异戊烯化测定法的制作方法

相关申请

本申请要求2017年10月17日提交的临时申请ussn62/573,522和2018年2月28日提交的临时申请ussn62/636,722的权益，每篇的内容通过引用整体并入本文。

序列表并入

命名为“nigh-005_001wo_seqlist.txt”的文本文件的内容于2018年10月16日创建，并且大小为59kb，在此通过引用整体并入。

发明领域

本发明涉及用于测定rab护送蛋白1(rep1)活性的测定法。更具体地，本发明涉及rab6a在测定法中作为异戊烯化(prenylation)的底物的用途，特别是其中已经使用基因疗法载体将rep1递送至细胞。

发明背景

通过向眼的受影响细胞提供rep1转基因的功能性拷贝，可以成功地治疗无脉络膜(choroideremia)。具体地，已经显示腺伴随病毒(aav)基因疗法载体可以用于将编码功能性rep1的核苷酸序列递送至眼以治疗该疾病。由于无脉络膜的基因疗法正在成为临床现实，因此需要可靠且灵敏的测定来测定外源递送的rep1的活性，特别地以测试新的基因疗法载体和作为临床载体储液的质量控制筛选。本公开内容提供了测定外源递送的rep1的活性的可靠且灵敏的测定法。

发明概述

令人惊讶地，本发明人发现了尽管普遍认为rab27a(也称为rab27a)提供了最合适的异戊烯化测定底物，但是在异戊烯化反应中使用rab6a(也称为rab6a)作为底物提供了一种更灵敏的用于测定rab护送活性蛋白1(rep1)的方法。rab6a不仅在检测异戊烯化的测定法中提供增加的灵敏性，它还提供有益的信噪比、更好的动态信号范围和更好的一致性。

此外，本发明人已经证明了，可以利用基于rab6a的测定法的增加的灵敏性来准确且可靠测定编码rep1的载体的活性，特别是aav基因疗法载体，例如那些适用于临床的载体。

本公开内容提供了用于测定rab护送蛋白1(rep1)活性的方法，其包括以下步骤：(a)使rep1蛋白与rab6a蛋白、rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rabgeranylgeranyltransferase)(rabggt酶)和脂质供体底物接触以产生脂质化的rab6a；和(b)检测所述脂质化的rab6a。

在本公开内容的测定rab护送蛋白1(rep1)的活性的方法的一些实施方案中，样品包含rep1蛋白。在一些实施方案中，从细胞分离或衍生包含rep1蛋白的样品，并且其中所述细胞经遗传工程化改造以表达rep1蛋白。在一些实施方案中，包含rep1蛋白的样品包含细胞的裂解物。

在本公开内容的测定rab护送蛋白1(rep1)的活性的方法的一些实施方案中，从包含编码rep1蛋白的核苷酸序列的病毒载体表达rep1蛋白。在一些实施方案中，病毒载体是腺伴随病毒(aav)载体。

在本公开内容的测定rab护送蛋白1(rep1)的活性的方法的一些实施方案中，rab6a蛋白或rabggt酶是基本上纯的。在一些实施方案中，rab6a蛋白和rabggt酶是基本上纯的。在一些实施方案中，rab6a:rabggt酶摩尔比为约1:2-3。在一些实施方案中，rab6a:rabggt酶摩尔比为1:2-3。在一些实施方案中，rab6a:rabggt酶摩尔比为约1:2.5。在一些实施方案中，rab6a:rabggt酶摩尔比是1:2.5。

在本公开内容的测定rab护送蛋白1(rep1)的活性的方法的一些实施方案中，脂质供体底物包含牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐/酯(geranylgeranylpyrophosphate)(ggpp)或其类似物。在一些实施方案中，脂质供体底物包含生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯(biotin-geranylpyrophosphate)(bgpp)。

在本公开内容的测定rab护送蛋白1(rep1)的活性的方法的一些实施方案中，检测脂质化的rab6a包括酶联免疫吸附测定法(elisa)、western印迹分析或放射自显影术。

在本公开内容的测定rab护送蛋白1(rep1)的活性的方法的一些实施方案中，制备包含编码所述rep1蛋白的核苷酸序列的aav载体，用于治疗无脉络膜。在一些实施方案中，检测脂质化的rab6a，并且所述rep-1蛋白或包含编码所述rep1蛋白的核苷酸序列的aav载体适用于无脉络膜的治疗。

在本公开内容的测定rab护送蛋白1(rep1)的活性的方法的一些实施方案中，检测所述脂质化的rab6a还包括量化所述脂质化的rab6a的量。在一些实施方案中，脂质化的rab6a的量是绝对量。在一些实施方案中，脂质化的rab6a的量是相对量。在一些实施方案中，脂质化的rab6a的量是相对于对照量或参考水平。

本公开内容提供了rab6a蛋白用于测定rab护送蛋白1(rep1)蛋白的活性的用途。

在本公开内容的rab6a蛋白用于测定rep1蛋白的活性的用途的一些实施方案中，从细胞分离或衍生rep1蛋白，并且该细胞经遗传工程化改造以表达rep1蛋白。在一些实施方案中，细胞包含rep1蛋白，并且该细胞经遗传工程化改造以表达rep1蛋白。在一些实施方案中，从细胞的裂解物分离或衍生rep1蛋白，并且细胞经遗传工程化改造以表达rep1蛋白。在一些实施方案中，细胞裂解物包含rep1蛋白，从细胞分离或衍生细胞裂解物，并且细胞经遗传工程化改造以表达rep1蛋白。

在本公开内容的rab6a蛋白用于测定rep1蛋白的活性的用途的一些实施方案中，从包含编码rep1蛋白的核苷酸序列的病毒载体表达rep1蛋白。在一些实施方案中，病毒载体是腺伴随病毒(aav)载体。在一些实施方案中，制备包含编码rep1蛋白的核苷酸序列的aav载体，用于治疗无脉络膜。在一些实施方案中，检测脂质化的rab6a，并且rep-1蛋白或包含编码rep1蛋白的核苷酸序列的aav载体适用于无脉络膜的治疗。

在本公开内容的rab6a蛋白用于测定rep1蛋白的活性的用途的一些实施方案中，rab6a蛋白是基本上纯的。

本公开内容提供了用于测定rab护送蛋白1(rep1)的活性的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含rep1的样品；(b)使步骤(a)的样品与rab6a，rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rabggt酶)和脂质供体底物接触；并且(c)检测脂质化的rab6a产物。

例如，本发明的方法可以用于测试适合于将rep1递送至靶细胞的基因疗法载体或用于载体储液(例如药物储液)的质量控制分析。

基因疗法载体的验证对于在临床中基因疗法的安全且有效实施是强制性的。对于分析和质量控制步骤，与对照实验或参考水平的比较可以提供基因疗法载体或rep1相对于已知或公认标准的活性的量度(例如，比已知或公认的标准更好或更差)。这可以用于验证基因疗法载体储液是否符合特定目标和法规。

在一个实施方案中，比较rep1或rep1编码aav载体的样品，其定义为主要参考标准品。可以例如在测试样品和主要参考标准样品上平行进行本发明的方法。可以例如相对于主要参考标准品定义测试样品的效力、生物学活性和/或行为。

换言之，本发明的方法可以例如用于质量控制分析和验证基因疗法载体为有效的(例如用于治疗无脉络膜)，优选地包含rep1编码核苷酸序列的aav载体颗粒，优选地，其中通过本发明的方法测定的载体的输出活性或功效高于阈值活性或在规定的靶标范围内(例如通过与对照实验或参照水平比较)指示载体适合于基因治疗目的。

因此，另一方面，本发明的方法用于rab护送蛋白1(rep1)编码基因疗法载体(优选aav载体)的质量控制分析。

另一方面，本发明提供了用于rab护送蛋白1(rep1)编码基因疗法载体(优选aav载体)的质量控制分析的方法，包括以下步骤:

(a)用载体转导细胞，在适合于表达rep1的条件下培养细胞并裂解细胞以提供含有rep1的样品；

(b)使步骤(a)的样品与rab6a、rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rabggt酶)和脂质供体底物接触；并且

(c)检测脂质化rab6a产物。

因此，该方法可以包括进行包括步骤(a)至(c)的多个实验，其中涉及包含rep1的样品的参数是变化的，而其他参数(例如涉及rab6a、rabggt酶和脂质的参数)保持恒定。此类参数可以包括例如相关蛋白质(例如rep1)的氨基酸序列、用于在细胞中表达rep1的载体中包含的rep1编码核苷酸序列、用于将rep1编码核苷酸序列递送到细胞的载体类型(例如病毒载体的类型，例如腺伴随病毒(aav)载体的类型)、rep1的浓度和/或用于将rep1编码核苷酸序列递送到细胞的载体的感染复数(moi)。在一个优选的实施方案中，该方法包括进行多个实验，包括在用于将rep1编码核苷酸序列递送到细胞的载体的不同moi下的步骤(a)至(c)(例如，以产生剂量-响应曲线)。

在一个实施方案中，脂质化rab6a产物的检测包括量化脂质化rab6a产物的量。在优选的实施方案中，脂质化rab6a产物的检测包括相对于对照或参照水平量化脂质化rab6a产物的量。例如，可以相对于定义为主要参考标准品的rep1或rep1编码aav载体的样品进行量化。可以例如在测试样品和主要参考标准样品上平行进行本发明的方法。可以例如相对于主要参考标准品定义测试样品的效力、生物学活性和/或行为。

在一个实施方案中，该方法包括比较脂质化rab6a产物(例如，异戊烯化的，例如牻牛儿基牻牛儿基化或生物素牻牛儿基化，rab6a)的量与自对照实验，例如使用rep1的已知或标准样品的实验确定的量的进一步步骤。

在另一个实施方案中，该方法还包括比较脂质化rab6a产物(例如，异戊烯化的，例如牻牛儿基牻牛儿基化或生物素牻牛儿基化，rab6a)的量与参考水平的进一步步骤。

在一个实施方案中，包含rep1的样品来自经遗传工程化改造以表达rep1的细胞。优选地，包含rep1的样品是经遗传工程化改造以表达rep1的细胞的裂解物。优选地，用包含rep1编码核苷酸序列的载体转染或转导细胞，以提供经遗传工程化改造以表达rep1的细胞。优选地，载体是病毒载体。

在一个实施方案中，使用包含rep1编码核苷酸序列的病毒载体表达rep1。

在一个实施方案中，病毒载体是腺伴随病毒(aav)载体。优选地，病毒载体是病毒载体颗粒的形式。

aav载体可以是任何血清型的(例如包含任何aav血清型基因组和/或壳体蛋白)。优选地，载体能够感染或转导眼细胞。

在一个实施方案中，aav载体包含aav血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11基因组。在另一个实施方案中，aav载体包含aav血清型2、4、5或8基因组。优选地，aav载体包含aav血清型2基因组。

在一个实施方案中，aav载体颗粒包含aav血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11壳体蛋白。在另一个实施方案中，aav载体颗粒包含aav血清型2、4、5或8壳体蛋白。例如，aav血清型8壳体蛋白可以是aav8/y733f突变体壳体蛋白。优选地，aav载体颗粒包含aav血清型2壳体蛋白。

在一个实施方案中，aav载体颗粒包含aav2基因组和aav2壳体蛋白(aav2/2)；aav2基因组和aav5壳体蛋白(aav2/5)；或aav2基因组和aav8壳体蛋白(aav2/8)。优选地，aav载体颗粒包含aav2基因组和aav2壳体蛋白(aav2/2)。

aav载体颗粒可以是一种或多种天然存在的aav的嵌合、改组或壳体修饰的衍生物。特别地，aav载体颗粒可以包含来自相同载体(即假型化载体)内的aav的不同血清型、进化枝、克隆或隔离群(isolates)的壳体蛋白序列。因此，在一个实施方案中，aav载体是假型化aav载体颗粒的形式。

在一个实施方案中，rep1是人rep1。

在一个实施方案中，rep1包含与seqidno:5具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选其中氨基酸序列基本上保留以seqidno:5所示的蛋白质的天然功能。

在一个实施方案中，rep1编码核苷酸序列包含与seqidno:6或7具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，优选其中由核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留以seqidno:5所示的蛋白质的天然功能。

在一个实施方案中，rep1编码核苷酸序列包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与seqidno:5具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选其中氨基酸序列基本上保留以seqidno:5所示的蛋白质的天然功能。

在一个实施方案中，rab6a和/或rabggt酶是基本上纯的。

在一个实施方案中，rab6a包含与seqidno:1具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选其中氨基酸序列基本上保留以seqidno:1所示的蛋白质的天然功能。

在一个实施方案中，rabggt酶包含与seqidno:3或8，优选seqidno:8具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选其中氨基酸序列基本上保留以seqidno:8所示的蛋白质的天然功能；和/或与seqidno:4或9，优选seqidno:9具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选其中氨基酸序列基本上保留以seqidno:9所示的蛋白质的天然功能。

在另一个实施方案中，rab6a:rabggt酶摩尔比率为约1:0.25-3、1:0.3-2.9、1:0.35-2.8、1:0.4-2.7、1:0.45-2.6或1:0.5-2.5，优选约1:0.5-2.5。

在一个实施方案中，rab6a:rabggt酶摩尔比率为约1:2-3、1:2.1-2.9、1:2.2-2.8、1:2.3-2.7或1:2.4-2.6，优选约1:2.4-2.6。在一个实施方案中，rab6a:rabggt酶摩尔比率为约1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9或1:3，优选约1:2.5。

在另一个实施方案中，rab6a:rabggt酶摩尔比率为约1:0.25-0.75、1:0.3-0.7、1:0.35-0.65、1:0.4-0.6或1:0.45-0.55，优选约1:0.4-0.6。在一个实施方案中，rab6a:rabggt酶摩尔比率为约1:0.25、1:0.3、1:0.35、1:0.4、1:0.45、1:0.5、1:0.55、1:0.6、1:0.65、1-0.7或1:0.75，优选约1:0.5。

在一个实施方案中，脂质供体底物是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐/酯(ggpp)或其类似物。优选地，用可检测标志物标记脂质供体底物。例如，脂质供体底物可以是同位素标记的(例如，脂质供体底物可以包含3h)，或者可以包含荧光基团、表位或生物素部分。

在优选的实施方案中，脂质供体底物是生物素-牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐/酯(bgpp)。

在一个实施方案中，使用酶联免疫吸附测定法(elisa)、western印迹分析或放射自显影术检测脂质化rab6a产物。在优选的实施方案中，使用elisa检测脂质化rab6a产物。elisa可以是例如夹心式elisa。

在一个优选的实施方案中，使用对生物素特异的检测试剂，例如链霉抗生物素蛋白检测生物素标记的脂质化rab6a产物。优选地，使用对生物素特异的检测试剂，例如链霉抗生物素蛋白(例如链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物)，使用western印迹分析检测生物素标记的脂质化rab6a产物。更优选地，使用对生物素特异的检测试剂(例如链霉抗生物素蛋白)，使用elisa检测生物素标记的脂质化rab6a产物。

在一个实施方案中，该方法用于测定用于治疗无脉膜的rep1编码基因疗法载体的活性。

另一方面，本发明提供rab6a用于测定rab护送蛋白1(rep1)活性的用途。

测定rep1、rab6a、rabggt酶、脂质供体底物和rep1的活性的方法可以如本文所述。

另一方面，本发明提供了用于测定包含rab护送蛋白1(rep1)编码核苷酸序列的载体功效的方法，其中该方法包括以下步骤:

(a)提供包含rep1的样品，其中使用包含rep1编码核苷酸序列的载体表达rep1；

(b)使步骤(a)的样品与rab6a、rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rabggt酶)和脂质供体底物接触；并且

(c)检测脂质化rab6a产物。

另一方面，本发明提供rab6a用于测定包含rab护送蛋白1(rep1)编码核苷酸序列的载体功效的用途。

优选地，该方法和用途用于测定用于治疗无脉膜的载体的功效。

载体、rep1、rab6a、rabggt酶、脂质供体底物、脂质化rab6a产物、检测方法以及该方法和用途的其他特征可以如本文所述。

附图简述

专利或申请文件包含至少一个彩色附图。专利局将根据请求并且在缴纳必要的费用后，提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的副本。

图1a-d是一系列照片，描绘了使用rab27a作为底物进行体外异戊烯化反应，然后使用未转导的细胞和用aav-gfp或aav-rep1转导的细胞(moi＝10000gp/细胞)对掺入的生物素化的脂质供体进行western印迹(wb)分析。实验涉及3组独立制备的裂解物。使用总体积为12.5μl的10μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加2μm鱼rep1。检测时间为2min。(a)细胞裂解物(1:1000)中人rep1水平的wb分析。未转导细胞(#4，#9和#12)显示内源rep1水平。用aav-gfp转导的细胞(#5，#10和#3)显示与未转导细胞相似的内源rep1水平。与未转导的细胞和经aav-gfp转导的细胞相比，用aav-rep1转导的细胞(#6，#11和#14)显示rep1水平增加。阳性对照(+ve)显示内源rep1水平。(b)β-肌动蛋白作为上样对照(1:15000)的wb分析。在所有分析的样品中β-肌动蛋白的水平相似。(c)在rab27a(1:10000)中掺入的生物素化的脂质供体的wb分析。未转导的细胞和经aav-gfp转导的细胞在rab27a中未显示可检测的生物素掺入。用aav-rep1转导的细胞显示一定水平的掺入rab27a中的生物素(#6，#11和#14)。由于鱼rep1活性，阳性对照显示所有中最强的条带。(d)使用imagestudiolite软件半定量(c)中的wb分析。

图2a-d是一系列照片，描绘了使用rab27a作为底物进行体外异戊烯化反应，然后使用未转导的细胞和用aav-gfp或aav-rep1转导的细胞(moi＝10000gp/细胞)对掺入的生物素化的脂质供体进行western印迹(wb)分析。实验涉及2组独立制备的裂解物。使用总体积为22μl的30μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加1μm鱼rep1。检测时间为2分钟。(a)细胞裂解物(1:1000)中人rep1水平的wb分析。未转导细胞(#9和#12)显示内源rep1水平。用aav-gfp转导的细胞(#10和#13)显示与未转导细胞相似的内源rep1水平。与未转导的细胞和经aav-gfp转导的细胞相比，用aav-rep1转导的细胞(#11和#14)显示rep1水平增加。阳性对照(+ve)显示内源rep1水平。(b)β-肌动蛋白作为上样对照(1:15000)的wb分析。在所有分析的样品中β-肌动蛋白的水平相似。(c)在rab27a(1:10000)中掺入的生物素化的脂质供体的wb分析。未转导细胞和经aav-gfp转导的细胞在rab27a中未显示可检测的生物素掺入。用aav-rep1转导的细胞显示一定水平的掺入rab27a中的生物素(#11和#14)。由于鱼rep1活性，阳性对照显示所有中最强的条带。(d)使用imagestudiolite软件半定量(c)中的wb分析。

图3a-d是一系列照片，描绘了使用rab6a作为底物的体外异戊烯化反应，然后使用未转导的细胞和用aav-gfp或aav-rep1转导的细胞(moi＝10000gp/细胞)对掺入的生物素化的脂质供体进行western印迹(wb)分析。实验涉及2组独立制备的裂解物。使用总体积为20μl的20μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加1μm鱼rep1。检测时间为2分钟。(a)细胞裂解物(1:1000)中人rep1水平的wb分析。未转导细胞(#9和#12)显示内源rep1水平。用aav-gfp转导的细胞(#10和#13)显示与未转导细胞相似的内源rep1水平。与未转导的细胞和经aav-gfp转导的细胞相比，用aav-rep1转导的细胞(#11和#14)显示rep1水平增加。阳性对照(+ve)显示内源rep1水平。(b)β-肌动蛋白作为上样对照(1:15000)的wb分析。在所有分析的样品中β-肌动蛋白的水平相似。(c)在rab6a(1:10000)中掺入的生物素化的脂质供体的wb分析。未转导的细胞和经aav-gfp转导的细胞在rab6a中显示非常低的生物素掺入。用aav-rep1转导的细胞显示掺入rab6a中的生物素(#11和#14)。由于鱼rep1活性，阳性对照显示最强的条带。(d)使用imagestudiolite软件半定量(c)中的wb分析。

图4a-d是一系列照片，描绘了使用rab6a作为底物的体外异戊烯化反应，然后使用未转导的细胞和用aav-rep1转导的细胞(moi＝250、1000、5000、10000和20000gp/细胞)对掺入的生物素化的脂质供体进行western印迹(wb)分析。使用总体积为15μl的20μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加0.5μm鱼rep1。检测时间为2分钟。(a)细胞裂解物(1:2500)中人rep1水平的wb分析。未转导的细胞显示内源rep1水平。用aav-rep1转导的细胞显示rep1水平的增加，其与所用的moi直接相关。阳性对照(+ve)显示内源rep1水平。(b)β-肌动蛋白作为上样对照(1:50,000)的wb分析。在所有分析的样品中β-肌动蛋白的水平相似。(c)在rab6a(1:10,000)中掺入的生物素化的脂质供体的wb分析。未转导的细胞在rab6a中显示非常低的生物素掺入。用aav-rep1转导的细胞显示越来越多的掺入rab6a中的生物素。由于鱼rep1活性，阳性对照显示所有中最强的条带。(d)使用imagestudiolite软件半定量(c)中的wb分析。

图5a-d是一系列照片，描绘了使用rab6a作为底物的体外异戊烯化反应，然后使用未转导的细胞和用aav-rep1转导的细胞(moi＝10,000gp/细胞)对掺入的生物素化的脂质供体进行western印迹(wb)分析。使用总体积为15μl的20μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加0.5μm鱼rep1。rep1/肌动蛋白的检测时间为2分钟，而生物素的检测时间为30秒。(a)细胞裂解物(1:2500)中人rep1水平的wb分析。未转导的细胞显示内源rep1水平。用aav-rep1转导的细胞显示rep1水平的增加。阳性对照(+ve)显示内源rep1水平。(b)β-肌动蛋白作为上样对照(1:50000)的wb分析。在所有分析的样品中β-肌动蛋白的水平相似。(c)在rab6a(1:10000)中掺入的生物素化的脂质供体的wb分析。未转导的细胞在rab6a中显示非常低的生物素掺入。用aav-rep1转导的细胞显示增加的对rab6a的生物素掺入。由于鱼rep1活性，阳性对照显示所有中最强的条带。(d)使用imagestudiolite软件半定量(c)中的wb分析。

图6a-d是一系列照片，描绘了体外异戊烯化反应，然后在未转导的arpe-19细胞中掺入生物素化的脂质供体的western印迹(wb)分析，和用aav-rep1转导的arpe-19细胞。使用总体积为45μl的15μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加0.1μm的鱼rep1。rep1/肌动蛋白的检测时间：2分钟；生物素的检测时间：30秒。使用以下细胞平行进行实验：(a)未转导的细胞(#86和#87)；和(b)细胞+aav-rep1moi10,000(#90和#91)-r&d级载体。(a)细胞裂解物(1:2,500)中人rep1水平的wb分析。未转导的细胞显示内源rep1水平。用aav-rep1转导的细胞显示rep1水平的增加。阳性对照(+ve)显示内源rep1水平。(b)β-肌动蛋白作为上样对照(1:50,000)的wb分析。在所有分析的样品中β-肌动蛋白的水平相似。(c)在rab6a(1:10,000)中掺入的生物素化的脂质供体的wb分析。未转导的细胞在rab6a中显示非常低的生物素掺入；用aav-rep1转导的细胞显示增加的对rab6a的生物素掺入。由于鱼rep1活性，阳性对照显示所有中最强的条带。(d)使用imagestudiolite软件半定量(c)中的wb分析。

图7a-d是一系列照片，描绘了体外异戊烯化反应，然后在未转导的ht1080细胞和用aav-rep1转导的ht1080细胞中掺入生物素化的脂质供体的western印迹(wb)分析。使用总体积为20μl的20μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加0.1μm的鱼rep1。rep1/肌动蛋白的检测时间：2分钟；生物素的检测时间：30秒。使用以下细胞平行进行实验：(a)未转导的细胞；#56和#57)；(b)细胞+aav-rep1moi10,000(#60和#61)-r&d级载体；和(c)细胞+aav-rep1moi10,000(#64和#65)-临床级载体。(a)细胞裂解物(1:2,500)中人rep1水平的wb分析。未转导的细胞显示内源rep1水平。用aav-rep1转导的细胞显示rep1水平的增加。阳性对照(+ve)显示内源rep1水平。(b)β-肌动蛋白作为上样对照(1:50,000)的wb分析。在所有分析的样品中β-肌动蛋白的水平相似。(c)在rab6a(1:10,000)中掺入的生物素化的脂质供体的wb分析。未转导的细胞显示rab6a中生物素掺入的基线水平；用aav-rep1转导的细胞显示增加的对rab6a的生物素掺入。(d)使用imagestudiolite软件半定量(c)中的wb分析。

图8a-e是一系列照片，描绘了体外异戊烯化反应，然后进行未转导的细胞和用aav-rep1转导的细胞(moi＝250、1000、5000、10000和20000gp/细胞)中掺入的生物素化脂质供体的western印迹(wb)分析，比较rab6a和rab27a底物。使用总体积为15μl的20μg裂解物和2种不同底物建立异戊烯化反应：rab27a(左手泳道和图；红色)和rab6a(右手泳道和图；蓝色)。对阳性对照(每种底物一种)掺加0.1μm鱼rep1。检测时间：2分钟。(a)细胞裂解物(1:2,500)中人rep1水平的wb分析。未转导的细胞显示内源rep1水平。用aav-rep1转导的细胞显示rep1水平的增加，其与所用的moi直接相关。阳性对照(+ve)显示内源rep1水平。(b)β-肌动蛋白作为上样对照(1:50,000)的wb分析。在所有分析的样品中β-肌动蛋白的水平相似。(c)在rab27a和rab6a中掺入的生物素化脂质供体的wb分析。未转导的细胞显示非常低的生物素对rab蛋白的掺入，其随着moi的增加而增加。由于鱼rep1活性，阳性对照显示强烈的生物素掺入。(d)使用imagestudiolite软件半定量(c)中的wb分析。使用prism软件绘制数据，如(e)中的四个图中所示。(e)在使用的moi间的来自生物素化底物的条带密度值(上部两个图)和使用的moi间生物素化底物与rep1之间的比率(下部两个图)。

图9a-d是一系列照片，描绘了体外异戊烯化反应，然后进行未转导的细胞中掺入的生物素化的脂质供体的western印迹(wb)分析，比较不同的异戊烯化反应条件。使用总体积为15μl的20μg裂解物和2种不同的底物建立异戊烯化反应：rab27a(红色)和rab6a(蓝色)。对阳性对照(每种底物一种)掺加重组人rep1。检测时间：2分钟。(a)在rab27a和rab6a中掺入的生物素化脂质供体的wb分析。生物素掺入水平与反应中总蛋白质的量成正比。由于鱼rep1活性，阳性对照显示强烈的生物素掺入。(b)β-肌动蛋白作为上样对照(1:50,000)的wb分析。β-肌动蛋白的水平与反应中使用的总细胞裂解物的量相匹配，并且在样品之间是相似的。(c)细胞裂解物(1:2,500)中人rep1水平的wb分析。未转导的细胞显示内源rep1水平。阳性对照(+ve)显示更高的rep1密度。(d)使用imagestudiolite软件半定量(a)中的wb分析。使用prism软件绘制数据。突出显示的值是针对检测到底物之间的较高差异的那些条件。

图10的图描绘了作为经aav-rep1转导的细胞中异戊烯化底物的rab27a和rab6a之间的比较。

图11a-b的表、照片和图显示了rab27a和rab6a都受到来自293细胞裂解物的内源rep1的异戊烯化。a)体外异戊烯化反应中使用的实验条件(#)汇总表，关于细胞裂解物的量(i:2.5μg；5μg；10μg；20μg)、ggt-ii的浓度(ii:0.5μm；1μm；2μm)和rab底物(rab27a或rab6a)的浓度(iii:0.16μm；0.8μm；4μm)。阳性对照(#17；+)：掺加有重组人rep1的细胞裂解物。b)在sds-page和western印迹分析之后，在异戊烯化反应产物中检测到蛋白质表达(人rep1和β-肌动蛋白)和生物素掺入。柱状图中描绘了生物素化的rab底物条带的光密度测定法(densitometry)分析(条件1-16)。

图12a-d是一系列照片和图，显示了rab6a比rab27a更适合评估在293细胞的aav2转导后人rep1的效力。a)以增加的aav2-rep1的moi(100；500；1,000；5,000；10,000；20,000和50,000)转导293细胞。在sds-page和western印迹分析(3个重复的代表图像)后，在异戊烯化反应产物(20μg)中检测到蛋白质表达(人rep1和β-肌动蛋白)和生物素掺入。b)每aav2-rep1的log(moi)的标准化rep1(针对相应肌动蛋白水平校正)的非线性回归图。使用s形四参数拟合(95％ci；约束条件：底部>0；坡度(hillslope)＝1)分析数据。符号是6个重复的平均值±sem。c)用aav2-rep1(n＝3)转导293细胞后对生物素化的rab27a和rab6a获得并针对内源水平(moi＝0)校正的条带密度值的图。在moi10,000、20,000和50,000下，rab6a显示比rab27a显著更高的数值(双向anova与bonferroni多重比较检验；**p＝0.0042；****p<0.0001)。d)针对rab27a和rab6a绘制每个标准化rep1的生物素掺入的光密度值，并通过线性回归分析(rab27a，y＝6.335*x-0.6392；rab6a，y＝12.6*x+0.9576)。

图13a-b是一系列照片，显示了rab6a作为其他细胞系体外异戊烯化的底物的验证。在细胞转导、sds-page和western印迹分析后，在异戊烯化反应产物中检测到蛋白质表达(人rep1和β-肌动蛋白)和生物素掺入(一个实验中两个重复)。用raav2/2-rep1(moi1,000；10,000和30,000gc/细胞)转导ht-1080细胞(a)和arpe-19细胞(b)，并且分别用20μg和10μg总蛋白制备异戊烯化反应。使用掺加有重组鱼rep1蛋白(ht-1080为25nm；arpe-19为11nm)的未转导细胞裂解物制备阳性对照(+rrep1)。

图14a-d的表(a)、6张照片(b)、3张图表(c)和表(d)显示rab27a和rab6a均受到来自293细胞裂解物的内源rep1的异戊烯化。a)体外异戊烯化反应中使用的实验条件汇总表(#1-#8)，关于总细胞裂解物的量(2,5；5；10；20μg)，ggt-ii的浓度(0,5；1；2μm)和rab底物(rab27a或rab6a)的浓度(0.16；0.8；4μm)。阳性对照(+ve)：掺加有重组鱼rep1(25nm)的细胞裂解物。b)在sds-page和westernblot分析之后，在异戊烯化反应产物中检测到蛋白质表达(人rep1和β-肌动蛋白)和生物素掺入(代表3个独立实验)。c)当使用不同量的总细胞裂解物、ggt-ii浓度或rab底物浓度(n＝3)时，评估rab27a和rab6a两者中生物素掺入的条件集的图。d)在c)中的数据集中进行的统计分析汇总表。用“条件”和“底物”为因素针对每种条件(总细胞裂解物、ggt-ii浓度或rab底物浓度)独立允许双向anova检验。详细给出了每个检验的p值和显著性，以及用于比较rab27a与rab6a的bonferroni多重比较检验。

图15a-d的3张照片(a)和3张图(b-d)显示了在raav2/2转导293细胞之后，rab6a比rab27a更敏感，以评估人rep1的生物学活性。a)用增加的raav2/2-rep1的moi(100；300；1,000；3,000；10,000；30,000；100,000和300,000)转导293细胞。在sds-page和western印迹分析(3个独立实验的代表图像)后，在异戊烯化反应产物(20μg)中检测到蛋白质表达(人rep1和β-肌动蛋白)和生物素掺入。b)每个raav2/2-rep1(loggc/细胞)的标准化rep1(针对相应肌动蛋白水平校正)的非线性回归图。使用s形四参数拟合分析数据(95％置信区间；r²＝0.8625)。符号是6个重复的平均值±sem。c)每个moi的raav2-rep1(loggc/细胞)的生物素掺入的非线性回归图。使用s形四参数拟合分析数据(95％置信区间；对于rab6a，r²＝0.8873；对于rab27a，r²＝0.8772)。符号是3个重复的平均值±sem。在moi10,000(**,p＝0.0097),30,000(***,p＝0.0002)和100,000和300,000(****,p<0.0001)时，rab6a显示比rab27a统计学显著更高的生物素掺入(双向anova与bonferroni的多重比较检验)。d)针对rab6a(r²＝0.8959,y＝18.82*x+0.4803)和rab27a(r²＝0.533,y＝6.569*x+0.9042)的标准化的过表达rep1，针对未转导的对照校正的底物中生物素掺入的线性回归图。

图16a-b的图(a)和rhrep1校准标准品的表(b)显示了用于检测rep1的酶联免疫吸附测定法(elisa)。用2μg/ml和每孔100μl的兔抗chm多克隆抗体(sigmahpa003231)包被板。用来自thermofisherscientific的superblock完成封闭/洗涤。校准标准品是不含二硫苏糖醇(dtt)的异戊烯化缓冲液中0.5-100ng/ml的rhrep1(nac)。用0.5μg/ml的生物素化的小鼠单克隆2f1(merck)进行检测。使用miltenyi试剂盒进行生物素化。用不含dtt的裂解缓冲液以1:100或1:1000稀释转导的和非转导的细胞裂解物样品。

图17的表显示了使用elisa检测rep1的rep1效力测定法结果。用rep1载体eng1014a以10,000的感染复数(moi)转导细胞，裂解并使用elisa检测rep1。非转导＝非转导对照，转导＝转导的细胞。样品以1:100稀释。

图18a-c的图(a)和一对表(b和c)显示了示例性raav2-rep1效力测定法rep1elisa。(a)显示浓度(x轴)相对于原始数据(光密度，y轴)。(b)是rhrep1校准标准品的表。(c)是显示rhrep1精确性概况(n＝10)的表。

图19a-b的表(a)和图(b)显示了异戊烯化原理和测定法。

图20的表显示了在基因疗法中通过体外异戊烯化测定法的评估。

图21a-c的一对图(a，c)和图(b)显示了根据异戊烯化率的rab分层。

图22的图描绘了未异戊烯化的rab合并物(背景)的检测以及与未异戊烯化合并物中rab27a的共染色。在左侧描绘了wt细胞，在右侧描绘了chm细胞。在野生型细胞中，用生物素检测未异戊烯化的rab。预期信号是低的。预期未异戊烯化的合并物中rab27a的检测也是低的。在chm细胞中，预期未异戊烯化的合并物中未异戊烯化的rab和rab27a的检测产生高信号。

图23a-c是western印迹的照片(a)和一对图(b，c)显示了未异戊烯化的rab的条带强度的量化。在(a)中，未异戊烯化的rab为绿色，并且rab27a为红色。wt＝野生型样品(n＝10)，chm＝无脉络膜样品(n＝12)。在(b)中，使用未配对的t检验比较wt和chm样品中未异戊烯化的rab与肌动蛋白的比率(p＝0.0362)。在(c)中，使用未配对的t检验比较wt和chm样品中未异戊烯化的rab27a与肌动蛋白的比率(p＝0.0044)。

图24的表显示了通过体外异戊烯化测定法的评估。

图25是一系列3张western印迹的照片，显示了在用于功能性测定法的12孔板的测试中raav2.rep1中的异戊烯化活性。使用增加的moi的aav2.rep1.eng1014-a载体。左框：将细胞在40μl缓冲液中裂解。右框：将细胞在50μl缓冲液中裂解。从上至下显示了hrep1(83kda)、肌动蛋白(42kda)和生物素化的rab6a(24kda)。每个框的泳道从左至右分别是0moi,300moi,1,000moi,3,000moi,10,000moi,30,000moi和0moi+鱼rep1蛋白。蛋白质大小从上至下在左侧指示为100、75、48、35和25kda。

图26a-c的三个图描绘了在用于功能性测定法的12孔板的测试中raav2.rep1中的异戊烯化活性。50μl细胞裂解物产生与以前的发现一致的数据。该测试使用每个反应的15μg蛋白质。(a)在y轴上显示标准化的rep1(a.u.rep1/a.u.肌动蛋白)，在x轴上显示以loggc/细胞raav2/2-rep1的moi。空心圆圈指示来自在40μl缓冲液中裂解的细胞的rep1(r²＝0.9845)，黑色圆圈指示来自在50μl缓冲液中裂解的细胞的rep1(r²＝0.999)。(b)在y轴上指示在底物(a.u.)中的生物素掺入，在x轴上指示作为loggc/细胞raav2/2-rep1的moi。空心圆圈指示来自40μl缓冲液中裂解的细胞的rep1(r²＝0.9997)，黑色圆圈指示来自50μl缓冲液中裂解的细胞的rep1(r²＝0.9992)。(c)在y轴上指示针对未转导的对照校正的底物中的生物素掺入(a.u.)，在x轴上描绘了标准化的过表达的rep1(a.u.rep1/a.u.肌动蛋白)。x指示来自40μl缓冲液中裂解的细胞中的rab6a(r²＝0.8805,y＝16.2*x-4.066)，空心圆圈指示来自50μl缓冲液中裂解的细胞的rab6a(r²＝0.9957,y＝16.99*x-2.011)。a.u.＝吸光度单位。

图27的图显示了如通过pcr确定的aav滴度。在x轴上是平衡盐水溶液(bss)中的1x10¹²个dna酶抗性颗粒(drp)/ml、1x10¹¹个drp/ml和1x10¹¹个drp/ml的初始滴度的样品。在y轴上，显示了如图右侧所描述的那样处理样品后测量的滴度。

图28是一系列3张western印迹的照片，显示了以1x10¹²drp/ml的高剂量和10,000的moi使用aav2.rep1.eng1014-a载体进行的相容性研究中raav2.rep-1的异戊烯化活性。从上至下显示：hrep1(83kda)、肌动蛋白(42kda)和生物素化的rab6a(24kda)。蛋白质大小从上至下在左侧以180、135、100、75、63、48、35、25、20、17和11kda指示。从左至右，一式三份的样品是：未转导的对照，用基线载体转导的细胞，在4℃保持6小时的用载体转导的细胞，在4℃保持6小时并在180分钟后注射的用载体转导的细胞，于4℃保持6小时和在注射器中180分钟的用载体转导的细胞，和用作阳性对照的鱼rep1(单一样品)。

图29是一系列3张western印迹的照片，显示了以低剂量1x10¹¹drp/ml和10,000的moi使用aav2.rep1.eng1014-a载体进行的相容性研究中，raav2.rep-1的异戊烯化活性。从上至下显示：hrep1(83kda)、肌动蛋白(42kda)和生物素化的rab6a(24kda)。蛋白质大小从上至下在左侧以180、135、100、75、63、48、35、25、20、17和11kda指示。从左至右，一式三份的样品是：未转导的对照，用基线载体转导的细胞，在4℃保持6小时的用载体转导的细胞，在4℃保持6小时并在180分钟后注射的用载体转导的细胞，于4℃保持6小时和在注射器中180分钟的用载体转导的细胞，和用作阳性对照的鱼rep1(单一样品)。

图30a-b是一对图，显示了在使用aav2.rep1.eng1014-a载体的相容性研究中，raav2.rep-1的异戊烯化活性的western印迹的半量化。(a)显示标准化的rep1。带密度值(a.u.)在y轴上，并且高剂量1x10¹²drp/ml和低剂量1x10¹¹drp/ml的aav2-rep1在x轴上。(b)显示标准化的生物素化的rab6a。带密度值(a.u.)在y轴上，并且高剂量1x10¹²drp/ml和低剂量1x10¹¹drp/ml的aav2-rep1在x轴上。在(a)和(b)中，每个剂量的柱形从左至右分别指示未转导的细胞，用基线载体转导的细胞，在4℃保持6小时的用载体转导的细胞，在4℃保持+6小时并于20℃在180分钟后注射的细胞，于4℃保持6小时并于20℃在注射器中180分钟的用载体转导的细胞。

发明详述

无脉络膜是一种罕见的疾病，其导致眼的脉络膜、视网膜色素上皮和光感受器变性。患病男性通常在青少年时期表现出夜盲症，在20和30岁期间逐渐丧失周围视力，并且在40岁完全失明。女性携带者一生可能保持良好的视力，但可能有轻度症状，最值得注意的是夜盲症，但偶尔可能有更严重的表型。

无脉络膜是由chm基因中的突变引起的，该基因编码rab护送蛋白1(rep1)。与rep1为75％同源的rab护送蛋白2(rep2)补偿身体的大多数细胞中任何rep1缺乏。然而，rep2无法弥补眼中rep1的缺乏。这导致rab护送蛋白活性不足以维持靶rabgtp酶的正常异戊烯化，并引起细胞功能障碍并最终导致细胞死亡。

可以通过向眼的受影响细胞提供rep1转基因的功能性拷贝来成功治疗无脉络膜(maclaren,r.e.etal.(2014)lancet383:1129-37)。具体地，已经显示腺伴随病毒(aav)基因疗法载体可以用于将编码功能性rep1的核苷酸序列递送至眼以治疗该疾病。随着无脉络膜的基因治疗成为临床现实，需要可靠且灵敏的测定法来确定外源递送的rep1的活性，特别是测试新的基因疗法载体并作为临床载体储液的质量控制筛选。

现有的用于测定rep1的方法使用rab27a作为异戊烯化底物(tolmachova,t.etal.(2012)j.genemed.14:158-168；tolmachova,t.etal.(2013)j.mol.med.91:825-837；vasireddy,v.etal.(2013)plosone8:e61396；andblack,a.etal.(2014)j.genemed.16:122-130)。这可能从rab27a在无脉络膜的发病机理中的大量牵连而得出。例如，已经显示rab27a在无脉络膜细胞中以未异戊烯化存在，而其他rab被适当地异戊烯化(seabra,m.c.etal.(1995)j.biol.chem.270:24420-24427)。此外，rab27a在视网膜色素上皮和脉络膜毛细血管(无脉络膜中最早变性的两个部位)中高水平表达。

然而，依赖于rab27a的异戊烯化的测定法产生非常弱的信号。因此，这些测定法的灵敏度低，并且它们可能不适合可靠地筛选临床基因疗法载体。因此，非常需要可用于测定rep1活性和测试基因疗法载体的更可靠且灵敏的测定法。

无脉络膜(chm)是一种由chm基因中的突变引起的罕见的x连锁的隐性视网膜营养不良，该chm基因编码rab护送蛋白1(rep1)。无脉络膜导致眼的视网膜色素上皮(rpe)和光感受器变性。chm在人细胞中普遍表达，并编码rab护送蛋白1(rep1)。rep1参与rabgtp酶(ras样gtp酶超家族内最大的家族)的c末端转录后修饰。称为异戊烯化的此种修饰是由rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rggt或ggt-ii)催化的，并且涉及一个或多个c20(牻牛儿基牻牛儿基)类异戊二烯基团对“异戊烯化基序”内的半胱氨酸残基共价附着。rep1可以通过向ggt-ii呈递未异戊烯化的rab和/或将这些异戊烯化的rab护送到它们在囊泡运输中起作用的其目的膜提供辅助。

无脉络膜样基因(chml)编码rab护送蛋白2(rep2)。rep2与rep1共享其95％的氨基酸序列，并且研究已经显示了rep2可以弥补身体的大多数细胞中rep1的缺乏。然而，rep2无法完全弥补眼中rep1的不足。在无脉络膜患者中，在眼中的rabgtp酶的异戊烯化受到影响，这导致细胞功能障碍并最终导致细胞死亡。

rep1在通过rabgtp酶的异戊烯化(可在体外重复的反应)进行的细胞内运输中发挥作用。腺伴随病毒(aav)基因替代疗法是一种针对无脉络膜的治疗。可以通过向眼的受影响细胞提供chm基因的功能性拷贝来治疗无脉络膜。具体地，可以在视网膜下递送编码chm的重组腺伴随病毒(raav)载体。因此，需要用于评估载体用于治疗无脉络膜的生物学活性的测定法。例如，需要可靠且灵敏的体外测定法以确定raav2/2-rep1的生物学活性。异戊烯化反应可在体外重复以测试rep1的生物学活性。病毒转导后用于异戊烯化测定法的一种底物是rab27a。rab27a蛋白是在1995年首次在chm淋巴母细胞的胞质级分中鉴定的。体外异戊烯化测定法的另一种底物是另一种rab蛋白rab6a。可以在体外测定这两种rab蛋白rab27a和rab6a对生物素化脂质供体在异戊烯化反应中掺入的应答，并用于开发稳健且灵敏的测定法，以评估aav载体对无脉络膜的生物学活性。

现在将通过非限制性实例描述本发明的各种优选特征和实施方案。

除非另有指示，本发明的实践将采用化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有解释。参见，例如sambrook,j.,fritsch,e.f.andmaniatis,t.(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress；ausubel,f.m.etal.(1995及定期增补)currentprotocolsinmolecularbiology,第9、13和16章,johnwiley&sons；roe,b.,crabtree,j.andkahn,a.(1996)dnaisolationandsequencing:essentialtechniques,johnwiley&sons；polak,j.m.andmcgee,j.o’d.(990)insituhybridization:principlesandpractice,oxforduniversitypress；gait,m.j.(1984)oligonucleotidesynthesis:apracticalapproach,irlpress；及lilley,d.m.anddahlberg,j.e.(1992)methodsinenzymology:dnastructuresparta:synthesisandphysicalanalysisofdna,academicpress。这些通用教科书中的每个通过引用并入本文。

异戊烯化

用于体外检测小的gtp酶的先前方法使用放射性标记的异戊二烯基供体。放射性标记可以被荧光团或生物素基团替换。这两种方法都涉及使用培养的细胞裂解物，因为rep1在所有细胞和组织中普遍表达。含有生物素的类异戊二烯(生物素标记的牻牛儿基焦磷酸盐，b-gpp)的蛋白质掺入可用于检测异戊烯化的蛋白质，因为它们相对于基于荧光的方法具有优越的灵敏度。

通过添加类异戊二烯部分使蛋白质脂质化是翻译后修饰，其影响高达2％的哺乳动物蛋白质组。此类脂质化能够使靶蛋白与细胞膜可逆缔合，并且还可以调节蛋白质-蛋白质相互作用。

优选地，本文提及的脂质化是异戊烯化，使得脂质供体底物和脂质化rab6a产物分别是异戊二烯基供体底物和异戊烯化的rab6a产物。

异戊烯化是一种特殊类型的翻译后修饰，其中牻牛儿基牻牛儿基或法呢基部分(或任一者的类似物)通过硫醚连接与蛋白质的一个或两个c端半胱氨酸残基连接。

优选地，异戊烯化是将牻牛儿基牻牛儿基部分或其类似物(例如生物素-牻牛儿基部分)添加至靶蛋白(例如rab6a)。

附着于蛋白质的牻牛儿基牻牛儿基部分(蛋白质用阴影圆圈示意性地描绘)是：

附着于蛋白质的法呢基部分(蛋白质用阴影圆圈示意性地描绘)是：

术语“类似物”在本文中就脂质(例如牻牛儿基牻牛儿基或法呢基)部分或脂质供体底物而言使用，指经过修饰以包含适合于特定目的，例如检测的官能团的化合物。类似物能够以基本上不受修饰阻碍(为了本发明的活性测定法的目的)的方式通过异戊烯化机器(即rep1和rabggt酶)被添加到底物蛋白质。

因此，上述部分的类似物包括为特定目的人工创建的那些(例如适于在测定法中检测的标记部分)。特别地，nguyen等人(nguyen,u.t.etal.(2009)nat.chem.biol.5:227-235)开发了以下生物素-牻牛儿基部分，其可以在体外蛋白质异戊烯化反应中检测到(生物素-牻牛儿基部分显示附着于蛋白质，其由阴影圆圈示意性地描绘)：

rab6a

rab6a(ras相关蛋白rab-6a)是哺乳动物rabgtp酶家族的成员，其本身是gtp酶的ras样超家族中最大的。

rabgtp酶(也称为rab蛋白)是外周膜蛋白，并且参与膜运输的调节，包括囊泡形成、沿肌动蛋白和微管蛋白网络的囊泡运动和膜融合。rab6a的主要功能理解为调节从高尔基复合体到内质网的蛋白质转运。

rabgtp酶通常通过异戊二烯基团(特别是，牻牛儿基牻牛儿基)锚定到细胞膜，所述异戊二烯基团与两个c端半胱氨酸残基共价结合。

rabgtp酶表现出两种构象：无活性，gdp结合形式；和有活性，gtp结合形式。从gdp到gtp结合形式的转化由gdp/gtp交换因素(gef)催化，从而激活rabgtp酶。相反，rabgtp酶对gtp的水解可以通过gtp酶活化蛋白(gap)增强，从而导致rab失活。

在一个实施方案中，rab6a是人rab6a。

rab6a的示例性氨基酸序列是以ncbi登录号np_942599.1保藏的序列。

rab6a的示例性氨基酸序列是：

编码rab6a的示例性核苷酸序列是在ncbi登录号nm_198896.1下描述的序列。

编码rab6a的示例性核苷酸序列是：

其它示例性的编码rab6a的核苷酸序列是：

rab27a的示例性氨基酸序列是：

rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rabggt酶)

rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rabggt酶)

rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rabggt酶；也称为牻牛儿基牻牛儿基转移酶ii)是蛋白质异戊二烯基转移酶，其仅使rab家族的gtpa酶异戊烯化。

rabggt酶通常天然催化将两个牻牛儿基牻牛儿基基团转移到rabgtp酶的c端的半胱氨酸残基。每个牻牛儿基牻牛儿基基团经由与半胱氨酸残基的硫醚连接与rabgtp酶缀合。

已经显示了rabggt酶能够结合一大批衍生化的磷酸类异戊二烯，并且可以催化其添加到rabgtp酶底物(例如rab6a)。例如，nguyen等人(nguyen,u.t.etal.(2009)nat.chem.biol.5:227-235)证明了生物素-牻牛儿基部分对rabgtp酶的成功添加。

rabggt酶是一种由alpha和beta亚基构成的异二聚体酶。

在一个实施方案中，rabggt酶是人rabggt酶。在一个优选的实施方案中，rabggt酶是大鼠rabggt酶。

rabggt酶alpha亚基的示例性氨基酸序列是在ncbi登录号np_004572.3(seqidno:10)和np_113842.1(seqidno:11)下描述的序列。

rabggt酶alpha亚基的示例性氨基酸序列是：

和：

和：

和：

rabggt酶beta亚基的示例性氨基酸序列是ncbi登录号np_004573.2(seqidno:4)和np_619715.1(seqidno:12)下描述的序列。

rabggt酶beta亚基的示例性氨基酸序列是：

和：

和：

脂质供体底物

为了将脂质部分添加到rabgtp酶，rabggt酶可以以脂质(例如牻牛儿基牻牛儿基或生物素-牻牛儿基)供体底物形式使用脂质部分作为底物。这些通常是脂质部分的焦磷酸盐衍生物。

例如，牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐/酯(ggpp)或生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯(bgpp)可以被rabggt酶用作脂质供体底物以分别将牻牛儿基牻牛儿基或生物素-牻牛儿基部分转移到底物rabgtp酶。

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐/酯具有结构：

生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯的示例性结构是：

rab护送蛋白1(rep1)

rab护送蛋白(rep)进行将未异戊烯化的rabgtp酶呈现到rabggt酶，并且将异戊烯化的rabgtp酶携带到其靶膜的功能。

rabgtp酶不包含可以由rabggt酶识别的异戊烯化位点处的共有序列。然而，底物识别经由rep实现，所述rep经由保守区结合rabgtp酶，然后给rabggt酶呈现其底物以进行异戊烯化。

一旦异戊烯化，脂质锚定使rabgtp酶变为不溶性的。因而，需要rep以结合并且溶解牻牛儿基牻牛儿基基团并且帮助将rabgtp酶递送到靶细胞膜。

rep1也可以称为rab蛋白牻牛儿基牻牛儿基转移酶组分a。此外，编码rep1的基因可以称为chm基因。

在一个实施方案中，rep1是人rep1。

rep1的示例性氨基酸序列是：

rep1的示例性氨基酸序列是：

编码rep1的示例性核苷酸序列是：

进一步示例性的编码rep1的核苷酸序列是：

进一步示例性的编码rep1的核苷酸序列是：

进一步示例性的编码rep1的核苷酸序列是：

rep1的示例性变体进一步描述于wo2012/114090(通过引用并入本文)。

活性测定

一方面，本发明提供了用于测定rab护送蛋白1(rep1)活性的方法，包括以下步骤:

(a)提供包含rep1的样品；

(b)使步骤(a)的样品与rab6a、rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rabggt酶)和脂质供体底物接触；并且

(c)检测脂质化rab6a产物。

另一方面，本发明提供rab6a用于测定rab护送蛋白1(rep1)活性的用途。

测定法灵敏性是一个需要考虑的重要因素，因为它能够检测低水平的靶标，这在存在少量试剂时尤其相关(例如基因疗法试剂的情况可以就是如此)。然而，最大化测定信号的动态范围也是重要的，例如，其可以与提供低或高灵敏性的试剂无关。

本发明的方法和用途是用于测试rep1的活性，而不是测试参与rabgtp酶的异戊烯化的其他试剂，例如rabggt酶或脂质供体底物的活性，或rabgtp酶作为异戊烯化底物的活性。例如，本发明的方法可以用于测试适合于将rep1递送至靶细胞的基因疗法载体或用于载体储液(例如药物储液)的质量控制分析。

在一个实施方案中，包含rep1的样品来自经遗传工程化改造以表达rep1的细胞。优选地，用包含rep1编码核苷酸序列的载体转染或转导细胞，以提供经遗传工程化改造以表达rep1的细胞。优选地，载体是病毒载体。

在一个实施方案中，使用包含rep1编码核苷酸序列的病毒载体表达rep1。

经遗传工程化改造以表达rep1的细胞(其可以为此类细胞的群体)可以是适合于遗传工程和rep1表达的任何细胞，例如来自细胞系(例如hek293)的细胞。细胞可以是例如人或小鼠细胞。优选地，细胞是人细胞。例如，细胞可以是视网膜细胞，例如视网膜色素上皮细胞或光感受器细胞。在一个实施方案中，细胞是hek293细胞。在另一个实施方案中，细胞是arpe-19细胞。在另一个实施方案中，细胞是ht1080细胞。

优选地，rab6a和/或rabggt酶来自标准来源，使得它们在重复实验中提供最小的变化或没有变化。优选地，rab6a和/或rabggt酶是基本上纯的(即基本上不包含干扰本发明的方法或用途的蛋白质污染物)。

因此，该方法或用途可以包括进行多个实验(例如包括步骤(a)至(c))，其中涉及包含rep1的样品的参数是变化的，而其他参数(例如涉及rab6a、rabggt酶和脂质供体底物的参数保持恒定。此类参数可以包括例如相关蛋白质(例如rep1)的氨基酸序列、用于在细胞中表达rep1的载体中包含的rep1编码核苷酸序列、用于将rep1编码核苷酸序列递送到细胞的载体类型(例如病毒载体的类型，例如腺伴随病毒(aav)载体的类型)、rep1的浓度和/或用于将rep1编码核苷酸序列递送到细胞的载体的感染复数(moi)。

术语“活性”在本文中用于指rep1促进rabgtp酶(例如rab6a)脂质化的能力。尽管rep1本身不催化脂质化，但是它是rabggt酶催化其底物rabgtp酶的脂质化需要的。因此，可以通过测定在某些条件下脂质化的rabgtp酶(即rab6a)的量来测量rep1的活性。

术语“功效”在本文中就包含rep1编码核苷酸序列的载体的功效而言使用，指载体为由载体转染或转导的细胞提供rep1活性的能力。

如本文所用，术语“脂质化rab6a产物”是指已加入脂质部分的rab6a。优选地，脂质化rab6a产物是异戊烯化的rab6a，例如牻牛儿基牻牛儿基因rab6a或生物素-牻牛儿基化rab6a。

优选地，检测脂质化rab6a产物的步骤提供了脂质化rab6a产物的量的量化。

脂质化rab6a的检测可以通过任何合适的方法进行，例如酶联免疫吸附测定法(elisa)、western印迹、放射自显术术(例如利用同位素标记的，例如氚化的，脂质的供体底物)，层析(例如hplc或fplc)和/或基于质谱术的方法(例如lc/ms)。

在一个实施方案中，使用western印迹检测脂质化rab6a产物。在优选的实施方案中，使用elisa检测脂质化rab6a产物。

举例来说，可以使用生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯脂质供体底物，根据本发明的方法进行异戊烯化反应。可以对反应产物进行western印迹分析，其中可以通过与例如链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物直接温育来检测脂质化rab6a产物(即生物素-牻牛儿基化rab6a)。脂质化的rab6a(即生物素-牻牛儿基化rab6a)的量化可以通过所得western印迹的光密度测定法分析来实现，其可以通过任何合适的手段(例如使用imagestudiolite软件(li-cor))进行。

作为另一个实例，可以使用生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯脂质供体底物，根据本发明的方法进行异戊烯化反应。可以对反应产物进行elisa分析，其中rab6a可以直接固定在平板上或使用已附着到平板的抗体固定(即夹心elisa)；然后可以通过与例如链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物一起温育来检测脂质化rab6a产物(即生物素-牻牛儿基化rab6a)。脂质化的rab6a(即生物素-牻牛儿基化rab6a)的量化可以通过任何合适的手段(例如使用分光光度计、荧光计或发光计进行检测)来实现。

根据需要(例如用于控制目的)，可以将进一步的检测步骤掺入到本发明的方法中，例如检测反应中存在的rep1的量或检测β-肌动蛋白的量(例如作为上样对照)。

在一个实施方案中，该方法包括比较脂质化的rab6a产物(例如，异戊烯化的，例如牻牛儿基牻牛儿基化或生物素-牻牛儿基化rab6a)的量与从对照实验，例如使用rep1的已知或标准样品的实验确定的量的进一步的步骤。

在另一个实施方案中，该方法包括比较脂质化的rab6a产物(例如异戊烯化的，例如牻牛儿基牻牛儿基化或生物素-牻牛儿基化rab6a)的量与参考水平的进一步的步骤。

与此类对照实验或参考水平的比较可以提供rep1相对于已知或公认的标准品的活性的量度(例如，比已知或公认的标准品更好或更差)。

本发明的方法可以例如用于质量控制分析用于治疗无脉络膜的基因疗法载体，优选地包含rep1编码核苷酸序列的aav载体颗粒，其中通过本发明的方法测定的载体的输出活性或功效高于阈值活性或在规定的靶标范围内(例如通过与对照实验或参照水平比较)指示载体适合于基因治疗目的。

异戊烯化反应的条件(例如在本发明方法的步骤(b)中发生)没有特别限制，条件是它们基本上不干扰rab6a的异戊烯化。

包含rep1的样品可以以任何合适的形式配制，例如可以在包含约50mmhepes、50mmnacl、2mmmgcl2、1mmdtt和蛋白酶抑制剂混合物(roche)的约ph7.5的异戊烯化缓冲液中制备样品。

包含rep1的样品可以例如包含约1-100、1-75、1-50、1-40、1-30、1-20或1-10μg总蛋白质。包含rep1的样品可以例如包含约10-100、10-75、10-50、10-40、10-30或10-20μg的总蛋白质。优选地，包含rep1的样品包含约10-30μg的总蛋白质，例如，约10、15、20、25或30μg的总蛋白质。

rab6a可以例如浓度为约0.1-25、0.1-20、0.1-15、0.1-10或0.1-5μμ，优选约0.1-5μμ。例如，rab6a可以处于约0.1-1μμ的低浓度。例如，rab6a可以浓度为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25μμ，优选约4μm。在某些实施方案中，rab6a可以例如浓度为约0.16μμ、0.8μμ或4μμ。

例如，rabggt酶可以浓度为约0.1-25、0.1-20、0.1-15、0.1-10、0.1-5或0.1-2.5μμ，优选约0.1-2.5μμ。例如，rabggt酶可以浓度为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25μμ，优选约2μμ。在某些实施方案中，例如，rabggt酶可以浓度为约0.5μμ、1μμ或2μμ。

例如，脂质供体底物(例如生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯(bgpp))浓度可以是约1-25、1-20、1-15、1-10或1-5μm，优选约1-5μm。例如，脂质供体底物(例如生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯(bgpp))的浓度可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25μm，优选约4μm。

异戊烯化反应可以在任何合适的缓冲液中进行，例如，反应可以在包含约50mmhepes、50mmnacl、2mmmgcl2、1mmdtt和蛋白酶抑制剂混合物(roche)的约ph7.5的异戊烯化缓冲液中进行。

异戊烯化反应可以在任何合适的温度(例如约37℃)下进行任何合适的时间长度。例如，异戊烯化反应可以进行约1-10、1-7.5、1-5、1-2.5或1-2小时，优选约1-2小时。例如，异戊烯化反应可以进行约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时，优选约2小时。

无脉络膜

无脉络膜是一种罕见的x连锁的进行性眼脉络膜、视网膜色素上皮和光感受器变性。患病男性的典型自然史是青少年时期夜盲症的发作，然后在20岁和30随期间逐渐丧失周边视力，导致40岁完全失明。女性携带者有轻微的症状，最明显的是夜盲症，但偶尔可能有更严重的表型。

无脉络膜是由chm基因突变引起的，该基因位于x染色体21q区域。rab护送蛋白2(rep2)(其与rep1是75％同源的)补偿身体的大多数细胞中的任何rep1缺陷。然而，出于尚不清楚的原因，rep2无法补偿眼中的rep1缺陷。这导致rab护送蛋白活性不足以维持靶rabgtp酶的正常异戊烯化并引起细胞功能障碍并最终导致细胞死亡，主要影响外视网膜和脉络膜。

可以通过将rep1转基因的功能性拷贝提供给受影响的眼细胞来成功地治疗无脉络膜(maclaren,r.e.etal.(2014)lancet383:1129-37)。

载体

载体是允许或促进实体从一个环境转移到另一个环境的工具。根据本发明，并且举例来说，重组核酸技术中使用的一些载体允许实体，例如核酸区段(例如异源dna区段，例如异源cdna区段)转移到靶细胞中。载体可以用于维持细胞内的异源核酸(例如dna或rna)，促进包含核酸区段的载体的复制或促进由核酸区段编码的蛋白质的表达的目的。

载体可以是非病毒的或病毒的。用于重组核酸技术的载体的实例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。载体也可以是例如裸核酸(例如dna或rna)。在其最简单的形式中，载体本身可以是感兴趣的核苷酸。

用于本发明的载体可以是例如质粒或病毒载体，并且可以包含用于表达多核苷酸的启动子和任选的启动子调节物。

病毒载体

在优选的实施方案中，本发明的载体是病毒载体。优选地，病毒载体是病毒载体颗粒的形式。

病毒载体可以是例如腺伴随病毒(aav)、逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体。优选地，病毒载体是aav载体。

术语“基因疗法载体”在本文中用于指适合于用于基因疗法的载体，并且包括例如病毒(例如aav)载体和载体颗粒。

在一些实施方案中，本公开内容的病毒载体和载体颗粒可以用于基因疗法中。重要的是，本公开内容的病毒载体和载体颗粒在储存和通过用于aav基因疗法的注射装置后维持生物相容性和稳定性。在一些实施方案中，本公开内容的病毒载体和载体颗粒可以在tmn200缓冲液中稀释以维持生物相容性和稳定性。tmn200缓冲液包含20mmtris(ph调整至8.0)，1mmmgcl2和200mmnacl。

物理病毒基因组滴度的测定是载体表征的一部分，并且是确保基因疗法期间病毒载体和病毒颗粒的效力和安全性的步骤。在一些实施方案中，测定aav滴度的方法包括定量pcr(qpcr)。存在有影响结果的不同变量，例如用作标准品的dna的构象或样品制备期间的酶消化。例如，可以将要测定滴度的病毒载体或颗粒制剂与使用质粒产生的标准稀释曲线进行比较。在一些实施方案中，标准曲线中使用的质粒dna为超螺旋构象。在一些实施方案中，标准曲线中使用的质粒dna为线性构象。可以例如通过用hindiii限制性酶消化制备线性化质粒，通过琼脂糖凝胶电泳显现并按照制造商的说明使用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen)进行纯化。在用于产生标准曲线的质粒内切割的其他限制酶也可能是合适的。在一些实施方案中，与使用线性化质粒相比，使用超螺旋质粒作为标准品显著增加了aav载体的滴度。

为了从纯化的aav载体中提取dna以定量aav基因组滴度，可以使用两种酶促方法。在一些实施方案中，可以用dna酶i单独消化aav载体。在一些实施方案中，可以用dna酶i和另外的蛋白酶k处理对aav载体进行双重消化。然后可以使用cfxconnect实时pcr检测系统(biorad)使用对转基因序列特异的引物和taqman探针进行qpcr。

变体、衍生物、类似物、同源物和片段

除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸外，本发明还涵盖其变体、衍生物、类似物、同源物和片段的用途。

在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是下述序列，其中残基的特定序列(无论氨基酸或核酸残基)已经以使得所讨论的多肽或多核苷酸基本上保留其功能的方式修饰。可以通过天然存在的蛋白质中存在的至少一个残基的添加、缺失、取代、修饰、置换和/或变异来获得变体序列。

如本文所用，术语“衍生物”就本发明的蛋白质或多肽而言包含序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的蛋白质或多肽基本上保留其至少一种其内源功能。

如本文所用，术语“类似物”就多肽或多核苷酸而言包括任何模拟物，即拥有其模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。

通常，可以进行氨基酸取代，例如1、2或3至10或20个取代，只要经修饰的序列基本上保留所需要的活性或能力。氨基酸取代可以包含使用非天然存在的类似物。

本发明中使用的蛋白质也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并产生功能等同的蛋白质。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸取代，只要保留内源功能。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的不带电荷的极性首基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

可以进行保守取代，例如根据下表。第二列中相同块中并且优选在第三列中的相同行中的氨基酸可以彼此替换:

如本文所用，术语“同源物”是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。

同源序列可以包含与主题序列可以是至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或90％相同，优选至少95％或97％或99％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选根据序列同一性表达同源性。

同源序列可以包含与主题序列可以至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或90％相同，优选至少95％或97％或99％相同的核苷酸序列。虽然同源性也可以根据相似性考虑，但在本发明的上下文中，优选根据序列同一性表达同源性。

优选地，提及与本文详述的任一种seqidno具有百分比同一性的序列是指在提及的seqidno的整个长度里具有所述百分比同一性的序列。

可以通过眼，或者更通常地借助于容易获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商品化的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。

可以在连续序列里计算同源性百分比，即将一个序列与另一个序列比对，并且将一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无缺口(ungapped)”比对。通常，仅在相对少量的残基里进行此类无缺口比对。

虽然这是一种非常简单且一致的方法，但是它未能考虑例如在一对其他方面相同的序列中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可以使以下密码子不对齐，因此当进行全局比对时潜在导致百分比同源性的大幅降低。因此，大多数序列比较方法设计为产生最佳比对，其考虑可能的插入和缺失而不对整体同源性评分过度罚分。这是通过在序列比对中插入“缺口”以试图最大化局部同源性来实现的。

然而，这些更复杂的方法对比对中出现的每个缺口分配“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口(反映两个比较序列之间较高的相关性)的序列比对将获得比具有许多缺口的序列比对更高的得分。通常使用“仿射缺口代价(affinegapcost)”，其对于缺口的存在收取相对高的代价并且对缺口中的每个后续残基收取较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然会产生具有更少缺口的优化的比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，当使用此类软件进行序列比较时优选使用默认值。例如，当使用gcgwisconsinbestfit包时，氨基酸序列的默认缺口罚分对于缺口为-12，并且对于每个延伸为-4。

因此，计算最大百分比同源性首先需要产生最佳比对，考虑缺口罚分。用于进行此类比对的合适的计算机程序是gcgwisconsinbestfit包(universityofwisconsin,u.s.a.；devereuxetal.(1984)nucleicacidsres.12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于blast包(参见ausubeletal.(1999)同上–第18章)，fasta(atschuletal.(1990)j.mol.biol.403-410)和geneworks比较工具套件。blast和fasta两者可用于离线和在线搜索(参见ausubel等人(1999)同上，第7-58至7-60页)。然而，对于某些应用，优选使用gcgbestfit程序。另一种称为blast2序列的工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见femsmicrobiol.lett.(1999)174:247-50；和femsmicrobiol.lett.(1999)177:187-8)。

虽然可以根据同一性测量最终的百分比同源性，但是比对过程本身通常不基于全有或全无对比较(all-or-nothingpaircomparison)。相反，通常使用缩放的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配得分。常用的此类矩阵的一个实例是blosum62矩阵-blast程序套件的默认矩阵。gcgwisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供的话)(关于更多详情，参见用户手册)。对于某些应用，优选使用gcg包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵，例如blosum62。

一旦软件产生了最佳比对，就可能计算同源性百分比，优选序列同一性百分比。软件通常进行这点作为序列比较的一部分并生成数字结果。

本发明的全长多肽或多核苷酸的“片段”也是变体，并且该术语通常是指功能上或例如在测定法中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。

可以使用标准重组dna技术如定点诱变来制备此类变体。在要进行插入的情况下，可以制备编码插入以及对应于插入位点任一侧的天然存在序列的5'和3'侧翼区的合成dna。侧翼区会含有对应于天然存在序列中的位点的方便的限制性位点，以便可以用合适的酶切割序列，并将合成的dna连接到切口中。然后根据本发明表达dna以制备编码的蛋白质。这些方法仅阐述本领域已知的用于操纵dna序列的众多标准技术，并且也可以使用其他已知技术。

密码子优化

用于本发明的多核苷酸可以是经密码子优化的。密码子优化先前已在wo1999/41397和wo2001/79518中描述。不同的细胞在其特定密码子选择上不同。该密码子偏倚对应于细胞类型中特定trna的相对丰度的偏差。通过改变序列中的密码子以使它们适合于与相应trna的相对丰度相匹配，可以增加表达。出于同样的原因，可以通过有意选择已知相应的trna在特定细胞类型中罕见的密码子来降低表达。因此，可获得额外的翻译控制程度。

实施例

材料和方法(实施例1-2)

细胞转导和收获

以一系列感染复数(moi，基因组颗粒/细胞)用raav2/2-rep1处理培养的hek293细胞。将raav2/2-gfp平行用作对照载体，并监测荧光的转基因表达的开始。

平行进行对未转导的细胞和+aav-gfp转导的和+aav-rep1转导的细胞的实验。

使用以下方案在转导后第5天制备细胞裂解物：用pbs清洗细胞，并在冰上与ph7.5的异戊烯化缓冲液(50mmhepes,50mmnacl,2mmmgcl2,1mmdtt和蛋白酶抑制剂混合物(roche))一起温育5分钟；然后用细胞刮刀将细胞刮到1.5ml管中，并且在冰上温育15分钟；随后，通过连接至1ml注射器的26-g注射器针将细胞推动20次来破坏它们。

将裂解的细胞在4℃以1500xg离心5分钟。然后将上清液转移到丙酸纤维素管中并在4℃以100000xg离心1小时。将来自第二离心步骤的上清液用于体外异戊烯化反应(如下所述)。

总蛋白质量化

使用bradford方法根据制造商的说明书(quickstart^tmbradford1xdyereagent,biorad,#500-0205)量化总细胞蛋白质浓度。从标准曲线外推样品值。

体外异戊烯化反应

使用异戊烯化缓冲液中的冷冻的细胞裂解物(10-30μg)、2μmrabggt酶、4μmrab蛋白(rab27a或rab6a)和作为脂质供体的5μm生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯(bgpp)建立异戊烯化反应。所有反应均补充有新鲜gdp(二磷酸鸟苷，20μm)和dtt(1mm)。

对于阳性对照样品，将鱼rep1(对于量，参见个别实验)加入到含有来自未转导的细胞的裂解物的异戊烯化反应。

将反应在37℃温育2小时，然后通过加入样品缓冲液(laemmli缓冲液，2x浓缩物，sigma#s3401)终止反应。该缓冲液含有4％sds、20％甘油、10％2-巯基乙醇、0.004％溴酚蓝和0.125mtrishcl，ph约6.8。

进行western印迹(wb)以检测人rep-1、β-肌动蛋白(作为上样对照)和生物素化的rab蛋白(rab27a或rab6a)。

为了检测人rep1，使用来自millipore的小鼠单克隆抗体(克隆2f1，#mabn52)。为了检测β-肌动蛋白，使用来自thermofisherscientific的小鼠单克隆抗体(克隆ac-15，#am4302)。这两次检测之后是二抗标记步骤(驴抗小鼠hrp，abcam，#ab98799)。

通过与链霉抗生物素蛋白-hrp(thermofisherscientific，#43-4323)直接温育来检测生物素化的脂质供体对合适的rab底物的掺入。

使用ecl底物和odysseyfc检测系统(li-cor)检测所有膜。使用imagestudiolite软件(li-cor)定量分析条带的强度。

实施例1:rab27a作为异戊烯化底物

为了测试使用rab27a作为底物的异戊烯化测定法的灵敏性，使用以下细胞平行进行实验：(a)未转导的细胞；(b)以10000的moi用aav-gfp转导的细胞；和(c)以10,000的moi用aav-rep1转导的细胞。

使用总体积为12.5μl的10μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加2μm鱼rep1。

结果指示rab27a是用于评估用aav-rep1转导细胞后rep1功能的异戊烯化测定法的底物(图1)。然而，来自wb半量化的信号不是很强。

用增加量的总细胞蛋白重复该研究以增加wb条带强度。

使用总体积为22μl的30μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加1μm鱼rep1。

结果证实rab27a作为用于异戊烯化测定法的底物起作用以评估用aav-rep1转导细胞后的rep1功能(图2)。此外，与使用10μg裂解物获得的数据相比，wb信号的强度已经增加。然而，信号仍然不是很强。理想地，观察到当用aav-rep1转导细胞时，异戊烯化的rab蛋白的较大增加。

实施例2：rab6a作为异戊烯化底物

为了使用rab6a作为底物测试异戊烯化测定法的灵敏性，使用以下细胞(实施例1中使用的相同细胞裂解物)平行进行实验：(a)未转导的细胞；(b)以10,000的moi用aav-gfp转导的细胞；和(c)以10,000的moi用aav-rep1转导的细胞。使用总体积为20μl的20μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加1μm鱼rep1。

结果指示rab6a是用于评估用aav-rep1转导细胞后rep1功能的异戊烯化测定法的有效底物(图3)。

与图2中显示的数据相比，尽管使用较少的总蛋白，但是对于经aav-rep1转导的细胞，wb信号的强度增加了约10倍。此外，与图2中显示的数据相比，阳性对照的条带强度高约100倍，证实了基于rab6a的测定法的增加的灵敏性。

数据还证明增加的灵敏性也实现检测内源水平的差异，从而使测定法更准确。

在通过使用rab6a作为异戊烯化底物提供的增加的灵敏性的测定法的成功演示后，使用aav-rep1研究的不同moi重复该测定法，无论rab6a异戊烯化是否与aav-rep1的量相关。

使用以下细胞平行进行实验：(a)未转导的细胞；(b)以250的moi用aav-rep1转导的细胞；(c)以1000的moi用aav-rep1转导的细胞；(d)以5000的moi用aav-rep1转导的细胞；(e)以10,000的moi用aav-rep1转导的细胞；和(f)以20,000的moi用aav-rep1转导的细胞。

使用总体积为15μl的20μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加0.5μm鱼rep1。

结果证实rab6a是用于评估用aav-rep1转导细胞后rep1功能的异戊烯化测定法的有效底物(图4)，并且进一步证明生物素化脂质供体在rab6a中的掺入与用于细胞转导的aav-rep1的量相关。

在验证rab6a作为有效的测定法底物后，我们然后测试目前在我们的1期临床试验中使用的aav-rep1载体(maclaren,r.e.etal.(2014)lancet383:1129-37)。

使用以下细胞平行进行实验：

(a)未转导的细胞(#29、#30和#31)；

(b)以10,000的moi用aav-rep1转导的细胞(#32、#33和#34)；和

(c)以10,000的moi用gmp级aav-rep1转导的细胞(#35、#36和#37)。

使用总体积为15μl的20μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加0.5μm鱼rep1。

结果与先前的实验一致，并证实生物素化的脂质供体在rab6a中的掺入与用于细胞转导的aav-rep1的量相关(图5)。

实施例3：rab6a作为使用arpe-19细胞的异戊烯化反应中的底物

细胞转导和收获

用raav2/2-rep1以10,000个基因组颗粒/细胞的moi处理培养的arpe-19细胞。在转导后第13天制备细胞裂解物：用pbs清洗细胞，并在冰上与ph7.5的异戊烯化缓冲液(50mmhepes，50mmnacl，2mmmgcl2,1mmdtt和蛋白酶抑制剂混合物(roche))一起温育。使用细胞刮刀将细胞刮入1.5ml管中，并在冰上温育15分钟。通过连接至1ml注射器的26-g注射器针将细胞推动20次来破坏它们。将细胞以1,500xg在4℃旋转5分钟。然后将上清液转移到丙酸纤维素管中，并在4℃以100,000g离心1小时。将上清液用于体外异戊烯化反应。

总蛋白质量化

使用bradford方法根据制造商的说明书(quickstart^tmbradford1xdyereagent,biorad,#500-0205)量化总细胞蛋白质。从标准曲线外推样品值。

体外异戊烯化反应

使用戊烯化缓冲液中的冷冻的细胞裂解物(15μg)，2μmrabggt酶，4μmrab蛋白(rab6a)和5μm生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯作为脂质供体，建立异戊烯化反应。所有反应均补充有新鲜gdp(20μm)和dtt(1mm)。在阳性对照样品中，将鱼rep1(对于量，参见实验)加入到含有未转导的细胞裂解物的异戊烯化反应。

将反应在37℃温育2小时，然后通过加入sds-page样品缓冲液终止反应。

进行western印迹法(wb)以检测人rep-1、β-肌动蛋白(上样对照)和生物素化的rab蛋白(rab27a或rab6a)。为了检测人rep1，使用来自millipore的小鼠单克隆抗体(克隆2f1，#mabn52)。为了检测β-肌动蛋白，使用来自thermofisherscientific的小鼠单克隆抗体(克隆ac-15，#am4302)。这两次检测之后是二抗标记步骤(驴抗小鼠hrp，abcam，#ab98799)。通过与链霉抗生物素蛋白-hrp(thermofisherscientific，#43-4323)直接温育来检测生物素化的脂质供体对合适的rab底物的掺入。使用ecl底物和odysseyfc检测系统(li-cor)检测所有膜。使用imagestudilite软件(li-cor)定量分析条带的强度。

结果与讨论

为了测试在arpe-19细胞(人视网膜色素上皮细胞)中使用rab6a作为底物的异戊烯化测定法，使用以下细胞平行进行实验:

(a)未转导的细胞(#86和#87)；和

(b)细胞+aav-rep1moi10,000(#90和#91)-r&d级载体。

使用总体积为45μl的15μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加0.1μm的鱼rep1。

结果指示rab6a作为异戊烯化测定法的底物起作用，以评估用aav-rep1转导arpe-19细胞后的rep1功能(图6)。

实施例4：rab6a作为使用ht1080细胞的异戊烯化反应中的底物

细胞转导和收获

以10,000个基因组颗粒/细胞的moi用raav2/2-rep1处理培养的ht1080细胞。在转导后第5天制备细胞裂解物：用pbs清洗细胞，并在冰上与ph7.5的异戊烯化缓冲液(50mmhepes，50mmnacl，2mmmgcl2,1mmdtt和蛋白酶抑制剂混合物(roche))一起温育。使用细胞刮刀将细胞刮入1.5ml管中，并在冰上温育15分钟。通过连接至1ml注射器的26-g注射器针将细胞推动20次来破坏它们。将细胞以1,500g在4℃旋转5分钟。然后将上清液转移到丙酸纤维素管中，并在4℃以100,000g离心1小时。将上清液用于体外异戊烯化反应。

总蛋白质量化

使用bradford方法根据制造商的说明书(quickstart^tmbradford1xdyereagent,biorad,#500-0205)量化总细胞蛋白质。从标准曲线外推样品值。

体外异戊烯化反应

使用异戊烯化缓冲液中的冷冻的细胞裂解物(20μg)、2μmrabggt酶、4μmrab蛋白(rab6a)和5μm作为脂质供体的生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯建立异戊烯化反应。所有反应均补充有新鲜gdp(20μm)和dtt(1mm)。在阳性对照样品中，将鱼rep1(对于量，参见实验)加入到含有未转导的细胞裂解物的异戊烯化反应。

将反应在37℃温育2小时，然后通过加入sds-page样品缓冲液终止反应。

进行western印迹法(wb)以检测人rep-1、β-肌动蛋白(上样对照)和生物素化的rab蛋白(rab27a或rab6a)。为了检测人rep1，使用来自millipore的小鼠单克隆抗体(克隆2f1，#mabn52)。为了检测β-肌动蛋白，使用来自thermofisherscientific的小鼠单克隆抗体(克隆ac-15，#am4302)。这两次检测之后是二抗标记步骤(驴抗小鼠hrp，abcam，#ab98799)。通过与链霉抗生物素蛋白-hrp(thermofisherscientific，#43-4323)直接温育来检测生物素化的脂质供体对合适的rab底物的掺入。使用ecl底物和odysseyfc检测系统(li-cor)检测所有膜。使用imagestudilite软件(li-cor)定量分析条带的强度。

为了测试在ht1080细胞中使用rab6a作为底物的异戊烯化测定法，使用以下细胞平行进行实验:

(a)未转导的细胞(#56和#57)；

(b)细胞+aav-rep1moi10,000(#60和#61)-r&d级载体；和

(c)细胞+aav-rep1moi10,000(#64和#65)-临床级载体。

使用总体积为20μl的20μg裂解物建立异戊烯化反应。对阳性对照掺加0.1μm的鱼rep1。

结果指示rab6a作为异戊烯化测定法的底物起作用，以评估用aav-rep1转导ht1080细胞后的rep1功能(图7)。

实施例5：rab27a和rab6a在异戊烯化反应中作为底物的比较

使用与图4所示实验中相同的细胞裂解物：(a)未转导的细胞；(b)细胞+aav-rep1moi250；(c)细胞+aav-rep1moi1,000；(d)细胞+aav-rep1moi5,000；(e)细胞+aav-rep1moi10,000；和(f)细胞+aav-rep1moi20,000。

使用总体积为15μl的20μg裂解物和2种不同底物：rab27a和rab6a建立异戊烯化反应。对阳性对照(每种底物一种)掺加0.1μm鱼rep1。在sds-page上平行运行样品并同时检测。

rab27a和rab6a两者均作为异戊烯化测定法的底物起作用以评估用aav-rep1转导细胞后的rep1功能。

生物素化的脂质供体的掺入与用于每种所用底物的细胞转导的aav-rep1的量相关(图8)。

来自生物素化的rab6a的条带密度高于rab27a的条带密度，这指示rab6a是用于测定相对效力和/或生物活性的平行线分析的更合适的底物。

实施例6：在使用不同条件的异戊烯化反应中作为底物的rab27a和rab6a性能的比较

制备未转导的293细胞裂解物以用于使用rab27a和rab6a的此实验。测试的条件显示在图9的表中。在sds-page上平行样品进行并同时检测。

rab27a和rab6a两者均作为异戊烯化测定法的底物起作用，以评估内源rep1功能。

生物素化的脂质供体的掺入与所用每种底物的反应中总蛋白质的量相关。

比较条件，反应中rab底物的浓度似乎对信号的影响最大。

与rab27a相比，当使用rab6a时，生物素化的底物增加2.5倍。

实施例7：在用aav2-rep1转导的裂解物中的异戊烯化反应中rab27a和rab6a作为底物的比较

使用增加的aav2-rep1(r&d材料)的moi制备新的裂解物(一式三份)：(a)未转导的细胞；(b)细胞+aav-rep1moi100；(c)细胞+aav-rep1moi500；(d)细胞+aav-rep1moi1,000；(e)细胞+aav-rep1moi5,000；(f)细胞+aav-rep1moi10,000；(g)细胞+aav-rep1moi20,000；和(h)细胞+aav-rep1moi50,000。

使用20μg总蛋白、2μmrab底物(rab27a或rab6a)和2μmrabggt酶，以10μl的总体积制备异戊烯化反应。对阳性对照(每种底物一种)掺加0.1μm鱼rep1。

在sds-page上平行运行来自每个重复的样品，并使用imagestudiolite软件检测生物素化的底物(1:10,000)、作为上样对照的β-肌动蛋白(1:50,000)和人rep1(1:2,500)。使用prism软件绘制来自生物素化底物的条带密度的半量化的数据(图10)。

在所有分析的样品中β-肌动蛋白的水平是相似的。未转导细胞(和阳性对照样品)显示内源rep1水平。用aav-rep1转导的细胞显示rep1水平的增加，其与所用的moi直接相关。由于鱼rep1活性，阳性对照显示更强的生物素掺入。

用底物和moi作为因素的所有三个重复的双向anova分析发现这两者是高度显著的(p<0.0001)。在给定moi时底物效应的bonferroni多重比较检验在5,000(p＝0.0023)以及所有以上(p<0.0001)的moi时显示显著成对差异。

rab27a和rab6a两者均作为异戊烯化测定法的底物起作用以评估用aav-rep1转导细胞后的rep1功能。

生物素化底物的条带密度的半量化仅显示rab6a的值显著高于对rab27a获得的值。

实施例8：rab6a的异戊烯化作为无脉络膜基因疗法的生物学活性

包含生物素的类异戊二烯(生物素标记的牻牛儿基焦磷酸盐/酯，b-gpp)的蛋白质掺入由于其相对于基于荧光的方法优越的灵敏性而用于检测异戊烯化的蛋白质。建立这种性质的测定法的第一步是优化异戊烯化反应条件，以检测内源rep1活性(图11)。所有反应使用相同的细胞裂解物平行进行。最初，测试了不同量的来自293细胞(也称为hek293或人胚胎肾293)的总细胞裂解物(2.5μg，5μg，10μg和20μg)，而将各浓度的ggt-ii(2μm)和rab底物(4μm，rab27a或rab6a)保持固定。然后使用20μg总细胞裂解物测试较低浓度的ggt-ii(1和0.5μm)和底物(0.8和0.16μm)(图11a)。这两种底物均通过内源rep1在体外以剂量依赖性方式进行异戊烯化(图11b的顶图，条件1-4和9-12)，提示这两种底物均可用于评估aav2递送的rep1的生物学活性。此外，当总蛋白量保持相同时，ggt-ii的浓度以及底物的浓度都会以剂量依赖性方式影响生物素的掺入(图11b中的底图，条件5-8和13-16)。如通过带密度值测量的，在所有其他方面匹配的条件下，用rab6a获得的信号始终高于用rab27a获得的信号(图11c)。这种差异可以高达2.5倍(条件4和12中0.8相对于1.8；条件7和15中0.3相对于0.75)。

接下来，以感染复数(moi，定义为基因组拷贝数/细胞或gc/细胞)范围用aav2-rep1转导293细胞。异戊烯化反应用两种底物平行进行(图12a)，以在chm基因提升的情况下测试这两种rab蛋白作为底物。考虑到rep1表达与aav2-rep1的moi之间的非线性关系，用于曲线拟合分析的模型是4参数对数(4-pl)回归模型(图12b)。log(ic50)为4.578(ic50＝37,887moi)，即在基本响应和最大响应之间产生一半响应的moi为约38,000。将如通过生物素掺入测量的生物素化底物的量相对于aav2-rep1的moi作图(图12c)。用底物和moi作为因素的双向anova揭示了这两个因素均是显著的(n＝3，p<0.0001)。针对每种底物的相对于未转导细胞(moi＝0)的生物素掺入的bonferroni多重比较检验发现，它在rab27a中在moi20,000(p＝0.0329)和50,000(p<0.0001)时是统计学显著的。对于rab6a，发现在moi5,000(p＝0.0196)及以上(p<0.0001)时，相对于未转导细胞的生物素的掺入是统计学显著的。最后，在图12d中绘制了相对于rep1在每种底物中的生物素掺入之间的关系。针对未转导细胞中存在的内源水平校正了这两个参数。对这两个数据集的线性回归分析显示了，每单位标准化的过表达的rep1的rab6a上的生物素掺入始终高于rab27a的。rab6a数据集也显示出对回归的更好拟合(r²＝0.892对rab27a的r²＝0.6313)。数据共同表明rab6a对于用作底物来测量异戊烯化活性的变化是更灵敏的。

为了评估rab6a作为体外异戊烯化测定法中的底物的用途，以类似方式转导其他细胞系。使用rab6a作为底物制备异戊烯化反应，并且图3中描绘了得到的结果。ht-1080(人纤维肉瘤)和arpe-19(人rpe)细胞系均以moi1,000、10,000和30,000转导(图13a和13b)。在这两种情况下，生物素化底物的水平都与rep1的量成正比，这显示了我们的方法可以在其他细胞系中重复。

除非将细胞或细胞系修饰得变为rep1缺陷细胞或细胞系，否则在该细胞或细胞系中存在内源水平的rep1。因此，通过区分内源和载体转基因表达的蛋白质，使测量的响应最大化的测定法提供了优越的性能。

该研究证明了生物素化的脂质供体和rab底物在体外测量aav2递送的rep1的生物活性的用途。本文所述的测定法提供了灵敏且可再现的体外测试，用于评估aav基因疗法载体的生物学活性。

就异戊烯化率而言，rab6a与rab27a正好相反：它在rab蛋白异戊烯化率的最高分层中，因此将提供增加活性的更灵敏的读数。因此，本公开内容在用作生物活性测定法中的底物方面比较rab6a与rab27a。数据显示了，这两种底物均可用于测量未转导细胞中的异戊烯化活性。测试了这两种底物以确定每种底物如何响应aav2递送的rep1而运转。rep1表达与moi之间的关系不是线性的，而是对数的。s形曲线暗示从可使用此方案测量的外源递送的转基因表达的rep1的量可能存在限制，我们在本实验中未达到此限制。在这两个数据集上进行的线性回归分析显示了，rab6a在标准化的rep1是线性的范围内(图12b中约为1至约2loggc/细胞)具有更高的生物素掺入(图12d)。因此，rab6a是可以更准确地预测每单位过表达的rep1掺入多少生物素的底物。

在其他细胞系中进一步证实了rab6a的使用。已经在前使用ht-1080细胞以测试递送rep1的慢病毒构建体，并在无脉络膜基因疗法试验(nct01461213)中使用aav2-rep1后确认rep1表达。arpe-19细胞出于它们与无脉络膜基因疗法的靶细胞类型的相似性而得到选择。关于在体外异戊烯化方案后rab6a中生物素掺入，这两种细胞系均作为293细胞响应，证实了该测定法是可重复的并且似乎不是细胞类型特异性的。

数据共同显示rab6a的体外异戊烯化是测试用aav2进行细胞转导后rep1转基因表达活性的更灵敏且稳健的方法。

实施例9：在异戊烯化反应中作为底物的rab27a和rab6a的比较

在研究使用293细胞的rab27a和rab6a中生物素掺入的差异中将总细胞裂解物(20μg)、ggt-ii(2μm)和rab底物(4μm)用作标准条件。建立此测定法中的第一步是优化异戊烯化反应条件，以检测内源rep1活性(图14)。测试的实验条件在图14a中描绘，并且包括总细胞蛋白的量(2.5、5、10和20μg)、ggt-ii的浓度(0.5、1和2μm)以及rab底物，rab27a或rab6a的浓度(0.16、0.8和4μm)。使用三个不同的细胞裂解物运行三个独立的实验。对反应产物进行western印迹分析，其中一个代表在图14b中显示。阳性对照(+ve)反应使用2μm的ggt-ii和4μm的rab6a进行，并掺加有重组鱼rep1(25nm)。在阳性对照孔中掺入生物素的带强度(图14b，右手侧)证明了反应中涉及的所有底物均处于适当条件下。在所有三个实验中，观察到这两种底物均在体外被内源rep1以剂量依赖性方式异戊烯化，如通过生物素掺入测量(图14b和14c)。这两者均可用于评估raav2/2递送的rep1的生物活性。对于统计数据分析，运行了三个独立的双向anova，以比较每种测试条件的rab27a和rab6a之间的生物素掺入。以“条件”(总细胞裂解物)和“底物”为因素的双向anova揭示了，这两种因素均显著促成条件#1-#4中变化的来源(图14d；n＝3；分别为p＝0.0102和p＝0.0014)。然而，用于生物素掺入的bonferroni多重比较检验发现，当使用20μg总细胞裂解物时，rab6a已经掺入比rab27a显著更多的b-gpp(图14d；p＝0.009)。使用相同的方法来分析ggt-ii浓度(条件#4-#6)和rab底物浓度(条件#4,#7和#8)两者的影响。以ggt-ii浓度为“条件”的双向anova分析揭示了在这种情况下，仅“底物”促成变化的来源(图14d；n＝3；p＝0.0145)。用于生物素掺入的bonferroni多重比较检验发现，当ggt-ii的浓度变化时，rab27a和rab6a之间没有统计学上的显著差异(图14d；ns)。关于rab底物浓度(条件#4,#7和#8)，双向anova分析显示“条件”和“底物”都是促成变化来源的因素(图14d；n＝3；p＝0.0382和p＝0.0044)。用于生物素掺入的bonferroni多重比较检验发现，当使用4μmrab底物时，rab6a已经掺入比rab27a显著更多的b-gpp(p＝0.0263)。这些数据显示了不同的rab底物影响在所有测试条件下获得的结果。此外，反应中ggt-ii的浓度是底物中生物素掺入的最小促成因素，可能因为过量使用它。

在chm基因提升的情况下，这两种rab蛋白均作为底物测试。运行三个独立的实验，其中在增加的感染复数(moi，定义为基因组拷贝数/细胞或gc/细胞)的范围，用raav2/2-rep1转导293细胞(100；300；1,000；3,000；10,000；30,000；100,000；300,000)(图15)。在每个实验中使用肌动蛋白作为加载对照，同时分析异戊烯化反应产物；在图15a中显示代表性的western印迹。与掺加到未转导细胞裂解物中的重组鱼rep1(25nm)平行进行两个阳性对照反应(每种rab底物一个)。

观察到通过western印迹检测到的rep1的量与添加到细胞的病毒颗粒的量相关(图15a，上图)：rep1的带密度随着moi的增加而增加。使用4参数对数(4-pl)回归模型，将标准化的rep1带密度(相对于对应的肌动蛋白带密度)相对于moi(对数标度)作图(图15b)。该模型考虑了以下事实：在此实验中，细胞是一个生物学受限的系统，其中moi的增加会在某个点使系统饱和并停止rep1的产生。在无约束条件下运行回归模型(r²＝0.8625)，并预测曲线顶部的最佳拟合值为标准化rep1的5.191个任意单位(a.u.)。此拟合的log(ic50)为5.255a.u.，对应于179,735gc/细胞的moi，其在测试的范围内。

关于rab底物中生物素掺入(图15a，下图)，进一步观察到，在比rab27a中更宽的范围内检测到rab6a中的生物素掺入。遵循与图15b中rep1相同的原理，将这两种底物中的生物素掺入(如通过带密度测量)相对于用于转导的raav2/2-rep1的moi绘图(图15c)。水平虚线(rab6a,5.009±1.25a.u.；rab27a,0.577±0.19a.u.)代表对于未转导样品中的每个rab获得的基线值(三个独立运行的平均值)。在没有任何约束的情况下对每个rab底物运行4-pl回归模型，并且这两个r²均显示在图15c中(rab27a,r²＝0.8772；rab6a,r²＝0.8873)。曲线顶部rab6a的最佳拟合预测为92.83a.u.，log(ic50)为4.912，对应于moi为81,694gc/细胞的moi。对于rab27a，曲线的顶部预测为53.8a.u.，log(ic50)为5.514，对应于326,488gc/细胞的moi。每种rab底物的log(ic50)值之间的差异指示其在该测定法中的灵敏性：可以在比rab27a中更宽的范围内检测到rab6a(其表现出较低的斜率和检测限)中的生物素掺入。用“moi”和“底物”作为因素在同一数据集中运行的双向anova加强这些发现：发现两者均是显著的(n＝3；p<0.0001)。此外，在每个测试的moi的底物中的生物素掺入的bonferroni多重比较检验揭示了在moi为10,000(p＝0.0097),30,000(p＝0.0002)和100,000和300,000(p<0.0001)时此类掺入在rab6a中比在rab27a中显著更高。在给定的raav2/2-rep1的moi时，rab6a在掺入生物素中是优越的。

rab6a用作底物来测量raav2/2-rep1的生物活性是更灵敏的。相对于标准化的过表达的rep1，针对底物中掺入的生物素的每个值作图，针对相应的未转导样品进行校正(图15d)。所得的线性回归分析显示了，每单位rep1在rab6a上的生物素掺入高于rab27a的(分别为y＝18.82*x+0.4803对y＝6.569*x+0.9042)。rab6a数据集也显示对回归的更佳拟合(r²＝0.8959对针对rab27a的r²＝0.533)。

在其他细胞系中证实了在体外异戊烯化测定法中使用rab6a作为底物。以类似方式用raav2/2-rep1转导ht-1080(人纤维肉瘤)和arpe-19(人rpe)细胞系，以进行定性分析。在这两种情况下，在一个单一实验中使用1,000、10,000和30,000gc/细胞的代表性moi来转导两个孔(重复)。阳性对照与掺入每种未转导的细胞裂解物中的重组鱼rep1(ht-1080为25nm；arpe-19为11nm)平行运行。对异戊烯化产物进行了western印迹分析，并且在图13中显示了结果。我们观察到转导所用的moi、rep1的表达以及rab6a中生物素掺入之间的相关性，就像我们对293细胞所做的一样(图13a和13b)。然而，对arpe-19和相应的生物素化rab6a检测的rep1水平总体上低于ht-1080和293细胞的。arpe-19细胞尺寸较大，这需要减少的每个孔中接种的细胞数，和可以在凝胶中加载的细胞裂解物的总量的体积约束。

公开内容首次报道了使用生物素化的脂质供体和rab底物在体外测量raav2/2递送的rep1的生物学活性。目的是提供可再现且灵敏的体外测试，以评估raav基因疗法载体对无脉络膜的生物学活性。

rab27a的异戊烯化不足是无脉络膜中rpe细胞变性的分子原因之一，尽管其他细胞扰动也可能导致无脉络膜表型。例如，rab27a在无脉络膜淋巴母细胞中异戊烯化不足的rab蛋白的子集中。尽管rab27a同等良好结合rep1和rep2，但rab27a比其它rab蛋白具有对rep2比对rep1更低的亲和力。由于rab27a-rep1复合物比rab27a-rep2具有更高的对ggt-ii的亲和力的事实，rab27a可以积累未异戊烯化。此外，rab27a具有rab蛋白中的最慢的gtp水解速率之一和最慢的异戊烯化速率之一两者。

生物素化的脂质供体在生物学测定法中是有益的。根据美国食品药品管理局(fda)的定义，生物学测定法是“定量测定法，其测量与其实现给定结果的特定能力相关的产物活性”。使用生物素化的脂质供体，体外评估异戊烯化的简单且灵敏的方法是可能的。已在hela、淋巴母细胞、成纤维细胞和ips衍生的rpe细胞中使用生物素标记的异戊二烯供体检测到未异戊烯化的rab蛋白水平。

rab6a底物比rab27a更准确地预测每单位过表达的rep1掺入了多少生物素。hek293细胞是该研究选择的细胞系。hek293细胞具有根据fda建议开发基因疗法产品效力测试的特征。hek293细胞从认证的细胞系提供商可购得，并且作为符合当前良好制造流程(cgmp)的主细胞库。此外，由于rep1遍在表达，并且在缺少rep1缺乏的稳定细胞系的情况下，始终存在rep1的内源水平。因此，使测量的响应最大化的测定法最有利于区分内源和载体转基因表达的rep1。将rab27a与rab6a进行比较。就异戊烯化率而言，rab6a与rab27a恰好相反：它位于rab蛋白异戊烯化率的顶部分层。rab6a提供了更灵敏的生物活性读数。在用作生物活性测定法中的底物方面将rab6a与rab27a进行比较。这两种底物均可用于测量293未转导细胞中的异戊烯化活性。用rab6a获得的带密度始终高于rab27a。对这两种底物测试了它们会如何响应raav2/2递送的rep1运行。rep1的表达与用于转导细胞的raav2/2-rep1的量成正比。rep1表达与moi之间关系的统计最佳拟合不是线性的，而是对数的，这是因为细胞是如下的系统，其中可以转导它的raav的量受到限制。s形曲线显示了可以使用此方案测量的从外源递送的转基因表达的rep1量存在限制。在本公开内容的实验中尚未达到此限度。对于rab底物中的生物素掺入也是如此。rab6a是一种用于测量生物素掺入的更有效底物，因为它的范围比rab27a更宽且更陡。对这两个数据集运行的线性回归分析显示了在标准化rep1呈线性的范围内，rab6a具有更高的生物素掺入。

在其他细胞系中进一步评估rab6a的使用。arpe-19细胞出于它们与无脉络膜基因疗法的靶细胞类型的相似性而选择。在体外异戊烯化方案后，关于rab6a中生物素的掺入，这两种细胞系均作为293细胞响应。此测定法是可重复的，并且似乎不是细胞类型特异性的。

我们的数据共同显示了rab6a的体外异戊烯化是用raav2/2的细胞转导后测试rep1活性的稳健方法。rab6a用作raav2/2-rep1的效力测定法中的底物似乎更灵敏，因为与rab27a作为底物相比，它能够更准确地检测病毒载体批次之间的微小差异。本公开内容对体外异戊烯化测定法的开发提供了有价值的改进，所述测定法评估aav载体在无脉络膜基因疗法中的生物学活性，包括例如在临床试验中的基因疗法。

实施例10：生物相容性、稳定性和浓度的评估

在模拟临床情况的设置中，评估了在储存和通过用于aav基因疗法的注射装置后，aav药物产品的生物相容性和稳定性。测试了raav2.rep-1的两种剂量和稀释剂。收集并分析样品以确定是否存在载体的任何损失，无论是物理损失还是生物学功能的损失(例如rep-1异戊烯化活性)。

使用10倍稀释将tmn200中1e+12的高剂量载体稀释到tmn200和平衡盐溶液(bss)中。将基线样品和3个独立加载的手术器械(带有41gteflon尖端的23g针头)在4℃保持30分钟，然后在室温保持90和180分钟。在所有时间点从注射样品和“注射器”样品中收集样品，并使用qpcr测定物理滴度(drp/ml)。通过wb和在体外异戊烯化中测定rep-1蛋白表达和活性水平，所述体外异戊烯化在基线使用生物素化脂质供体、于4℃使用30分钟和室温使用180分钟。

运行基因组滴度分析以确保样品重复之间的良好精确性。对于所有测试时间点，与基线水平相比，用bss稀释的样品的基因组滴度存在显著损失(下降60-70％)。因此，从蛋白质分析排除这些。对于任何时间点，用tmn200稀释的样品显示与基线无显著差异。与基线相比，4℃和180分钟的样品显示持续的rep-1表达。类似地，生物素化的rab底物的水平与基线没有变化。

即使在较低的稀释度，使用tmn200作为稀释剂确保aav药物产品的物理滴度，以及在长达3.75小时的时段内药物产品的表达和功能性水平。

物理病毒基因组滴度的测定是载体表征的一部分，并且是确保基因疗法期间病毒颗粒效力和递送安全性的关键步骤。测定aav滴度的最普遍的方法是定量pcr(qpcr)。不同变量可影响结果，例如用作标准品的dna的构象或样品制备期间的酶消化。

为了分析dna标准品构象的影响，使用超螺旋质粒和线性化形式制备两条标准曲线。通过用hindiii限制性酶消化制备线性化的质粒，通过琼脂糖凝胶电泳显现，并按照制造商的说明使用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen)纯化。每个质粒标准品的七个系列稀释液(质粒dna的109-103拷贝)用于生成标准曲线。为了从纯化的aav载体中提取dna，使用两种酶促方法：使用dna酶i的单消化和使用额外的蛋白酶k处理的双消化。使用特异于转基因序列的引物和taqman探针，使用cfxconnect实时pcr检测系统(biorad)进行qpcr。

与使用线性化质粒相比，使用超螺旋质粒作为标准品显著提高aav载体的滴度(p<0.0001，成对t检验)。根据生成的数据，与线性化标准品相比，使用超螺旋标准液品的滴定值的绝对差高约4.6倍。在用dna酶i处理的样品和用额外的蛋白酶k处理的相同样品之间没有发现滴度的显著差异(p＝0.075，成对t检验)。

标准dna构象影响通过qpcr得到的绝对定量，当使用超螺旋质粒时，导致高估的aav滴度。这些结果突出显示了使用线性化质粒获得可靠且准确的aav载体滴度的重要性，不仅对于研究目的是重要的，而且还确保疗法安全性和临床试验中的效力。

材料和方法

aav载体产生：在一些修改的情况下遵循标准方案(zolotukhin,s,etal.(1999).genether.6:973–985)产生在cag启动子的控制下含有chm转基因的aav2病毒载体。简言之，用磷酸钙共转染hek293(293人胚肾)细胞，并使用碘克沙醇不连续离心和肝素层析从细胞裂解物中纯化病毒颗粒。以4.95e+12drp/ml的浓度在配制缓冲液(20mmtrisph8.0,1mmmgcl2,200mmnacl,atph8，在注射用水中)中制备病毒原液。

细胞培养：在mem培养基中培养hek293细胞(人胚胎肾，#85120602,culturecollections,publichealthengland,salisbury,uk)。在dmem中培养ht1080细胞(人纤维肉瘤，#85111505,culturecollections,publichealthengland,salisbury,uk)。在dmem:f12中培养arpe-19细胞(人rpe，#crl-2302,atccvialgcstandards,middlesex,uk)。mem培养基补充有l-谷氨酰胺(2mm)。所有三种培养基均补充有青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)、非必需氨基酸(1％)和10％胎牛血清。将细胞在5％co2环境中维持于37℃。rpe-j细胞(大鼠视网膜色素上皮，#crl-2240,atccvialgcstandards,middlesex,uk)在补充有l-谷氨酰胺(2mm)、青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)、非必需氨基酸(1％)和4％胎牛血清的dmem中培养。将细胞在5％co2环境中维持于34℃中。

细胞转导和总细胞裂解物的制备：对于转导实验，在转导前一天将所有细胞接种在6孔板中：293,9.5e+05个细胞/孔；ht1080,4e+05个细胞/孔；arpe-19,2e+05个细胞/孔。在感染复数(moi，即基因组颗粒/细胞)范围进行用raav2/2的转导，并且转导后3天(dpt)以及之后每2-3天更换培养基。如下在5dpt制备细胞裂解物：用pbs洗涤细胞，并在冰上与补充有蛋白酶抑制剂(complete^tmmini,roche,welwyn,uk)的异戊烯化缓冲液(50mmhepes,50mmnacl,2mmmgcl2,1mmdtt,ph7.5)一起温育。使用细胞刮刀将细胞刮入1.5ml管中，在冰上温育15分钟，然后通过将它们通过与1ml注射器附接的26-g针20次来破坏。将细胞在4℃以1,500rcf离心5分钟，并将上清液转移至丙酸纤维素管中，并以100,000rcf于4℃离心1h。保留上清液作为总细胞裂解物，用于体外的异戊烯化反应。根据制造商的说明(quickstart^tmbradford1xdyereagent,bio-rad,hertfordshire,uk)使用bradford方法确定总蛋白质含量，并使用s型4参数对数回归从标准曲线推断样品值。

体外异戊烯化测定法：使用异戊烯化缓冲液中的总细胞裂解物(多达20μg)、重组大鼠rabggt酶(2μm,jenabiosciences,jena,germany)、重组人rab蛋白(rab27a,abnovacorporation,uk；rab6a,jenabiosciences,jena,germany)和生物素标记的牻牛儿基焦磷酸盐(b-gpp,5μm,jenabiosciences,jena,germany)作为脂质供体建立异戊烯化反应。所有反应均补充有新鲜的5'-二磷酸鸟苷(gdp,20μm,merckmillipore,watford,uk)和dtt(1mm,thermo-fisherscientific,loughborough,uk)。使用掺加有重组rep1蛋白(鱼his-rep1,jenabiosciences,jena,germany,或人his-rep1,nightstartherapeuticsltd.,uk)的未转导的细胞裂解物制备阳性对照。将反应在37℃温育2小时，然后通过添加laemmli样品缓冲液终止。

western印迹分析：将反应产物在10％预制聚丙烯酰胺凝胶(criterion^tm,bio-rad,hertfordshire,uk)上进行sds-page，转移到pvdf膜(transblotturbo,bio-rad,hertfordshire,uk)，并用封闭缓冲液[pbs+0.1％tween20(pbst)+3％牛血清清蛋白(bsa)]封闭45分钟。对于蛋白质表达，分别对于抗β-肌动蛋白(am4302,thermo-fisherscientific,loughborough,uk；1:50,000)和抗人rep1(mabn52,merckmillipore,watford,uk；1:2,500)一抗在封闭缓冲液中在搅拌下温育膜达1小时。将膜用pbst洗涤3x7分钟，与hrp标记的二抗在封闭缓冲液(1:10,000)中温育30分钟，再如前洗涤，并使用clarityecl(bio-rad,hertfordshire,uk)和odyssey成像系统(li-corbiosciences,cambridge,uk)检测。通过与链霉亲合素-hrp(thermo-fisherscientific,loughborough,uk)直接温育30分钟检测生物素化脂质供体对合适的rab底物中的掺入。使用imagestudiolite软件(li-corbiosciences,cambridge,uk)进行光密度测定数据分析。

统计分析：相对于作为加载对照的肌动蛋白标准化rep1表达水平。相对于aav2-rep1的log-base-10转换moi绘制标准化的rep1，并以置信区间(ci)为95％，坡度＝1，底部>0约束(6个重复的平均值±sem)拟合到四参数对数(4-pl)回归模型。使用底物和moi作为因素，使用双向方差分析(anova)，比较每种moi的这两种底物的生物素掺入(3个重复的平均值±sem)。应用bonferroni检验校正多重比较(95％ci)。针对标准化的rep1水平(针对未转导的对照样品进行校正)对每种底物中的生物素掺入作图，并通过线性回归(95％ci)进行分析。所有统计分析均使用windows版prism7(sandiego,ca,usa)进行。

对于图14和图15，用“底物”和“条件”为因素，使用双向anova比较使用不同实验条件在rab27a和rab6a两者中的生物素掺入(3个重复的平均值±sem)。应用bonferroni检验以95％的置信区间(ci)校正多重比较。相对于raav2/2-rep1的log-base-10转换moi(loggc/细胞)对标准化的rep1(针对相应的肌动蛋白水平校正)作图，并以95％ci，无约束(6个重复的平均值±sem)拟合到四参数对数(4-pl)回归模型。相对于raav2/2-rep1的moi(loggc/细胞)对这两种底物中的生物素掺入作图，并以95％ci，无约束(3个重复的平均值±sem)拟合到4pl回归模型。用“底物”和“moi”作为因素，使用双向anova比较每个moi的每个底物的生物素掺入量。应用bonferroni检验校正多重比较(95％ci)。相对于标准化的rep1水平(针对未转导的对照样品进行校正)将每种底物中的生物素掺入作图，并通过线性回归(95％ci)进行分析。所有统计分析均使用windows版prism7(sandiego,ca,usa)进行。

通过引用并入

上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述方法和用途的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应过度限于此类具体的实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的、用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求书的范围内。

其他实施方式

尽管已经显示和描述了本公开内容的具体实施方案，但是在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以做出各种其他改变和修改。所附权利要求术的范围包括在本公开内容的范围内的所有此类变化和修改。

序列表

<110>夜星有限公司(nightstarxlimited)

牛津大学创新有限公司(oxforduniversityinnovationlimited)

maclaren,roberte

moreirapatricio,mariaines

robinson,gregorys

<120>异戊烯化测定法

<130>nigh-005/001wo

<150>62/636,722

<151>2018-02-28

<150>62/573,522

<151>2017-10-17

<160>17

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<211>208

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100105110

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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130135140

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145150155160

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165170175

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195200205

glnleusergluglulysglulysglyalacysglycys

210215220

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.用于体外测定rab护送蛋白1(rep1)活性的方法，其包括以下步骤：

(a)使rep1蛋白与rab6a蛋白、rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶(rabggt酶)和脂质供体底物接触以产生脂质化的rab6a，其中腺伴随病毒(aav)载体包含编码所述rep1蛋白的序列(aav-rep1)，其中以每个细胞至少5000个基因组拷贝(gc/细胞)的感染复数(moi)提供所述aav-rep1载体，并且其中在细胞中表达所述rep1蛋白；和

(b)检测所述脂质化的rab6a。

2.权利要求1的方法，其中所述rab6a蛋白或所述rabggt酶是基本上纯的。

3.权利要求1的方法，其中所述rab6a蛋白和所述rabggt酶是基本上纯的。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述脂质供体底物包含牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐/酯(ggpp)或其类似物。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述脂质供体底物包含生物素-牻牛儿基焦磷酸盐/酯(bgpp)。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中检测所述脂质化的rab6a包括酶联免疫吸附测定法(elisa)、western印迹分析或放射自显影术。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中制备所述aav-rep1载体，用于治疗无脉络膜。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中检测所述脂质化的rab6a，并且其中所述aav-rep1载体适用于无脉络膜的治疗。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中检测所述脂质化的rab6a还包括量化所述脂质化的rab6a的量。

10.权利要求9的方法，其中所述脂质化的rab6a的量是绝对量。

11.权利要求9的方法，其中所述脂质化的rab6a的量是相对量。

12.权利要求11的方法，其中所述脂质化的rab6a的量是相对于对照量或参考水平。

13.权利要求12的方法，其中所述对照量或参考水平是从未转导的细胞测量的脂质化rab6a的水平，其中所述未转导的细胞表达内源rep1。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中当与从未转导的细胞测定的脂质化rab6a的水平相比时，每个细胞至少5000个基因组拷贝(gc/细胞)的感染复数(moi)提供脂质化rab6a的统计学显著水平。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中以每个细胞至少38,000个基因组拷贝(gc/细胞)的感染复数(moi)提供所述aav-rep1载体，其中所述moi提供每单位过表达的rep1的脂质化rab6a的基础水平和每单位过表达的rep1的脂质化rab6a的最大水平之间等距的每单位过表达的rep1的脂质化rab6a的水平。

16.权利要求1-14中任一项的方法，其中以每个细胞至少81,000个基因组拷贝(gc/细胞)的感染复数(moi)提供所述aav-rep1载体，其中所述moi提供每单位过表达的rep1的脂质化rab6a的基础水平和每单位过表达的rep1的脂质化rab6a的最大水平之间等距的每单位过表达的rep1的脂质化rab6a的水平。

17.权利要求1-14中任一项的方法，其中以每个细胞至少10,000、30,000、100,000或300,000个基因组拷贝(gc/细胞)的感染复数(moi)提供所述aav-rep1载体。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述aav-rep1载体包含aav2基因组。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述aav-rep1载体包含aav2壳体蛋白。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述aav-rep1载体包含cag启动子，并且其中编码所述rep1蛋白的序列在所述cag启动子的控制下。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞。

22.权利要求21的方法，其中所述细胞是视网膜细胞。

23.权利要求21或22的方法，其中所述细胞是视网膜色素上皮(rpe)细胞。

说明或声明(按照条约第19条的修改)

以下所附内容是根据pct条约第19条修改的内容

国际局收到于2019年2月21日寄出的有关权利要求书修改。

以新的权利要求第1-23项替换原始的权利要求第1-31项。