结构体与细胞团块连接的构建物的制作方法

本发明涉及结构体与细胞团块连接的构建物。

背景技术：

在人类生物学、再生医疗、药物评价等各个领域中，需要人为创造出具有类似于人体内脏器官的三维结构和活体功能的类器官(器官类似物)的技术。

对类器官的造出而言，已进行了古典式的如以胚性干细胞(es细胞)为材料的胚样体(embryoidbody)制备为代表的基于利用未分化细胞的三维培养而进行的自主性多谱系细胞分化而进行组织结构体的造出[非专利文献1：eirakum等人，nature，2011]。尽管通过这种方法可以实现初期胚的重构，但难于人为而有计划地并保证再现性地实施任意内脏器官的形成。此后，以实现任意内脏器官形成为目的，进行了使用未分化细胞或导入变异的细胞制备类似于体内上皮结构的类器官[非专利文献2：satot等人，nature，2009]、制备同时具有上皮和间质的类器官[非专利文献3：spencejr等人，nature，2011]、制备内部具有血管网的类器官等[非专利文献4：takebet等人，nature，2013；非专利文献5：takebet等人，cellstemcell，2015、专利文献1：wo2013/047639]，利用了细胞间相互作用的自组织的诱导和控制法正在建立。

另一方面，这样的利用了细胞间相互作用的自组织的诱导和控制的极限也正在变得清楚。即，尽管可能人为地重构上皮片结构或毛细血管网等精细的组织结构，但是对于例如与上皮片在结构上连接的复杂的导管结构、或连接到毛细血管网的粗的细小动静脉以上的大血管系统等的重构而言，尚未成功。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：eirakum等人，nature472，pp51-56，2011

非专利文献2：satot等人，nature459，pp262-265，2009

非专利文献3：spencejr等人，nature470，pp105-109，2011

非专利文献4：takebet等人，nature499，pp481-484，2013

非专利文献5：takebet等人，cellstemcell16，pp556-565，2015专利文献

专利文献1：wo2013/047639

发明概述

发明要解决的问题

为了实现与上皮片在结构上连接的复杂的导管结构、或连接到毛细血管网的粗的细小动静脉以上的大血管系统等的重构，开发不仅人为诱导和控制细胞间相互作用、而且多个组织之间的“组织间相互作用”的系统是非常重要的。

本发明以提供多个组织之间的“组织间相互作用”的人为诱导和控制系统为目的。

用于解决问题的方法

在活体移植中，为了移植片与血管进行吻合，需要发生血管化类器官中的血管重塑，从移植到出现血液灌流需要几天的时间。为了在移植后的更早阶段实现对移植组织的血液灌流，本发明人们成功地在体外创造出了类器官与包含有大血管或人造血管的血管系统结构体的融合体，从而完成了本发明。

本发明的要旨如下。

(1)构建物，其用于生物体移植植，其中，所述构建物中结构体与细胞团块连接，前述结构体是具有立体结构的物体，可以模仿或具有类似于生物体的结构和/或功能。

(2)根据(1)所述的构建物，其中，结构体具有管腔结构、非管腔结构或它们的组合。

(3)根据(2)所述的构建物，其中，结构体是选自由血管、胆管、食道、胰管、气管、支气管、细支气管、输尿管、输卵管、输精管、汗腺、颌下腺导管、腮腺管、泪腺、心脏、神经、大脑、中脑、小脑、视丘、下丘脑、脑垂体、脑桥、延髓、眼、舌、牙齿、皮肤、咽、喉头、胸腺、声带、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠、肛门、肺、横隔膜、肝脏、胆囊、胰脏、肾脏、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、脾脏、膀胱、睾丸、卵巢、子宫、骨、软骨、肌腱、毛囊、浆膜、大网膜、粘膜组织、肌肉组织和韧带组成的组中的至少一种。

(4)根据(3)所述的构建物，其中，结构体来自生物体。

(5)根据(3)所述的构建物，其中，结构体是人造物。

(6)根据(2)所述的构建物，其中，结构体选自由片状结构体、管状结构体和丝状结构体组成的组中的至少一种。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的构建物，其中，细胞团块包含1种或2种以上的细胞。

(8)根据(1)～(7)中任一项所述的构建物，其中，细胞团块选自由器官芽、球形体、细胞聚集体和细胞球组成的组中的至少一种。

(9)根据(1)～(8)中任一项所述的构建物，其中，结构体和细胞团块的组合选自由血管和器官芽、胆管和器官芽、食道和器官芽、胰管和器官芽、气管和器官芽、支气管和器官芽、细支气管和器官芽、输尿管和器官芽、输卵管和器官芽、输精管和器官芽、汗腺和器官芽、颌下腺导管和器官芽、腮腺管和器官芽、泪腺和器官芽、心脏和器官芽、神经和器官芽、大脑和器官芽、中脑和器官芽、小脑和器官芽、视丘和器官芽、下丘脑和器官芽、脑垂体和器官芽、脑桥和器官芽、延髓和器官芽、眼和器官芽、舌和器官芽、牙齿和器官芽、皮肤和器官芽、咽和器官芽、喉头和器官芽、胸腺和器官芽、声带和器官芽、胃和器官芽、十二指肠和器官芽、小肠和器官芽、大肠和器官芽、直肠和器官芽、肛门和器官芽、肺和器官芽、横隔膜和器官芽、肝脏和器官芽、胆囊和器官芽、胰脏和器官芽、肾脏和器官芽、肾上腺和器官芽、甲状腺和器官芽、甲状旁腺和器官芽、脾脏和器官芽、膀胱和器官芽、睾丸和器官芽、卵巢和器官芽、子宫和器官芽、骨和器官芽、软骨和器官芽、肌腱和器官芽、毛囊和器官芽、浆膜和器官芽、大网膜和器官芽、粘膜组织和器官芽、肌肉组织和器官芽、以及韧带和器官芽组成的组中的至少一种组合。

(10)根据(9)所述的构建物，其中，器官芽选自由肝芽、类肺器官、类气道上皮器官、类肠器官、类胰脏器官、类肾脏器官、类脑器官、类气道器官、类胃器官、类甲状腺器官、类胸腺器官、类睾丸器官、类食道器官、类皮肤器官、类神经器官、类输卵管器官、类卵巢器官、类唾液腺器官、类视胞器官、类视杯器官、类膀胱器官、类前列腺器官、类软骨器官、类心脏器官、类骨组织器官、类肌肉组织器官和类癌器官组成的组中的至少一种。

(11)组织或内脏器官的制备方法，包括移植(1)～(10)中任一项所述的构建物至非人动物中。

(12)组织或内脏器官的再生或功能恢复方法，包括移植(1)～(10)中任一项所述的构建物至人或非人动物中。

(13)非人嵌合动物的制备方法，包括移植(1)～(10)中任一项所述的构建物至非人动物中。

(14)评价药品的方法，包括使用选自由(1)～(10)中任一项所述的构建物、通过(11)所述的方法制备的组织和内脏器官、和通过(13)所述的方法制备的非人嵌合动物组成的组中的至少一种。

(15)再生医疗用组合物，其包含根据(1)～(10)中任一项所述的构建物。

(16)根据(15)所述的组合物，用于制备组织或内脏器官。

(17)根据(15)所述的组合物，用于进行组织和/或内脏器官的再生和/或功能恢复。

本发明提供了多个类器官之间的“组织间相互作用”的新的人为控制系统，并提供了通过这种人为控制系统制备的器官类似体或器官。进一步地，提供了多个类器官与大血管等异种结构体的“组织间相互作用”的人为控制系统，并提供了通过这种人为控制系统制备的器官类似体或内脏器官。另外，本发明不限于提供单纯的生物体组织间的相互作用控制系统，还提供了与人造物的相互作用的控制系统，并包括通过这种人为控制系统制备的器官类似体或内脏器官，其中，所述人造物是以人工血管等高分子结构体为代表的那样的利用化学物质或金属等制备的人造物。

关于多个类器官间的“组织间相互作用”的新的人为控制系统的提供，它与cyfuse公司专利“wo2008/123614、wo2014/141528、wo2014/148647”或已发表论文“bireyf等人，nature545，pp54-59，2017：通过脑外套类器官和脑外套下部类器官的融合的脑制备”是完全不同的手法，具有创造性。对于本发明提供与结构体和人造物“相互作用”的人为控制系统、及通过该人为控制系统制备的器官类似体或内脏器官而言，显然具有新颖性。本发明是将人为创造出具有类似人内脏器官的三维结构和活体功能的类器官(器官类似体)的技术进行了革新性发展的重要技术。

在本说明书中，包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请：日本申请号2017-208853的说明书和/或附图中记载的内容。

发明效果

通过本发明，提供了多个类器官间的“组织间相互作用”的新的人为控制系统以及多个类器官和大血管等结构体的“组织间相互作用”的人为控制系统。

附图简述

[图1]hipsc肝芽与小鼠大血管的融合。

[图2]对hipsc肝芽赋予血管/胆管的技术。

[图3]hipsc肝芽与人工血管的融合。

[图4]大血管融合肝芽的体内功能分析。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

本发明提供了用于生物体移植植的构建物，前述构建物中结构体和细胞团块连接，前述结构体是具有立体结构的物体，能模仿或具有类似于生物体的结构和/或功能。

本发明中的结构体是具有立体结构的物体，能模仿或具有类似于生物体的结构和/或功能。结构体可以是对于活体的组织和/或内脏器官的全部或一部分的结构和/或功能在体外阶段进行模仿或类似的结构体，也可以是即使在体外阶段不模仿或类似，在移植到活体后(在体内阶段)也模仿或类似的结构体。

结构体可以与细胞团块来源相同(同种)，也可以与细胞团块来源不同(异种)。

作为结构体，可以例示与细胞团块来源相同或不同的生物来源的生物体组织或内脏器官、人工组织或内脏器官等，结构体可以具有管腔结构、非管腔结构或它们的组合，可以是生物体来源的那些，也可以是人造物。具体地，可以例示：血管、胆管、食道、胰管、气管、支气管、细支气管、输尿管、输卵管、输精管、汗腺、颌下腺导管、腮腺管、泪腺、心脏、神经、大脑、中脑、小脑、视丘、下丘脑、脑垂体、脑桥、延髓、眼、舌、牙齿、皮肤、咽、喉头、胸腺、声带、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠、肛门、肺、横隔膜、肝脏、胆囊、胰脏、肾脏、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、脾脏、膀胱、睾丸、卵巢、子宫、骨、软骨、肌腱、毛囊、浆膜、大网膜、粘膜组织、肌肉组织和韧带等生物体组织或内脏器官、人工血管、人工气管、细胞片等人工组织或内脏器官等，但不限于这些。结构体可以采用片状结构体、管状结构体、丝状结构体等形状。在结构体是人造物的情况，用生物体相容性材料形成是较好的。作为生物体相容性材料，可以例示金属(例如，不锈钢、钴合金、钛合金等)、玻璃、陶瓷、合成高分子(例如，尼龙、聚丙烯、聚二噁烷酮、聚乳酸、聚对苯二甲酸乙二酯、特氟龙(teflon)(注册商标))等、生物来源材料(例如，真丝、胶原蛋白、去细胞组织)等，但不限于此。另外，结构体只要是能模仿或具有类似于生物体的结构和/或功能的那些即可，也可以是器官芽、球形体、细胞聚集体、细胞球等细胞集合体(细胞团块)或细胞集合体彼此发生融合的那些。

对结构体能模仿或类似的活体的结构和/或功能没有特别限制，可以是活体中存在的结构或活体中发生的任何功能，可以例举：生物体组织或内脏器官的全部或一部分的结构、细胞的功能或细胞之间的相互作用，以及细胞已经构成的组织或内脏器官的功能、或组织、内脏器官间的相互作用等，但不限于这些。另外，对活体组织或内脏器官的缺损部分的填补或对活体组织或内脏器官的损伤部分的补强等也包含在活体功能的概念中。模仿或类似于活体的结构和/或功能的程度可大可小，对该程度的大小没有限制。

细胞团块可以是器官芽(类器官)、球形体、细胞聚集体、细胞球等任何细胞集合体，可以包含1种细胞，也可以包含2种以上的细胞。另外，也可以是细胞集合体彼此发生融合的那些。“器官芽”是指，通过进行成熟，能够分化为内脏器官的结构体，作为其的一个例子，在wo2013/047639中公开了从内脏器官细胞、血管细胞(优选地，血管内皮细胞)、和未分化间充质类细胞或从其分化的细胞这三种细胞制备器官芽的方法，在本发明中，可以合适地使用通过该方法制备的器官芽。“内脏器官细胞”是指构成内脏器官的功能细胞、或者向功能细胞分化的未分化细胞。作为“未分化内脏器官细胞”，可以例举例如：可分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髓等内脏器官的细胞等，可分化为脑、脊髓、肾上腺髓质、表皮、毛发或指甲或皮肤腺、感觉系统、末梢神经、晶状体等外胚层器官的细胞、可分化为肾脏、输尿管、心脏、血液、生殖腺、肾上腺皮质、肌肉、骨骼、真皮、结缔组织、中皮等中胚层器官的细胞、可分化为肝脏、胰腺、肠道、肺、甲状腺、甲状旁腺、尿路等内胚层器官的细胞等。在本领域技术人员中使用的术语中，成肝细胞(hepatoblast)、肝祖细胞(hepaticprogenitorcells)、胰母细胞(pancreatoblast)、肝前体细胞(hepaticprecursorcells)、胰母细胞(pancreatoblast)、胰祖细胞(pancreaticprogenitors)、胰腺祖细胞(pancreaticprogenitorcells)、胰前体细胞(pancreaticprecursorcells)、内分泌前体细胞(endocrineprecursors)、肠祖细胞(intestinalprogenitorcells)、肠前体细胞(intestinalprecursorcells)、间介中胚层(intermediatemesoderm)、后肾间充质前体细胞(metanephricmesenchymalprecursorcells)、多潜能肾单位祖细胞(multipotentnephronprogenitor)、肾祖细胞(renalprogenitorcell)、心脏中胚层(cardiacmesoderm)、心血管祖细胞(cardiovascularprogenitorcells)、心脏祖细胞(cardiacprogenitorcells)(jr.spence，等人nature.；470(7332)：105-9.(2011)；self，等人emboj.；25(21)：5214-5228.(2006)；j.zhang，等人circulationresearch.，104：e30-e41(2009)；g.lee，等人naturebiotechnology25，1468-1475(2007))等包含在未分化内脏器官细胞中。未分化内脏器官细胞可以自人工多能性干细胞(ips细胞)、胚性干细胞(es细胞)等多潜能干细胞通过公知的方法制备。血管细胞是构成血管的细胞或可以分化为这种细胞的细胞，可以是经分化的细胞，也可以是未分化的细胞。血管细胞可以自脐静脉等血管组织分离，但不限于自血管组织分离的细胞，也可以是自ips细胞或es细胞等具有全能性或多能性的细胞经分化诱导的细胞。作为血管细胞，优选血管内皮细胞。“血管内皮细胞”是指构成血管内皮的细胞或可以分化为这种细胞的细胞。血管内皮细胞可以是经分化的细胞，也可以是未分化的细胞。在本领域技术人员中使用的术语中，内皮细胞(endothelialcells)、脐静脉内皮细胞(umbilicalveinendothelialcells)、内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells)、内皮前体细胞(endothelialprecursorcells)，血管生成祖细胞(vasculogenicprogenitors)、成血管细胞(hemangioblast)(hj.joo，等人blood.25；118(8)：2094-104.(2011))等包含在血管内皮细胞中。“间充质类细胞”是主要存在于中胚层来源的结缔组织中并形成在组织中发挥功能的细胞的支持结构的结缔组织细胞，该概念还包含决定了向间充质类细胞的分化命运，但尚未分化为间充质类细胞的细胞。间充质类细胞可以是经分化的细胞，也可以是未分化的细胞。在本领域技术人员使用的术语中，间充质干细胞(mesenchymalstemcells)、间充质祖细胞(mesenchymalprogenitorcells)、间充质细胞(mesenchymalcells)(r.peters，等人plosone.30；5(12)：e15689.(2010))等包含在间充质类细胞中。间充质类细胞也可以是自ips细胞或es细胞等具有全能性或多潜能的细胞经分化诱导的细胞，也可以是源自骨髓、脂肪等体细胞的细胞。在以下描述的实施例中，使用了自ips细胞分化诱导的肝祖细胞、间充质类干细胞和自脐静脉来源的血管内皮细胞而制备的肝芽。

作为结构体和细胞团块的组合，可以例示血管和器官芽、胆管和器官芽、食道和器官芽、胰管和器官芽、气管和器官芽、支气管和器官芽、细支气管和器官芽、输尿管和器官芽、输卵管和器官芽、输精管和器官芽、汗腺和器官芽、颌下腺导管和器官芽、腮腺管和器官芽、泪腺和器官芽、心脏和器官芽、神经和器官芽、大脑和器官芽、中脑和器官芽、小脑和器官芽、视丘和器官芽、下丘脑和器官芽、脑垂体和器官芽、脑桥和器官芽、延髓和器官芽、眼和器官芽、舌和器官芽、牙齿和器官芽、皮肤和器官芽、咽和器官芽、喉头和器官芽、胸腺和器官芽、声带和器官芽、胃和器官芽、十二指肠和器官芽、小肠和器官芽、大肠和器官芽、直肠和器官芽、肛门和器官芽、肺和器官芽、横隔膜和器官芽、肝脏和器官芽、胆囊和器官芽、胰脏和器官芽、肾脏和器官芽、肾上腺和器官芽、甲状腺和器官芽、甲状旁腺和器官芽、脾脏和器官芽、膀胱和器官芽、睾丸和器官芽、卵巢和器官芽、子宫和器官芽、骨和器官芽、软骨和器官芽、肌腱和器官芽、毛囊和器官芽、浆膜和器官芽、大网膜和器官芽、粘膜组织和器官芽、肌肉组织和器官芽和韧带和器官芽等的组合，但不限于这些。

作为器官芽，可以例示：肝芽、类肺器官、类气道上皮器官、类肠器官、类胰脏器官、类肾脏器官、类脑器官、类气道器官、类胃器官、类甲状腺器官、类胸腺器官、类睾丸器官、类食道器官、类皮肤器官、类神经器官、类输卵管器官、类卵巢器官、类唾液腺器官、类视胞器官、类视杯器官、类膀胱器官、类前列腺器官、类软骨器官、类心脏器官、类骨组织器官、类肌肉组织器官、类癌器官等，但不限于这些。

在本发明中，细胞团块和结构体可以以集合、凝集、融合、吻合等任何形式连接，结构体和细胞团块的连接只要是旨在模仿或具有类似于生物体的结构和/或功能的结合即可。

连接到结构体的细胞团块发挥功能即可。进而，通过连接结构体和细胞团块，提高了细胞团块间的相互作用和细胞团块与结构体的相互作用，细胞团块的功能可以提高。例如，在连接了细胞团块的结构体中，通过细胞团块伴着血管网而与结构体融合，提高了细胞团块与结构体之间的相互作用，能够期待连接到结构体的细胞团块的功能提高。

对于使结构体与细胞团块连接，可以使用任何方法，例如，可以在结构体上将细胞团块彼此靠近地布置，培养，由此进行连接。优选地，结构体具有细胞黏附表面。或者，也可以使细胞团块彼此发生融合后与结构体连接。培养期间可以是1～30天，优选地1～10天。使结构体与细胞团块连接后，可以通过培养合适的期间(例如，1～30天，优选地，5～14天)，使构建物(结构体与细胞团块的连接体)成熟。培养可以是分批培养、半分批培养(补料分批培养)、连续培养(灌流培养)中的任何一种方法，其中优选灌流培养。另外，也可以是静置培养、通气培养、搅拌培养、震荡培养、旋转培养中的任何一种。

通过将连接了细胞团块的结构体移植至人或非人动物，例如，在被移植的组织或内脏器官中构建血管网，开始血液灌流，由此能创造出具有高度秩序的组织结构的组织或内脏器官。成为移植对象的动物除了人之外，还可以是实验动物、宠物动物、役用动物、赛马、斗狗等中利用的动物，具体地，可以例举：小鼠、大鼠、兔子、猪、犬、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等非人动物。另外，为了避免免疫排斥反应，非人动物优选是免疫缺陷动物。连接了细胞团块的结构体的移植部位可以是任何部位，只要它可以移植即可，可以例示血管、颅内、肠系膜、肝脏、脾脏、肾脏、肾被膜下、门静脉上等。通过将连接了细胞团块的结构体移植至活体(人、非人动物等)，可以使功能已丧失或低下的组织或内脏器官再生，另外，如果在非人动物中制备人组织或内脏器官，则可以用于创制新药筛选。

或者，也可以将结构体与细胞团块连接的构建物体外培养，使功能进一步提高，将其作为器官类似体或内脏器官，用于人类生物学、再生医疗、创制新药筛选等。

本发明提供了组织或内脏器官的制备方法，包括将结构体与细胞团块连接的构建物移植至非人动物。

另外，本发明提供了组织或内脏器官的再生或功能恢复方法，包括将结构体与细胞团块连接的构建物移植至人或非人动物。

通过将结构体与细胞团块连接的构建物移植至非人动物，使其植活，可以制备非人嵌合动物。由此，本发明提供了非人嵌合动物的制备方法，包括将结构体与细胞团块连接的构建物移植至非人动物。经移植了结构体与细胞团块连接的构建物的非人动物(例如，小鼠)可以模仿细胞团块来源生物种类(例如，人)的生理功能。

进一步地，本发明提供了评价药品的方法，包括使用选自由结构体与细胞团块连接的构建物、自结构体与细胞团块连接的构建物制备的组织和内脏器官、和经移植了结构体与细胞团块连接的构建物的非人嵌合动物组成的组中的至少一种。作为药品的评价，可以例举例如：药物代谢的评价(例如，药物代谢分布的预测)、药效评价(例如，筛选作为医药品有效的药品等)、毒性评价、药物相互作用评价等。

药物代谢的评价是以源自人的细胞制备的细胞团块作为对象，通过选自在结构体与细胞团块连接的构建物、自结构体与细胞团块连接的构建物制备的组织和内脏器官、和经移植了结构体与细胞团块连接的构建物的非人嵌合动物中，收集和分析在施用医药品的候选化合物后的生物样本，可以获得人型的药物代谢分布。由此，使得通过现有技术极难以实现的在人中预测医药品的分布、代谢和排泄过程成为可能，并且有望飞跃性加快安全且有效的医药品的开发。

作为医药品有效的药品筛选能够实现以源自人的细胞制备的细胞团块作为对象，通过使用选自结构体与细胞团块连接的构建物、自结构体与细胞团块连接的构建物制备的组织和内脏器官、和经移植了结构体与细胞团块连接的构建物的非人嵌合动物，施用新型的医药品候选化合物进行分析。由此，现有的体外试验是不够的，并且预期可以大幅改善实际施用于人时的药效的预测准确性。

毒性评价是通过使用选自结构体与细胞团块连接的构建物、自结构体与细胞团块连接的构建物制备的组织和内脏器官、和经移植了结构体与细胞团块连接的构建物的非人嵌合动物，通过测定施用被验物质后的组织损害标记等，使得损害预测的准确性提高成为可能。

药物相互作用评价可以通过使用选自结构体与细胞团块连接的构建物、自结构体与细胞团块连接的构建物制备的组织和内脏器官、和经移植了结构体与细胞团块连接的构建物的非人嵌合动物，在施用多个药品后，进行其后的各药品的分布、代谢和排泄过程等的药物动态或毒性评价、药效评价而进行。

另外，本发明提供了再生医疗用组合物，其包含结构体与细胞团块连接的构建物。

可以将本发明的组合物移植至活体内，制备组织或内脏器官。另外，将本发明的组合物移植至活体内，可以进行组织或内脏器官的再生或功能恢复。

本发明的组合物移植到活体后，结构体与细胞团块连接的构建物能够分化为具有血管网的组织或内脏器官。该血管网中能够产生血液灌流。认为根据血管网中产生血液灌流，使得创造出具有与成体组织同等或与其接近的高度有序的组织结构的组织和内脏器官成为可能。

在本发明的组合物中也可以添加fgf2、hgf、vegf等的组织血管化促进剂、伴随移植的止血用明胶海绵(商品名：sponzel，astellas株式会社)、和用于固定移植组织的bolheal(teijinphama株式会社)·beriplast(cslbehring株式会社)、tachocomb(cslbehring株式会社)、胶原蛋白、基质胶等组织黏附剂等。

实施例

以下通过实施例更详细地描述本发明。

[实施例1]

实验方法

·人诱导性多能性干细胞(ipsc)的培养法

将细胞培养皿或细胞培养板用imatrix-511(nippi，0.7～0.9μg/cm²)于37℃、包被1小时，用pbs洗涤。在37℃水浴中浸入冷冻保存的人ipsc(tkda3株或1231a3株，分别由东京大学、京都大学ips细胞研究所提供)2分钟，同时用手摇动使其融解。将细胞保存液混悬在细胞保存液的9倍量的ak02培养基(ajinomoto)中，进行150-200xg，5分钟的离心操作。除去细胞上清，将细胞混悬在ak02培养基中加入了y-27632(wako，10um)的培养基中，以0.36～1.8x10³个细胞/cm²的浓度接种人ipsc。在培养第1天交换为ak02培养基、以后每隔1天进行培养基交换。关于传代，将使用直径10cm的细胞培养皿培养一周的人ipsc用pbs洗涤后，加入accutase(innovativecelltechnology)2ml于37℃处理5分钟至10分钟，剥离细胞。加入ak02培养基2ml，转移细胞至15ml管中，进行150-200xg，5min的离心操作。除去细胞上清，将细胞混悬至在ak02培养基中加入了y-27632(10um)的培养基中，以0.36～1.8x10³个细胞/cm²的浓度接种了人ipsc。

·从ipsc向肝祖细胞的分化诱导法

将细胞培养皿或细胞培养板(thermofisherscientific)用imatrix-511(nippi，0.4～0.6μg/cm²)于37℃包被1小时，用pbs洗涤。用直径10cm的细胞培养皿培养了一周的人ipsc用pbs洗涤之后，加入accutase1ml，于37℃处理5分钟至10分钟，剥离细胞。加入1ml的ak02培养基，转移细胞至15ml的管中，进行150-200xg，5分钟的离心操作。除去细胞上清，将细胞混悬至在rpmi培养基(wako)中加入了青霉素/链霉素(gibco，1％)、b27(gibco，2％)、wnt3a(r&d，50ng/ml)、激活素a(100ng/ml)、y-27632(10um)的培养基中，以8.4x10⁴个细胞/cm²的密度接种在层粘连蛋白包被的平皿中。在培养第1天和第3天，交换为在rpmi培养基中加入了青霉素/链霉素(1％)、b27(2％)、wnt3a(50ng/ml)、激活素a(100ng/ml)、丁酸钠(0.5mm)的培养基。培养第4天交换为在rpmi培养基中加入了青霉素/链霉素(1％)、b27(2％)、wnt3a(50ng/ml)、激活素a(100ng/ml)的培养基中。将培养第6天的细胞作为内胚层细胞definitiveendoderm(确定性内胚层，de)。在培养第6天和培养第8天，交换为rpmi培养基中加入了青霉素/链霉素(1％)b27(2％)、基础fgf(10ng/ml)的培养基中。将培养第10天的细胞作为肝祖体细胞肝内胚层(hepaticendoderm，he)。

·人间充质类干细胞(msc)的培养法

在细胞培养皿(直径10cm)中接种悬浊于mscgm培养基(lonza)中的间充质干细胞(mesenchymalstemcells)(以下称为msc，lonza，3-5x10⁵个细胞)。3天进行1次培养基交换。7天后用pbs洗涤后，加入2ml的胰酶/edta(gibco)于37℃处理5分钟，进行细胞剥离。加入2mlmscgm培养基，转移细胞至15ml管中，进行150-200xg，5min的离心操作。除去细胞上清，混悬细胞至在hcm(不含egf)培养基(lonza)中添加了fbsgold(mpbiomedicals)5％、hgf10ng/ml、制癌蛋白m(oncostatinm)(r&d)20ng/ml、地塞米松(dexamethazon)100nm的培养基与egm培养基以1：1的比例混合的培养基(hcm/egm混合培养基)中，供肝芽的制备。

·人脐静脉来源的血管内皮细胞(huvec)的培养法

将悬浊在egm培养基(lonza)或egm-2培养基(lonza)中的kusabiraorange标记的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells)(称为huvec，lonza，3-5x10⁵个细胞)接种至细胞培养皿(直径10cm)中。3天进行1次培养基交换。7天后用pbs洗涤后，加入2ml的胰酶/edta(gibco)于37℃处理5分钟，进行细胞剥离。加入2mlegm培养基或egm-2培养基，转移细胞至15ml的管中，进行150-200xg，5分钟的离心操作。除去细胞上清，将细胞混悬至hcm/egm混合培养基中，供肝芽的制备。

·肝芽制备法

关于ipsc肝芽的制备，在微孔板elplasiarb500400na(kuraray)24孔板的每1孔中，于hcm/egm混合培养基中混悬并接种人ipsc来源的de或人ipsc来源的de或he2.3x10⁵个细胞、和huvec1.6x10⁵个细胞、和msc1.6x10⁵个细胞。

·肝芽-大血管/人工血管/胆管/肠道的融合体创造法

制备肝芽24小时后，自微孔板elplasiarb500400na(kuraray)回收了小型肝芽。在12孔细胞培养插件(cellcultureinsert)(thermofisherscientific)或6孔细胞培养插件(cellcultureinsert)(thermofisherscientific)上，放置大血管(小鼠主动脉、大鼠大腿动脉、大鼠大腿静脉、人脐动脉)、猪胆管、胎小鼠肠道、或人工血管(triplex，terumo；ptfe多孔管，中兴化成工业)，并将回收的肝芽进行配置使得彼此靠近。或者，也可以使小型肝芽融合后，与大血管/胆管/肠道或人工血管进行融合。使用荧光显微镜bz-x710(keyence)、共聚焦显微镜sp5或sp8对样品进行拍照。在融合后第9天回收与人工血管融合的肝芽，进行定量rt-pcr而进行功能评价。

·使用了定量rt-pcr的赋予了大血管的肝芽的机能评价

将用elplasiarb500400na(kuraray)制备的小型肝芽和在细胞培养插件(cellcultureinsert)(corning)上培养的融合肝芽在培养后第10天进行回收，使用purelinkrnamini试剂盒(thermofisherscientific)纯化rna。使用iscriptcdnasynthesis试剂盒(bio-rad)进行cdna合成，使用thunderbirdprobeqpcrmix(takara)和lightcycler(登録商标)480(rochelifescience)进行基因的扩增和检测。使用真核18srrna内源性对照(vic^tm/mgb探针，引物限制)校正基因表达。其他基因的引物信息如下所示。halb，探针#27，正向引物：aatggtgccaagctgctga(序列号1)；反向引物：cttcccttcatcccgaagtt(序列号2)，hafp，探针#61，正向引物：tccttgtaagtggcttcttgaac(序列号3)；反向引物：tgtactgcagagataagtttagctgac(序列号4)，hcd31，探针#46，正向引物：cattgttcccggtttcca(序列号5)；反向引物：cagagagaccggctgtgg(序列号6)。

·向大鼠大腿动脉移植赋予了大鼠大腿血管的肝芽

自日本clea株式会社购入免疫缺陷大鼠(f344/njcl-rnu/rnu)。获取其他大鼠的大腿动脉，制备了赋予了大血管的肝芽。免疫缺陷大鼠在异氟烷吸入麻醉下，通过端端吻合向大腿动脉移植了赋予了大血管的肝芽。移植后每周从大鼠颈动脉收集血液，进行血中人白蛋白浓度的测定。移植3周后回收移植片，进行组织分析。

·石蜡切片制备法

将回收的组织在4％多聚甲醛/磷酸缓冲液(pbs)中进行16小时固定。将固定组织用pbs洗涤3次后，分别在震荡30分钟以上并同时浸入70％乙醇、95％乙醇、100％乙醇(2次)进行组织脱水。其后，分别在65℃震荡30分钟以上并同时浸入50％乙醇/二甲苯溶液、100％二甲苯溶液、100％石蜡溶液(2次)中之后，包埋于石蜡中。用切片机将经包埋的组织样品薄切成7～10μm厚。

·苏木精和伊红染色

将石蜡切片经二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇、miniq水逐步脱石蜡、进行亲水化。用流水洗涤后，用苏木精溶液染色3～5分钟，用流水洗涤后，用伊红溶液染色2～5分钟。用流水洗涤后，用醇进行脱水，用二甲苯透化后，将非水溶性封入剂放至样品上，用盖玻片进行覆盖并封片。

·免疫组织化学分析

将石蜡切片经二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇、miniq水逐步脱石蜡、进行亲水化。在10mm柠檬酸缓冲液(ph6.0)中进行121℃、15分钟的抗原赋活化处理后，在3％过氧化氢水/甲醇液中处理10分钟，以灭活内源性过氧化物酶。用blockingone溶液(nacalaitesque)进行室温封闭1小时后、使之与稀释的第一抗体室温反应1小时或4℃反应一晚。用pbs洗涤3次后，使其与hr标记的或荧光标记的第二抗体室温反应30分钟以上。用pbs洗涤3次后，在荧光标记的第二抗体的情况下，用dapi进行核染色后封片，进行显微镜观察。在hrp标记的第二抗体的情况下，用dab试剂(vector)反应2～10分钟，进行生色。用纯化水洗涤后，用苏木精染色3分钟，用流水洗涤10分钟后，与0.1％碳酸氢钠反应5分钟，用醇进行脱水，用二甲苯透化后，将非水溶性封入剂放至样品上，用盖玻片进行覆盖并封片。

·elisa分析

将自大鼠获取的血液于4℃1,500xg进行20分钟离心后的上清或回收的培养液进行elisa分析。按照人白蛋白elisa定量套装(bethyllaboratories，inc.)的方法进行分析。

结果

结果示于图1～4中。

·人ipsc肝芽和小鼠大血管的融合

利用出生后8周的小鼠制备小鼠大血管。人ipsc肝芽(以下称为hipsc肝芽)贴付至小鼠大血管，经时进行观察(图1a)。其结果是，在融合15天后，观察到了hipsc肝芽与小鼠大血管周围融合的外观(图1a-d)。在融合15天后，观察到形成源自hipsc肝芽的血管网结构(图1b、1g)。观察到赋予了大血管的hipsc肝芽表达hnf4a(图1e)或afp(图1f)等肝分化标记、也观察到人cd31阳性血管形成(图1g)。

·人ipsc肝芽和血管/胆管/肠道的融合

人ipsc肝芽能够与人脐动脉、大鼠大腿动脉、大鼠大腿静脉、猪胆管、胎小鼠肠融合，显示出在肝芽内形成了血管网(图2a-e)。通过对赋予了大鼠大腿静脉的肝芽的组织分析，表明肝芽内的细胞源自人，明确了肝芽内的血管网形成了管状结构(图2f)。赋予了大鼠大腿静脉的肝芽与不赋予大血管的肝芽比较，分泌的人白蛋白值提高2.36倍(图2g，n＝4，p＜0.03，非配对t检验)。

·人ipsc肝芽和人工血管的融合

在细胞培养插件(cellcultureinsert)上彼此靠近地放置了人工血管(triplex，terumo；ptfe多孔管，中兴工业)和肝芽，经时地观察了肝芽的融合(图3a、3b)。其结果是，在融合3天后，观察到人工血管周围的肝芽融合，认为形成了血管网结构(图3c)。回收培养第10天的赋予了人工血管的肝芽，进行基因表达分析时，与不赋予大血管的肝芽比较，观察到赋予了人工血管的肝芽中afp、alb、cd31的基因表达增加(图3d)。

·赋予了大鼠大腿动脉的肝芽的体内移植分析

将培养第9-11天的赋予了大鼠大腿动脉的肝芽通过血管吻合而移植到免疫缺陷大鼠(f344/njcl-rnu/rnu)的大腿动脉(图4a)。显示血液灌流前的肝芽呈白色，但是血液灌流后，血液在肝芽内流通，肝芽呈现红色(图4a和4b)。移植3周后，也观察到组织的植活(图4c)。对移植前的赋予了大鼠大腿动脉的肝芽进行组织学分析的结果是，观察到动脉周围存在大量的人组织(图4d)。即使在移植之后，也观察到在动脉周围存在大量的人组织(图4e)。为了测定赋予了大鼠大腿动脉的肝芽在体内的功能，经时地进行了采血，测定了大鼠血中的人白蛋白量(图4f)。其结果是，在移植后7天后、14天后、21天后均检测到人白蛋白，表明赋予了大鼠大腿动脉的肝芽在活体内发挥功能。

将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请全文作为参考并入本说明书中。

工业实用性

本发明可以利用在人类生物学、再生医疗、药物评价等中。