的性质。
治疗可以是周期性的，并且施用之间的时间段可以是约两周或更长时间，例如，约三周或更长时间，约四周或更长时间，约每月或更长时间一次，约五周或更长时间，或约六周或更长时间。例如，治疗可以是每两到四周或每四到八周。可以在手术之前和/或之后给予治疗，和/或可以在外科手术治疗或侵入性手术的解剖部位直接施用或应用。合适的制剂和施用途径如上所述。
在一些实施方案中，如本文所述的抗cd47抗体分子可以作为皮下注射施用。可以使用自动注射器施用皮下注射，例如用于长期预防/治疗。
在一些优选的实施方案中，取决于剂量，抗cd47抗体分子的治疗效果可持续若干半衰期。例如，单剂量的抗cd47抗体分子的治疗效果可在个体中持续1个月或更长时间，2个月或更长时间，3个月或更长时间，4个月或更长时间，5个月或更长时间，或6个月或更长时间
本发明还提供了产生与人cd47并且还与食蟹猴cd47和/或小鼠cd47特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将来自非人来源的抗cd47cdr移植到人v结构域框架中，以产生人源化的抗cd47抗体分子或其抗原结合部分；
(2)产生在cdr中包含一个或多个突变的人源化抗cd47抗体分子或其抗原结合部分的克隆的噬菌体文库；
(3)筛选所述噬菌体文库与人cd47并且任选地还与食蟹猴cd47和/或与小鼠cd47的结合；
(4)从筛选步骤(3)中选择对人cd47并且任选地还对食蟹猴cd47和/或对小鼠cd47具有结合特异性的克隆；和
(5)从由步骤(4)选择的克隆产生与人cd47并且任选还与食蟹猴cd47和/或与小鼠cd47特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分。
所述方法可以进一步包括基于步骤(4)中选择的克隆例如基于步骤(4)中选择的克隆的cdr中特定位置的进一步探索性诱变产生另外的克隆的步骤，以对于步骤(5)中产生的抗体分子或其抗原结合部分增强人源化、最小化人t细胞表位的含量和/或改善制备特性。
所述方法可以进一步包括以下步骤：评估步骤(4)中选择的克隆或步骤(5)中产生的抗体分子中一个或多个v结构域的免疫原性，并且任选地产生一个或多个另外的突变(例如在cdr和框架区中)以降低免疫原性。免疫原性可以通过鉴定t细胞表位的位置来评估，例如使用本文所述的计算机模拟技术。
适用于上述方法的细化如下面的实施例1中所述。
如本文所用，术语“cd47”是指保留cd47的至少部分生物学活性的整合素相关蛋白(iap)及其变体。如本文所用，cd47包括天然序列cd47的所有哺乳动物物种，包括人、大鼠、小鼠和鸡。术语“cd47”用于包括人cd47的变体、同种型和物种同源物。本发明的抗体可以与来自人以外物种的cd47，特别是与来自食蟹猴(macacafascicularis)的cd47交叉反应。在某些实施方案中，抗体可以对人cd47完全特异，并且可以不表现出非人交叉反应性。
如本文所用，在本发明抗体的上下文中使用的“拮抗剂”或“抗cd47拮抗剂抗体”(可互换地称为“抗cd47抗体”)是指能够与cd47结合并抑制cd47生物活性和/或由cd47信号传导介导的下游途径的抗体。抗cd47拮抗剂抗体包括可以阻断、拮抗、抑制或降低(包括显著地)cd47生物活性，包括由cd47信号传导介导的下游途径，例如受体结合和/或引发对cd47的细胞应答的抗体。出于本发明的目的，将明确理解术语“抗cd47拮抗剂抗体”涵盖使cd47本身、或cd47生物活性(包括但不限于其增强髓系谱系细胞吞噬作用激活的能力)、或者活性或生物活性的后果在任何有意义的程度上基本上无效、降低或中和的所有术语、标题和功能状态和特征。
如果与cd47与其它受体的结合相比，cd47以更大的亲和力、抗体亲抗原性、更容易和/或更长的持续时间结合，则cd47“特异性结合”、“特异性相互作用”、“优先结合”、“结合”或“相互作用”cd47。
“抗体分子”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标(例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体分子”不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，还涵盖其任何抗原结合片段(例如，“抗原结合部分”)或单链，包含抗体的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，包括例如但不限于scfv、单结构域抗体(例如，鲨鱼抗体[vnar抗体]或其片段和骆驼科动物抗体[vhh抗体]或其片段)、大抗体(maxibodies)、微抗体(minibodies)、胞内抗体(intrabodies)、双抗体、三抗体、四抗体和bis-scfv。
“抗体分子”涵盖任何类别的抗体，例如igg、iga或igm(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定类别。取决于其重链恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配到不同的类别。免疫球蛋白有五大类：iga、igd、ige、igg和igm，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
如本文所用，术语抗体分子的“抗原结合部分”是指完整抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合cd47的能力。抗体分子的抗原结合功能可以由完整抗体的片段执行。涵盖在术语抗体分子的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括fab；fab'；f(ab')2；由vh和ch1结构域组成的fd片段；由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；单结构域抗体(dab)片段和分离的互补决定区(cdr)。
术语“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c末端区域。“fc区”可以是天然序列fc区或变体fc区。尽管免疫球蛋白重链fc区的边界可能不同，但人igg重链fc区通常被定义为从位置cys226或从pro230的氨基酸残基延伸至其羧基末端。fc区中残基的编号是如kabat中的eu索引的编号。免疫球蛋白的fc区通常包含两个恒定结构域，ch2和ch3。如本领域所知，fc区可以以二聚体或单体形式存在。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。如本领域已知的，重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(cdr)连接的四个框架区(fr)组成，所述三个互补决定区也称为高变区，有助于抗体的抗原结合位点的形成。当选择fr在cdr侧翼时，例如当人源化或优化抗体时，优选来自含有相同典型类别的cdr序列的抗体的fr。
本申请中使用的cdr定义组合了在该领域中创建的许多不同的、通常相互矛盾的方案中使用的结构域，其基于免疫球蛋白库集分析以及单独的和其与抗原的共晶体的抗体的结构分析(参见swindells等人,2016,abysis:integratedantibodysequenceandstructure-management,analysis,和prediction.jmolbiol.[pmid:27561707；epub22august2016]的综述)的综合。本文使用的cdr定义(“统一”定义)包含所有此类先前见解的经验教训，并包括对可能介导靶标结合互补性的完整残基景观采样所需的所有合适的环位置。
表1显示了与用于定义相同cdr的周知的替代系统相比，如本文定义(“统一”方案)的vxp037鼠抗cd47抗体cdr的氨基酸序列。
如本文所用，术语“保守替换”是指将氨基酸替换为不会显著有害地改变功能活性的另一氨基酸。“保守替换”的优选实例是将氨基酸替换为以下blosum62替换矩阵中值≥0另一氨基酸(参见henikoff&henikoff,1992,pnas89:10915-10919)：
术语“单克隆抗体”(mab)是指来源于单个拷贝或克隆(包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体或其抗原结合部分，而不是指其产生方法。优选地，本发明的单克隆抗体存在于同质或基本上同质的群体中。
“人源化”抗体分子是指非人(例如鼠)抗体分子或其抗原结合部分的形式，其是包含最小的源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或它们的片段(例如，fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体可以是人免疫球蛋白(接纳体抗体(recipient))，其中来自接纳体的cdr的残基被具有期望特异性、亲和力和容量的来自非人物种(供体抗体)(例如，小鼠、大鼠或兔)的cdr的残基代替。
“人抗体或完全人抗体”是指来源于携带人抗体基因的转基因小鼠或来自人细胞的抗体分子或其抗原结合部分。
术语“嵌合抗体”意指抗体分子或其抗原结合部分，其中可变区序列来源于一个物种，并且恒定区序列来源于另一物种，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体并且恒定区序列来源于人抗体的抗体分子。
“抗体-药物缀合物”和“免疫缀合物”是指抗体分子或其抗原结合部分，包括与cd47结合并且与细胞毒性剂、细胞抑制剂和/或治疗剂缀合的抗体衍生物。
本发明的抗体分子或其抗原结合部分可以使用本领域熟知的技术产生，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这些技术的组合或本领域熟知的其它技术。
术语“表位”是指能够被抗体分子或其抗原结合部分在抗体分子的一个或多个抗原结合区域识别并被其结合的分子的部分。表位可以由一级、二级或三级蛋白质结构的限定区域组成，并且包括由抗体或其抗原结合部分的抗原结合区域识别的靶标的二级结构性单元或结构性结构域的组合。表位同样可以由分子的限定的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且具有特定的三维结构性特征以及特定的电荷特征。如本文所用，术语“抗原表位”被定义为抗体分子可以特异性结合的多肽部分，如通过本领域熟知的任何方法确定的，例如，通过常规免疫测定、抗体竞争性结合测定或通过x射线晶体学或相关的结构测定方法(例如nmr)。
术语“结合亲和力”或“kd”是指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。kd是解离速率(也称为“off-rate(koff)”)与结合速率或“on-rate(kon)”的比率。因此，kd等于koff/kon并表示为摩尔浓度(m)。因此，kd越小，结合的亲和力越强。因此，与1nm的kd相比，1μm的kd表示较弱的结合亲和力。抗体的kd值可以使用本领域中充分建立的方法测定。用于确定抗体的kd的一种方法是通过使用表面等离子体共振(spr)，通常使用生物传感器系统，例如
术语“效力”是生物活性的量度，并且可以指定为ic50，或在本文所述的cd47活性测定中测量使活性抑制50％的与抗原cd47缀合的抗体或抗体药物的有效浓度。
本文所用的短语“有效量”或“治疗有效量”是指达到期望治疗结果所需的量(在剂量和时间段以及施用方式下)。有效量是至少赋予受试者治疗益处所需要的活性剂的最小量，但小于毒性量。
本文关于本发明抗体分子的生物活性所使用的术语“抑制”或“中和”是指抗体基本上拮抗、阻止、预防、抑制、减缓、破坏、消除、停止、减少或逆转例如所抑制的生物活性(包括但不限于抗体分子与cd47的生物活性或结合相互作用)的进展或严重程度的能力。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于导入多核苷酸插入物的载体的接纳体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或故意的突变，后代可能未必与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组dna互补物方面)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
如本文所用，“载体”意指能够在宿主细胞中递送，并且优选表达一种或多种目的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂(cationiccondensingagent)结合的dna或rna表达载体，包封在脂质体中的dna或rna表达载体，以及某些真核细胞，例如生产细胞。
除非另有说明，否则本文所用的术语“治疗”是指对于应用该术语的疾病或病症，或者这样的疾病或病症的一种或多种症状，逆转、缓解、抑制其进展，延迟其进展，延迟其发作或预防。除非另有说明，否则本文所用的术语“治疗”是指如上定义的治疗行为。术语“治疗”还包括受试者的辅助和新辅助治疗。为避免疑义，本文提及的“治疗”包括治愈性、姑息性和预防性治疗。为避免疑义，本文提及“治疗”还包括对治愈性、姑息性和预防性治疗的提及。
应当理解，在本文中无论何处用语言“包括”描述任何实施方案时，还提供了以“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其它类似实施例。
在根据马库什组或其它替代组描述本发明的方面或实施方案的情况下，本发明不仅包括作为整体列出的整个组，而且还包括该组中的每个单独成员以及主要组的所有可能的子组，以及缺少一个或多个小组成员的主要组。本发明还设想了明确排除要求保护的发明中的任何组成员中的一个或多个。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如果发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变体将被理解为暗示包含所述整体或整体的组但不排除任何其它整体或整体的组。除非上下文另有要求，否则未用数量词限定的名词包括单数和复数指示对象。术语“例如”或“如”之后的任何实例并不意味着穷举或限制。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。
现在将参考附图描述本发明的特定非限制性实例。
实例1.优化的抗cd47治疗性抗体的产生和表征
引言
在该实例中，我们成功地产生了一组拮抗性、优化的抗cd47抗体。这些抗cd47抗体表达良好、生物物理稳定、高度可溶并且与优选的人种系具有最大的同一性。
材料和方法
igg克隆、瞬时表达、纯化
通过限制性连接克隆将抗体v-结构域编码dna序列克隆到单独的质粒载体中的单独的igg重链和轻链表达盒中。抗体以两种形式的工程化人igg表达：具有s228p突变以稳定igg4铰链的igg4，和igg1null–具有低铰链突变l234a/l235a/g237a的igg1，其将fcγ受体驱动的效应子功能降至最低。根据制造商的方案，在用无内毒素的igg表达质粒制剂瞬时转染后，在hek-293expi细胞中表达igg。使用单步骤方案纯化igg：将条件培养基(纯)加载到在pbsph7.4中预平衡的1mlproa琼脂糖柱上。用5倍柱体积的pbsph7.4洗涤柱，然后用100mm的甘氨酸ph2.7洗脱蛋白质，并使用30kda截止透析膜在pbsph7.4中进行透析。
igg滴定结合elisa
为了包被greinerbio-one高结合elisa板，将靶蛋白在碳酸盐缓冲液中稀释至1μg/ml，并以每孔100μl添加，在4℃下过夜。将包被的板用pbsph7.4洗涤3次，用pbs中的1％bsa(380μl/孔)在室温下封闭1小时，然后用pbs-tween20(pbst)洗涤3次。然后添加cd47抗体(100μl/孔；在pbst中稀释)，然后在室温下孵育1小时。然后将板用pbst洗涤3次并添加山羊抗人κ链-hrp(100μl/孔)，在室温下1小时。然后将板用pbst洗涤3次并用pbs洗涤两次，然后每孔添加100μltmb。通过添加100μl2mh2so4/孔终止反应，并在板读数器上在450nm处读取od。
通过elisa测试抗cd47抗体的多反应性。将纯化、重组的靶和非靶抗原在碳酸盐缓冲液中以100ng/孔包被在96孔nuncmaxisorp板中，在4℃下过夜。然后将板用pbs洗涤3次，用pbs中的1％bsa封闭，然后用pbs-tween20洗涤3次。然后施加一抗的稀释系列，将板用pbs-tween20洗涤3次，然后施加山羊抗人κ链-hrp1:4,000二抗。然后将孔用pbs-tween20洗涤3次，用pbs洗涤2次，每孔添加100μltmb过氧化物酶底物，通过添加100μl2mh2so4终止反应，并在450nm处读取吸光度。如前所述，进行在带负电荷的生物分子表面上的通过elisa的igg结合分析(参见mouquet等人,2010,nature467:591-595)。
cd47文库的产生和选择
通过质量寡聚物合成和pcr来组装cd47scfv库。然后通过限制性连接将扩增的scfv库克隆到噬菌粒载体中，转化到大肠杆菌tg-1细胞中，并释放噬菌体库，其基本上如先前详细描述的(finlay等人,2011,methodsmolbiol681:383-401)。
如下进行噬菌体选择：用cd47蛋白(人或食蟹猴)包被链霉亲和素磁性微珠，用pbs洗涤珠三次并重悬于pbsph7.4加5％脱脂乳蛋白(mpbs)中。在选择的第1轮中以200nm靶蛋白包被这些珠，然后在随后的轮中以100、50和10nm包被。
cd47-sirpα结合竞争测定
建立了竞争elisa，以检验优化的先导阻断cd47与sirpα的结合相互作用的能力。为了包被greinerbio-one高结合elisa板，以每孔100μl添加碳酸盐包被缓冲液中的10μg/ml人sirpα-fc，在4℃下过夜。将包被的板用ph7.4的pbs洗涤3次，用pbs中的1％bsa(380μl/孔)在室温下封闭1小时，然后用pbs-tween20(pbst)洗涤3次。然后以每孔100μl添加在pbs中的0.2μg/ml生物素化的人、小鼠或食蟹猴cd47-fc，在添加或不添加加竞争性igg的情况下在室温下持续60分钟。然后将板用pbst洗涤3次，并在室温下添加链霉亲和素-hrp(100μl/孔)，持续1小时。然后将板用pbst洗涤3次，并用pbs洗涤两次，然后每孔添加100μltmb。通过每孔添加100μl2mh2so4终止反应，并在板读数器上在450nm处读取od。
抗体v结构域t细胞表位含量：计算机模拟分析
使用基于鉴定治疗性抗体和蛋白质中t细胞表位的位置的计算机模拟技术(abzena,ltd.)来评估抗体v结构域中的潜在免疫原性。使用itopetm分析对与人ii类mhc结合具有混杂的高亲和力的肽的关键先导的vl和vh序列。混杂的高亲和力ii类mhc结合肽被认为与作为药物蛋白质的临床免疫原性的高风险指示物的t细胞表位的存在有关。itopetm软件预测肽的氨基酸侧链与34种人ii类mhc等位基因的开放末端结合槽内的特定结合口袋(特别是口袋位置p1、p4、p6、p7和p9)之间的有利相互作用。这些等位基因代表了在世界范围内发现的最常见的hla-dr等位基因，而没有权重归因于发现在任何特定种族人群中最常见的那些。20种等位基因包含“开放”p1构型，而14种等位基因包含其中第83位的甘氨酸被缬氨酸替换的“封闭”构型。关键的结合残基的位置是通过计算机生成9聚体肽实现的，该9聚体肽与跨过测试蛋白序列的八个氨基酸重叠。该过程成功地以高准确度区分了结合或不结合ii类mhc分子的肽。
另外，使用tcedtm(tcellepitopedatabasetm)搜索来分析序列与先前通过其它蛋白质序列的体外人t细胞表位作图分析所鉴定的t细胞表位的匹配。tcedtm用于针对来自无关蛋白质和抗体序列的大型肽数据库(>10,000个肽)搜索任何测试序列。
癌细胞吞噬作用分析
通过密度梯度离心从全血中分离出人外周血单核细胞(pbmc)。随后通过使用cd14微珠的磁性细胞分离来分离cd14+pbmc。平行地，使用绿色cfse(羧基荧光素二乙酸酯，琥珀酰亚胺酯)细胞示踪染料标记hl-60细胞。将总共1.25x106个标记的hl-60细胞在抗cd47抗体存在的情况下，在37℃的含有5％co2的潮湿气氛中于24孔板中预孵育1小时。孵育后，将5x105cd14阳性细胞添加到每个孔中，并在相同的培养条件下再孵育一个小时。通过剧烈吸液收集细胞，使用冰冷的4％多聚甲醛固定10分钟，然后用fc受体结合抑制剂单克隆抗体封闭10分钟。封闭步骤之后，将细胞用alexafluor647(af647)缀合的抗人cd14抗体在室温下孵育30分钟，并在4％多聚甲醛中再固定5分钟。
在bdfortessa流式细胞仪上分析细胞，记录侧向散射和前向散射特性以及cfse和af647荧光强度数据。捕获数据，直到记录至少1x104个af647阳性事件。采集后使用flowjo软件(版本10.4.2)分析数据。简单地说，将细胞碎片通过散射特性(ssc-面积与fsc-面积)进行门选。还将单个细胞通过ssc-面积与ssc-高度并且然后通过fsc-面积与fsc-高度进行门选。从剩余的单细胞群体中，使用基于在溶媒处理的测试中的cd14阳性细胞的群体设置的四分之一门对cfse和cd14双阳性细胞进行门选。计算来自cd14阳性群体的cfse阳性细胞百分比，并使用graphpadprism软件(7.0a版)作图。
结果和讨论
将cdr移植到优选的人种系v基因上
最初采用cdr移植将拮抗性鼠抗cd47iggvp037的cdr(mvh/mvl；参见wo2014/093678和表2)引入人种系免疫球蛋白v-结构域框架序列支架。为了使我们的工程努力偏向具有最佳药物样特性的最终先导治疗性igg化合物，我们选择将亲本抗体的cdr移植到已知具有良好稳定性并且以高频率用于表达的人抗体库的“优选”种系支架ighv5-51和igkv2-28上。
这些支架和移植的cdr的定义在表2中列出。鼠抗cd47抗体的重链和轻链序列也显示在表2中。虽然该cdr移植过程是众所周知的，但是预测给定的一组人v-结构域序列是否将作为非人cdr移植的合适接纳体框架仍然存在问题。使用不合适的框架可导致靶结合功能损失，蛋白质稳定性问题或甚至最终igg的表达受损。因此，ighv5-51/igkv2-28移植物被用作cdr诱变和选择改良克隆的模板。
文库产生和筛选
将cdr移植的ighv5-51/igkv2-28v-结构域序列组合成vl-vhscfv形式，并通过质量寡聚物合成和组装产生诱变文库盒。将最终的scfv文库连接到噬菌体展示载体中，并通过电穿孔转化到大肠杆菌中以产生1.3x109个独立的克隆。通过对96个克隆测序验证了文库构建质量。该测序数据显示，在每个可变位置编码鼠或人种系残基的位置已经以约50％的频率有效地取样。使用辅助噬菌体m13释放文库，并对三个独立分支a、b和c的生物素化的人、小鼠和食蟹猴cd47-fc蛋白进行选择。
选择后筛选(图1)和dna测序揭示854个独特的人和小鼠cd47结合scfv克隆的存在，其在cdr内具有显著增加的人含量，而框架序列保持完全种系。在这854个克隆中，在所有cdr中观察到种系化突变(表3)。基于cdr种系化水平对比于与人和小鼠cd47-fc两者结合的elisa信号，对先导克隆进行排名(图1)。然后将来自该排名的前4个克隆的v结构域加上组合了两个观察的最高人源化的重链和轻链v结构域的第5克隆(‘vh-a1/vl-b1’)亚克隆到igg表达载体中，用于如下进一步测试(表4)。
虽然在直接来自文库选择的先导克隆的所有cdr中观察到种系化突变，但仍然可能的是，序列分析可能允许被设计为具有最大人源化的另外的克隆。因此，使用具有针对人和小鼠蛋白的结合信号的854个序列独特命中来分析该功能性表征群体的cdr中鼠氨基酸的保留频率。定位氨基酸保留频率表示为在vh和vl结构域中发现的百分比(图2a和b)。在一系列组合设计中，rf<75％的鼠残基被认为是对靶结合互补位可能不重要的位置，并且可能对种系化开放。
仅含有rf>75％的那些鼠残基的设计称为“mh”(mh＝最大人源化)。还创建了另一设计者克隆(“ttp”＝总理论可能性)，其组合了在群体中观察到的5个最高人源化的cdr。通过基因分析产生了mh和ttp克隆并且(连同上述4个文库来源的克隆以及阳性对照mvh/mvl和阴性对照同种型匹配的无cd47反应性v结构域)克隆到人表达载体中用于作为igg1null和igg4(s228p)产生。所有igg均容易从hek-293细胞的瞬时转染中表达和纯化。
先导igg特异性和效能特征
然后以直接滴定elisa形式测试上述纯化的igg与人、小鼠和食蟹猴cd47-fc的结合(图3)。出人意料的是，该分析表明，尽管克隆mh、a-d5和d-h3保留了对cd47的所有3种直系同源物的结合亲和力，但两种克隆显示出与小鼠cd47的结合力降低(g-b6和f-e7)，一种克隆(vha-1/vl-b1)维持与人和小鼠cd47二者的可比较的结合，但失去了与小鼠cd47的交叉反应，并且一种克隆(ttp)失去了几乎所有的结合功能。
在cd47-sirpα阻断测定中(图4)，a-d5、g-b6、f-e7和d-h3均在与mvh/mvligg1抗体类似的浓度范围对人、小鼠和食蟹猴cd47与sirpα-fc相互作用表现出浓度依赖性阻断。值得注意的是，vh-a1/vl-b1igg1表现出对人和食蟹猴cd47的有效阻断作用，但对小鼠cd47没有阻断作用。有趣的是，尽管已在elisa中证明克隆mh与cd47的所有3种直系同源物结合，但在任何测定中均未显示出阻断信号。在所有阻断测定中，克隆ttp也为阴性。
为了确保先导克隆在突变和重选过程中不遭受靶特异性的损失；测试了先导和对照igg1克隆与来自免疫球蛋白超家族的一组14种纯化的人蛋白质的结合(图5)。所有五种igg在1μg/ml的浓度下表现出与cd47-fc的结合信号(人od450nm>2.0，食蟹猴>2.0，小鼠>1.25)，并且对其它任何蛋白没有可检测的结合(od450nm<0.1)。一个值得注意的例外是vh-a1/vl-b1克隆，其再次显示出与人和食蟹猴cd47的强结合，但没有针对小鼠cd47的信号。
细胞膜上先导igg结合特异性的流式细胞术分析
通过流式细胞术分析cd47的抗体在细胞表面的浓度依赖性结合。将cho-k1细胞用人、小鼠或食蟹猴cd47全长cdna稳定转染。然后在100,000-24ng/ml的浓度范围测试igg1null和igg4(s228p)形式的抗cd47iggmvh/mvl、vh-a1/vl-b1、a-d5、g-b6、f-e7和d-h3和同种型对照igg1全部以及市售小鼠抗人cd47单克隆ms1991与人、食蟹猴或野生型对照('wt'，即未转染)cho-k1的结合。除同种型对照外，所有igg均显示出与人和食蟹猴cd47+细胞的浓度依赖性结合，每种情况下的最大mfi均是对于与未转染的cho-k1结合的观察到的信号>10倍高(图6)。对于除vh-a1/vl-b1以外的所有克隆均观察到与cho-k1wt细胞的可测量结合，但仅在高抗体浓度下。然而，在低至24ng/ml的浓度下，mvh/mvligg显示出为“无抗体”阴性对照>10倍高的最强反应性。这种背景结合可以表明原始的小鼠抗体vxp037不仅具有与小鼠cd47的交叉反应性，而且具有与仓鼠的交叉反应性。对于治疗性蛋白质而言，与仓鼠cd47的这种交叉反应性的最小化是优选的，因为抗体通常会在cho细胞培养物中产生以用于临床。对仓鼠cd47蛋白的高igg结合亲和力可能会导致生产运行中不需要的共纯化cd47宿主细胞蛋白质含量显著增加，必须从药物产品中去除该蛋白质以避免患者的免疫原性。
为了检查先导igg与cd47+人癌细胞的结合，将hl60细胞(源自人类急性髓细胞白血病)也用于如上所述的流式细胞术分析。除同种型对照igg以外的所有抗体均显示出与hl60细胞的强浓度依赖性结合(图7)。
‘可开发性’elisa测定中的先导iggd-a6分析
本领域已知，用于治疗用途的igg与几种指示性生物学底物的结合是由于生物利用度差和体内半衰期短而导致患者中差的表现的高风险的指标。三种这样的生物学底物是胰岛素、dsdna和ssdna。因此，用这三种底物包被elisa板，并且检查优化的先导抗体的igg1null形式的结合。将这些基于人igg的抗体的结合信号与已发现具有多反应性和差的表现而在临床试验中停止其进展的‘阳性对照’人igg抗体(bococizumab和briakinumab人igg1类似物)的结合信号进行比较。对于阴性对照人igg1抗体，使用igg1尤特克单抗类似物，因为其和briakinumab与相同的治疗靶标反应，但具有更长的pk并且被成功批准作为治疗产品。在图8所示的elisa分析中，阳性对照抗体对所有3种底物均表现出预期的强反应性，而阴性对照则显示出低反应性。重要的是，针对所有三种底物，所有测试的igg1null先导蛋白都显示出≤阴性对照的结合。该发现强调了在优化的克隆a-d5、g-b6、d-h3和vh-a1/vl-b1中维持了高特异性靶标驱动的结合。
基于先导克隆a-d5的设计者igg的分析
如上所述，已经证明克隆a-d5具有与人、食蟹猴和小鼠cd47的高特异性结合，低脱靶结合潜力，改善的对小鼠cd47的中和作用，降低的与cho细胞的背景结合以及cdr中的多个人种系突变。然而，作为文库来源的克隆，a-d5序列仍然保留了许多非种系(小鼠来源的)残基，根据图2a和2b中的数据表明这些残基可能是多余的。a-d5序列和所有其它文库来源的克隆在cdr-l1中也保留了'ng'基序，其具有很高的脱酰胺风险，因为发现在长的柔性igkv2-28种系模板cdr-l1环中的顶点处具有高溶剂暴露。在同时使a-d5可变结构域中的人种系序列最大化并且使蛋白质中的高风险脱酰胺基序含量最小化的尝试中，产生了一系列设计者克隆。此工作分两个阶段进行，来自第一阶段的a-d5.1至a-d5.10克隆包含表4中列出的cdr序列。将这些克隆以igg1null形式表达和纯化，并且通过elisa检查在所有cd47直系同源物上的靶结合(图9a、b、c)，以及中和所有直系同源物的cd47-sirpα相互作用(图10a、b、c)。在这一阶段，发现人种系和这些改良可以与适度的效能损失结合在一起。此外，尝试去除cdr-l1中“ng”基序的初始突变(通过n到q的保守替换)是成功的，虽然降低了靶结合elisa和cd47-sirpα相互作用的中和(图10a、b、c)两方面的效力。
在第二阶段中，在来自阶段1的最高性能突变体a-d5.4上设计了一系列其它突变体(表5)。这9种突变体对a-d.4的cdr-h2的进一步人源化进行了采样，还将或不将‘ng’脱酰胺化风险基序中的‘n’替换为保守的和非保守突变(例如s、g、a和t)，或者将‘g’残基替换为a。这些克隆再次以igg1null形式表达和纯化，并通过elisa检查在所有cd47直系同源物上的靶标结合(图11a、b、c)，以及中和所有直系同源物的cd47-sirpα相互作用(图12a、b、c)。在这一阶段，发现与克隆a-d5相比，cdr-h2的人种系含量可以再增加2个残基而没有效力的损失。此外，尝试通过n的替换去除cdr-l1中“ng”基序的突变是成功的，从而鉴定出克隆a-d5.16，该克隆包含非保守的n到a突变，以及最大人源化的cdr-h2，与a-d5和mvl/mvh两者相比，在靶标结合elisa或cd47-sirpα的中和中的效力仅轻微降低(约3倍)。a-d.16的cdr-l1序列‘rssqsllhsagynylh’(seqidno:82)(以及克隆a-d5.14、a-d5.15、a-d5.17和a-d5.28)仅在两个位置(带下划线)包含非种系残基，并且实现了最大人种系含量和最大稳定性特征之间的最佳平衡。
随后还以igg1null形式测试了a-d5来源的a-d5.4和a-d5.16的结合特异性的维持，以确保在突变和重新选择过程中靶特异性没有损失；测试了两种克隆与来自免疫球蛋白超家族的一组14种纯化的人蛋白质的结合(图13)。两种igg在10μg/ml下显示出与cd47-fc的结合信号(人、食蟹猴和小鼠均>2.0od450nm)，并且对任何其它蛋白质均没有可检测的结合(od450nm<0.1)。在图14所示的“可开发性”elisa分析中，阳性对照抗体对所有3种底物均表现出预期的强反应性，而阴性对照则显示出低反应性。重要的是，a-d5.4和a-d5.16igg1null先导蛋白对所有3种底物显示出≤阴性对照的结合。该发现强调了在优化的克隆a-d5、a-d5.4和a-d5.16中维持了高特异性、靶标驱动的结合。
最后，通过流式细胞术检查了a-d5衍生物突变体a-d5.4和a-d5.16与野生型cho(图15)和hl60(图16)细胞的结合。这些分析证实了igg1null或igg4形式的克隆mvh/mvl的原始鼠v结构域驱动与cho细胞的强烈的、浓度依赖性结合，而两种igg形式的克隆a-d5、a-d5.4和a-d5.16介导几乎没有或没有结合信号(图15)。相比之下，克隆mvh/mvl、a-d5、a-d5.4和a-d5.16均显示出与人cd47+hl60细胞的强结合(图16)，表明在我们优化的克隆中确实保留了细胞膜上的人cd47结合，但是改善了仓鼠cd47反应性。
抗体v结构域t细胞表位分析
使用基于鉴定治疗性抗体和蛋白质中t细胞表位的位置的计算机模拟技术(abzena,ltd.)来评估mvh/mvl和先导抗体v结构域的免疫原性。用针对34种ii类mhc同种异型中的每一种测试的重叠的9聚体肽(每个肽与最后一个肽重叠8个残基)进行v-结构域序列的分析。根据可能的“适合度”以及与ii类mhc分子的相互作用对每个9聚体进行评分。通过软件计算的肽得分在0至1之间。突出显示产生高平均结合得分(在itopetm评分功能中>0.55)的肽，并且如果>50％的ii类mhc结合肽(即34种等位基因中的17种)具有高结合亲和力(得分>0.6)，则这样的肽被定义为“高亲和力”ii类mhc结合肽，被认为具有高的含cd4+t细胞表位的风险。低亲和力ii类mhc结合肽以>0.55(但多数不>0.6)的结合得分结合大量等位基因(>50％)。使用tcedtm对序列进行进一步分析。将该序列用于通过blast搜索来询问tcedtm，以便从先前在abzenaltd.进行的体外t细胞表位作图研究中，从刺激t细胞应答的无关蛋白质/抗体中鉴定出肽(t细胞表位)之间的任何高序列同源性。
肽分为四类：高亲和力外源('haf'-高免疫原性风险)表位、低亲和力外源('laf'-较低免疫原性风险)表位、tced+(先前在tcedtm数据库中鉴定的)表位和种系表位('ge'-具有高ii类mhc结合亲和力的人种系肽序列)。如先前利用多种种系肽的研究证实的，种系表位9聚体肽由于t细胞耐受性(即，这些肽在宿主中被视为“自身”)而不太可能具有免疫原性潜力。重要的是，这样的种系v结构域表位(进一步由人抗体恒定区中的相似序列辅助)也竞争抗原呈递细胞膜上ii类mhc的占有，降低了外源肽呈递足以达到t细胞刺激所需的“激活阈值”的风险。因此，高ge含量在抗体治疗剂临床开发中是有益品质。
如图17所示，与mvh/mvl相比，关键的先导v结构域在肽表位含量上显示出显著的有益变化。由于此处进行的v结构域工程化方法已成功选择了维持抗cd47效力而无需在框架中包含任何鼠残基的抗体(表2)，因此在所有文库来源的和设计者先导中不包含在mvh/mvl的重链和轻链v结构域的框架中发现的多个haf和laf表位(图17)。还发现ge表位含量显著增加(在所有先导中从3增到≥14)，尤其是在先导克隆的vh区，其中在所有先导中ge含量从0增加到9，并且在所有先导中tced+表位从3减少到2(表8)。然而重要的是，还通过在先导克隆的cdr中发现的种系化突变消除了多个外源表位。例如，在大多数先导克隆中通过第2位的突变v>l和第7位的突变n>y消除了在mvh/mvl(以及因此先前通过cdr移植而人源化vxp037的任何形式)的lcdr-1中发现的tced+肽‘lvhsngnty’(seqidno:116)(表4和5)。类似地，来自mvh/mvl序列的lcdr2编码跨越vl框架2-lcdr2-框架3的三个外源表位肽。这些包括两种haf肽(‘lliykvsyr’(seqidno:117)和‘yrfsgvpdr’(seqidno:118))和一种laf肽(‘liykvsyrf’(seqidno:119))。将lcdr2插入人种系框架igkv2-28并未完全消除此问题，因为来自mvh/mvl的总序列‘lliykvsyrfsgvpdr’(seqidno:120)在igkv2-28移植序列中保持100％的同一性(表2)。在克隆a-d5、a-d5.4和a-d5.16的该区域中仍然发现了一种haf和两种laf肽，而haf序列‘yrfsgvpdr’(seqidno:118)通过第1位的突变y>n而缺失。然而，出人意料地，在文库筛选期间已在功能性结合群体中鉴定(表3)并且在第4位包含单个人类种系突变y>n的lcdr2序列kvsnrfs(seqidno:85)被发现完全改善了该区域中所有预测的外源表位(没有预测的haf、laf或tced+肽)，同时还产生了另外两个ge序列(图18)。还观察到，先导克隆a-d5及其所有设计者衍生物(表4和5)保留了跨越vl框架3和lcdr3区域的也是tced+的haf肽‘vgvyycfqn’(seqidno:121)。发现该肽第1位的v突变为a、t或f均破坏了预期的表位结构并消除了该肽的免疫原性风险。
上面的发现允许设计最大程度的去免疫的轻链序列，其与a-d5.16vh序列(表4)配对以形成克隆‘a-d5.16-di’。a-d5.16-di包含lcdr序列‘rssqsllhsagynylh’(seqidno:82)、lcdr2序列‘kvsnrfs’(seqidno:85)和框架2-lcdr3序列‘agvyycfqnthtprt’(seqidno:122)(框架2残基具有下划线)。该克隆容易以igg1null形式表达，并且发现保留了与mvh/mvligg相当的对人、食蟹猴和小鼠cd47(图18a-c)的靶结合亲和力(在小鼠上减少，图18c)。还发现a-d5.16-di表现出比a-d5.16改善的cd47-sirpα阻断，并且与mvh/mvl相当的对人和食蟹猴cd47的阻断，在小鼠上稍微降低(图19)。因此，这些发现导致了去免疫的克隆a-d5.4-di，其具有含lcdr序列“rssqsllhsngytylh”(seqidno:52)(或者使用aho定义的ssqsllhsngyty[seqidno:92]))、lcdr2序列“kvsnrfs”(seqidno:85)和框架2-lcdr3序列“agvyycfqnthtprt”(seqidno:12s2)(框架2残基标有下划线)的轻链设计。
癌细胞的吞噬作用
进行研究以检查cd47阻断在驱动由人原代巨噬细胞吞噬hl60人癌细胞中的相对效力。如图20a所示，igg4(s228p)形式-mvh/mvl、a-d5、a-d5.4和a-d5.16在所有测试浓度下均驱动明显的吞噬作用。igg1null形式的a-d5在20μg/ml时未显示任何显著的效力，表明fcγ受体1结合亲和力对于驱动吞噬作用的必要性。出乎意料的是，与mvh/mvl相比，igg4a-d5、a-d5.4和a-d5.16在1和10μg/ml时都驱动明显更强的吞噬作用。然后检查跨越人巨噬细胞的4个独立供体的igg4a-d5和mvh/mvl的这种现象(图20b)。该分析表明，图20a所示的较高效力是正确的，而a-d5在所有供体中的效力均显著更高(图20b)。
尽管已经参考优选或示例性实施例描述了本发明，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以实现对本发明的各种修改和变化，并且这些修改是本文清楚考虑的。既不意图对本文所公开的和所附权利要求中提出的具体实施方案进行限制，也不应推断出任何限制。
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