本公开涉及并入有跨膜蛋白的囊泡，制备并入有跨膜蛋白的囊泡的方法，包含并入有跨膜蛋白的囊泡的分离膜，以及在多孔基质膜上制备固定了并入有跨膜蛋白的囊泡的薄膜复合物层的方法。
背景技术：
聚合物囊泡或聚合囊泡是由两亲性嵌段共聚物在合适的溶剂(例如水)中形成的自组装结构，并呈现出由双层壁包围的内部空腔，该双层壁可以并入各种结构，如跨膜蛋白。聚合物囊泡的稳定性随形成聚合物的分子量的增加而增加，并且其渗透性随亲水与疏水比的增加而增加。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(peo-ppo-peo)的嵌段共聚物，通常被称为pluronic，其具有低的亲水与疏水比，可形成囊泡，并因此适用于获得可渗透膜。不幸的是，它们不容易通过直接溶解自组装。在微流体装置中组装更为合适(déboraf.donascimentoetal,microfluidicfabricationofpluronicvesicleswithcontrolledpermeabilitylangmuir2016,32,5350-5355)。此外，已知具有非常高的ppo/peo比(例如68/10)的pluronics自组装成约100nm的囊泡结构，其并不是非常稳定。即使通过聚合的季戊四醇四丙烯酸酯(peta)的永久互穿网络(ipn)稳定时，它们的保质期也不会超过一个月。(fengli,pluronicpolymersomesstabilizedbycorecross-linkedpolymermicelles,softmatter,2009,5,4042–4046)。
具有小ppo/peo比的pluronics可在阴离子表面活性剂或无机盐(如十二烷基硫酸钠或naf)存在下自组装，形成约800nm最大至3000nm的结构。(li,f.；ketelaar,t.；marcelis,a.t.m.；leermakers,f.a.m.；stuart,m.a.c.；sudholter,e.j.r.,stabilizationofpolymersomevesiclesbyaninterpenetratingpolymernetwork.macromolecules2007,40(2),329-333.；chen,s.；yang,b.；guo,c.；ma,j.h.；yang,l.r.；liang,x.f.；hua,c.；liu,h.z.,spontaneousvesicleformationofpoly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly(ethyleneoxide)triblockcopolymer.journalofphysicalchemistryb2008,112(49),15659-15665.)。
pluronics被认为是无毒的，且已广泛用于药物递送系统，并为基因治疗提供了令人兴奋的机会。(fengli,pluronicpolymersomesstabilizedbycorecross-linkedpolymermicelles,softmatter,2009,5,4042–4046)。许多研究已表明了当与广谱抗原一起使用时pluronics作为佐剂提高细胞介导和抗体介导的免疫应答的潜在用途(jain-guptan,etal,pluronicp85enhancestheefficacyofoutermembranevesiclesasasubunitvaccineagainstbrucellamelitensischallengeinmice,femsimmunolmedmicrobiol66(2012)436–444)。
更多的研究描述了泊洛沙姆(poloxamer)在胶束中的自组装能力，能够包括各种更疏水的药物并在人体内转运它们(yaparae,inalo,poly(ethyleneoxide)–poly(propyleneoxide)-basedcopolymersfortransdermaldrugdelivery:anoverview,tropjpharmres,october2012；11(5):855；kambojvk,vermapk,poloxamersbasednanocarriersfordrugdeliverysystem,derpharmacialettre,2015,7(2):264-269，batrakovaevetal,polymermicellesasdrugcarriers)。包括pluronics的嵌段共聚物如pluronic-聚乳酸共聚物在囊泡中自组装，可负载和转运各种货物(例如胰岛素)(xiongxyvesiclesfrompluronic/poly(lacticacid)blockcopolymersasnewcarriersfororalinsulindelivery,journalofcontrolledrelease120(2007)11–17)。
pluronics可以表现出生物学活性，包括对增强dna细胞摄取、核移位和基因表达的影响。具有较高的亲水-亲脂平衡值的pluronics导致在细胞质中的均匀分布；具有较低的亲水-亲脂平衡值的pluronics更喜欢局限于细胞核(fanwetal.degradablegenedeliverysystemsbasedonpluronics-modifiedlow-molecular-weightpolyethyleneimine:preparation,characterization,intracellulartrafficking,andcellulardistribution,internationaljournalofnanomedicine2012:71127–1138)。
包含跨膜蛋白(诸如水通道蛋白)的囊泡可用于制备具有固定化水通道蛋白的膜，以用于诸如净化水(wo2006/122566)或产生盐度能(wo2007/033675)的应用。囊泡通常以层或膜的形式沉积在支撑基质上，这允许水分子通过纳滤、反渗透、正渗透或压力延缓渗透而选择性地通过膜。
wo2013/043118公开了薄膜复合物(tfc)膜，其中固定了并入有水通道蛋白水通道(aqp)的囊泡。此外，它公开了一种生产薄膜复合物膜的方法及其在过滤工艺中的用途，诸如纳滤和渗透过滤工艺。wo2010/146365描述了tfc-水通道蛋白-z(aqpz)过滤膜的制备，其使用两亲性三嵌段共聚物作为囊泡形成物质用于并入固定化的aqp。wo2014/108827公开了一种具有用包含水通道蛋白水通道的薄膜复合物(tfc)层修饰的纤维的中空纤维(hf)模块，其中可以在并入到tfc层中之前，将水通道蛋白水通道并入脂质或嵌段共聚体囊泡中。
然而，通常在现有技术中，用于囊泡生产的两亲性脂质和嵌段共聚物是需要溶解在苛刻溶剂(诸如四氯甲烷(ccl4)或氯仿(chcl3))中以溶解其主要疏水部分的固体。在膜合成中，蒸发该溶剂以形成膜，然后将其再水化，以使两亲物变成各种乳液形式(诸如囊泡)，同时并入aqp膜蛋白。希望开发使用对环境影响较小的溶剂的工艺。
在分离过程或清洗过程中，可以在高温下处理工业膜。当膜用于处理食品诸如乳制品时，通常需要对膜进行消毒以避免微生物的发育。具有并入的囊泡的现有技术膜在暴露于高温时趋于快速劣化。在本发明的一方面，目的是开发用于并入膜中的囊泡，其显示出较高的温度稳定性，同时在高温处理后保持合适的透水性。
技术实现要素：
本发明涉及并入有跨膜蛋白的囊泡，其中囊泡膜形成材料包含聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)和聚醚胺的混合物。
根据本发明的囊泡通常能够经受高温而直径没有明显收缩。囊泡直径的低收缩导致膜的高机械尺寸稳定性，这进而提供了长的生产寿命。此外，低收缩使透水性几乎不受影响。
聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)通常为基本上线性的聚合物，其重均分子量在约1,000da至约15,000da之间，诸如重均分子量在约2,500da至约10,000da之间。在某一方面，重均分子量高于3,000da，诸如高于4,000da，且优选高于5,000da。但通常该方面的重均分子量不高于8,000da，诸如不高于7,000da，且优选不高于6,000da。在优选的方面，重均分子量为约5,800da。
聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)可以具有不同的嵌段组成和比例，但通常该化合物可以由以下化学式表示：
其中，
x表示10-30之间的整数；
y表示50-100之间的整数；
z表示10-30之间的整数。
在本发明的某个实施方式中，x表示15-25之间的整数，y表示60-80之间的整数，且z表示15-25之间的整数。在本发明的某个实施方式中，x和y具有相同的含义。此外，x和z优选为约20，且y优选为约70。该化合物可作为pluronicp-123获得。在替代实施方式中，x和z在30-200的范围内，且y在40-60的范围内。根据该替代实施方式的一个具体实例是泊洛沙姆407(basf商品名：pluronicf127)，其中x＝z＝101且y＝56。
聚醚胺通常含有连接至聚醚主链的一个或多个伯氨基基团。聚醚主链通常基于环氧丙烷(po)或环氧丙烷(po)和环氧乙烷(eo)的混合物。当使用环氧丙烷(po)和环氧乙烷(eo)的混合物时，po/eo的摩尔比通常高于1，即聚醚胺主要基于聚丙二醇(ppg)。在优选的方面，po/eo的摩尔比通常高于2，诸如高于3。
聚醚主链可含有1至3个胺基团，即聚醚为单胺、二胺或三胺。在本发明的优选方面，聚醚胺为单胺。当应用环氧丙烷(po)和环氧乙烷(eo)的混合物时，胺基团主要位于分子的环氧丙烷(po)部分的末端。
聚醚胺的分子量通常为500至5000da。在本发明的某个方面，分子量为1000至4000da，诸如1500至3000da。在本发明的优选方面，聚醚胺的分子量为约2000da。
在本发明的某个实施方式中，聚醚胺具有结构通式：
其中，
m为1-15的整数；
n为5-50的整数；
r为ch3。
在本发明的某个方面，n/m的比为1或更大，诸如2或3或更大。更合适的，m表示2至10的整数，诸如4-8。最优选的为6左右。n合适地在10至40的范围内，诸如在25至35的范围内。
聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)和聚醚胺之间的比例可以在宽范围内选择。然而，通常，聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)与聚醚胺之间的重量比为5比1。
目前认为，聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)形成囊泡的主链，其中丙二醇单元组装成疏水域，而乙二醇伸入囊泡外空间。聚醚胺的疏水部分将分子锚定在囊泡中，导致胺基团伸入囊泡外空间。因此，可以说聚醚胺用胺基团修饰囊泡的表面。
跨膜蛋白在其自然环境中跨越整个生物脂膜，即从细胞内部到细胞外空间。许多跨膜蛋白充当特定物质的通道，从而允许这些物质在细胞内部与细胞外液之间交换。跨膜蛋白的一个特征是存在疏水区域，这将确保跨膜蛋白整合到膜中。跨膜蛋白还在中空纤维区域的两侧具有亲水性片段，所述亲水性片段分别指向细胞内部和细胞外液。在本发明中，跨膜蛋白被并入囊泡的疏水部分。
尽管任何跨膜蛋白都可以并入本发明公开的膜材料中，但是通常希望使用跨膜蛋白来转运离子(离子通道)和水(水通道蛋白水通道)。离子通道包括氯通道和金属离子转运体。在一些跨膜蛋白中，除氯离子外氯通道还可以传导hco3-、i-、scn-和no3-。金属离子转运体包括镁转运体、钾离子通道、钠离子通道、钙通道、质子通道等。
在本发明的优选实施方式中，跨膜蛋白是水通道蛋白水通道。水通道蛋白水通道促进转运水进出细胞。在工业膜中，水通道蛋白水通道通过渗透作用确保水的流动，而溶液中的其它溶质则被截留。
跨膜蛋白倾向于在水性溶液中聚集和沉淀，并因此将跨膜蛋白溶解在洗涤剂中可能是合适的。尽管可以使用多种洗涤剂，但是通常该洗涤剂选自由月桂基二甲基胺-n-氧化物(ldao)、辛基葡糖苷(og)、十二烷基麦芽糖苷(ddm)或其组合组成的组。
本发明还涉及制备并入有跨膜蛋白的囊泡的方法，其包括以下步骤：
a.将跨膜蛋白的水性溶液和聚醚胺混合；
b.将聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)作为水性溶液加入到步骤a制得的混合物中；
c.搅拌步骤b中得到的溶液。
所制备的囊泡也可称为聚合物囊泡或聚合囊泡。囊泡是在搅拌步骤中由两亲性嵌段共聚物在合适的溶剂(例如水)中形成的自组装结构。囊泡呈现为由双层壁包围的内部空腔，该双层壁可以并入各种结构，如跨膜蛋白。
聚合物囊泡的稳定性随着形成的聚合物的分子量的增加而增加。因此，聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)的平均分子量至少为1000道尔顿。然而，分子量太大往往难以组装成囊泡。因此，聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)的平均分子量优选不高于15,000道尔顿。在本发明的优选实施方式中，聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)为基本上线性的聚合物，其重均分子量在约2,500da至约10,000da之间。在本发明的替代实施方式中，聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)的分子量为10,000至15,000da。
囊泡的渗透性通常随着亲水与疏水比的增加而增加。因此，丙二醇单元的量通常高于乙二醇单元的量。聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷的嵌段共聚物(peo-ppo-peo)，俗称pluronic，具有低的亲水与疏水比值，且因此适于获得可渗透膜。在本发明的实施方式中，聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)具有化学式：
x表示10-30之间的整数，优选15-25；
y表示50-100之间的整数，优选60-80；和
z表示10-30之间的整数，优选15-25。
聚醚胺合适地具有结构通式：
其中，
m为1-15的整数；
n为5-50的整数；
r＝ch3。
在本发明的实施方式中，聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)和聚醚胺的重量比为5比1。
在步骤a中，在将水性跨膜蛋白(诸如水通道蛋白)与聚醚胺混合之前，适当地将该跨膜蛋白溶解在洗涤剂中。跨膜蛋白在洗涤剂中的溶解防止或改善了跨膜蛋白在水性溶液中沉淀的趋势。合适地，洗涤剂选自由月桂基二甲基胺-n-氧化物(ldao)、辛基葡糖苷(og)、十二烷基麦芽糖苷(ddm)或其组合组成的组。
在本发明的实施方式中，如上文公开所生产的囊泡被包括在分离膜中。在一种实施方式中，分离膜包含并入有囊泡的活性层和多孔支撑膜。多孔支撑膜基本上不应阻碍由跨膜蛋白转运的水和/或离子的通量。多孔支撑膜的主要目的是作为并入有囊泡的活性层的支架，从而使跨膜蛋白成为主要的差别元素。
在本发明的优选方面，活性层包含并入到在多孔基质膜上形成的薄膜复合物层中的囊泡。不希望受任何特定理论的束缚，据信在表面上含有胺基团的囊泡不仅物理上并入或固定(吸附)在tfc层中，而且还化学结合在tfc层中，因为反应性胺基团将参与与酰氯(诸如均苯三甲酰氯(tmc))的界面聚合反应。以此方式，据信囊泡将共价结合在tfc层中，从而导致囊泡负载量相对更高并因此导致通过膜的水通量更高。另外，据信当并入选择性膜层中时，tfc层中囊泡的共价偶联导致水通道蛋白和并入有水通道蛋白的囊泡具有更高的稳定性和/或寿命。
此外，当所述跨膜蛋白包含离子通道或水通道蛋白等，并且将包含所述跨膜蛋白的所述囊泡固定或并入所述活性或选择性层中时，制备具有不同选择性和转运特性的分离膜或过滤膜变得可行，例如，当所述跨膜蛋白是离子通道时的离子交换膜，或当所述跨膜蛋白是水通道蛋白时的水过滤膜。因为跨膜蛋白在复合到自组装囊泡中时保持其具有生物活性的折叠结构，其中可使其不被降解。即使敏感的两亲性蛋白也可变得足够稳定，并因此，当在实验室和工业规模中被加工成分离膜时仍保留了它们的所需功能。
本发明还涉及在多孔基质膜上制备固定了并入有跨膜蛋白的囊泡的薄膜复合物层的方法，其包括以下步骤：
a.提供包含如上所述制备的囊泡和二胺或三胺化合物的水性溶液；
b.用步骤a的水性溶液覆盖多孔支撑膜的表面；
c.施加包含酰卤化合物的疏水溶液；以及
d.使水性溶液和疏水溶液进行界面聚合反应，以形成薄膜复合物层。
二胺化合物可以选自一系列化合物，包括例如苯二胺，诸如间苯二胺、对苯二胺、2,5-二氯对苯二胺、2,5-二溴对苯二胺、2,4,6-三氯间苯二胺、2,4,6-三溴间苯二胺等；二氨基联苯，诸如2,2'-二氨基联苯、4,4'-二氨基联苯、3,3'-二氯-4,4'-二氨基联苯、3,5,3',5'-四溴-4,4'-二氨基联苯等；二氨基二苯基甲烷，诸如4,4'-二氨基二苯基甲烷、3,3'-二氨基二苯基甲烷、2,2'-二氨基二苯基甲烷、3,3'-二氯-4,4'-二氨基二苯基甲烷、2,2'-二氯-4,4'-二氨基二苯基甲烷、3,5,3',5'-四氯-4,4'-二氨基二苯基甲烷、3,5,3',5'-四溴-4,4'-二氨基二苯基甲烷等；二氨基联苄，诸如4,4'-二氨基联苄、3,5,3',5'-四溴-4,4'-二氨基联苄等；2,2-双氨基苯基丙烷，诸如2,2-双(4'-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3',5'-二氯4'-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3',5'-二溴-4'-氨基苯基)丙烷等；二氨基二苯砜，诸如4,4'-二氨基二苯砜、3,5,3',5'-四氯-4,4'-二氨基二苯砜、3,5,3',5'-四溴-4,4'-二氨基二苯砜等；二氨基二苯甲酮，诸如4,4'-二氨基-二苯甲酮、2,2'-二氨基二苯甲酮，3,3'-二氯-4,4'-二氨基二苯甲酮、3,5,3',5'-四溴-4,4'-二氨基二苯甲酮、3,5,3',5'-四氯-4,4'-二氨基二苯甲酮等；二氨基二苯醚，诸如3,3'-二氨基二苯醚、4,4'-二氨基二苯醚、3,3'-二溴-4,4'-二氨基二苯醚等；哌嗪、n-苯基-苯-1,3二胺、黑素以及此类化合物的混合物。在优选的方面，二胺选自间苯二胺(mpd)，也称为1,3-二氨基苯。
三胺化合物可以选自一系列化合物，包括例如二亚乙基三胺、二亚丙基三胺、亚苯基三胺、双(六亚甲基)三胺、双(六亚甲基)三胺、双(3-氨丙基)胺、六亚甲基二胺、n-牛脂基二丙撑、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺以及这些化合物的混合物。
酰卤化合物通常具有两个或三个可与二胺或三胺化合物反应的酰卤基团。二酰卤或三酰卤化合物的合适实例包括均苯三甲酰氯(tmc)、均苯三甲酰溴、间苯二甲酰氯(ipc)、间苯二甲酰溴、对苯二甲酰氯(tpc)、对苯二甲酰溴、己二酰氯、氰尿酰氯以及这些化合物的混合物。
二胺或三胺化合物的胺基团将与酰卤化合物的酰氯基团竞争反应。通常，二胺或三胺化合物与酰卤化合物的重量比为0:1至30:1。当表面上需要高密度的囊泡时，二胺或三胺基团的量通常在该范围的较低部分，即0:1至1:1，诸如0:1至0.5:1之间。在本发明的其他实施方式中，需要更刚性的tfc层，并且选择的反应物在该范围的较高部分，诸如1:1至30:1，优选1:1至5:1。
可以将水性胺溶液添加到均匀层中的多孔支撑膜上，并随后在施加酰卤溶液之前将其干燥。在本发明的某些实施方式中，将水性胺溶液施加到多孔支撑膜上，并随后在多孔支撑膜的相对侧上提供真空以刺激水性胺溶液渗透到多孔结构中。解除真空后，施加酰氯溶液以通过胺与酰氯的反应形成薄膜复合物层。真空的使用被认为能使薄膜复合物层更好地集成在多孔支撑膜中。
多孔支撑膜可以由多种材料形成。材料的具体选择不是必需的，只要支撑膜能够足以支撑tfc层并在操作条件下抵抗分解，即能够承受膜两侧的压力和/或化学环境即可。多孔支撑膜材料的具体实例包括聚砜或聚醚砜聚合物。支撑体可以是对称的或不对称的。在多孔支撑膜不对称的情况下，tfc层适当地形成于表层层面上。
在一些实施方式中，多孔支撑膜还可以被织造或非织造机械支撑体支撑，以增加机械构造并降低操作期间断裂的风险。
多孔支撑膜可以是本领域已知的任何物理外观，诸如平板膜、管状膜或中空纤维膜。在本发明的某方面，中空纤维膜是优选的，因为它提供了更高的堆积密度，即对于一定的体积活性膜面积更高。膜可以组合在一起或组装成本领域已知的模块。因此，多个平板膜可以组装成板框式膜配置。板框式膜系统利用铺设在板状结构顶部的膜，其又通过框状支撑件保持在一起。
平板膜还可以组装成螺旋缠绕式过滤器模块。除平板膜之外，螺旋缠绕膜模块还包括进料隔室和围绕被称为渗透管的中空管缠绕的渗透隔室。螺旋缠绕元件利用错流技术，并且由于其结构，可以容易地以不同的配置创造成具有不同长度、直径和膜材料。螺旋缠绕式过滤器模块的制造可以通过首先铺设膜，然后将其膜向内地对半折叠。然后将进料隔室放入折叠的膜之间，形成膜夹层。进料隔室的目的是为水在膜表面之间流动提供空间，并且允许膜叶之间的均匀流动。接下来，将渗透隔室附接到渗透管，并且使用胶将事先制备的膜夹层附接到渗透隔室。铺设下一个渗透层并用胶密封，并且重复整个过程，直到所有所需的渗透隔室都附接到膜。然后将完成的膜层缠绕在管上，形成螺旋形状。
管状膜模块是具有多孔壁的管状结构。管状模块通过切向错流工作，并且通常用于处理困难的进料流，诸如具有高溶解固体、高悬浮固体和/或油、油脂或脂肪的进料流。管状模块由至少两个管组成；内管，被称为膜管，以及外管，即外壳。进料流穿过膜管的长度并被过滤出来到外壳中，同时在膜管的相对末端处收集浓缩物。
中空纤维膜可以组装成模块。因此，本发明提供了通过在壳体中组装一束中空纤维来产生中空纤维模块的步骤，其中，用于传递第一溶液的入口在一端连接至中空纤维的腔，且出口在另一端连接至腔，并且在壳体中设有入口，用于将第二溶液传递到与壳体连接的出口。
根据本发明产生的膜模块可以以各种配置使用，包括正渗透配置和反渗透配置。
本发明还涉及包含内部货物的囊泡，其中带电囊泡能够在环境中的ph变化时释放内部货物。包含聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)和聚醚胺的混合物的囊泡在碱性ph值下是稳定的，诸如低于ph7或ph8或以上。然而，当囊泡外部的环境改变为酸值时，诸如ph值为ph7或以下或ph6或以下，则囊泡形成解离。囊泡的ph选择性行为提供了在碱性ph值下将货物并入囊泡中，将囊泡与货物转运到所需位置，并通过使囊泡处于将使囊泡解离的酸性条件下来释放货物的机会。
用于货物递送的囊泡具有与上述并入有跨膜蛋白的囊泡相同的组成和制备方法。由于制备方法的原因，囊泡处于非常碱性的ph值，即ph为ph7至ph14，且温度为30至90℃。初步测试表明，囊泡在室温下可稳定至少一年而无任何变化。
此外，囊泡在中性或碱性ph下会重新组装，从而容易在需要时并入内部货物而无需任何其他纯化步骤。
包含货物物质的囊泡可用作原位或体内递送包括生物活性部分的各种货物物质的载体系统。货物物质可以是生物活性物质，例如，诸如选自由小分子药物、生物分子、生物大分子和细胞组成的组的生物活性物质。生物活性物质可以负载在非生物活性载体上。货物物质可以是聚合物或无机颗粒。根据本发明可被用作货物物质的物质的说明性实例包括但不限于下列物质：小分子药物、生物分子、生物大分子(包括但不限于多糖、糖胺聚糖和蛋白质)、细胞(包括活细胞)、治疗剂(即在动物(诸如人)中引起可测量的生理反应的试剂)、荧光素、显色剂、酶、蛋白质(包括免疫调节蛋白和基质金属蛋白酶)、抗生素、麻醉剂、抗体、生长因子、激素、抗炎药、镇痛药、强心剂、精神药物、填充剂(例如无机和/或聚合物颗粒)、免疫治疗剂、细胞因子、寡核苷酸、标记物(例如荧光素、放射性核苷酸、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒、染料)等及其组合。
具体实施方式
广泛地，本发明涉及聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)和聚醚胺的混合物的用途，用于形成具有跨膜蛋白(诸如水通道蛋白水通道)的自组装囊泡。然后可以将已并入了跨膜蛋白的囊泡用于生产其中并入或固定了跨膜蛋白的分离膜，例如用于允许水分子通过该膜。例如，为了生产包含跨膜蛋白的分离膜，可以将囊泡添加到包含芳香胺(诸如二胺或三胺，例如1,3-二氨基苯(mpd))的水性液体组合物中应用于多孔支撑结构的表面，当与酰氯在有机溶剂中的溶液接触时，其将参与界面聚合反应以在所述支撑体上形成薄膜复合物活性或选择性层，从而形成分离膜，其中所述囊泡已被固定或并入。
不希望受任何特定理论的束缚，据信在表面上含有游离的可用nh2反应性基团的囊泡将不仅物理上并入或固定(吸附)在tfc层上，而且还化学结合在tfc层上，因为nh2反应性基团会参与与酰氯(诸如均苯三甲酰氯(tmc))的界面聚合反应。以此方式，认为囊泡将共价结合在tfc层中。此外，据信通过适当调节反应性组分，可以获得高的囊泡负载量，并因此获得更高的通过膜的特定区域的通量。另外，据信当并入选择性膜层中时，tfc层中囊泡的共价偶联导致包含跨膜蛋白的囊泡具有更高的稳定性和/或寿命。
此外，当所述跨膜蛋白包含离子通道或水通道蛋白等，并且将包含所述跨膜蛋白的所述囊泡固定或并入所述活性或选择性层中时，制造具有多种选择性和转运性质的新型分离膜或过滤膜变得可行，例如，当所述跨膜蛋白是离子通道时的离子交换膜，或当所述跨膜蛋白是水通道蛋白时的水过滤膜。因为跨膜蛋白在复合到自组装纳米结构中时保持其具有生物活性的折叠结构，其中可使其不被降解，即使敏感的两亲性蛋白也可变得足够稳定，并因此，当在实验室和工业规模中被加工成分离膜时仍保留了它们所需的功能。
本发明的分离膜在工业或家庭环境中可用于制备纯水滤液，诸如在纳滤过程或反渗透过程中通过分离膜过滤水溶液。出于本文的目的，术语“分离膜”包括用于水过滤和水分离的选择性渗透膜和半渗透膜，诸如不对称膜，其包含多孔支撑膜，在一侧上形成有选择性层，诸如薄的交联芳族聚酰胺层或薄膜或交替带电的聚电解质(l-b-l)层。另一侧可以通过通常由聚酯纤维制成的织造或非织造层或网来增强。
此外，本发明的分离膜可用于浓缩产物溶液的方法中，所述方法包括利用安装在过滤器壳体或模块中的本发明的分离膜来从产物溶液中提取水，例如通过正渗透。
在本发明的一个方面，包括中空纤维(hf)模块，其具有用包含本发明的囊泡制剂的选择性层修饰的一束中空纤维膜。优选地，选择性层包含通过界面聚合反应在纤维的内表面上形成的薄膜复合物(tfc)层，其中所述tfc层包含并入由聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)和聚醚胺的混合物组成的囊泡中的水通道蛋白水通道。
本发明的分离膜还可用于使用压力延缓渗透产生盐度能的方法中，所述方法包括利用所述分离膜来增加静水压力，并利用静水压力的增加作为盐度能的来源，参见wo2007/033675和wo2014128293(a1)。
如本文所用的术语“水通道蛋白水通道”包括功能性天然或合成水通道蛋白或水甘油通道蛋白水通道，诸如水通道蛋白z(aqpz)、glpf、sopip2；1、水通道蛋白1和/或水通道蛋白2。水通道蛋白水通道包括细菌水通道蛋白和真核水通道蛋白，诸如酵母水通道蛋白、植物水通道蛋白和哺乳动物水通道蛋白，以及相关的通道蛋白，诸如水甘油通道蛋白。水通道蛋白和水甘油通道蛋白的实例包括：原核水通道蛋白，诸如aqpz；哺乳动物水通道蛋白，诸如aqp1和aqp2；植物水通道蛋白，诸如质膜内在蛋白(pip)、液泡膜内在蛋白(tip)、结瘤素内在蛋白(nip)和小内在蛋白(sip)，例如sopip2；1、pttpip2；5和ptpip2；2；酵母水通道蛋白，诸如aqy1和aqy2；以及水甘油通道蛋白，诸如glpf和yfl054。水通道蛋白水通道蛋白质可以根据本文所述的或如karlsson等人(febsletters537：68-72,2003)列出的或如jensen等人us2012/0080377a1所述的方法来制备(例如参见实施例6)。
如本文所用的术语“分离膜”包括可用于将水和任选的某些小尺寸溶质(包括阴离子和阳离子)与其他溶质、颗粒、胶体和大分子分离的膜。分离膜的实例是“过滤膜”，诸如纳滤(nf)膜、正渗透(fo)膜和反渗透(ro)膜。一种类型的过滤膜是“薄膜复合物”(或tfc)膜，通常被分类为纳滤和反渗透膜。平板tfc膜通常是通过将聚酰胺层沉积在非织造或织造的织物支撑体顶部的聚醚砜或聚砜多孔层之上而制成的。聚酰胺排斥层是通过胺的水溶液与酰氯在有机溶剂中的溶液的界面聚合而形成的。tfc膜可按wo2013/043118(nanyangtechnologicaluniversity&aquaporina/s)所述生产。其他类型的过滤膜是通过逐层(lbl)沉积方法形成的那些，诸如在gribova等人(chem.mater.,24:854-869,2012)和wang等人(membranes,5(3):369-384,2015)中所述的。例如，如gribova等人的图4中概述的，本发明的囊泡可被嵌入或并入聚电解质多层(pem)膜中。
如本文所用的“薄膜复合物”或(tfc)膜可使用于水溶液中的胺反应物，优选芳族胺，诸如二胺或三胺，例如1,3-二氨基苯(间苯二胺，>99％，例如购自sigma-aldrich)，以及溶解于有机溶剂中的酰卤反应物，诸如二酰氯或三酰氯，优选芳族酰卤，例如苯-1,3,5-三羰基氯(cas编号84270-84-8，均苯三甲酰氯(tmc)，98％，例如购自sigma-aldrich)来制备，其中所述反应物在界面缩聚反应中结合，参见khorshidi等人(2016)scientificreports6，文章号：22069，和美国专利号：4,277,344，其详细描述了在支撑膜(例如聚醚砜膜)的表面形成包含层压在多孔膜支撑体上的聚酰胺的复合膜。将苯1,3,5-三羰基氯(均苯三甲酰氯)溶解在溶剂中，诸如c6-c12碳氢化合物，包括己烷(>99.9％，fisherchemicals)、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷等(直链或支链烃)或其他低芳烃溶剂，例如isopartmg流体，其由石油基原料产生，在催化剂存在下经氢处理以产生低气味流体，其主要成分包括异烷烃。isopartmg流体：化学名称：烃类，c10-c12，异烷烃，<2％芳烃；cas号：64742-48-9，化学名称：石脑油(石油)，加氢重质油(来自exxonmobilchemical)。反应物1,3-二氨基苯的替代物包括二胺，诸如六亚甲基二胺等，以及反应物苯-1,3,5-三羰基氯的替代物包括己二酰氯、氰尿酸等，如本领域已知的。
本发明的囊泡可称为“自组装”以描述通过两亲性物质(即聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)和聚醚胺的混合物)的亲水和疏水相互作用形成囊泡的过程。
如本文所用的“流体动力学直径”表示通过动态光散射(dls)测量的水性介质中纳米颗粒的流体动力学尺寸，定义为假设的硬球的尺寸，该假设的硬球以与被测量的颗粒相同的方式扩散。
正渗透(fo)或直接渗透是使用选择性且渗透性的膜来实现水与溶解的溶质的分离的一种渗透过程。用于该分离的驱动力是高浓度溶液(本文称为驱动)和低浓度溶液(称为进料)之间的渗透压梯度。渗透压梯度引起通过膜的净水流进入驱动，从而有效地浓缩进料。驱动溶液可以由单一或多种简单盐组成，或者可以是专门为正渗透应用定制的物质。进料溶液可以是稀释产物流，诸如饮料、废物流或海水，参见ifoa,http://forwardosmosis.biz/education/what-is-forward-osmosis/。
因此，fo的大多数应用分为三大类：产物浓缩、废物浓缩或产生清洁水作为浓缩过程的副产物。当在本文中使用时，术语“pafo”描述压力辅助正渗透过程。当在本文中使用时，术语“pro”描述压力延缓渗透，其可用于产生渗透能。本发明的膜可用于所有类型的正渗透过程，并且可以专门适应于每种正渗透类型。
本文使用的术语“反渗透”(ro)是指当在选择性渗透膜上施加的进料水压力用于克服渗透压时。反渗透通常从进料水中去除许多类型的溶解物质和悬浮物质，包括细菌，并且既用于工业过程也用于饮用水的生产。在ro过程期间，溶质保留在膜的加压侧并且纯溶剂(渗透物)通过到另一侧。选择性指定膜不允许更大的分子或离子通过其孔(洞)，同时允许溶液的较小组分(诸如溶剂分子)自由通过。低压反渗透(lpro)膜通常在从约<5bar的进料水压力和最高达约25bar的最大操作压力15lmh/bar的比流量下操作。lpro在较低的进料压力范围内进行，例如2至5bar，有时被指定为超低压反渗透。本领域已知的lpro膜具有典型的操作限制，用于进料水温度为约45℃，进料水ph在2至11的范围内，以及化学清洁在ph1至12的范围内。
参考以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1
由
材料：
通过以下方法来制备磷酸盐缓冲液10mm(pbs)(ph7.2，136mmnacl，2.6mmkcl)：将8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4溶解在800mlmiliq纯化的h2o中，用hcl将ph调节至7.2，并将体积补充至1l。
如下文公开的制备水通道蛋白z5mg/ml储备溶液。功能性水通道蛋白-z在大肠杆菌(e.coli)菌株bl21(de3)细菌培养物中作为带有烟草蚀刻病毒切割位点的his标记的蛋白过量生产。融合蛋白具有264个氨基酸，且mw为27234da。来自大肠杆菌dh5的基因组dna用作扩增aqpz基因的来源。使用基因特异性引物扩增aqpz基因并添加烟草蚀刻病毒切割位点(tev)；在aqpz的n末端添加enlyfqsn。用酶ndei和bamhi消化扩增的aqpz，然后连接到类似消化的6-his标记的表达pet28b载体dna上。通过pcr筛选验证阳性克隆。然后通过dna测序确认构建体的真实性。
大肠杆菌菌株bl21(de3)用于表达该蛋白。将含有50μg/ml卡那霉素的luriabroth培养基在37℃下温育13-16小时，稀释100倍至新鲜lb肉汤中并繁殖至约1.2-1.5(在600nm处的od)的密度。通过在35℃下添加1mmiptg3小时诱导重组蛋白质的表达，然后离心。在0.4mg/ml溶菌酶、50单位bensonase和3％正辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷的存在下，将收获的细胞重悬于冰冷结合缓冲液(20mmtrisph8.0、50mmnacl、2mmβ-巯基乙醇、10％甘油)中。将样品在12,000pa下于微流化器中进行五次裂解循环。通过以40,000xg离心30分钟压制不溶性物质。将上清液通过q-sepharose快速流动柱(amershampharmacia)，并收集10流过物(flowthrough)。将流过物级分用nacl补足至300mm，然后装载到预平衡的ni-nta柱上。用100柱体积的洗涤缓冲液(20mmtrisph8.0、300mmnacl、25mm咪唑、2mmβ-巯基乙醇、10％甘油)洗涤该柱，以除去非特异性结合的物质。用五床体积的洗脱缓冲液(20mmtrisph8.0、300mmnacl、300mm咪唑、2mmβ-巯基乙醇、10％15甘油、含有30mmn-辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷)洗脱ni-nta琼脂糖结合的物质。用阴离子交换色谱法；monoq柱(gehealthcare)进一步纯化aqpz。用amicon浓缩器稀释并浓缩样品混合物，使盐和咪唑的浓度达到约10mm，在装载到monoq柱之前，膜截断10,000da。在阴离子交换色谱法中使用的缓冲液为(a)20mmtrisph8.0、30mmog、10％甘油和(b)20mm20trisph8.0、1mnacl、30mmog、10％甘油。将离子交换柱中含有aqpz的洗脱峰级分合并。将纯化的aqpz提取物在-80℃下冷冻保存。
在纯化前一天，将aqp提取物(储存在-80℃冷冻箱中)在冰上或在4℃冷藏室中解冻。在4℃下准备好部分缓冲液和ddh2o。将aqp提取物在冰浴上于充分冷却的烧杯中用磁棒搅拌，以溶解所有沉淀物。将1.5体积的预冷无ldao的aqp结合缓冲液逐渐添加到1体积的溶解提取物中(使用另外的0.5体积缓冲液冲洗提取管和滤杯)，充分混合并通过无菌0.45μm真空滤杯过滤。对滤杯施加真空以避免过渡起泡，并将滤液置于冰上，在2小时内使用。
在rt下，将histrap柱用无菌水平衡，然后用aqp结合缓冲液平衡。流速设定为1ml/min(对于1ml的预填充柱)或2.5ml/min(对于5ml的预填充柱和自填充柱)。使用
将洗脱的级分加盖，并储存在冰上或4℃下。通过变性和天然page分析分别检查aqp纯度和构象。通过nanodrop测量蛋白质浓度。可以根据需要第二次和第三次处理提取流过物，以产生合适质量的aqp组合物。
在通过aqp质量分析后，通过添加冰冷的不含咪唑的含2％ldao的aqp结合缓冲液，将蛋白质浓度调节至5mg/ml。最后，通过0.45μm灭菌杯过滤使aqp灭菌，并储存于4℃的冷藏室中以在一个月内使用，或者储存于-80℃的冷冻箱中。
制备方法：
1.通过在玻璃量筒中将聚合物溶解在pbs中至终浓度为10mg/ml，制备
2.在烧瓶中称取15mg/ml
3.将水通道蛋白z储备溶液添加至终浓度为1/200aqpz/聚合物摩尔蛋白质比，其中聚合物为
4.将步骤1中制备的
5.在室温下以170转/min搅拌混合物过夜(不超过20小时)。
6.第二天早晨，取按步骤1至5的顺序获得的囊泡制剂，将其转移至储存瓶中并在室温下保存。
通过在0.5mnacl中进行dls、zeta电位和停流测量，对囊泡制剂的尺寸、透水性和zeta电位进行了测试。对于5个不同批次测量5次结果。
表1
通过在30℃至100℃范围的各种温度下将5ml囊泡制剂加热10min来测试温度稳定性和热性能，并通过dls和停流测量进一步确定它们的尺寸和透水性。
热处理不会显著影响制剂的稳定性，从而导致从室温下的约200nm到约1800nm的较大尺寸结构的直径缩小。从透水性的角度来看，最高至100℃都观察不到任何变化。记录了从1700到1687s-1的ki值。
ph行为表明，在1至7的ph范围内，囊泡制剂会分解为直径最大为20nm的胶束，并在碱性ph值(从9至13)下重新组装，显示出相同的尺寸180nm，且ki值为约1700s-1。
实施例2
bwro(苦咸水反渗透)膜的制备
这些膜是按照以下概述的步骤制得的：
a)将mpd溶解在milliq水中以达到2.5％(w/w)的浓度，参见下文；
b)将tmc溶解在isopar中至终浓度为0.15％w/v；
c)用约20ml/m2膜的mpd溶液覆盖矩形膜，例如5.5cm×11cmmembrana1fphpes膜，并在温和搅拌下静置30秒；
d)用实验室干燥纸(例如kim-wipe)将非活性侧(背面)干燥5-10秒；
e)将膜放在玻璃板上，并用n2温和地干燥，直到表面从亮变暗；
f)在膜边缘(≈1mm)周围贴上胶带；
g)将贴有膜的玻璃板放入玻璃或金属容器中，在一端加入约155ml/m2膜tmc-isopar，并温和地来回摇动30秒；
h)从储液器中取出玻璃板，并用n2干燥10-15秒。
移除胶带后，可将膜转移到milliq上，使新形成的活性面朝上，且如有必要，在后续步骤的处理过程中保持湿润。
mpd溶液计算：
称取1.05gmpd，并溶解于35mlmilliq中。加入7ml如实施例1所述制备的液体aqpz组合物。尽可能保持溶液中充满惰性气体(ar或n2)。
然后将尺寸为5.5cm×11cm的具有液体aqpz制剂的tfc膜安装在sterlitechcf042fo池(www.sterlitech.com)中，并使用去离子(milliq)水作为进料，以及1mnacl水溶液作为驱动，且进料和驱动速度为268ml/min，在fo模式下，进行持续时间为60分钟(5个膜)的测试和900分钟(4个膜)的测试。
结果列于表4中。
表4.在ro低压膜上测试的囊泡制剂。
实施例3
手工tfcfo(正渗透)过滤膜的制备
按照以下概述的步骤制备膜：
a)提供支撑膜，例如具有指状结构的pes非织造物，尺寸为5.5cm×11cm；
b)将3wt％mpd与3wt％ε-己内酰胺、0.5wt％nmp和93.5wt％di水混合，得到溶液；
c)添加0.1mg/ml实施例1的液体aqpz制剂，得到悬浮液；
d)将c)中的悬浮液温育2小时；
e)由0.09wt％tmc、0.9wt％丙酮和99.01wt％isopar制备tmc溶液；
f)将支撑膜在悬浮液d)中浸涂30秒；
g)用气刀进行干燥；
h)加入e)中的tmc溶液进行界面聚合；
i)然后在通风橱中干燥2min。
制备三个膜并将其安装在sterlitechcf042ro池(www.sterlitech.com)中，使用500ppmnacl作为进料在5bar下操作60分钟。
结果列于表5中。
表5.在fo手工膜上测试的囊泡制剂
实施例4
fo(正渗透)膜的制备
通过以下方法制备并入有aqpz的囊泡：首先将跨膜蛋白水溶液(如上制备的水通道蛋白z储备溶液)与聚醚胺(15mg/ml的
通过在多孔支撑体上的界面聚合，将所制备的囊泡并入聚酰胺薄膜复合物(tfc)膜中。制备包含囊泡混合物(6ml的上述制得的混合物)和间苯二胺溶液(通过将1.5gmpd溶解在52.5mlmilliq中制得)的水溶液。有机溶液由均苯三甲酰氯(tmc)和isopartme组成，其浓度为0.15％w/v。
如上所述，涂覆方案包括用水溶液浸泡多孔支撑体，然后温和地去除多余的部分。随后，施加有机溶液并形成聚酰胺层，将过量的有机溶液温和干燥。在测试之前，将膜储存在mili-q水中。
囊泡性质：ki1412s-1，ph9.83，zeta电位-0.339(平均)，尺寸：204nm(平均)，100％群体。使用来自malvern的zetasizernanozs通过动态光散射确定挤出囊泡的尺寸(流体动力学直径)。使用bio-logicsfm300停流装置，使用在517nm处的单色仪和在530nm处的截止滤波器，测试通过aqp通道的水通量。对于每个单独的停流测试，将0.13ml挤出的聚合物囊泡或aqp插入的聚合物囊泡与0.13mlnacl0.5m快速混合，这会导致水从囊泡中流出，从而导致囊泡收缩。用双指数方程拟合动力学数据，并确定与通过聚合物膜的水通量成正比的速率常数(s-1)。
该测试是在正渗透装置上进行的，以1m盐作为驱动溶液，并以5μm钙黄绿素作为进料。驱动和进料溶液逆流泵送，膜的活性侧面向进料溶液。结果列于下表6中。
表6
含有氨基修饰的并入有aqpz蛋白的囊泡的膜，与不含囊泡的膜相比，其性能得到了改善。通过膜的平均水通量(jv)提高了84％(jv＝11.17±1.61lm-2h-1相对jv＝4.85±1.02lm-2h-1)，而钙黄绿素(r)的截留率保持在可比较的水平(r>99％)。并入囊泡后，反向盐通量平均提高了50％(js＝1.23±0.25gm-2h-1相对js＝0.82±0.74gm-2h-1)，但是借助于比盐通量js/jv的总体性能仍然保持在可比较的水平上(具有囊泡的膜为0.14±0.02，相比于不含囊泡的膜为0.15±0.10)。
数据表明，氨基修饰的并入有水通道蛋白的囊泡是将aqpz蛋白并入到聚酰胺膜中的一种有效方式，使得在不影响比盐通量的情况下改善了水通量。不希望受任何特定理论的约束，可以解释为，由于存在反应性胺基团，因此在表面上含有胺基团的囊泡将不仅物理结合，而且还化学结合在tfc膜的聚酰胺层中。这些胺基团将参与与酰氯的界面聚合反应，以获得与该层共价结合的囊泡。共价键打开了更高的囊泡负载以及因此更高的通过膜的水通量的可能性。
实施例5
真空介导涂覆
将多孔支撑体安装在抽吸池中，使活性层朝上，并在下面面对非活性层施加真空泵。用于tfc层的支撑体是来自membranagmbh的micropes1fph微孔支撑体。将50ml含有mpd的水溶液和ro水中的制剂10-2-10倒入抽吸池中，覆盖多孔支撑体。然后，施加100mbar的吸力5分钟，将mpd和制剂吸到支撑体上。关闭真空，并施加50ml的含有tmc和isopar-e的有机溶液，并给出1分钟的反应时间以促进界面聚合。然后将有机溶液冲洗掉，并将膜干燥3分钟，然后将其转移到具有ro水的培养皿中，直到准备进行qc测试。
制剂10-2-10：10mg/mlpluronicf127(泊洛沙姆407)–2mg/mljeffaminem2005–10mg/ml水通道蛋白储备溶液。在pbs缓冲液中(137mmnacl，2,7mmkcl，10mmna2hpo4和2mmkh2po4)。
表7.对通过真空介导涂覆的正渗透膜的质量检测
尽管水通量和钙黄绿素截留率与对照试样没有实质性差异，但与涂有不含制剂的tfc层的对照相比，涂有含制剂的溶液的试样中的盐通量明显较低。这表明制剂的存在降低了盐通量(并因此增加了盐截留率)。当比较对照膜和制剂的盐通量时，非配对student’st检验显示出强烈的趋势，p值在0.053191(2％)到0.053386(10％)之间。在用于涂覆的水溶液中，制剂的百分比浓度的增加似乎并不影响盐截留率水平。
实施例6
并入有跨膜蛋白的氨基修饰的囊泡
并入有水通道蛋白z的囊泡的制备方法：
1.通过在玻璃量筒中将聚合物溶解于pbs中至终浓度为10mg/ml，制备
2.称取15mg/ml的
3.将水通道蛋白z储备溶液添加到
4.将步骤1中制备的
5.在室温下以170转/min搅拌混合物过夜(不超过20小时)。
6.第二天早晨，取按步骤1至5的顺序获得的囊泡制剂，将其转移至储藏瓶中并在室温下保存。
没有并入水通道蛋白z的对照囊泡的制备方法：
1.通过在玻璃量筒中将聚合物溶解于pbs中至终浓度为10mg/ml，制备
2.称取15mg/ml的
4.将步骤1中制备的
5.在室温下以170转/min搅拌混合物过夜(不超过20小时)。
6.第二天早晨，取按步骤1至5的顺序获得的囊泡制剂，将其转移至储藏瓶中并在室温下保存。
通过在0.5mnacl中进行dls、zeta电位和停流测量，对囊泡制剂的尺寸、透水性和zeta电位进行了测试。
囊泡的表征：
使用来自malvern的zetasizernanozs通过动态光散射来确定囊泡的尺寸(流体动力学直径)。使用bio-logicsfm300停流(sf)装置，使用在517nm处的单色仪和在530nm处的截止滤波器，测试通过囊泡膜的水通量。对于每个单独的sf测试，将0.13ml聚合物囊泡或aqpz包埋的聚合物囊泡样品与0.13mlnacl0.5m快速混合，这会导致水从囊泡流出，从而导致囊泡收缩。
表8
表8示出了渗透系数ki，其是基于并入有水通道蛋白z的囊泡和空白囊泡的停流光散射结果的指数增长来计算的。指数增长的分析是对显示最快收缩的第一群体的结构进行的。渗透系数ki(s-1)与通过聚合物膜的水通量成正比，且结果表明，水通道蛋白在囊泡中的存在显著增加了通过聚合物膜的水通量。水通道蛋白z的存在基本上不影响囊泡的其他性质，即流体动力学直径、zeta电位和ph都保持在相同水平。
实施例7
并入有重构水通道蛋白z的囊泡的tfcfo膜的制备方法：
a)提供支撑膜，例如，具有手指状结构的pes非织造物，尺寸为5.5cm×11cm；
b)在miliq水中制备mpd溶液，以获得2.5％(w/w)浓度。如果要将水通道蛋白并入膜中，则添加囊泡的溶液。mpd溶液的最终浓度可以含有10g/l至100g/l囊泡的溶液；
c)在isopare中制备tmc溶液，以获得0.15％(w/v)；
d)将矩形膜浸入mpd溶液中以完全覆盖膜表面；
e)将矩形膜从mpd溶液中转移，以在实验室干燥纸(例如kim-wipe)上干燥将为非活性面的一侧5-10秒；
f)将膜放在玻璃板上，并用n2温和干燥，直到表面从亮变暗；
g)在膜的边缘周围贴上胶带(≈1mm)；
h)将贴有膜的玻璃板转移到玻璃容器中，并用tmc溶液覆盖膜，以完全覆盖膜表面；
i)从储液器中取出玻璃板，并用n2干燥，直到表面从亮变暗；
j)将膜水平放置在玻璃板上约10秒，然后移除胶带；
k)将膜转移到装有milliq的第一容器中5分钟；
l)在后续步骤中所述的测试之前，将膜转移到装有milliq的第二容器中储存。
tfcfo膜的测试
然后将尺寸为5.5cm×11cm具有含水通道蛋白z制剂的tfcfo膜安装在sterlitechcf042fo池(www.sterlitech.com)中，并使用去离子(milliq)水中的5μm钙黄绿素作为进料，以及1mnacl水溶液作为驱动，并且进料和驱动速度为50ml/min，在fo模式下进行持续200分钟的测试。
表9
表9示出了掺入并入有水通道蛋白z蛋白的囊泡的膜的fo实验结果，并与空白膜(对照膜)进行了比较。可以得出结论：通过掺入并入有水通道蛋白z的囊泡，jv增加，并且js/jv保持在相同水平。