包含作为从鸟类的蛋分离的细胞的胚盘多能干细胞、神经干细胞、胚胎成纤维细胞条件培养基作为有效成分的用于细胞增殖、皮肤再生及皱纹改善的培养基组合物的制作方法

本发明涉及包含作为从鸟类的蛋(egg)分离的细胞的胚盘多能干细胞(pluripotentstemcells，pscs)或神经干细胞(neuralstemcells，nscs)、胚胎成纤维细胞(embryonicfibroblasts，fbs)条件培养基(conditionedmedium)作为有效成分的包含人干细胞、人间充质干细胞或人皮肤细胞的用于促进细胞增殖的培养基组合物。

背景技术：

干细胞(stemcell)具有通过适合的环境及刺激可分化为各种细胞的能力，其作为具有自增殖能力的细胞，例如，从初期胚胎分离的胚胎干细胞(embryonicstemcell，escs)、从胚胎期的原始生殖细胞分离的胚胎生殖细胞(embryonicgermcell，eg细胞)、诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell)等三种多能干细胞(pluripotentstemcells，pscs)，尤其，胚胎干细胞是指源自蛋的胚盘的多能干细胞(eggblastodermderivedpluripotentstemcells，pscs)。并且，造血干细胞(hematopoieticstemcells，hscs)、间充质干细胞(mesanchymlstemcells，mscs)、神经干细胞(neuronalstemcells，nscs)为如成体干细胞(adultstemcells)等多能干细胞(multipotentstemcells，mscs)。干细胞具有发展为具有特征性现象和特殊化功能的细胞的潜力，因此，作为用于各种脏器功能恢复的细胞资源来成为研究对象。

另一方面，干细胞可通过细胞分裂自增殖(self-renewal)与自身相同的细胞，因此具有增殖(proliferation；expansion)特性，而且，通过施加分化刺激而分化为特定细胞，也可通过其他环境或其他分化刺激分化为其他细胞，从而在分化过程中具有可塑性(plasticity)的特征，而这与停止细胞分裂的分化的细胞不同。可获得干细胞的方法大致有两种。其中，一个方法为从由受精卵产生的胚胎获得的方法(胚胎干细胞)，另一个方法为回收储存在成人身体的各部分中的干细胞(成体干细胞)的方法。虽然这两种方法在功能性层面上具有差异，但是，胚胎干细胞或成体干细胞具有可分化为多种细胞的特征。

并且，真皮主要由胶原蛋白和弹性蛋白纤维形成，它们具有支撑皮肤的作用。因此，如果在这种真皮上发生问题，则会产生皱纹，而且皮肤失去弹性，引起皮肤老化。胶原蛋白在皮肤再生、皮肤含水率、伤口治愈及皱纹改善等方面具有很重要的作用，其从纤维芽细胞生成。胶原蛋白具有可包含多量水分的功能，因此具有给真皮提供水分的作用，如果发生老化，就由于胶原蛋白的含水分功能下降而导致皱纹变多。当受伤时，由于纤维芽细胞持续性地生成胶原蛋白，胶原蛋白还具有治愈伤口部位的作用。真皮主要由胶原蛋白和弹性蛋白纤维形成，它们具有支撑皮肤的作用。因此，如果在这种真皮上发生问题，则会产生皱纹，而且皮肤失去弹性，引起皮肤老化。胶原蛋白在皮肤再生、皮肤含水率、伤口治愈及皱纹改善等方面具有很重要的作用，其从纤维芽细胞生成。胶原蛋白具有可包含多量水分的功能，因此具有给真皮提供水分的作用，如果发生老化，就由于胶原蛋白的含水分功能下降而导致皱纹变多。当受伤时，由于纤维芽细胞持续性地生成胶原蛋白，胶原蛋白还具有治愈伤口部位的作用。

对此，本发明人致力于开发源自蛋的干细胞条件培养基的新用途，结果表示，源自鸟类的蛋的干细胞条件培养基(conditionedmedium)在没有饲养层细胞的情况下也可以显著地使人干细胞或皮肤细胞等增殖，产生显著的皮肤再生及皱纹改善效果，因此，可将上述源自蛋(egg)的干细胞条件培养基有效用作用于细胞增殖的培养基组合物或者用于皮肤再生及皱纹改善的化妆品组合物的有效成分，由此完成了本发明。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的在于，包含源自鸟类的蛋(egg)的干细胞条件培养基(conditionedmedium)作为有效成分的用于细胞增殖的培养基组合物。

并且，本发明提供包含源自鸟类的蛋(egg)的细胞条件培养基(conditionedmedium)作为有效成分的用于皮肤再生及皱纹改善的化妆品组合物。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供包含源自鸟类的蛋(egg)的干细胞条件培养基(conditionedmedium)作为有效成分的用于细胞增殖的培养基组合物。

并且，本发明提供包含源自鸟类的蛋(egg)的细胞条件培养基作为有效成分的用于治疗皮肤创伤的药学组合物。

而且，本发明提供包含源自鸟类的蛋(egg)的细胞条件培养基作为有效成分的用于皮肤再生或皱纹改善的化妆品组合物。

发明的效果

本发明的鸟类的蛋(egg)干细胞条件培养基(conditionedmedium)可从根本上防止使用动物血清所导致的污染，而且，不存在由于使用支撑细胞而由不同物质之间的感染物质所导致的传染可能性，从而产生包括人干细胞、皮肤细胞在内的多种细胞增殖效果，并且，产生显著的皮肤再生或皱纹改善效果，因此，可将蛋干细胞条件培养基有效用作用于细胞增殖的培养基组合物以及用于皮肤再生或皱纹改善的化妆品组合物。

附图说明

图1为示出从蛋受精卵胚盘衍生的多能干细胞的图。

图1的a部分为示出形成集落的形态的图。

图1的b部分为通过免疫细胞染色法确认oct4基因处于表达状态的图。

图1的c部分为确认碱性磷酸酶的活性的图。

图1的d部分为对作为多能干细胞的标志物的sox2、nanog的表达与否进行确认的图。

图2的a部分为对源自蛋的神经干细胞的碱性磷酸酶的活性进行确认的图。

图2的b部分为对作为神经干细胞标志物的巢蛋白(nestin)及sox9的表达与否进行确认的图。

图3为对源自蛋的干细胞条件培养基的人胚胎干细胞及人间充质干细胞的增殖效果进行确认的图。

图4为对源自蛋的干细胞条件培养基的皮肤细胞增殖效果进行确认的图。

图5为对针对胶原蛋白基因的表达的源自蛋的干细胞条件培养基的效果进行确认的图。

图6为对针对has-2的表达及透明质酸(hyaluronicacid)的生成量的源自蛋的干细胞条件培养基的效果进行确认的图。

图7为对针对弹性蛋白的表达的源自蛋的干细胞条件培养基的效果进行确认的图。

具体实施方式

以下，更加详细说明本发明。

本发明提供包含源自鸟类的蛋(egg)的干细胞条件培养基(conditionedmedium)作为有效成分的用于细胞增殖的培养基组合物。

上述蛋为鸟类的蛋(egg)，上述鸟类包括鸡、火鸡、鸭子、雁、鹌鹑、野鸡、麻雀、鸽子、鹦鹉、雀科小鸟(finches)、鹰、乌鸦，鸵鸟、澳洲鸵鸟(emu)及鹤鸵(cassowary)等分类学上鸟纲(avesclass)的所有种类、亚种(subspecies),属(rass)，但并不限定于此。尤其优选地，上述鸟类为原鸡(gallusgallus)或作为鸡的种类的白色来亨鸡、棕色来亨鸡、横斑洛克鸡(barred-rock)、苏塞斯鸡(sussex)、加利福尼亚灰鸡、意大利帕特里奇彩色鸡(italianpartidge-colored)。

本发明的源自蛋的干细胞包括在eyal-giladiandkochay(eg&k，1976)的产生阶段中从stage-x或xi相关的胚胎的蛋受精卵的胚盘(blastoderm)获得的多能干细胞(pluripotentstemcell)、通过从在38℃的条件下在培养基中培养蛋受精卵3-5天来达到h&h(hamburgerandhamilton，1951)stage14-17产生阶段的胚胎采取血液而得的全能细胞、从在38℃的条件下在培养基中培养蛋受精卵5-6天来在h&h(hamburgerandhamilton，1951)stage28中形成的生殖素分离的胚胎生殖细胞(embryonicgermcells，egcs)、在38℃的条件下培养蛋受精卵11天来获得的通过在从肌肉组织获得的胚胎成纤维细胞(embryonicfibroblast，efs)中处理yamanaka转录因子(oct4，sox2，kif-4，c-myc)来进行逆分化或者通过过表达mirna-302cluster来获得的逆分化干细胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)，但并不限定于此。

上述条件培养基是指在达到作为细胞分裂全盛期的对数生长期时给细胞更换无血清培养基后仅回收培养液的培养基。这是指利用在培养基中从处于分裂中的细胞提取出的未知生长因子(growthfactor)、细胞因子(cytokine)。根据一实例，上述条件培养基包含将蛋干细胞培养在无血清培养基中后去除上述干细胞的溶液，可富含源自蛋干细胞的生长因子、细胞因子等物质。

并且，上述条件培养基通过在包含生长因子等的培养基中第一次培养蛋干细胞后在无血清培养基中培养来制备，但不执行第一次预培养步骤也无妨，可以在基本培养基中培养蛋干细胞后通过干细胞来制备。

另一方面，优选地，上述细胞增殖用于选自由人干细胞、体细胞及皮肤细胞组成的组中的一种细胞，优选地，上述人干细胞为胚胎干细胞或成体干细胞，作为上述成体干细胞，可使用选自由源自骨髓的干细胞、源自脂肪的干细胞、源自脐带血的干细胞、源自血液的干细胞、源自肝脏的干细胞、源自皮肤的干细胞、源自胃肠道的干细胞、源自胎盘的干细胞、源自神经的干细胞、源自副肾的干细胞、源自上皮的干细胞及源自子宫的干细胞组成的组中的一种。

本发明的具体实施例中，本发明人从鸡的蛋分离神经干细胞、多能干细胞后(参照图1及图2)，通过在基本培养基中培养来制备了蛋干细胞条件培养基。

并且，为了确认本发明的蛋干细胞条件培养基的细胞增殖效果，在包含蛋干细胞条件培养基的基本培养基中培养人干细胞或皮肤细胞，通过结果确认，即使不添加动物血清及支撑细胞也可以产生显著的人干细胞或皮肤细胞的增殖能力(参照图3及图4)。

因此，本发明的鸟类的蛋(egg)干细胞条件培养基(conditionedmedium)可从根本上防止使用动物血清所导致的污染，而且，不存在由于使用支撑细胞而由不同物质之间的感染物质所导致的传染可能性，从而可有效用作用于包括人干细胞、皮肤细胞在内的多种细胞增殖的培养基组合物。

并且，本发明提供包含源自鸟类的蛋(egg)的细胞条件培养基作为有效成分的用于治疗皮肤创伤的药学组合物。

优选地，上述源自鸟类的蛋的细胞为选自由多能干细胞、神经干细胞及纤维芽细胞组成的组中的一种。

本发明的创伤是指生物体受损的状态，可包括针对形成生物体的内部或外部表面的组织等对象的特定部分的损伤。

上述源自鸟类的蛋(egg)的细胞条件培养基促进皮肤细胞增殖、治愈创伤、对皮肤再生具有活性，相对于组合物总重量，可包含0.1重量百分比至100重量百分比的本发明的上述有效成分。

本发明的具体实施例中，本发明人为了在源自蛋(egg)的细胞条件培养基中确认皮肤细胞增殖能力，在源自蛋的细胞培养液培养hacat(角蛋白形成细胞(keratinocyte)，thermo)皮肤细胞规定时间后，比较生长程度，结果显示具有有效的皮肤细胞增殖能力(参照图4)。

总而言之，在本发明的源自鸟类的蛋(egg)的细胞条件培养基中培养皮肤细胞时产生突出的皮肤细胞增殖效果，可将源自鸟类的蛋(egg)的细胞条件培养基用作用于治疗皮肤创伤的药学组合物的有效成分。

本发明的包含源自蛋(egg)的细胞条件培养基的药学组合物除了包含作为有效成分的源自蛋(egg)的细胞条件培养基之外，还可包含通常所使用的适当的载体、赋形剂及稀释剂。并且，在制备药学组合物时可使用固体或液体的制剂用添加物。制剂用添加物可为有机或无机中的任一种。

作为赋形剂，可举例乳糖、蔗糖、白糖、葡萄糖、玉米淀粉(cornstarch)、淀粉、滑石、山梨糖、结晶纤维素、糊精、高岭土、碳酸钙、二氧化硅等。作为结合剂，可举例聚乙烯醇、聚乙烯醚、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、蓍胶(tragacanth)、明胶、虫胶(shellac)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、柠檬酸钙、糊精、果胶(pectin)等。作为润滑剂，可举例硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅、硬化植物油等。作为着色剂，只要可添加在常规的医药品中，都可以适用。可在它们片剂、颗粒剂包衣糖的(糖衣)、明胶，且根据需要可包衣其他的包衣物。并且，可根据需要可添加防腐剂、抗氧化剂等。

本发明的药学组合物可制备成在本技术领域中通常所制备的任何剂型(例如，文献remington'spharmaceuticalscience，最新版；mackpublishingcompany，eastonpa)，制剂的形态不受特别限制，但优选地，可以为外用剂。本发明的外用剂可包括片剂、液态涂敷剂、喷雾剂、乳剂、霜剂、糊剂、粉剂、渗透垫剂、喷雾剂、凝胶剂、贴剂、搽剂、软膏剂、气溶剂、粉末剂、悬浮液剂、经皮吸收剂等常规的外用剂的形态。这些剂型记载于作为在所有制药化学中通常公知的处方书的文献[remington'spharmaceuticalscience，15thedition，1975，mackpublishingcompany，easton，pennsylvania18042(chapter87：blaug，seymour)中。

在本发明的外用剂中，作为药剂学上可接受的载体根据其的剂型而不同，但可举例凡士林、液状石蜡、胶凝烃(别名：液体石蜡和聚乙烯的复合软膏基质)等烃类；中链脂肪酸甘油三酸酯、腥油、硬脂、可可脂等动植物油；鲸蜡醇、硬脂醇、硬脂酸、棕榈酸异丙酯等高级脂肪酸醇及脂肪酸以及其酯类；聚乙二醇(macrogol)(聚乙二醇(polyethyleneglycol))、1，3-丁二醇、丙三醇、明胶、白糖、糖醇等水溶性基剂；甘油脂肪酸酯、聚氧硬脂酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油等乳化剂；丙烯酸酯、海藻酸钠等粘结剂；液化石油气、二氧化碳等喷射剂；对氧苯甲酸酯类等防腐剂等，可通过使用这些并根据常规的方法来制备本发明的外用剂。并且，除此之外，还可根据需要配合稳定剂、香料、着色剂、ph调节剂、稀释剂、表面活性剂、保存剂、抗氧化剂等。可通过常规的方法将本发明的外用剂涂敷于局部创伤部位来使用。并且，可通过将本发明的外用剂粘结在常规的创可贴的创伤剥离套等固体支撑体上来使用。作为本发明的实施方式，首先用粘结层覆盖固体支撑体来提高固体支撑体的培养液的附着。作为粘结剂的例，可包括聚丙烯酸酯及氰基丙烯酸酯。

本发明的的药学有效剂量可根据患者的创伤种类、适用部位、处置次数、处置时间、剂型、患者的状态、辅助剂的种类等而不同。使用量不受特别限制，但是，当在创伤中适用包含源自蛋(egg)的细胞条件培养基的组合物时，本发明的药学组合物的每天有效剂量可以为1μl/cm²至50μl/cm²，优选地，为5μl/cm²至20μl/cm²。上述一天的量可一天给药一次或者一天中隔一段时间分为2～3次来给药，也可以每隔数日间歇性地给药。但是，本发明的药学组合物的上述使用量是考虑给药途径、患者的年龄、性别、体重、患者的重症度、创伤种类、适用部位、处置次数、处置时间、剂型、患者的状态、辅助剂的种类等多种相关因子来决定的，因此，上述有效剂量在任何方面上都不会限制本发明的范围。

并且，本发明提供包含源自蛋(egg)的细胞条件培养基作为有效成分的用于皮肤再生或皱纹改善的化妆品组合物。

优选地，上述源自鸟类的蛋的细胞为选自由多能干细胞、神经干细胞及纤维芽细胞组成的组中的一种。

本发明的源自蛋(egg)的细胞条件培养基有效增殖皮肤细胞，增加与皮肤皱纹和保湿相关的胶原蛋白基因的表达，增加透明质酸的生成，增加弹性蛋白基因的表达，因此，其可用作用于皮肤再生或皱纹改善的化妆品组合物。

本发明的包含源自蛋(egg)的细胞条件培养基的用于改善皮肤状态的化妆品组合物可包含可收容化妆品制剂的载体。其中，“可收容化妆品制剂的载体”是指可包含在化妆品中的公知使用的化合物或组合物或者以后所要开发的化合物或组合物，是在与皮肤接触时无毒性、无不稳定性或无刺激的人体可适应的化合物或组合物。相对于本发明的化妆品组合物的总重量，可包含约1重量百分比至约99.99重量百分比的上述载体，优选地，可包含组合物的重量的约90重量百分比至约99.99重量百分比。但是，上述比率可随着制备本发明的化妆品组合物的后述的剂型或其具体适用部位(脸部、颈部等)或其优选适用量等而不同，因此，上述比率在任何方面上都不会限制本发明的范围。

作为上述载体，可举例醇类、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、湿润剂、保湿剂、粘性变形剂、乳剂、稳定剂、紫外线散射剂、紫外线吸收剂、发色剂、香料等。可用作上述醇类、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、湿润剂、保湿剂、粘性变形剂、乳剂、稳定剂、紫外线散射剂、紫外线吸收剂、发色剂、香料的化合物/组合物等为在本技术领域中公知的，因此，本技术领域的普通技术人员可选择适当的相关物质/组合物来使用。作为本发明的一实例，本发明的化妆品组合物除了包含上述源自蛋的干细胞培养液之外，还可包含丙三醇、丁二醇、丙二醇、聚氧乙烯硬化蓖麻油、乙醇、三乙醇胺等，可根据需要包含微量的防腐剂、香料、着色料、纯化水等。本发明的化妆品组合物可制备成多种形态，例如，可制备成化妆水、精华水、凝胶、乳液、护肤液、霜(水包油型、油包水型、多重形态)、溶液、悬浮液(无水及水系)、无水产物(油及乙二醇类)、凝胶、面膜、膜剂、粉末或明胶等具有皮膜的胶囊(软胶囊、硬胶囊)剂型等形态。本发明中的皮肤不仅仅是指脸部，可包括头皮、全身，作为可适用于这种头皮的化妆品组合物，有洗发乳、护发液、护发素、生发剂等，作为可适用于全身的化妆品组合物，可制备成用作沐浴露等用途的多种形态。包含本发明的源自蛋的干细胞培养液的用于皮肤再生或皮肤创伤改善化妆品组合物的制备方法并不限定于前述的制备方法，本发明所属技术领域的普通技术人员可通过变形上述制备方法的一部分的方法来制备本发明的化妆品组合物。

尤其，上述用于皮肤再生的化妆品组合物或用于皱纹改善的化妆品组合物除了使用在本发明中特别揭示的制备方法之外，还可以利用常规的制备方法来制备成通常的乳化剂型及可溶化剂型的形态。在制备成乳化剂型及可溶化剂型的化妆品组合物的情况下，作为乳化剂型的化妆品，有营养化妆水、霜、精华水等，作为可溶化剂型的化妆品，有柔软化妆水。并且，包含皮肤科学上可接受的介质或基剂，因此，可制备成在皮肤科学领域中通常所使用的可局部适用或全身适用的辅助剂形态。并且，作为适合的化妆品的剂型，可提供为如溶液、凝胶、固体或糊状无水产物、通过在水相中分散油相来获得的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微细颗粒球或离子型(脂质体)、非离子型的小囊分散剂的形态、霜、柔肤水、护肤液、粉剂、软膏、喷雾剂或遮瑕棒的形态。并且，还可以制备成还包含泡沫(foam)形态或压缩的推进剂的气溶剂组合物的形态。

并且，本发明的用于皮肤再生的化妆品组合物或用于皱纹改善的化妆品组合物还可包含如脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂及胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foamingagent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、金属离子封闭剂及螯合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润剂、必需油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质小囊或在化妆品中通常所使用的任意其他成分等化妆品学或皮肤科学领域中通常所使用的辅助剂。而且，上述的成分能够以在皮肤科学领域中通常所使用的量导入。这种本发明的化妆品组合物包含皮肤收敛、抗炎、创伤、伤口治愈、抗老化等功能性化妆品的形态。

以下，通过实施例及实验例详细说明本发明。

但是，下述实施例及实验例仅用于例示本发明，而本发明的内容并不限定于下述实施例及实验例。

实施例1.从鸟类的蛋(egg)细胞分离干细胞并培养

1-1.从鸟类的蛋分离神经干细胞并培养

利用作为原鸡的一种的白色来亨鸡(whiteleghorn)种的蛋(egg)来分离神经干细胞并培养。

具体地，在38℃的温度条件下培养蛋受精卵8天并将脊髓管切成1mm后，处理酶(0.01％的木瓜蛋白酶(papain)(sigma)、0.01％的dnai)，然后，添加磷酸缓冲盐溶液(pbs)缓冲液并在800g离心分离3分钟后，去除上清液，在包含表皮细胞生长因子(egf)、碱性成纤维生长因子(bfgf)、胰岛素(insulin)的生长因子的细胞神经诱导(neurobasala)培养基中培养1周来获得球状神经细胞块。具体的培养方法参照了whalleywetal.，(2009)，developmentalbiology332:234-245。

1-2.从鸟类的蛋的胚盘分离多能干细胞并培养

本发明的多能干细胞是指从受精卵的胚盘细胞分离并培养的胚胎干细胞(embryonicstemcell，esc)，是指具有oct4、nanog、sox2、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)活性的细胞。

具体地，利用了作为鸡的一种的白色来亨鸡(whiteleghorn)或棕色来亨鸡种的受精卵(fertilizedegg)。根据eyal-giladiandkochav(eg&k，1976)的发生阶段，即，利用手术用剪刀剪出stage-x或xi阶段的胚胎的胚盘(blastoderm)。在pbs缓冲液(pbsbuffer)去除所剪出的上述胚盘的卵黄膜(viteline)和卵黄并从具有分化全能性的胚盘分离了胚胎干细胞。为了胚胎干细胞的生长，对细胞处理丝裂霉素c(mitomycinec)(10ug/ml)2小时来与抑制生长的鸡胚成纤维细胞(chickenembryonicfibroblastcells)或stocells共培养，具体的培养方法参照了eyal-giladiandkochay(1976)，devbiol.49:321-37及painbetal.(1996)，development122:2339-2348。

1-3.从鸟类的蛋分离胚胎成纤维细胞并培养

利用了作为原鸡的一种的白色来亨鸡(whiteleghorn)种的蛋(egg)。在37℃～38℃的温度条件下培养4天蛋受精卵来获得组织后，去除头部和内脏后用酶(胰蛋白酶-edta(trypsin-edta))进行处理。添加包含105％的胎牛血清(fbs)的杜贝克改良鹰培养基(dmem)后，在800g离心分离3分钟，然后，去除上清液，在10％的dmem培养基长期培养来获得胚胎成纤维细胞(embryonicfibroblasts，fbs)。具体的培养方法参照了dairetal(2014).stemcellinternational2014:1-15。

实施例2.鸟类的蛋干细胞条件培养基(conditionedmedium)

利用在上述实施例1中所获得的作为源自蛋的干细胞的多能干细胞、或神经干细胞及纤维芽细胞来制备了条件培养基。

具体地，在作为基本培养基的dmem/f12培养基中培养多能干细胞、神经干细胞或纤维芽细胞3天，然后，去除多能干细胞、神经干细胞或纤维芽细胞后，仅回收培养液，最终，制备了鸟类的蛋干细胞条件培养基、鸟类的纤维芽细胞条件培养基。

实验例1.确认从鸟类的蛋(egg)细胞分离的干细胞

确认了在上述实施例1中分离并培养的源自蛋的干细胞的干细胞能力。多能干细胞表达碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)活性、作为标志物基因的oct4、sox2、nanog基因，神经干细胞表达碱性磷酸酶活性及作为标志物基因的巢蛋白(nestin)、sox9，因此，利用碱性磷酸酶染色、rt-pcr或免疫化学染色来确认了源自蛋的干细胞的干细胞能力。

在碱性磷酸酶染色通过在包含10％的mgcl2的tris-马来酸缓冲液中使用萘酚as-ma-磷酸盐(naphtol-as-ma-phosphate)(sigman5000)和耐晒红tr盐(fastredtrsalt)(sigmaf2768)来执行。并且，通过逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)进行oct4、nanog、巢蛋白(nestin)的基因表达，作为在免疫染色中所使用的抗体oct4，使用了抗小鼠oct4(anti-mouseoct4)(santacruz)和cy3抗小鼠igg(cy3-anti-mouseigg)。在rt-pcr中所使用的引物如下列表1所示。

表1

其结果，如图1所示，从蛋受精卵胚盘分离的多能干细胞形成集落(图1的a部分)，表达oct4基因(图1的b部分)，呈现出碱性磷酸酶活性(图1的c部分)，相比于胚胎成纤维细胞，多能干细胞标志物基因的表达显著(图1的d部分)。并且，如图2所示，源自蛋的神经干细胞也呈现出碱性磷酸酶活性(图2的a部分)，作为神经干细胞标志物的巢蛋白(nestin)、sox9的表达显著(图2的b部分)。

因此，确认了在实施例1中分离并培养的源自蛋的干细胞分别为多能干细胞及神经干细胞。

实验例2.确认鸟类的蛋干细胞条件培养基的细胞增殖能力

为了鸟类的蛋干细胞条件培养基的人干细胞增殖能力，在包含血清替代物(serumreplacer)(20％)的dmem/f12培养基(sr)和在上述实施例2中所制备的源自蛋的多能干细胞条件培养基(pcs-cm)中分别培养了人胚胎干细胞或间充质干细胞后比较其结果并进行分析。

具体地，在包含20％的血清替代物(serumreplacer)(gibco)的dmem/f12培养基中培养了作为对照组的人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells，hescs)。并且，在包含在上述实施例2中所制备的源自蛋的多能干细胞条件培养基(20％)的dmem/f12培养基中培养了实验组。培养了共5天，示出了生长程度(图3的a部分)。在包含10％的fbs的培养基中培养了人间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells)，将1×10⁶个所培养的细胞接种(seeding)于60mm的培养皿(dish)后，在对照组1中使用了未包含fbs的dmem培养基。在对照组2中使用了包含5％的fbsdmem培养基(5％的fbs)，在包含5％的在实施例2中所制备的源自蛋的多能干细胞条件培养基的dmem培养基(5％的psccm)中培养实验组3天后，对生长程度进行了计数(图3的b部分)。

其结果，如图3所示，在包含本发明的源自蛋的多能干细胞条件培养基的基本培养基中，人胚胎干细胞或间充质干细胞的增殖明显优秀(图3)。

因此，可将本发明的蛋干细胞条件培养基用作用于干细胞增殖的培养基组合物。

实验例3.确认鸟类的蛋干细胞条件培养基的皮肤细胞增殖能力

为了确认鸟类的蛋干细胞条件培养基的皮肤细胞增殖能力，在包含浓度为4％的在上述实施例1中分离的纤维芽细胞、神经干细胞、多能干细胞的条件培养基的基本培养基中培养了皮肤细胞。

具体地，在包含10％的fbs的dmem培养基中培养作为皮肤细胞的hatcat细胞后，在未包含fbs的dmem培养基中培养1天来抑制细胞生长。并且，将未包含fbs的dmem培养基作为对照组，作为实验组，在未包含fbs的dmem培养基中添加浓度为4％的纤维芽细胞、神经干细胞、多能干细胞的条件培养基后，确认了1天至3天的生长程度。

其结果，如图4所示，相比于无处理对照组，神经干细胞、多能干细胞的条件培养基显著增殖hacat细胞，在纤维芽细胞条件培养基中确认了hacat细胞的增殖效果(图4)。

并且，将产生显著效果的多能干细胞条件培养基按4％、2％、1％的用量递减的方式进行试验，其结果，相比于对照组，在添加2％的添加浓度中也产生了显著的增殖效果(图4)。

实验例4.确认鸟类的蛋干细胞条件培养基的皮肤再生及皱纹改善效果

确认了鸟类的蛋干细胞条件培养基的皮肤再生及皱纹改善效果。

具体地，在包含浓度为4％的在上述实施例1中分离的纤维芽细胞、神经干细胞、多能干细胞的条件培养基的dmem基本培养基中培养皮肤细胞(hacat)2天后，利用定量pcr(qpcr)对与皱纹改善相关的胶原蛋白基因(cola1(collagentypeiα1；nm_000088.3)，cola2(collagentypeiα2；nm_000089.3))的表达与否确认了表达程度，作为对照组，在dmem基本培养基中培养皮肤细胞后，确认了胶原蛋白基因的表达与否。

并且，为了确认是否与皮肤皱纹及保湿相关的透明质酸合成有关，确认了作为透明质酸合成基因的透明质酸合成酶2(hyaluronicacidsynthetase-2，has-2)及弹性蛋白基因的表达，利用透明质酸elisa检测试剂盒(haassayelisakit)测定了透明质酸(hyaluronicacid)的生成量。

具体地，将10⁵个hacat细胞接种(seeding)于60mm的培养皿(dish)后，在包含10％的fbs的dmem培养基中培养，然后，利用未包含血清的基本培养基来使细胞生成停止24小时后，添加于包含0～4％的纤维芽细胞或多能干细胞的条件培养基的培养基中后，培养48小时，然后，确认了透明质酸合成酶2(hyaluronicacidsynthetase-2，has-2)的表达。

另一方面，在本实验中所使用的引物如下列表2所示。

表2

其结果，如图5所示，相比于包含对照组及纤维芽细胞条件培养基的培养基，包含本发明的神经干细胞条件培养基和多能干细胞的条件培养基的培养基显著增加与皱纹改善相关的胶原蛋白基因的表达(图5的a部分及图5的c部分)。尤其，以减少添加量的方式确认胶原蛋白基因的表达，其结果，相比于对照组，产生显著效果的多能干细胞条件培养基在2％以下的添加浓度中的基因表达显著增加(图5的b部分及图5的d部分)。并且，如图6所示，包含本发明的多能干细胞的条件培养基的培养基显著增加has-2的表达及透明质酸(hyaluronicacid)的生成量(图6)。

同时，如图7所示，包含本发明的多能干细胞的条件培养基的培养基显著增加与皮肤弹性相关的弹性蛋白的表达(图7)。

因此，本发明的神经干细胞条件培养基和多能干细胞的条件培养基产生显著的皮肤再生及皱纹改善效果。

sequencelisting

<110>李廷福

<120>包含作为从鸟类的蛋分离的细胞的胚盘多能干细胞、神经干细胞、胚胎成纤维细胞条件培养基作为有效成分的用于细胞增殖、皮肤再生及皱纹改善的培养基组合物

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