用于细胞培养的可溶性泡沫支架及其制造方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年11月21日提交的系列号为62/589,238的美国临时申请以及2018年2月19日提交的系列号为62/632,178的美国临时申请的优先权权益，本文以所述申请的内容为基础并将其全文纳入本文，如同在下文完整阐述。

本公开一般涉及可溶性细胞培养材料。具体地，本公开涉及用于细胞培养的可溶性泡沫支架以及制造所述可溶性泡沫支架的方法。

背景技术：

体外研究对于药物发现过程以及潜在的新疗法的开发是重要的。然而，在二维(2d)培养基材上进行的传统体外细胞培养不能够模拟体内环境。由于在体内环境中的几乎所有细胞均被其他细胞和细胞外基质(ecm)以三维(3d)方式包围，因此2d细胞培养不足以模拟细胞的天然3d环境。2d培养中的细胞被迫使粘附于刚性表面并且在几何上受限，从而采取扁平形貌，这改变了在细胞内信号转导时重要的细胞骨架调节，结果可影响细胞生长、迁移和凋亡。另外，ecm的组构对细胞分化、增殖和基因表达是重要的，而在大多数2d细胞中不存在ecm的组构。2d培养的这些限制常导致体外的生物学响应明显不同于体内观察到的生物学响应。

目前，在药物发现中，筛选化合物的标准程序从基于2d细胞培养的测试开始，之后是动物模型测试，接着是临床试验。根据公开的可用数据，仅约10％的化合物成功地通过临床开发。许多药物在临床试验期间失败(尤其是在iii期临床期间，而这是临床开发的最昂贵阶段)，这主要是因为缺少临床功效和/或具有不可接受的毒性。这些失败情况中的一部分归因于从2d培养测试收集到的数据，其中，由其非天然微环境，对药物的细胞应答发生了改变。由于与药物发现相关的高成本，因此需要提高在药物发现过程中尽早排除无效和/或不可接受的有毒化合物的能力。目前正在考虑可更真实地模拟体内细胞行为并对体内测试提供更可预测性结果的基于体外细胞的系统。

最近的研究提示，与2d培养不同，3d细胞培养更准确地代表了细胞在体内所经历的环境，并且已经证明，3d培养中的细胞应答比2d培养中的细胞应答更加近似于体内行为。3d培养的额外维度被认为是导致细胞应答差异的原因，因为其不仅影响参与同周围细胞相互作用的细胞表面受体的空间组织，而且还诱导对细胞的物理约束。3d培养中的这些空间和物理形态被认为影响从细胞外到细胞内的信号转导，并最终影响基因表达和细胞行为。

3d培养的益处已经影响了模拟细胞的天然3d环境的细胞培养技术的发展。一些生物反应器包括形成固定或填充床的静止填充材料形式的载体，以用于促进细胞粘附和生长。固定床的填充材料的布置影响局部流体、热和质量运输，并且通常非常致密以在给定空间中使细胞培养最大化。另一种3d细胞培养技术是多孔3d基质或支架，其促进孔内以及基质的其他内部空间中的被培养细胞的生长和增殖。

在上述每种技术中，蛋白酶处理可以用于收获细胞。然而，常用的收获程序(例如蛋白酶处理)使细胞经受可能损伤细胞结构和功能的苛刻条件。另外，单独的蛋白酶处理常仅造成有限量的细胞剥离。对于固定床材料，问题部分是由于固定床材料的致密填充性质，这使得更加难以使蛋白酶剂循环通过固定床并增加收获的细胞的产率。类似地，可能难以使蛋白酶剂循环通过3d基质的内部空间，这进而使得在收获过程期间难以移出细胞。由培养的细胞分泌的细胞外大分子的存在使这一困难变复杂，所述细胞外大分子用于将细胞粘附于固定床材料的表面或基质的表面。

替代性地或与蛋白酶处理结合，已经开发了用于收获细胞的方法和系统，其施加机械力来从固定床材料或3d基质释放培养的细胞。例如，可以晃动或振荡固定床材料或3d基质，或者包括固定床材料或3d基质的更大系统，以释放培养的细胞。机械力的施加也可能对培养的细胞造成物理损伤，进而降低细胞培养产率。

技术实现要素：

根据本公开的实施方式，本文提供了用于细胞培养的可溶性泡沫支架。所述可溶性泡沫支架包括具有表面活性的至少一种第一水溶性聚合物以及离子移变(ionotropically)交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐。

根据本公开的实施方式，提供了用于形成可溶性泡沫支架的方法。所述方法包括：通过将聚半乳糖醛酸化合物加入到水性溶液中形成第一水性混合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐；通过将至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物和二价金属盐加入到水性溶液中来形成第二水性混合物；合并第一水性混合物与第二水性混合物以形成合并的水性混合物；将凝胶诱导剂加入到合并的水性混合物中；以及将气泡引入到合并的水性混合物中以形成泡沫支架。

根据本公开的实施方式，提供了用于在可溶性泡沫支架上培养细胞的方法。所述方法包括：将细胞接种在可溶性泡沫支架上以使细胞进入可溶性泡沫支架的孔，以及使可溶性泡沫支架接触细胞培养基。所述可溶性泡沫支架包括具有表面活性的至少一种第一水溶性聚合物以及离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐。

根据本公开的实施方式，提供了从可溶性泡沫支架收获细胞的方法。所述方法包括：通过将可溶性泡沫支架暴露于酶来消化可溶性泡沫支架，以及将可溶性泡沫支架暴露于螯合剂。所述可溶性泡沫支架包括至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物以及离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐。根据本公开的实施方式，提供了由组合物形成的泡沫支架产品。所述组合物包括离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐，以及包括至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物，以及小于约55重量％的水溶性增塑剂。

在以下的具体实施方式中给出了其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言，根据所作描述就容易看出，或者通过实施包括以下具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所述的各个实施方式而被认识。

应理解，前面的一般性描述和以下的具体实施方式都仅仅是示例性的，并且旨在提供用于理解权利要求的性质和特性的总体评述或框架。所附附图提供了进一步理解，附图被结合在本说明书中并构成说明书的一部分。附图说明了一个或多个实施方式，并与说明书一起用来解释各种实施方式的原理和操作。

附图说明

通过以下的说明和附图能够更加清晰地理解本公开，以下附图仅作为非限制性的实例给出，其中：

图1是根据本公开所述的可溶性泡沫支架的透视图；

图2示出了在实施例1中制备的泡沫支架的sem图；

图3示出了在实施例2中制备的泡沫支架的sem图；

图4示出了在实施例3中制备的泡沫支架的sem图；

图5示出了在实施例4中制备的泡沫支架的sem图；

图6示出了在实施例5中制备的泡沫支架的sem图；

图7示出了在实施例6中制备的泡沫支架的sem图；

图8示出了在实施例7中制备的泡沫支架的sem图；

图9示出了在实施例8中制备的泡沫支架的sem图；

图10示出了在实施例9中制备的泡沫支架的sem图；

图11示出了在实施例10中制备的泡沫支架的sem图；

图12示出了在实施例11中制备的泡沫支架的sem图；

图13示出了在实施例12中制备的四种泡沫，在实施例12中添加有不同量的增塑剂以形成该四种泡沫支架；

图14示出了在实施例13中制备的泡沫支架的sem图；

图15示出了在实施例4中制备的泡沫支架的孔中形成的球体；

图16示出了粘附于实施例14中制备的泡沫支架的细胞；

图17示出了粘附于实施例15中制备的泡沫支架的细胞；

图18示出了扩增6天后，粘附于实施例15中制备的泡沫支架的细胞；

图19是示出了实施例24的每种培养条件的转染hek细胞的gfp阳性百分比的条形图；

图20是示出了实施例25的每组泡沫支架的转染细胞的gfp阳性百分比的条形图；

图21是示出了实施例25的每组泡沫支架的病毒颗粒(vp)的数目的条形图；

图22是示出了实施例25的每组泡沫支架获得的每个细胞的病毒颗粒的数目的条形图；以及

图23是示出了对于实施例25的各泡沫支架组，在感染后展现出gfp表达的细胞的分数的条形图。

具体实施方式

下面对本公开的实施方式作详细说明，这些实施方式的实例在附图中示出。只要可能，在附图中使用相同的附图标记表示相同或相似的部分。

除非上下文明确有其他的说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指代物。阐述相同特征的所有范围的端点可独立地组合并包含所述端点。所有参考文献都以参考的方式纳入本文中。

如在本文中所使用的，“具有”、“具备”、“含有”、“包括”、“包含”、“含”等以其开放含义使用，通常表示“包括但不限于”。

除非另外说明，本文中使用的所有科技术语的含义具有本领域通用的含义。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本公开的范围构成限制。

下文首先概括地描述本公开，然后在几个示例性实施方式的基础上详细描述本公开。在各个示例性实施方式中彼此组合示出的各特征并非都必须实现。特别地，各个特征也可以省略或与相同的示例性实施方式或其他示例性实施方式所示的其他特征以其他方式组合。

本公开的实施方式涉及用于细胞培养的可溶性泡沫支架以及制造所述可溶性泡沫支架的方法。本公开的实施方式还涉及用于在可溶性泡沫支架中进行粘附细胞、细胞聚集体或球体的细胞培养的方法。另外，本公开的实施方式涉及包括可溶性泡沫支架的生物反应器系统。如将在下文论述中变得更清楚的，本文公开的泡沫支架被描述成可溶的和不溶的。如本文所用的术语“不溶的”用于指材料或材料的组合是不可溶的，并且在常规细胞培养条件(包括例如细胞培养基)下保持交联的。如本文所用的术语“可溶性”用于指材料或材料的组合被暴露于适当浓度的消化或分解材料或材料的组合的酶时，所述材料或材料的组合被消化。本文所述的可溶性泡沫支架是多孔支架，其具有开孔构造和高度互连的孔。支架的孔为细胞培养提供了保护性环境，其中有助于细胞间相互作用以及以3d方式形成ecm。可溶性泡沫支架可以被完全消化，这能够允许使用蛋白酶处理和/或机械收获技术收获细胞而不损伤细胞。

图1是根据本公开所述的可溶性泡沫支架10的透视图。如下文将进一步详细描述并且如根据本公开的其他附图将变得更清楚，可溶性泡沫支架10是包括开孔构造的多孔泡沫。可溶性泡沫支架10的孔隙率为约85％至约96％，并且平均孔尺寸直径为约50μm至约500μm。可溶性泡沫支架10在泡沫支架的孔内为细胞培养提供了保护性环境。另外，当被暴露于适当的酶时，可溶性泡沫支架10也是可溶解的，所述酶消化或分解材料，促进收获在支架中培养的细胞而不会损伤细胞。

如本文所述的可溶性泡沫支架包括至少一种离子移变交联的多糖。一般而言，多糖具有有益于细胞培养应用的属性。多糖是亲水的、无细胞毒性的并且在培养基中是稳定的。实例包括果胶酸[其也被称为聚半乳糖醛酸(pga)]或其盐，部分酯化的果胶酸或其盐，或者部分酰胺化的果胶酸或其盐。果胶酸可通过水解某些果胶酯形成。果胶是细胞壁多糖，并且在自然界中对植物有结构作用。果胶的主要来源包括柑橘果皮(例如，柠檬和酸橙的果皮)以及苹果皮。果胶主要是基于1,4-连接的α-d-半乳糖醛酸酯骨架的线性聚合物，所述骨架被1,2-连接的l-鼠李糖随机中断。平均分子量在约50,000至约200,000道尔顿的范围内。

果胶的聚半乳糖醛酸链可部分酯化，例如，被甲基部分酯化，并且游离的酸基团可以用单价离子，例如钠、钾或铵离子部分或完全中和。用甲醇部分酯化的聚半乳糖醛酸被称为果胶酯酸，其盐被称为果胶酯酸盐(pectinate)。高甲氧基(hm)果胶的甲基化程度(dm)可为例如60摩尔％至75摩尔％，并且低甲氧基(lm)果胶的甲基化程度可为1摩尔％至40摩尔％。本文所述的部分酯化的聚半乳糖醛酸的酯化程度可以小于约70摩尔％，或小于约60摩尔％，或小于50摩尔％，或者甚至小于约40摩尔％，以及其间的所有数值。不希望囿于任何特定理论，认为最小量的游离羧酸基团(未酯化)促进了一定程度的离子移变交联，其使得形成了不溶的可溶性支架。

或者，果胶的聚半乳糖醛酸链可以被部分酰胺化。聚半乳糖醛酸部分酰胺化的果胶可以例如通过用氨处理来产生。酰胺化果胶含有羧基(～cooh)，甲酯基(～cooch3)和酰胺化基团(-conh2)。酰胺化的程度可以变化，并且例如可以是约10％至约40％酰胺化。

根据本公开的实施方式，本文所述的可溶性泡沫支架可以包括果胶酸和部分酯化的果胶酸的混合物。也可以使用具有相容性聚合物的掺混物。例如，果胶酸和/或部分酯化的果胶酸可以与其他多糖混合，例如，葡聚糖、取代的纤维素衍生物、藻酸、淀粉、糖原、阿拉伯木聚糖、琼脂糖等。还可使用葡糖胺基葡聚糖(glycosaminoglycans)，如透明质酸和硫酸软骨素，或者各种蛋白质，如弹性蛋白、纤维蛋白、丝纤蛋白、胶原及它们的衍生物。水溶性合成聚合物也可与果胶酸和/或部分酯化的果胶酸掺混。示例性的水溶性合成聚合物包括但不限于聚亚烷基二醇、聚(羟基烷基(甲基)丙烯酸酯)、聚(甲基)丙烯酰胺和衍生物、聚(n-乙烯基-2-吡咯烷酮)、和聚乙烯基醇。

根据本公开的实施方式，本文所述的可溶性泡沫支架还可以包括至少一种第一聚合物。所述至少一种第一聚合物是水溶性的、非离子移变交联的并且具有表面活性。如本文所用的术语“表面活性”是指用于降低或消除两种液体之间或液体与固体之间或者气体与液体之间的表面张力(或界面张力)的试剂的活性。所述至少一种第一聚合物的亲水亲油平衡值(hlb)可以大于约8或者甚至大于约10。例如，所述至少一种第一聚合物的hlb可以在约8至约40之间，或者在约10至约40之间。所述至少一种第一聚合物的hlb可以在约8至约15之间，或者甚至在约10至约12之间。hlb提供了聚合物的亲油或亲水程度的参考。较大的hlb值表示更强的亲水性，而较小的hlb值表示更强的亲油性。一般地，hlb值在1至40的范围内变化，并且亲水-亲油转变常被认为在约8至约10之间。当hlb值小于亲水-亲油转变时，材料是亲油的，并且当hlb值大于亲水-亲油转变时，材料是亲水的。

根据本公开的实施方式所述的示例性第一聚合物可以是纤维素衍生物、蛋白酶、合成两亲聚合物或其组合中的任一种。示例性的纤维素衍生物包括但不限于：羟乙基纤维素(hec)、羟丙基纤维素(hpc)、甲基纤维素(mc)、羟乙基甲基纤维素(hemc)和羟丙基-甲基纤维素(hpmc)。示例性的蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白(bsa)、明胶、酪蛋白和疏水蛋白。示例性的合成两亲聚合物包括但不限于以商标名获得的泊洛沙姆[商购自英国斯奈思的禾大国际公司(crodainternational)]，以商标名获得的泊洛沙姆[商购自新泽西州帕西帕尼的巴斯夫公司(basfcorp.)]，以及以商标名获得的泊洛沙姆(商购自新泽西州帕西帕尼的巴斯夫公司)。

如本文所述的可溶性泡沫支架还可以包括至少一种第二聚合物。所述至少一种第二聚合物是水溶性的并且不具有表面活性。示例性的第二聚合物可以为合成聚合物、半合成聚合物、天然聚合物及其组合中的任何一种。示例性的合成聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基醇、羧基乙烯基聚合物、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、n-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺的均聚物和共聚物、聚乙烯基甲基醚-马来酸酐以及聚环氧乙烷/聚环氧丙烷嵌段共聚物。示例性的半合成聚合物包括但不限于：葡聚糖衍生物、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和衍生物、甲基纤维素和衍生物、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素以及羟丙基纤维素。示例性的天然聚合物包括但不限于淀粉和淀粉衍生物，通过微生物发酵获得的聚合物，例如，可得然胶、普鲁兰多糖和结冷胶，黄原胶，葡聚糖，蛋白质，例如白蛋白、酪蛋白和酪蛋白酸盐，明胶，海藻提取物，例如琼脂、藻酸盐和卡拉胶，种子提取物，例如瓜尔胶和衍生物以及槐豆胶、透明质酸和硫酸软骨素。

本文所述的可溶性泡沫支架可以经过交联以增加它们的机械强度，并且当被放置成与细胞培养基接触时，防止支架溶解。交联可以通过下文所述的离子移变凝胶化进行，其中，离子移变凝胶化是基于聚合电解质在多价抗衡离子的存在下交联以形成交联骨架的能力。不希望囿于任何特定理论，认为，可溶性泡沫支架中的多糖的离子移变凝胶化是由于二价阳离子与多糖之间的强相互作用的结果。

根据本公开的实施方式，本文所述的支架是多孔泡沫支架。本文所述的泡沫支架的孔隙率可以是约85％至约96％。例如，本文所述的泡沫支架的孔隙率可以是约91％至约95％，或约94％至约96％。如本文所使用的，术语“孔隙率”是指开孔体积在可溶性支架中的量度，并且是就％孔隙率而言，其中，％孔隙率是空隙在可溶性泡沫支架的总体积中的百分比。本文所述的泡沫支架的平均孔尺寸直径可以在约50μm至约500μm之间。例如，平均孔尺寸直径可以在约75μm至约450μm之间，或在约100μm至约400μm之间，或者甚至在150μm至约350μm之间，以及其间的所有数值。

本文所述的支架的湿密度可以小于约0.40g/cc。例如，本文所述的支架的湿密度可以小于约0.35g/cc，或小于约0.30g/cc，或小于约0.25g/cc。本文所述的支架的湿密度可以在约0.16g/cc至约0.40g/cc之间，或在约0.16g/cc至约0.35g/cc之间，或在约0.16g/cc至约0.30g/cc之间，或者甚至在约0.16g/cc至约0.25g/cc之间，以及其间的所有数值。本文所述的支架的干密度可以小于约0.20g/cc。例如，本文所述的支架的干密度可以小于约0.15g/cc，或小于约0.10g/cc，或小于约0.05g/cc。本文所述的支架的干密度可以在约0.02g/cc至约0.20g/cc之间，或在约0.02g/cc至约0.15g/cc之间，或在约0.02g/cc至约0.10g/cc之间，或者甚至在约0.02g/cc至约0.05g/cc之间，以及其间的所有数值。

在支架中可具有几种孔类型。开孔允许细胞在支架的两侧上可及，并且允许液体流动及营养物质运输通过可溶性支架。部分开孔允许细胞在支架的一侧上可及，但是营养物质和废产物的质量运输限于扩散。闭孔不具有开口并且细胞不可及或者营养物质和废产物的质量运输不可及。本文所述的可溶性泡沫支架具有开孔构造和高度互连的孔。一般来说，所述开孔构造和高度互连的孔能够实现细胞迁移到可熔性泡沫支架的孔中，并且还促进增强营养物质、氧气和废产物的质量运输。开孔构造还通过向细胞间相互作用提供高的表面积以及向ecm再生提供空间而影响细胞粘附和细胞迁移。

当被暴露于使材料消化或分解的适当的酶时，本文所述的可溶性泡沫支架被消化。适于消化泡沫支架，收获细胞或者既适于消化泡沫支架又适于收获细胞的非蛋白水解酶包括果胶裂解酶或果胶酶，它们是水解果胶物质的相关酶的异质组。果胶酶(聚半乳糖醛酸酶)是将复杂的果胶分子分解成较短的半乳糖醛酸分子的酶。果胶酶的商购来源一般是多酶，例如pectinex^tmultrasp-l[商购自北卡罗来纳州弗兰克林顿的诺维信北美公司(novozymenorthamerican,inc.)]，其是一种由选定的棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)株产生的果胶裂解酶制剂。pectinex^tmultrasp-l主要含有聚半乳糖醛酸酶,(ec3.2.1.15)果胶反式消去酶(ec4.2.2.2)和果胶酯酶(ec:3.1.1.11)。ec名称是基于酶催化的化学反应，针对酶的酶委员会分类方案。

根据本公开的实施方式，可溶性泡沫支架的消化还包括将所述支架暴露于二价阳离子螯合剂。示例性的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、环己二胺四乙酸(cdta)、乙二醇四乙酸(egta)、柠檬酸和酒石酸。

完成本文所述的可溶性泡沫支架的消化的时间可以小于约1小时。例如，完成泡沫支架的消化的时间可以小于约45分钟，或小于约30分钟，或小于约15分钟，或在约1分钟至约25分钟之间，或在约3分钟至约20分钟之间，或者甚至在约5分钟至约15分钟之间。

根据本公开的实施方式，本文所述的支架还可以包括附着聚合物涂层。所述附着聚合物可以包括肽。示例性的肽可以包括但不限于bsp、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、i型和iv型胶原、变性胶原(明胶)以及类似肽和它们的混合物。另外，所述肽可以是具有rgd序列的那些。所述涂层例如可以是ii-sc[商购自纽约州康宁市的康宁股份有限公司(corning,incorporated)]。任选地，所述附着聚合物可以包括细胞外基质。所述涂层例如可以是(商购自纽约州康宁市的康宁股份有限公司)。

根据本公开的实施方式，本文还公开了用于形成本文所述的可溶性泡沫支架的方法。本文所述的方法可以包括：形成第一水性混合物，其包括将多糖溶解在水性溶液中。多糖可以是如上所述的那些，例如果胶酸或其盐，部分酯化的果胶酸或其盐，或者部分酰胺化的果胶酸或其盐，以及这些多糖的掺混物。

本文所述的用于形成可溶性泡沫支架的方法可以进一步包括在水性溶液中形成包含水不溶性二价金属盐的第二水性混合物。二价金属盐的金属可以包括但不限于镁、钙、锌、锶、钡和类似的阳离子及其组合。二价金属盐的阴离子可以包括但不限于草酸根、酒石酸根、磷酸根、碳酸根、柠檬酸根，以及类似的有机和无机阴离子，及其组合。

根据本公开的实施方式，形成第二水性混合物可以进一步包括：将如上所述的至少一种第一聚合物加入到第二水性混合物中。任选地，本文所述的方法可以进一步包括：将如上所述的至少一种第二聚合物加入到第二水性混合物中。根据本公开的实施方式，所述至少一种第一聚合物和所述至少一种第二聚合物可以单独地被加入到第二水性混合物中，或者可以一起被加入到第二水性混合物中。当作为混合物加入时，所述混合物可以包含约50％的所述至少一种第一聚合物和约50％的所述至少一种第二聚合物。例如，所述混合物可以包括约35％至约65％(以及其间的所有数值)的所述至少一种第一聚合物和约35％至约65％(以及其间的所有数值)的所述至少一种第二聚合物。

根据本公开的实施方式，形成第二水性混合物可以进一步包括：将水溶性增塑剂加入到第二水性混合物中。本文所述的增塑剂是无毒性的并且不影响可溶性泡沫支架的多糖的溶解性。增塑剂向所得泡沫提供了挠性和柔软性，使得所得泡沫柔软且柔韧。本文所述的增塑剂可以包括但不限于多羟基醇，例如，丙三醇、山梨糖醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇及其组合。将水溶性增塑剂加入到第二水性混合物中可以包括：加入小于被添加以形成第二水性混合物的总固体添加剂的约55重量％。例如，将水溶性增塑剂加入到第二水性混合物中可以包括：加入小于被添加以形成第二水性混合物的总固体添加剂的约50重量％，或小于约40重量％，或小于约30重量％，或小于约25重量％，或约15重量％至约55重量％，或约15重量％至约50重量％，或约15重量％至约40重量％，或约15重量％至约30重量％，或约15重量％至约25重量％，以及其间的所有数值。如本文所用的术语“被添加以形成第二水性混合物的总固体添加剂”是指除水之外的水性混合物中的所有组分。

根据本公开的实施方式，形成第二水性混合物可以进一步包括：将乳化剂加入到第二水性混合物中。本文所述的乳化剂可以包括但不限于20、80(各自商购自英国斯奈思的禾大国际公司)。

根据本公开的实施方式，形成第二水性混合物可以进一步包括：将至少一种可浸出固体加入到第二水性混合物中。本文所述的可浸出固体包括在泡沫支架的形成期间强化或产生孔的材料。可浸出固体可以为但不限于无毒性的可浸出材料，例如，盐、生物相容性单糖和双糖以及水溶性蛋白质。示例性的盐包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙、酒石酸钠、柠檬酸钠等。示例性的生物相容性单糖和双糖包括但不限于葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖。示例性的水溶性蛋白质包括但不限于明胶和琼脂糖。

上述关于第二水性混合物所述的每种材料均可以被任选地加入到第二水性混合物中，并且可以以任何顺序加入到第二水性混合物中，并且两种或更多种材料可以同时被加入到第二水性混合物中。在一个示例性方法中，形成第二水性混合物包括：将可浸出固体加入到包含二价金属盐的水性溶液中，以及混合该水性混合物以促进可浸出固体的溶解物溶于水性混合物中。随后将所述至少一种第一聚合物、所述至少一种第二聚合物和/或所述水溶性增塑剂加入到第二水性混合物中。

用于形成本文所述的可溶性泡沫支架的方法可以进一步包括：在形成第一水性混合物和第二水性混合物之后，将第二水性混合物与第一水性混合物合并以形成合并的水性混合物。通过混合、搅拌、搅动、充气、搅打、注入或其他机械动作将气泡引入到水性混合物中，可以由合并的水性混合物形成泡沫。气体可以例如但不限于空气、氮气、氦气、氢气、氩气、二氧化碳或其他惰性气体。将气泡引入到合并的水性混合物中则可以进行小于约30分钟的时间，例如，约1分钟至约30分钟，或约3分钟至约25分钟，或者甚至约5分钟至约20分钟。在将气泡引入到合并的水性混合物中的同时，用于形成可溶性泡沫支架的方法可以进一步包括将凝胶诱导剂加入到合并的水性混合物中。所述凝胶诱导剂可以是提供缓冲作用的酸和/或缓慢产生酸的材料。示例性的酸包括但不限于乳酸内酯、乙醇酸内酯、葡萄糖酸δ内酯和酸酐。

本文所述的用于形成可溶性泡沫支架的方法可以进一步包括：用附着聚合物涂层涂覆可溶性泡沫支架。涂覆可溶性泡沫支架可以包括：将支架暴露于其中具有附着聚合物的水性溶液。如前所述，附着聚合物可以包括肽。示例性的肽可以包括但不限于bsp、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、i型和iv型胶原、变性胶原(明胶)以及类似肽和它们的混合物。另外，所述肽可以是具有rgd序列的那些。所述涂层例如可以是ii-sc(商购自纽约州康宁市的康宁股份有限公司)。

根据本公开的实施方式，还公开了用于在本文所述的可溶性泡沫支架上培养细胞的方法。在所述可溶性泡沫支架上可以培养任何类型的细胞，包括但不限于永生化细胞、原代培养细胞、癌细胞、干细胞(例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞)等。所述细胞可以是哺乳动物细胞、禽细胞、鱼细胞等。所述细胞可以属于任何组织类型，包括但不限于肾、成纤维细胞、乳房、皮肤、脑、卵巢、肺、骨、神经、肌肉、心脏、结直肠、胰腺、免疫(例如，b细胞)、血液等组织类型。在袋中，所述细胞可以为任何培养形式，包括分散(例如刚接种的)、融合、二维、三维、球体等。在可溶性泡沫支架上培养细胞可以包括：将细胞接种在可溶性泡沫支架上。在可溶性泡沫支架上接种细胞可以包括：使支架与含有细胞的溶液接触。在将细胞接种在可溶性泡沫支架上期间，细胞进入可溶性泡沫支架的孔。如果可溶性泡沫支架包括附着聚合物涂层，则细胞可以进入可溶性泡沫支架的孔并且粘附于支架材料。

在可溶性泡沫支架上培养细胞可以进一步包括：使支架与细胞培养基接触。一般而言，使支架接触细胞培养基包括：将要在支架上培养的细胞放置在将要在其中培养细胞的具有培养基的环境中。使支架与细胞培养基接触可以包括：将细胞培养基移取到支架上，或者将支架浸没在细胞培养基中，或者使细胞培养基以连续的方式在支架上通过。一般而言，如本文所用的，术语“连续的”是指在细胞培养基持续地流入及流出细胞培养环境的情况下培养细胞。这种使细胞培养基以连续的方式在支架上通过可以包括将支架浸没在细胞培养基中预定的时间，在该预定的时间之后接着移除至少一些的细胞培养基并加入新鲜的细胞培养基，以使得与可溶性泡沫支架接触的细胞培养基的体积保持基本上恒定。可以根据任何预定的计划移除和更换细胞培养基。例如，可以每一小时，或者每12小时，或者每24小时，或者每2天，或者每3天，或者每4天，或者每5天移除和更换至少一些细胞培养基。

细胞培养基可以例如但不限于糖、盐、氨基酸、血清(例如胎牛血清)、抗生素、生长因子、分化因子、着色剂或其他所需因子。示例性的细胞培养基包括达氏修正依氏培养基(dmem)、汉氏f12营养混合物、最低必需培养基(mem)、rpmi培养基、伊思考夫改良杜尔贝可培养基(imdm)mesencult^tm-xf培养基等。

根据本公开的实施方式，还公开了用于从本文所述的可溶性泡沫支架收获细胞的方法。本文所述的用于收获细胞的方法可以包括：通过将可溶性泡沫支架暴露于酶来消化可溶性泡沫支架。如前所述，适于消化泡沫支架，收获细胞或者既适于消化泡沫支架又适于收获细胞的非蛋白水解酶包括果胶裂解酶或果胶酶，它们是水解果胶物质的相关酶的异质组。果胶酶的商购来源一般是多酶，例如pectinex^tmultrasp-l[商购自北卡罗来纳州弗兰克林顿的诺维信北美公司(novozymenorthamerican,inc.)]，其是一种由选定的棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)株产生的果胶裂解酶制剂。pectinex^tmultrasp-l主要含有聚半乳糖醛酸酶,(ec3.2.1.15)果胶反式消去酶(ec4.2.2.2)和果胶酯酶(ec:3.1.1.11)。ec名称是基于酶催化的化学反应，针对酶的酶委员会分类方案。

将可溶性泡沫支架暴露于酶可以包括：将支架暴露于约1u至约200u的酶浓度。例如，所述方法可以包括：将支架暴露于以下酶浓度：约2u至约150u，或约5u至约100u，或者甚至是约10u至约75u，以及其间的所有数值。

本文所述的用于收获细胞的方法可以进一步包括：将材料暴露于螯合剂。示例性的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、环己二胺四乙酸(cdta)、乙二醇四乙酸(egta)、柠檬酸和酒石酸。将可溶性泡沫支架暴露于螯合剂可以包括：将支架暴露于约1mm至约200mm的螯合剂浓度。例如，所述方法可以包括：将支架暴露于以下螯合剂浓度：约10mm至约150mm，或约20mm至约100mm，或者甚至是约25mm至约50mm，以及其间的所有数值。

实施例

以下将参照关于某些示例性和具体实施方式进一步描述本公开的实施方式，这些实施方式仅仅是说明性的，不用来构成限制。

实施例1

通过在设置在104℃的温度下的油浴中，将约162克的聚半乳糖醛酸钠盐溶于去矿物质水中制备含有2.0重量％聚半乳糖醛酸(pga)的第一水性混合物。将该水性混合物冷却到室温。通过向在配备有线圈搅打器的kitchenaid(凯膳怡)混合机的料盆中的约24.52克的超纯水中加入约1.06克的caco3来制备第二水性混合物。还向kitchenaid混合机的料盆中加入约0.125克的20[商购自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)]。然后将约17.5克的蔗糖加入到混合机料盆中并混合以促进蔗糖在第二水性混合物中的溶解。加入约7.5克的丙三醇，约1.94克的美多秀hpmcculminal724以及第一水性混合物，以在混合料盆中形成合并的水性混合物，并且以一定的搅拌速度(kitchenaid混合机的速度1)混合约5分钟。接着以快速搅打速度(kitchenaid混合机的速度10)搅打合并的水性混合物约20分钟，以将空气引入到合并的水性混合物中。在继续搅打合并的水性混合物的同时，将在约30ml水中的约3.77克的葡萄糖酸内酯(gdl)的溶液加入到混合料盆中，并且继续搅打约1分钟。

在上述过程后，获得不透明的白色泡沫，其湿泡沫密度为约0.25g/cc。在室温下将泡沫留在混合料盆中并且不覆盖，放置约1小时以留出时间用于在泡沫中发生交联。然后将泡沫暴露于约-80℃的温度约16小时以冻住泡沫，接着暴露于-86℃的温度和0.11mbar(毫巴)的压力约72小时。观察到所得的泡沫的干泡沫密度为约0.04g/cc至约0.045g/cc，并且观察到泡沫是多孔的并具有高度互连的孔。图2示出了在本实施例1中制备的泡沫的sem图。确定所得泡沫的组成包括约1.3重量％的pga、约0.78重量％的hpm并且总固体含量为约2.08重量％。

实施例2

重复如实施例1所述的过程，但是第二水性混合物通过加入约0.53克来制备。观察到所得泡沫是多孔的并且具有高度互连的孔。图3示出了在本实施例2中制备的泡沫的sem图。

实施例3

通过在设置在104℃的温度下的油浴中，将约162克的聚半乳糖醛酸钠盐溶于去矿物质水中制备含有2.0重量％聚半乳糖醛酸(pga)的第一水性混合物。将该水性混合物冷却到室温。通过将约7.5克的丙三醇加入到超纯水中并且在800w的微波下加热约30秒来制备第二水性混合物。在约5.8ml的超纯水中冷溶胀约0.97克的牛明胶，然后将其加入到第二水性混合物中并搅拌直到观察到溶解。将约1.06克的caco3和约0.125克的20加入到第二水性混合物中。然后声波处理第二水性混合物约1分钟，接着将其转移到配备有线圈搅打器的kitchenaid混合机的料盆中。接着将约17.5克的蔗糖和约0.97克的美多秀hpmcculminal724加入到kitchenaid混合机的料盆中并搅拌水性混合物约5分钟。加入含有2.0重量％pga的第一水性混合物，以在混合料盆中形成合并的水性混合物，并且以一定的搅拌速度(kitchenaid混合机的速度1)混合约3分钟。接着以快速搅打速度(kitchenaid混合机的速度10)搅打合并的水性混合物约20分钟，以将空气引入到合并的水性混合物中。在继续搅打合并的水性混合物的同时，将在约30ml水中的约3.77克的葡萄糖酸内酯(gdl)的溶液加入到混合料盆中，并且继续搅打约1分钟。

在上述过程后获得了不透明的白色泡沫。在室温下将泡沫留在混合料盆中并且不覆盖，放置约1小时以留出时间用于在泡沫中发生交联。然后将泡沫暴露于约-80℃的温度约16小时以冻住泡沫，接着暴露于-86℃的温度和0.11mbar(毫巴)的压力约72小时。观察到所得的泡沫的干泡沫密度为约0.04g/cc，并且观察到泡沫是多孔的并具有高度互连的孔。图4示出了在本实施例3中制备的泡沫的sem图。

实施例4

重复如实施例3所述的过程，但是在约5.8ml的超纯水中冷溶胀约0.97克的猪明胶而不是牛明胶，然后将其加入到第二水性混合物中并搅拌直到观察到溶解。观察到所得的泡沫的湿泡沫密度为约0.21g/cc并且干泡沫密度为约0.06g/cc，并且观察到泡沫是多孔的并具有高度互连的孔。图5示出了在本实施例4中制备的泡沫的sem图。

实施例5

重复如实施例1所述的过程，但是第一水性混合物是通过在设置在104℃的温度下的油浴中，将约172克的3.0重量％聚半乳糖醛酸钠盐溶解于去矿物质水中来制备。另外，第二水性混合物中省略了美多秀hpmcculminal724。观察到所得的泡沫的湿泡沫密度为约0.40g/cc并且干泡沫密度为约0.11g/cc。观察到该泡沫不如实施例1中形成的泡沫那么多孔，并且孔比实施例1中形成的泡沫的孔互连得更少。认为省略美多秀hpmcculminal724或者具有表面活性的任何聚合物降低了泡沫的孔隙率以及泡沫的孔之间的互连水平。图6示出了在本实施例5中制备的泡沫的sem图。虽然湿密度大于约0.40g/cc且干密度大于约0.11g/cc的泡沫证明能够支持细胞的培养，但是相比于具有的湿密度和干密度诸如本实施例5中形成的泡沫所具有的那些的泡沫，湿密度小于约0.40g/cc且干密度小于约0.11g/cc的泡沫展现出改进的细胞培养条件。

实施例6

重复如实施例1所述的过程，但是第一水性混合物是通过在设置在104℃的温度下的油浴中，将约162克的1.59重量％聚半乳糖醛酸钠盐溶解于去矿物质水中来制备。另外，第二水性混合物是通过将0.53克的caco3加入到约24.52克的超纯水中来制备，并且将2.58克的美多秀hpmcculminal724加入到第二水性混合物中。观察到所得的泡沫的湿泡沫密度为约0.36g/cc并且干泡沫密度为约0.09g/cc。图7示出了在本实施例6中制备的泡沫的sem图。

实施例7

重复如实施例1所述的过程，但是在第二水性混合物中不加入蔗糖。观察到所得的泡沫的湿泡沫密度为约0.23g/cc并且干泡沫密度为约0.03g/cc。图8示出了在本实施例7中制备的泡沫的sem图。

实施例8

重复如实施例1所述的过程，但是第一水性混合物是通过在设置在104℃的温度下的油浴中，将约162克的2.59重量％聚半乳糖醛酸钠盐溶解于去矿物质水中来制备。另外，第二水性混合物通过将0.97克的美多秀hpmcculminal724加入到第二水性混合物中来制备。将合并的水性混合物中的pga与美多秀hpmcculminal724的比值控制在81/19。观察到所得的泡沫的湿泡沫密度为约0.18g/cc并且干泡沫密度为约0.057g/cc。图9示出了在本实施例8中制备的泡沫的sem图。

实施例9

重复如实施例1所述的过程，但是第二水性混合物通过将1.94克葡聚糖加入到第二水性混合物中来制备，并且第二水性混合物省略了美多秀hpmcculminal724。观察到所得的泡沫的湿泡沫密度为约0.34g/cc并且干泡沫密度为约0.095g/cc。观察到该泡沫不如实施例1中形成的泡沫那么多孔，并且孔比实施例1中形成的泡沫的孔互连得更少。认为省略美多秀hpmcculminal724或者具有表面活性的任何聚合物降低了泡沫的孔之间的互连水平。另外，加入不具有表面活性的聚合物并不促进泡沫中的孔的形成。图10示出了在本实施例9中制备的泡沫的sem图。

实施例10

重复如实施例1所述的过程，但是第二水性混合物通过将1.94克的p123而不是美多秀hpmcculminal724加入到第二水性混合物中来制备。将合并的水性混合物中的pga与pluronicp123的比值控制在62.5/37.5。观察到所得泡沫的湿泡沫密度为约0.18g/cc并且干泡沫密度为约0.03g/cc，并且观察到泡沫具有比实施例1中形成的泡沫更大的孔隙率。图11示出了在本实施例10中制备的泡沫的sem图。

实施例11

重复如实施例1所述的过程，但是第二水性混合物通过加入p123和葡聚糖的50:50重量比的掺混物而不是美多秀hpmcculminal724来制备。观察到所得泡沫的湿泡沫密度为约0.20g/cc并且干泡沫密度为约0.038g/cc，并且观察到泡沫具有比实施例1中形成的泡沫更大的孔隙率。图12示出了在本实施例11中制备的泡沫的sem图。

实施例12

重复如实施例11所述的过程以形成多种泡沫，其中，将不同量的丙三醇加入到第二水性混合物中。在形成本实施例的第一泡沫时，将6.5克的丙三醇加入到第二水性混合物中。加入构成总固体添加剂的19重量％的丙三醇以形成合并的水性混合物。观察到所得泡沫的湿泡沫密度为约0.19g/cc并且干泡沫密度为约0.055g/cc。在形成本实施例的第二泡沫时，将7.5克的丙三醇加入到第二水性混合物中。加入构成总固体添加剂的22重量％的丙三醇以形成合并的水性混合物。观察到所得泡沫的湿泡沫密度为约0.21g/cc并且干泡沫密度为约0.048g/cc。在形成本实施例的第三泡沫时，将19.44克的丙三醇加入到第二水性混合物中。加入构成总固体添加剂的42重量％的丙三醇以形成合并的水性混合物。观察到所得泡沫的湿泡沫密度为约0.23g/cc并且干泡沫密度为约0.23g/cc。在形成本实施例的第四泡沫时，将29.16克的丙三醇加入到第二水性混合物中。加入构成总固体添加剂的52重量％的丙三醇以形成合并的水性混合物。观察到所得泡沫的湿泡沫密度为约0.26g/cc并且干泡沫密度为约0.35g/cc。

实施例12的这四种泡沫说明了当在泡沫的形成期间加入增塑剂时，增塑剂的量对密度和孔隙率的影响。随着增塑剂的含量增加，观察到更慢的干燥、更大的密度和更小的孔隙率。并且，如图13所示，随着丙三醇的量增加到高于被添加用于形成第二水性混合物的总固体添加剂的约20-25重量％，泡沫失去了大致圆柱的形状。观察到当加入到第二水性混合物中的增塑剂的量小于被添加以形成第二水性混合物的总固体添加剂的约52重量％时，泡沫的孔隙率和孔的互连性最大。

实施例13

重复如实施例1所述的过程，但是第二水性混合物通过加入p127和葡聚糖的50:50重量比的掺混物来制备。观察到所得泡沫的孔隙率和孔的互连性类似于实施例11中制备的泡沫。图14示出了在本实施例13中制备的泡沫的sem图。

实施例14

用ii-sc涂覆各自根据实施例1-12的过程形成的泡沫。通过将约5.0mg的ii-sc粉末加入到约20ml的乙醇:水为70:30的含水乙醇溶液中来制备250μg/ml的ii-sc的含水乙醇溶液。每种泡沫为约2-3mm厚且直径为约22mm，将这些泡沫放置在聚苯乙烯6孔细胞培养板的各单独的孔中。向每个孔中加入约4.0ml的250μg/mlii-sc的含水乙醇溶液，然后将板在室温下静置约1.5小时。从孔中移除过量的溶液并且用约5.0ml的70％含水乙醇洗涤泡沫一次。接着通过加入约4.0ml的0.05％(体积/体积)的在70％含水乙醇中的戊二醛(通过在6.0ml水和14ml乙醇中混合40μl的25％戊二醛溶液制备)使ii-sc涂层交联。使板在室温下静置约1.5小时以留有时间发生交联。用超纯水清洗泡沫三次。

实施例15

用明胶涂覆各自根据实施例1-12的过程形成的泡沫。通过在超纯水中溶胀约500mg的明胶粉末(来自猪皮)，随后在20ml的超纯水中溶解并均质化来制备0.1重量％的明胶溶液。每种泡沫为约2-3mm厚且直径为约22mm，将这些泡沫放置在聚苯乙烯6孔细胞培养板的各单独的孔中。向每个孔中加入约4.0ml的明胶溶液，然后将板在室温下静置约1.5小时。从孔中移除过量的溶液并且用约5.0ml的70％含水乙醇洗涤泡沫一次。接着通过加入约4.0ml的0.05％(体积/体积)的在70％含水乙醇中的戊二醛(通过混合在25ml水中的50μl的25％戊二醛溶液制备)使明胶涂层交联。使板在室温下静置约1.5小时以留有时间发生交联。用超纯水清洗泡沫三次。

实施例16

对在根据实施例4的过程形成的泡沫上培养vero细胞进行研究。在细胞培养板上，在补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基中培养vero细胞(ccl-81，商购自弗吉尼亚州马纳萨斯的atcc公司)。将泡沫切割成约2-3mm厚且直径为约22mm的部分。在70％含水乙醇中消毒泡沫部分约5.0分钟，然后放置在6孔超低粘附细胞培养板的各单独的孔中。在超纯水中洗涤泡沫部分两次并在imdm培养基中洗涤泡沫部分一次。在接种之前从孔中移除过量的培养基。

使用胰蛋白酶从细胞培养板中收获vero细胞，并且重悬在imdm培养基中，将含有约100,000个细胞的150μl接种在位于6孔细胞培养板的孔中的每个泡沫部分中。将6孔细胞培养板放置在细胞培养孵育箱中，在约2.0小时后，向每个孔加入约3.0ml的imdm培养基。在细胞培养孵育箱中约18小时后，使用相差显微技术观察泡沫部分。图15示出了从相差显微技术获得的图像，其显示细胞不粘附于未经涂覆的泡沫部分，而是在泡沫部分的孔中形成球体。因此，确定本公开的可溶性泡沫支架可以用于培养球体或非粘附细胞。

实施例17

研究在根据实施例4的过程形成并且根据实施例14的过程涂覆的泡沫上培养人间充质干细胞(hmsc)。在细胞培养板上，在mesencult^tm-xf培养基[商购自加拿大不列颠哥伦比亚温哥华stemcell技术公司(stemcelltechnologies)的无血清培养基]中培养hmsc传代2(商购自马里兰州弗雷德里克的roosterbio公司)。将泡沫切割成约2-3mm厚且直径为约22mm的部分。在70％含水乙醇中消毒泡沫部分约5.0分钟，然后放置在6孔超低粘附细胞培养板的各单独的孔中。在超纯水中洗涤泡沫部分两次并在mesencult^tm-xf培养基中洗涤泡沫部分一次。在接种之前从孔中移除过量的培养基。

使用胰蛋白酶从细胞培养板中收获hmsc细胞，重悬在mesencult^tm-xf培养基中，将含有约100,000个细胞的150μl接种在位于6孔细胞培养板的孔中的每个泡沫部分中。将6孔细胞培养板放置在细胞培养孵育箱中，在约2.0小时后，向每个孔加入约3.0ml的mesencult^tm-xf培养基。在细胞培养孵育箱中约18小时后，用1μg/ml钙黄绿素-am对细胞进行染色并使用荧光显微技术观察泡沫部分。图16示出了从荧光显微技术获得的图像，其显示细胞能够粘附于泡沫部分，并且在泡沫部分的孔内铺展。因此，确定本公开的涂覆有ii-sc的可溶性泡沫支架除了可以用于培养球体或非粘附细胞以外，还可以用于培养粘附细胞，并且所述支架支持在不含血清的培养基中的细胞培养。

实施例18

研究在根据实施例4的过程形成并且根据实施例15的过程涂覆的泡沫上培养人间充质干细胞(hmsc)。在细胞培养板上，在补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基中培养如实施例17中所用的hmsc传代2。将泡沫切割成约2-3mm厚且直径为约22mm的部分。在70％含水乙醇中消毒泡沫部分约5.0分钟，然后放置在6孔超低粘附细胞培养板的各单独的孔中。在超纯水中洗涤泡沫部分两次并在mesencult^tm-xf培养基中洗涤泡沫部分一次。在接种之前从孔中移除过量的培养基。

使用胰蛋白酶从细胞培养板中收获hmsc，重悬在imdm培养基中，并且将含有约100,000个细胞的150μl接种在位于6孔细胞培养板的孔中的每个泡沫部分中。将6孔细胞培养板放置在细胞培养孵育箱中，在约2.0小时后，向每个孔加入约3.0ml的imdm培养基。在细胞培养孵育箱中约18小时后，用1μg/ml钙黄绿素-am对细胞进行染色并使用荧光显微技术观察泡沫部分。图17示出了从荧光显微技术获得的图像，其显示细胞能够粘附于泡沫部分，并且在泡沫部分的孔内铺展。使hmsc细胞在泡沫上扩增持续进行6天，并再次使用荧光显微技术观察。图18示出了6天后从荧光显微技术获得的图像，其显示细胞粘附于泡沫部分，并且在泡沫部分的孔内进一步铺展。因此，确定本公开的涂覆有明胶的可溶性泡沫支架除了可以用于培养球体或非粘附细胞以外，还可以用于培养粘附细胞，并且所述支架支持在不含血清的培养基中的细胞培养。

实施例19

研究在根据实施例2和4的过程形成并且根据实施例15的过程涂覆的泡沫上的vero细胞的扩增。在经过组织培养处理(tct)的板上，在补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基中培养如实施例16中所用的vero细胞。将泡沫切割成约2-3mm厚且直径为约22mm的部分。在70％含水乙醇中消毒泡沫部分约5.0分钟，然后放置在聚苯乙烯6孔细胞培养板的各单独的孔中。在超纯水中洗涤泡沫部分两次并在imdm培养基中洗涤泡沫部分一次。在接种之前从孔中移除过量的培养基。

使用胰蛋白酶从tct板收获vero细胞并且重悬于imdm培养基中。用含有约25,000个细胞的150μl接种一些泡沫部分，并且用含有约50,000个细胞的150μl接种其他泡沫部分，其中，泡沫部分位于6孔细胞培养板的孔中。将6孔细胞培养板置于细胞培养孵育箱中约6天。约6天后，除去培养基并且通过向每个孔中加入约2.0ml的含约50u/ml果胶酶和约5.0mmedta的消化溶液来溶解泡沫。观察到泡沫在5.0分钟内溶解。泡沫溶解后，使用台盼蓝排除方案对细胞进行计数，详见“protocolforperformingatrypanblueviabilitytest:technicalreferenceguide(进行台盼蓝活力测试的方案：技术参考指南)”。lonzacologne公司，2012年9月，检索自：

http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/lonza_benchguides_protocol_for_performing_a_trypan_blue_viability_test__technical_reference_guide.pdf.

观察到细胞定植在泡沫部分的所有孔表面上。在根据实施例4的过程形成的经涂覆的泡沫中观察到约70至90倍扩增，并且在根据实施例2的过程形成的经涂覆的泡沫中观察到约40至70倍扩增。因此，确定本公开的涂覆有明胶的可溶性泡沫支架可以用于vero细胞的扩增。

实施例20

研究在根据实施例4的过程形成并且根据实施例15的过程涂覆的泡沫上的人间充质干细胞(hmsc)的分化。在细胞培养板上，在mesencult^tm-xf培养基中培养如实施例17中所用的hmsc传代2。将泡沫切割成约2-3mm厚且直径为约22mm的部分。在70％含水乙醇中消毒泡沫部分约5.0分钟，然后放置在聚苯乙烯6孔细胞培养板的分离的孔中。在超纯水中洗涤泡沫部分两次并在mesencult^tm-xf培养基中洗涤泡沫部分一次。在接种之前从孔中移除过量的培养基。

使用胰蛋白酶从细胞培养板中收获hmsc细胞，重悬在mesencult^tm-xf培养基中，并且将含有约100,000个细胞的150μl接种在位于6孔细胞培养板的孔中的每个泡沫部分中。将6孔细胞培养板置于细胞培养孵育箱中约3天。在约3天后，移除mesencult^tm-xf培养基并且向孔中加入骨细胞分化培养基、软骨细胞分化培养基和脂肪细胞分化培养基[分别以商标名stempro^tm骨细胞分化试剂盒、stempro^tm软骨细胞分化试剂盒和stempro^tm脂肪细胞分化试剂盒商购自马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司(thermofisherscientific)]，其中，将每种类型的分化培养基加入到与其他类型的分化培养基不同的孔中的泡沫部分中。3周后，用茜素红对暴露于骨细胞分化培养基的泡沫部分进行染色，用阿尔新蓝对暴露于软骨细胞分化培养基的泡沫部分进行染色，以及用油红o对暴露于脂肪细胞分化培养基的泡沫部分进行染色。染色后，观察到在本公开的涂覆有明胶的可溶性泡沫支架上培养的hsmc保持骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。因此，确定在本公开的可溶性泡沫支架上培养的细胞展现出类似于细胞在体内的生物学响应。

实施例21

研究在根据实施例2、11和13的过程形成并且根据实施例14的过程涂覆的泡沫上的人间充质干细胞(hmsc)的扩增。在细胞培养板上，在mesencult^tm-xf培养基中培养如实施例17中所用的hmsc传代2。将泡沫切割成约2-3mm厚且直径为约22mm的部分。在70％含水乙醇中消毒泡沫部分约5.0分钟，然后放置在6孔超低粘附细胞培养板的分离的孔中。在超纯水中洗涤泡沫部分两次并在mesencult^tm-xf培养基中洗涤泡沫部分一次。在接种之前从孔中移除过量的培养基。

使用胰蛋白酶从细胞培养板中收获hmsc细胞，重悬在mesencult^tm-xf培养基中，并且将含有约100,000个细胞的150μl接种在位于6孔细胞培养板的孔中的每个泡沫部分中。将6孔细胞培养板放置在细胞培养孵育箱中约7天，并且在第4天移除培养基并用新鲜培养基更换。约7天后，移除培养基并且通过向每个孔中加入约2.0ml的含约50u/ml果胶酶和约5.0mmedta的消化溶液来溶解泡沫。观察到泡沫在5.0分钟内溶解。在泡沫溶解后，使用前述的台盼蓝排除方案对细胞进行计数。观察到细胞定植在泡沫部分的所有孔表面上，并且在本公开的涂覆有ii-sc的可溶性泡沫支架上成功地完成了hsmc的扩增。

实施例22

研究在根据实施例2和11的过程形成并且根据实施例14的过程涂覆的泡沫上，人间充质干细胞(hmsc)在静态条件和动态条件中培养的比较。如实施例17那样培养hmsc传代2。使用胰蛋白酶从细胞培养板中收获hmsc细胞，重悬在mesencult^tm-xf培养基中，并且将含有约100,000个细胞的150μl接种在实施例2中形成的20个泡沫支架中以及在实施例11中形成的20个泡沫支架中。将支架置于6孔细胞培养板的孔中，并且将所述板放置在细胞培养孵育箱中约2小时。约2小时后，从孵育箱取出一个含有根据实施例2形成的支架的6孔细胞培养板以及一个含有根据实施例形成的支架的6孔细胞培养板，并且将支架转移到单独的生物反应器。将其他6孔细胞培养板保留在孵育箱中。将所有的支架保持在它们相应的条件下约6天，然后通过加入含有约50u/ml果胶酶和约5.0mmedta的消化溶液，使它们溶解。在泡沫溶解后，使用前述的台盼蓝排除方案对细胞进行计数。观察到，在本公开的涂覆有ii-sc的可溶性泡沫支架上的细胞的扩增在静态条件下与在动态条件下相似。

实施例23

研究人间充质干细胞(hmsc)的多传代培养。如本文所述，细胞培养的传代数是培养物经过传代培养(即，收获和重新接种)的次数的记录。因此，与本公开有关的多传代培养描述了从一个可溶性泡沫支架收获细胞并重新接种在不同的可溶性泡沫支架上的过程。使用胰蛋白酶从细胞培养板中收获hmsc，重悬在mesencult^tm-xf培养基中，并且将含有约100,000个细胞的150μl接种在如在实施例2中形成以及如在实施例14中涂覆的第一组泡沫支架中。将支架置于mesencult^tm-xf培养基中并放置在细胞培养孵育箱中约6天。约6天后，通过加入含有约50u/ml果胶酶和约5.0mmedta的消化溶液来溶解支架。在泡沫溶解后，使用前述的台盼蓝排除方案对细胞进行计数。接着使用从第一组支架收获的含有约100,000个细胞的溶液来接种如在实施例2中形成并且如在实施例14中涂覆的第二组泡沫支架。将支架置于mesencult^tm-xf培养基中并放置在细胞培养孵育箱中约7天。约7天后，通过加入含有约50u/ml果胶酶和约5.0mmedta的消化溶液来溶解支架。在泡沫溶解后，使用台盼蓝排除方案对细胞进行计数。接着使用从第二组支架收获的含有约100,000个细胞的溶液来接种如在实施例2中形成并且如在实施例14中涂覆的第三组泡沫支架。将支架置于mesencult^tm-xf培养基中并放置在细胞培养孵育箱中约7天。约7天后，通过加入含有约50u/ml果胶酶和约5.0mmedta的消化溶液来溶解支架。在泡沫溶解后，使用台盼蓝排除方案对细胞进行计数，然后接种在细胞培养板上，在其中，细胞被暴露于实施例20中所用的分化培养基、软骨细胞分化培养基和脂肪细胞分化培养基。3周后，用茜素红对暴露于骨细胞分化培养基的细胞进行染色，用阿尔新蓝对暴露于软骨细胞分化培养基的细胞进行染色，以及用油红o对暴露于脂肪细胞分化培养基的细胞进行染色。染色后，观察到在本公开的涂覆有ii-sc的可溶性泡沫支架上的经历了多传代培养的hsmc保持骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。

实施例24

将在根据实施例11的过程形成并且根据实施例14的过程涂覆的泡沫支架上的人胚肾(hek)细胞的转染与在ii-sc可溶性微载体(商购自纽约州康宁市的康宁股份有限公司)上的hek细胞的转染进行比较。将hek细胞接种在可溶性微载体上。将第一组可溶性微载体置于6孔细胞培养板中并暴露于补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基。将6孔细胞培养板置于细胞培养孵育箱中并在静态条件下扩增约3天。将第二组可溶性微载体放置在一次性旋转烧瓶中并且悬浮在补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基中约3天，并且间歇搅拌(每2.0小时搅拌15分钟)。约3天后，将约150μl的转染试剂加入到位于6孔细胞培养板的孔中的可溶性微载体中，并且将约1.0ml的转染试剂加入到旋转烧瓶中并继续间歇搅拌。

用hek细胞接种泡沫的部分。将一些泡沫部分放置在6孔细胞培养板中，暴露于补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基中，然后将6孔培养板放置在细胞孵育箱中约3天。将其他泡沫部分放置在辐射流灌注筒装置的室中约3天。所述灌注筒装置允许连续地移除消耗的补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基并且从室加入新鲜的补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基。约3天后，将约150μl的转染试剂加入到位于6孔细胞培养板的孔中的泡沫部分中，并且将约1.0ml的转染试剂加入到灌注筒装置中的泡沫部分中。

在加入转染试剂后，从可溶性微载体和泡沫部分收获细胞，并且通过测量绿色荧光蛋白(gfp)作为报告基因的响应来检测报告基因表达水平。转染的hek细胞的gfp阳性百分比可以用作转染效率的指示，其通过流式细胞计数来测量。如本文所用的术语“转染效率”是指在暴露于转染试剂后，具有存在于细胞内的给定核酸或生物学活性分子的细胞的百分比。图19是示出了每种培养条件的转染hek细胞的gfp阳性百分比的条形图。如图所示：条1610代表在6孔细胞培养板中的可溶性泡沫部分上培养的转染hek细胞的gfp阳性百分比；条1620代表在灌注筒装置中的可溶性泡沫部分上培养的转染hek细胞的gfp阳性百分比；条1630代表在6孔细胞培养板中的可溶性微载体上培养的转染hek细胞的gfp阳性百分比；以及条1640代表在旋转烧瓶中的可溶性微载体上培养的转染hek细胞的gfp阳性百分比。观察到，在本公开的涂覆有ii-sc的可溶性泡沫支架上培养的细胞展现出比在微载体上培养的细胞更大的转染效率。不希望囿于任何特定理论，认为在泡沫支架的孔内的细胞比粘附于微载体表面的细胞经历了更多的转染试剂暴露。

实施例25

证明在根据实施例11的过程形成并且根据实施例14的过程涂覆的泡沫支架上的腺相关病毒(aav)载体的产生。用1百万个293aav细胞接种第一和第二组泡沫支架，并且转移到辐射流灌注筒装置的室中，在其中，它们被暴露于补充有10％胎牛血清(fbs)的imdm培养基。

约24小时后，使用磷酸钙转染方法，利用aav-2无辅助包装系统(商购自加利福尼亚州圣地亚哥的细胞生物实验室公司(cellbiolabs))转染来自第一组泡沫支架的细胞。同样在约24小时后，使用pei方法，利用aav-2无辅助包装系统转染来自第二组泡沫支架的细胞。对于磷酸钙方法，将细胞与磷酸钙/dna复合物孵育约18小时，并且质粒的质粒浓度为6.4μg/ml且摩尔比为1:1:1。对于pei方法，用2μg质粒/ml转染泡沫支架上的细胞。在每次pei方法中，采用的质粒的pei/dna比为2/1且摩尔比为1:1:1。

辐射流灌注筒装置在20ml/分钟的灌注速率下操作约2小时，然后在5ml/分钟的灌注速率下操作约16小时。对于所有细胞组，在约18小时后移除培养基并更换新鲜培养基。然后进一步孵育细胞并在转染后72小时收获细胞。收集泡沫支架并通过加入含有约50u/ml果胶酶和约5.0mmedta的消化溶液来溶解泡沫支架。在泡沫支架溶解后，采用离心技术收集细胞并在dpbs中洗涤。保留一部分细胞用于流式细胞计数分析，并且余下的细胞用20mmtrisph8，150mmnacl，补充有50u/ml核酸酶的0.1％脱氧胆酸钠缓冲液裂解。

在37℃下孵育约30分钟后，通过以14,000rpm离心约5分钟澄清病毒提取物。使用aav-2elisa测定(商购自德国海德堡的progenbiotechnik公司)测量病毒滴度。

使用流式细胞计数分析转染效率，并且观察到优良的转染效率。图20是示出了每组泡沫支架的转染细胞的gfp阳性百分比的条形图。如图所示：条1710代表使用磷酸钙转染方法转染的细胞的gfp阳性百分比，在该转染方法中，测得转染效率为约86.4％；并且条1720代表使用pei转染方法转染的细胞的gfp阳性百分比，其中，测得转染效率为约73.8％。

还使用elisa测定法测量病毒滴度。图21是示出了每组泡沫支架的病毒颗粒(vp)的数目的条形图。如图所示：条1810代表使用磷酸钙转染方法转染的细胞的病毒颗粒，其中测得8.7x10¹¹个病毒颗粒；并且条1820代表使用pei转染方法转染的细胞的病毒颗粒，其中测得5.7x10¹¹个病毒颗粒。图22是示出了每组泡沫支架的每个细胞的病毒颗粒的数目的条形图。如图所示：条1910代表使用磷酸钙转染方法转染的细胞的病毒颗粒/细胞，其中测得1.17x10⁵个病毒颗粒/细胞；并且条1920代表使用pei转染方法转染的细胞的病毒颗粒/细胞，其中测得6.8x10⁴个病毒颗粒/细胞。

最后，通过测试提取物诱导感染的hek293细胞中的gfp表达的能力来评估病毒载体的功能。用用于感染的10⁵个病毒颗粒/细胞制备的提取物来感染hek293细胞，评估病毒载体的感染性。在感染后约72小时，通过流式细胞计数测量感染的hek细胞的gfp阳性百分比。来自每组泡沫支架的细胞均观察到感染。gfp表达用于确定基因转移的效率，对于本实施例，其为约10％至约26％。因此，得出结论：在本文公开的泡沫支架上可产生功能性aav载体。图23是示出了每组泡沫支架在感染后展现出gfp表达的细胞的分数的条形图。如图所示：条2010代表使用磷酸钙转染方法转染的细胞的展现出gfp表达的细胞分数，其中，约26％的细胞展现出gfp表达；并且条2020代表使用pei转染方法转染的细胞的展现出gfp表达的细胞分数，其中，约10％的细胞显示出gfp表达。

根据本公开的方面(1)，提供了一种用于细胞培养的可溶性泡沫支架。所述可溶性泡沫支架包括离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐；以及包括至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物。

根据本公开的方面(2)，提供了如方面(1)所述的可溶性泡沫支架，其还包括附着聚合物涂层。

根据本公开的方面(3)，提供了如方面(2)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述附着聚合物涂层包括肽。

根据本公开的方面(4)，提供了如方面(2)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述附着聚合物涂层包括肽，其选自下组：bsp、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、i型胶原、iv型胶原、变性胶原以及它们的混合物。

根据本公开的方面(5)，提供了如方面(2)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述附着聚合物涂层包括ii-sc。

根据本公开的方面(6)，提供了如方面(1)-(5)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其中，所述至少一种第一聚合物的亲水亲油平衡值(hlb)大于约8。

根据本公开的方面(7)，提供了如方面(1)-(6)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其中，所述至少一种第一聚合物的亲水亲油平衡值(hlb)大于约10。

根据本公开的方面(8)，提供了如方面(1)-(7)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其中，所述至少一种第一聚合物的亲水亲油平衡值(hlb)在约10至约40之间。

根据本公开的方面(9)，提供了如方面(1)-(8)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其中，所述至少一种第一聚合物包括纤维素衍生物。

根据本公开的方面(10)，提供了如方面(9)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述纤维素衍生物选自下组：羟乙基纤维素(hec)、羟丙基纤维素(hpc)、甲基纤维素(mc)、羟乙基甲基纤维素(hemc)和羟丙基-甲基纤维素(hpmc)。

根据本公开的方面(11)，提供了如方面(1)-(8)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其中，所述至少一种第一聚合物包括蛋白质。

根据本公开的方面(12)，提供了如方面(11)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述蛋白质选自下组：牛血清白蛋白(bsa)、明胶、酪蛋白和疏水蛋白。

根据本公开的方面(13)，提供了如方面(1)-(8)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其中，所述至少一种第一聚合物包括合成两亲聚合物。

根据本公开的方面(14)，提供了如方面(13)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述合成两亲聚合物包括泊洛沙姆。

根据本公开的方面(15)，提供了如方面(1)-(14)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括至少两种具有表面活性的第一水溶性聚合物。

根据本公开的方面(16)，提供了如方面(1)-(15)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其还包括不具有表面活性的至少一种第二聚合物。

根据本公开的方面(17)，提供了如方面(16)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述至少一种第二聚合物包括合成聚合物。

根据本公开的方面(18)，提供了如方面(17)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述合成聚合物选自下组：聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基醇、羧基乙烯基聚合物、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、n-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺的均聚物和共聚物、聚乙烯基甲基醚-马来酸酐以及聚环氧乙烷/聚环氧丙烷嵌段共聚物。

根据本公开的方面(19)，提供了如方面(16)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述至少一种第二聚合物包括半合成聚合物。

根据本公开的方面(20)，提供了如方面(19)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述半合成聚合物选自下组：葡聚糖衍生物、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和衍生物、甲基纤维素和衍生物、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素以及羟丙基纤维素。

根据本公开的方面(21)，提供了如方面(16)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述至少一种第二聚合物包括天然聚合物。

根据本公开的方面(22)，提供了如方面(21)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述天然聚合物选自下组：淀粉、淀粉衍生物、可得然胶、普鲁兰多糖、结冷胶、黄原胶、葡聚糖、白蛋白、酪蛋白、酪蛋白酸盐，明胶，琼脂、藻酸盐、卡拉胶、瓜尔胶、瓜尔胶衍生物、槐豆胶、透明质酸和硫酸软骨素。

根据本公开的方面(23)，提供了如方面(1)-(22)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其还包括水溶性增塑剂。

根据本公开的方面(24)，提供了如方面(23)所述的可溶性泡沫支架，其中，所述水溶性增塑剂选自下组：丙三醇、多羟基醇、山梨糖醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇及其组合。

根据本公开的方面(25)，提供了如方面(23)-(24)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括小于约55重量％的水溶性增塑剂。

根据本公开的方面(26)，提供了如方面(23)-(25)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括约15重量％至约55重量％的水溶性增塑剂。

根据本公开的方面(27)，提供了如方面(1)-(26)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括约85％至约96％的孔隙率。

根据本公开的方面(28)，提供了如方面(1)-(27)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括约50μm至约500μm的平均孔尺寸直径。

根据本公开的方面(29)，提供了如方面(1)-(28)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括约75μm至约450μm的平均孔尺寸直径。

根据本公开的方面(30)，提供了如方面(1)-(29)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括约100μm至约400μm的平均孔尺寸直径。

根据本公开的方面(31)，提供了如方面(1)-(30)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括小于约0.40g/cc的湿密度。

根据本公开的方面(32)，提供了如方面(1)-(31)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括小于约0.30g/cc的湿密度。

根据本公开的方面(33)，提供了如方面(1)-(32)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括约0.16g/cc至约0.40g/cc的湿密度。

根据本公开的方面(34)，提供了如方面(1)-(33)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括小于约0.20g/cc的干密度。

根据本公开的方面(35)，提供了如方面(1)-(34)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括小于约0.10g/cc的干密度。

根据本公开的方面(36)，提供了如方面(1)-(35)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括约0.02g/cc至约0.20g/cc的干密度。

根据本公开的方面(37)，提供了如方面(1)-(36)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其包括开孔构造。

根据本公开的方面(38)，提供了如方面(1)-(37)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其中，可溶性泡沫支架的消化在小于约1小时内完成。

根据本公开的方面(39)，提供了如方面(1)-(38)中任一个方面所述的可溶性泡沫支架，其中，可溶性泡沫支架的消化在小于约15分钟内完成。

根据本公开的方面(40)，提供了用于形成可溶性泡沫支架的方法。所述方法包括：通过将聚半乳糖醛酸化合物加入到水性溶液中来形成第一水性混合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐；通过将至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物和二价金属盐加入到水性溶液中来形成第二水性混合物；合并第一水性混合物与第二水性混合物以形成合并的水性混合物；将凝胶诱导剂加入到合并的水性混合物中；以及将气泡引入到合并的水性混合物中以形成泡沫支架。

根据本公开的方面(41)，提供了如方面(40)所述的方法，其中，形成第二水性混合物还包括：加入至少一种不具有表面活性的第二聚合物。

根据本公开的方面(42)，提供了如方面(41)所述的方法，其中，加入至少一种第一聚合物和至少一种第二聚合物包括：加入约35％至约65％的至少一种第一聚合物和约35％至约65％的至少一种第二聚合物。

根据本公开的方面(43)，提供了如方面(40)-(42)中任一个方面所述的方法，其中，形成第二水性混合物包括：加入至少两种具有表面活性的第一水溶性聚合物。

根据本公开的方面(44)，提供了如方面(40)-(43)中任一个方面所述的方法，其中，二价金属盐包括：选自镁、钙、锌、锶、钡及其组合的阳离子；以及选自草酸根、酒石酸根、磷酸根、碳酸根、柠檬酸根及其组合的阴离子。

根据本公开的方面(45)，提供了如方面(40)-(43)中任一个方面所述的方法，其中，形成第二水性混合物还包括：将水溶性增塑剂加入到第二水性混合物中。

根据本公开的方面(46)，提供了如方面(45)所述的方法，其中，所述水溶性增塑剂选自下组：丙三醇、多羟基醇、山梨糖醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇及其组合。

根据本公开的方面(47)，提供了如方面(45)-(46)中任一个方面所述的方法，其中，水溶性增塑剂占第二水性混合物的总固体添加剂的小于约55重量％。

根据本公开的方面(48)，提供了如方面(45)-(47)中任一个方面所述的方法，其中，水溶性增塑剂占第二水性混合物的总固体添加剂的约15重量％至约55重量％。

根据本公开的方面(49)，提供了如方面(40)-(48)中任一个方面所述的方法，其中，形成第二水性混合物还包括：将乳化剂加入到第二水性混合物中。

根据本公开的方面(49)，提供了如方面(40)-(48)中任一个方面所述的方法，其中，形成第二水性混合物还包括：将乳化剂加入到第二水性混合物中。

根据本公开的方面(50)，提供了如方面(40)-(49)中任一个方面所述的方法，其中，形成第二水性混合物还包括：将至少一种可浸出固体加入到第二水性混合物中。

根据本公开的方面(51)，提供了如方面(50)所述的方法，其中，所述至少一种可浸出固体选自下组：盐、生物相容性单糖和双糖以及水溶性蛋白质。

根据本公开的方面(52)，提供了如方面(40)-(51)中任一个方面所述的方法，其中，所述凝胶诱导剂选自下组：乳酸内酯、乙醇酸内酯、葡萄糖酸δ内酯和酸酐。

根据本公开的方面(53)，提供了如方面(40)-(52)中任一个方面所述的方法，其还包括：用附着聚合物涂层涂覆可溶性泡沫支架。

根据本公开的方面(54)，提供了如方面(53)所述的方法，其中，所述附着聚合物涂层包括肽。

根据本公开的方面(55)，提供了如方面(53)所述的方法，其中，所述附着聚合物涂层包括肽，其选自下组：bsp、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、i型胶原、iv型胶原、变性胶原以及它们的混合物。

根据本公开的方面(56)，提供了如方面(53)所述的方法，其中，所述附着聚合物涂层包括ii-sc。

根据本公开的方面(57)，提供了用于在可溶性泡沫支架上培养细胞的方法。所述方法包括：将细胞接种在可溶性泡沫支架上，以使得细胞进入可溶性泡沫支架的孔，所述可溶性支架包括：离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐；以及包括至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物；以及使可溶性泡沫支架与细胞培养基接触。

根据本公开的方面(58)，提供了如方面(57)所述的方法，其中，细胞在可溶性泡沫支架的孔中聚集以形成球体。

根据本公开的方面(59)，提供了如方面(57)-(58)中任一个方面所述的方法，其中，可溶性泡沫支架包括附着聚合物涂层，并且其中，在可溶性泡沫支架上接种细胞包括：使细胞粘附于可溶性泡沫支架的表面。

根据本公开的方面(60)，提供了如方面(57)-(59)中任一个方面所述的方法，其中，使可溶性泡沫支架与细胞培养基接触包括：将可溶性泡沫支架浸没在细胞培养基中。

根据本公开的方面(61)，提供了如方面(57)-(60)中任一个方面所述的方法，其中，使可溶性泡沫支架与细胞培养基接触包括：使细胞培养基在可溶性泡沫支架上连续通过。

根据本公开的方面(62)，提供了如方面(61)所述的方法，其中，使细胞培养基在可溶性泡沫支架上连续通过包括：使至少一些细胞培养基不与可溶性泡沫支架接触，以及使可溶性泡沫支架与新鲜细胞培养基接触，以使得与可溶性泡沫支架接触的细胞培养基的体积保持基本上恒定。

根据本公开的方面(63)，提供了从可溶性泡沫支架收获细胞的方法。所述方法包括：通过将可溶性泡沫支架暴露于酶，消化可溶性泡沫支架；可溶性支架包括：离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐；以及包括至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物；以及将可溶性泡沫支架暴露于螯合剂。

根据本公开的方面(64)，提供了如方面(63)所述的方法，其中，所述酶包括非蛋白水解酶。

根据本公开的方面(65)，提供了如方面(64)所述的方法，其中，非蛋白水解酶选自下组：果胶裂解酶和果胶酶。

根据本公开的方面(66)，提供了如方面(63)-(65)中任一个方面所述的方法，其中消化可溶性泡沫支架包括：将可溶性泡沫支架暴露于约1u至约200u的酶。

根据本公开的方面(67)，提供了如方面(63)-(66)中任一个方面所述的方法，其包括：将可溶性泡沫支架暴露于约1mm至约200mm的螯合剂。

根据本公开的方面(68)，提供了由组合物形成的泡沫支架产品。所述组合物包括：离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐；至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物；和小于约55重量％的水溶性增塑剂。

根据本公开的方面(69)，提供了如方面(68)所述的泡沫支架产品，其还包括附着聚合物涂层。

根据本公开的方面(70)，提供了如方面(69)所述的泡沫支架产品，其中，所述附着聚合物涂层包括肽。

根据本公开的方面(71)，提供了如方面(69)所述的泡沫支架产品，其中，所述附着聚合物涂层包括肽，其选自下组：bsp、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、i型胶原、iv型胶原、变性胶原以及它们的混合物。

根据本公开的方面(72)，提供了如方面(69)所述的泡沫支架产品，其中，所述附着聚合物涂层包括ii-sc。

根据本公开的方面(73)，提供了如方面(68)-(72)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其中，所述至少一种第一聚合物的亲水亲油平衡值(hlb)大于约8。

根据本公开的方面(74)，提供了如方面(68)-(73)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其中，所述至少一种第一聚合物的亲水亲油平衡值(hlb)大于约10。

根据本公开的方面(75)，提供了如方面(68)-(74)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其中，所述至少一种第一聚合物的亲水亲油平衡值(hlb)可以在约10至约40之间。

根据本公开的方面(76)，提供了如方面(68)-(75)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其中，所述至少一种第一聚合物包括纤维素衍生物。

根据本公开的方面(77)，提供了如方面(76)所述的泡沫支架产品，其中，所述纤维素衍生物选自下组：羟乙基纤维素(hec)、羟丙基纤维素(hpc)、甲基纤维素(mc)、羟乙基甲基纤维素(hemc)和羟丙基-甲基纤维素(hpmc)。

根据本公开的方面(78)，提供了如方面(68)-(75)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其中，所述至少一种第一聚合物包括蛋白质。

根据本公开的方面(79)，提供了如方面(78)所述的泡沫支架产品，其中，所述蛋白质选自下组：牛血清白蛋白(bsa)、明胶、酪蛋白和疏水蛋白。

根据本公开的方面(80)，提供了如方面(68)-(75)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其中，所述至少一种第一聚合物包括合成两亲聚合物。

根据本公开的方面(81)，提供了如方面(80)所述的泡沫支架产品，其中，所述合成两亲聚合物包括泊洛沙姆。

根据本公开的方面(82)，提供了如方面(68)-(81)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括至少两种具有表面活性的第一水溶性聚合物。

根据本公开的方面(83)，提供了如方面(68)-(82)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其中，泡沫支架组合物还包括至少一种不具有表面活性的第二聚合物。

根据本公开的方面(84)，提供了如方面(83)所述的泡沫支架产品，其中，所述至少一种第二聚合物包括合成聚合物。

根据本公开的方面(85)，提供了如方面(84)所述的泡沫支架产品，其中，所述合成聚合物选自下组：聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基醇、羧基乙烯基聚合物、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、n-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺的均聚物和共聚物、聚乙烯基甲基醚-马来酸酐以及聚环氧乙烷/聚环氧丙烷嵌段共聚物。

根据本公开的方面(86)，提供了如方面(83)所述的泡沫支架产品，其中，所述至少一种第二聚合物包括半合成聚合物。

根据本公开的方面(87)，提供了如方面(86)所述的泡沫支架产品，其中，所述半合成聚合物选自下组：葡聚糖衍生物、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和衍生物、甲基纤维素和衍生物、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素以及羟丙基纤维素。

根据本公开的方面(88)，提供了如方面(83)所述的泡沫支架产品，其中，所述至少一种第二聚合物包括天然聚合物。

根据本公开的方面(89)，提供了如方面(88)所述的泡沫支架产品，其中，所述天然聚合物选自下组：淀粉、淀粉衍生物、可得然胶、普鲁兰多糖、结冷胶、黄原胶、葡聚糖、白蛋白、酪蛋白、酪蛋白酸盐，明胶，琼脂、藻酸盐、卡拉胶、瓜尔胶、瓜尔胶衍生物、槐豆胶、透明质酸和硫酸软骨素。

根据本公开的方面(90)，提供了如方面(68)-(89)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其中，所述水溶性增塑剂选自下组：丙三醇、多羟基醇、山梨糖醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇及其组合。

根据本公开的方面(91)，提供了如方面(68)-(90)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括约15重量％至约55重量％的水溶性增塑剂。

根据本公开的方面(92)，提供了如方面(68)-(91)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括约85％至约96％的孔隙率。

根据本公开的方面(93)，提供了如方面(68)-(92)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括约50μm至约500μm的平均孔尺寸直径。

根据本公开的方面(94)，提供了如方面(68)-(93)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括约75μm至约450μm的平均孔尺寸直径。

根据本公开的方面(95)，提供了如方面(68)-(94)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括约100μm至约400μm的平均孔尺寸直径。

根据本公开的方面(96)，提供了如方面(68)-(95)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括小于约0.40g/cc的湿密度。

根据本公开的方面(97)，提供了如方面(68)-(96)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括小于约0.30g/cc的湿密度。

根据本公开的方面(98)，提供了如方面(68)-(97)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括约0.16g/cc至约0.40g/cc的湿密度。

根据本公开的方面(99)，提供了如方面(68)-(98)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括小于约0.20g/cc的干密度。

根据本公开的方面(100)，提供了如方面(68)-(99)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括小于约0.10g/cc的干密度。

根据本公开的方面(101)，提供了如方面(68)-(100)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括约0.02g/cc至约0.20g/cc的干密度。

根据本公开的方面(102)，提供了如方面(68)-(101)中任一个方面所述的泡沫支架产品，其包括开孔构造。

尽管本公开包括有限数量的实施方式，但是本领域技术人员得益于本公开，会理解能设计出其他的实施方式而不偏离本公开的范围。