用于抑制LDHA表达的方法和组合物与流程

相关申请

本申请根据35u.s.c.§119（e）要求以下的权益：于2018年9月4日提交的名称为“methodsandcompositionsforinhibitingexpressionofldha”的美国临时申请号62/726950、于2017年10月13日提交的名称为“methodsandcompositionsforinhibitingexpressionofldha”的美国临时申请号62/572403、以及于2017年10月13日提交的名称为“methodsandcompositionsforinhibitingexpressionofldha”的美国临时申请号62/572398，所述美国临时申请的全部内容引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及用于降低基因表达和/或活性的寡核苷酸、组合物和方法。

发明背景

原发性高草酸尿症（ph）是由草酸盐的过量生产引起的常染色体隐性遗传病症，导致肾中的草酸钙沉淀，并且最终导致晚期肾病。存在称为ph1型（ph1）、2型（ph2）和3型（ph3）的3种形式的ph，以及特发性高草酸尿症。乳酸脱氢酶（ldh）已被鉴定为用于降低肝脏草酸盐生产的靶，因为它是负责将乙醛酸盐转换为草酸盐(肝脏中的草酸盐代谢的最后一步)的关键酶。已开发了靶向编码ldh亚基的基因的rnai寡核苷酸。

发明概述

本发明至少部分基于有效寡核苷酸的鉴定，所述有效寡核苷酸产生持久的基于rnai的ldh蛋白敲减，从而降低ldh酶活性。在一些实施方案中，与现有的寡核苷酸相比，本文公开的rnai寡核苷酸除其它特征外还具有改善的稳定性、改善的生物利用度、改善的肝靶向和/或改善的对基因敲减的持续作用。在一些实施方案中，本文公开的rnai寡核苷酸包含n-乙酰半乳糖胺（galnac）部分与之缀合的具有缺口的四环结构，用于将寡核苷酸特异性地递送至肝细胞，从而避免或最小化在其它组织例如肌肉、皮肤或子宫中的潜在的不希望有的效应。在一些实施方案中，本文公开的rnai寡核苷酸可用于降低受试者（例如患有原发性高草酸尿症的患者）中的肝草酸盐产生。在一些实施方案中，本文公开的rnai寡核苷酸可用于降低尿草酸盐水平。在一些实施方案中，本文公开的rnai寡核苷酸可用于治疗原发性高草酸尿症，包括ph1、ph2和/或ph3，以及特发性高草酸尿症。

本公开内容的一些方面提供了用于降低ldha表达的寡核苷酸，该寡核苷酸包含具有如ucagauaaaaaggacaacaugg（seqidno：1）所示的序列的反义链、以及具有如auguuguccuuuuuaucugagcagccgaaaggcugc（seqidno：2）所示的序列的有义链。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸都是修饰的。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包含2'-修饰。在一些实施方案中，2'-修饰是2'-氟或2'-o-甲基。在一些实施方案中，下述位置中的一个或多个用2'-o-甲基进行修饰：有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36和/或反义链的位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。在一些实施方案中，有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26和31-36，以及反义链的位置1、6、8、11-13、15、17和19-22都用2'-o-甲基进行修饰。在一些实施方案中，下述位置中的一个或多个用2'-氟进行修饰：有义链的位置3、5、8-11、13、15或17和/或反义链的位置2-5、7、9、10、14、16或18。在一些实施方案中，有义链的位置3、5、8-11、13、15或17，以及反义链的位置2-5、7、9、10、14、16和18都用2'-氟进行修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，至少一个修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键合。在一些实施方案中，寡核苷酸具有在以下一个或多个之间的硫代磷酸酯键合：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21、以及反义链的位置21和22。在一些实施方案中，寡核苷酸具有在以下每一个之间的硫代磷酸酯键合：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21、以及反义链的位置21和22。

在一些实施方案中，在反义链的第一个位置处的尿苷包含磷酸酯类似物。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含在反义链的位置1处的下述结构：

。

在一些实施方案中，有义链上的–gaaa–序列的一个或多个核苷酸与单价galnac部分缀合。在一些实施方案中，有义链上的–gaaa–序列的每个核苷酸均与单价galnac部分缀合。在一些实施方案中，–gaaa–基序包含以下结构：

，

其中：

l代表键、点击化学手柄或长度为1至20个、包括1和20个连续的共价键合原子的接头，其选自取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代和未取代的杂亚烷基、取代和未取代的杂亚烯基、取代和未取代的杂亚炔基及其组合；和

x是o、s或n。

在一些实施方案中，l是缩醛接头。在一些实施方案中，x为o。

在一些实施方案中，–gaaa–序列包含以下结构：

。

在一些实施方案中，用于降低ldha表达的寡核苷酸包含具有如ucagauaaaaaggacaacaugg（seqidno：1）所示的序列的反义链、以及具有如auguuguccuuuuuaucugagcagccgaaaggcugc（seqidno：2）所示的序列的有义链，

其中有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26和31-36，以及反义链的位置1、6、8、11-13、15、17和19-22都用2'-o-甲基进行修饰，并且有义链的位置3、5、8-11、13、15或17，以及反义链的位置2-5、7、9、10、14、16和18都用2'-氟进行修饰；

其中所述寡核苷酸具有在以下每一个之间的硫代磷酸酯键合：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21、以及反义链的位置21和22；

其中所述寡核苷酸包含在反义链的位置1处的下述结构：

，

其中有义链上的–gaaa–序列的每个核苷酸均与包含以下结构的单价galnac部分缀合：

。

本公开内容的其它方面提供了包含本文所述的任何寡核苷酸和na⁺抗衡离子的组合物。

还提供了具有如图3中所描绘的化学结构的组合物。

本公开内容的其它方面提供了向受试者递送寡核苷酸的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的任何组合物或寡核苷酸。在一些实施方案中，受试者患有或处于患有ph1、ph2、ph3和/或特发性高草酸尿症的风险中，该方法包括通过向受试者施用本文所述的寡核苷酸，来降低受试者中的肝细胞中的ldha蛋白表达。

本公开内容的其它方面提供了本文所述的寡核苷酸或组合物用于治疗患有或处于患有原发性高草酸尿症的风险中的受试者的用途，所述治疗包括向受试者施用寡核苷酸或组合物。在一些实施方案中，将寡核苷酸或组合物静脉内或皮下施用于受试者。

附图简述

并入本说明书并构成本说明书的一部分的附图示出了某些实施方案，并且连同书面描述一起，用于提供本文公开的组合物和方法的某些方面的非限制性实例。

图1a是显示了rnai寡核苷酸的非限制性实例的示意图，所述rnai寡核苷酸含有具有与ldhamrna互补的区域的引导（反义）链。

图1b是环序列的实例的化学结构的非限制性表示，所述环序列存在于图1a中所示的过客（有义）链的位置27-30处。

图1c是修饰的尿苷的化学结构的非限制性表示，所述修饰的尿苷显示于图1a中所示的引导（反义）链的位置1处。在化学式中，或是单键，其中未指定与其直接附着的部分的立体化学。

图2a是显示了使用ldhaaav小鼠模型，用于图1a中所示的特定寡核苷酸的体内评估的时间线的示意图。如所示的，在第-1周时执行aav注射，并且以0.5、1、3或6mg/kg皮下注射单个剂量的寡核苷酸。在1、2、4、6、8和10周时，收集4mm活组织检查穿孔器，并且在模块和rnalater中速冻，用于mrna敲减分析。

图2b是证实了实施例1中描述的研究结果的子集的图。在1、3或6mg/kg剂量后，以剂量后周数显示了剩余的hldhamrna百分比。这些结果针对时间匹配的pbs进行标准化。人ldhamrna的剂量依赖性降低在剂量后持续四周。

图3是rnai寡核苷酸的非限制性化学结构，所述rnai寡核苷酸含有具有与ldhamrna互补的区域的引导（反义）链和具有缺口的四环结构的过客（有义）链。

图4是显示了在第一个剂量后的第28和56天，在食蟹猴（幼年和青年）中如图3中所示的寡核苷酸的两个剂量后，ldhamrna（上图）、ldh蛋白（中图）和ldh活性（剩余%，下图）的降低的图。

图5是显示了在食蟹猴中如图3中所示的寡核苷酸的两个剂量后，ldh蛋白水平的降低（如通过蛋白质印迹检测）的图。

图6是显示了在食蟹猴中如图3中所示的寡核苷酸的十个剂量后，ldhamrna表达的降低（剩余%）的图。

图7是显示了在食蟹猴中如图3中所示的寡核苷酸的十个剂量后，ago2/risc中掺入的寡核苷酸的浓度的图。

图8a-8b是显示了在标签公开的多中心研究中，在ph患者中以不同剂量（1.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg）的如图3中所示的寡核苷酸的效应的图。图8a显示了在研究过程中，这些患者中的尿草酸盐（uox）含量的绝对值的变化。对于1.5mg/kg剂量组，在d57后n=2。对于3mg/kg剂量组，在d57后n=2。对于6mg/kg剂量组，在d15后n=2和n=1。图8b显示了在研究过程中，1.5mg/kg剂量组和3mg/kg剂量组中的患者中距离基线的24小时尿草酸盐（uox）%变化。

发明详述

根据一些方面，本公开内容提供了靶向ldhamrna的rnai寡核苷酸，其对于降低ldh酶活性有效。在一些实施方案中，这些rnai寡核苷酸可用于降低例如肝脏细胞（例如，肝细胞）中的ldha。在一些实施方案中，使用本文公开的rnai寡核苷酸阻遏肝ldh活性提供了治疗原发性高草酸尿症包括ph1、ph2和/或ph3，以及特发性高草酸尿症的治疗方法。

下文提供了本公开内容的进一步方面，包括限定术语的描述。

i.定义

大约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所陈述的参考值相似的值。在一些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所陈述的参考值的任一方向（大于或小于）的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少内的值的范围，除非另有说明或从上下文中另外显而易见（除了此类数字超过可能值100%之外）。

施用：如本文使用的，术语“施用（administering）”或“施用（administration）”，意欲以药理学有用的方式（例如，以治疗受试者中的病况），向受试者提供物质（例如，寡核苷酸）。

无唾液酸糖蛋白受体（asgpr）：如本文使用的，术语“无唾液酸糖蛋白受体”或“asgpr”，指由主要的48kda（asgpr-1）和次要的40kda亚基（asgpr-2）形成的二分c型凝集素。asgpr主要在肝细胞的窦状表面上表达，并且具有在循环糖蛋白的结合、内化和随后清除中的主要作用，所述循环糖蛋白含有末端半乳糖或n-乙酰半乳糖胺残基（无唾液酸糖蛋白）。

减弱：如本文使用的，术语“减弱”意指降低或有效地停止。作为非限制性实例，本文提供的一种或多种治疗可以降低或有效地停止受试者中的草酸盐累积。这种减弱可以通过例如以下例示：草酸盐累积的一个或多个方面（例如症状、组织特征和细胞等）或者起因于此类累积的症状中的减少，草酸盐累积的一个或多个方面或者起因于此类累积的症状中没有可检测的进展（恶化），或当它们可能被预期时，没有可检测的草酸盐累积或起因于此类累积的症状。

互补的：如本文使用的，术语“互补的”指两个核苷酸（例如，在两种相对的核酸上或在单条核酸链的相对区域上）之间的结构关系，其允许两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一种核酸的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在一些实施方案中，互补核苷酸可以以沃森-克里克方式、或以允许形成稳定双链体的任何其它方式碱基配对。在一些实施方案中，两种核酸可以具有彼此互补的多重核苷酸的区域，以便形成互补性区域，如本文所述。

脱氧核糖核苷酸：如本文使用的，术语“脱氧核糖核苷酸”指与核糖核苷酸相比，在其戊糖的2'位置处具有氢代替羟基的核苷酸。修饰的脱氧核糖核苷酸是这样的脱氧核糖核苷酸，其具有除在2'位置处外的原子的一种或多种修饰或取代，包括在糖、磷酸酯基或碱基中的修饰或取代。

双链寡核苷酸：如本文使用的，术语“双链寡核苷酸”指基本上以双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，在共价分开的核酸链的核苷酸的反向平行序列之间，形成双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，在共价连接的核酸链的核苷酸的反向平行序列之间，形成双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基对。在一些实施方案中，由单条核酸链形成双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对，所述单条核酸链折叠（例如，经由发夹），以提供碱基配对在一起的互补的反向平行的核苷酸序列。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含彼此完全双链体化的两条共价分开的核酸链。然而，在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含两条共价分开的核酸链，所述核酸链是部分双链体化的，例如具有在一端或两端处的突出端。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分互补的反向平行的核苷酸序列，并且因此可以具有一个或多个错配，其可以包括内部错配或端错配。

双链体：如本文使用的，在提及核酸（例如，寡核苷酸）时，术语“双链体”指通过两个反向平行的核苷酸序列的互补碱基配对形成的结构。

赋形剂：如本文使用的，术语“赋形剂”指可以包括在组合物中的非治疗剂，例如以提供或促成所需稠度或稳定效应。

肝细胞：如本文使用的，术语“肝细胞（hepatocyte）”或“肝细胞（hepatocytes）”指肝脏的实质组织的细胞。这些细胞占肝脏质量的大约70-85%，并且制造血清白蛋白、纤维蛋白原和凝血酶原组的凝血因子（除了因子3和4之外）。关于肝细胞谱系细胞的标记物可以包括但不限于：转甲状腺素蛋白（ttr）、谷氨酰胺合成酶（glul）、肝细胞核因子1a（hnf1a）和肝细胞核因子4a（hnf4a）。关于成熟肝细胞的标记物可以包括但不限于：细胞色素p450（cyp3a11）、延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fah）、6-磷酸葡萄糖（g6p）、白蛋白（alb）和oc2-2f8。参见例如，huch等人，（2013），nature，494（7436）:247-250，其与肝细胞标记物有关的内容引入本文作为参考。

乳酸脱氢酶（ldh）：如本文使用的，术语“乳酸脱氢酶”或“ldh”指调节乳酸盐/丙酮酸盐、羟基丙酮酸盐/甘油酸盐、以及乙醛酸盐/草酸盐代谢的稳态的酶。功能性ldh由四条单体多肽链组成，以形成四聚体。两个最常见的亚基，称为ldh的肌肉（m）或心脏（h）形式，分别由ldha和ldhb基因编码。基于其亚基组成，已鉴定了五种不同的同工酶（4h、3h1m、2h2m、1h3m、4m），其显示了相似的酶促活性，但不同的动力学行为和组织分布。肝脏和骨骼肌的主要同工酶ldh5具有4m亚基。

乳酸脱氢酶a（ldha）：如本文使用的，术语“乳酸脱氢酶a”或“ldha”指由ldha基因（entrez基因id：3939）编码的ldh酶的单体，其中存在编码不同同种型的至少五种mrna转录物变体（例如，ncbi参考序列：nm_005566.3、nm_001135239.1、nm_001165414.1、nm_001165415.1和nm_001165416.1）。

乳酸脱氢酶b（ldhb）：如本文使用的，术语“乳酸脱氢酶b”或“ldhb”指由ldhb基因（entrez基因id：3945）编码的ldh酶的单体，其中存在编码不同同种型的至少两种mrna转录物变体（例如，ncbi参考序列：nm_001174097.2和nm_001315537.1）。

环：如本文使用的，术语“环”指核酸（例如，寡核苷酸）的未配对区域，其侧翼为彼此充分互补的核酸的两个反向平行区域，使得在在适当的杂交条件下（例如，在磷酸盐缓冲液中、在细胞中），侧接未配对区域的两个反向平行区域杂交，以形成双链体（称为“茎”）。

修饰的核苷酸间键合：如本文使用的，术语“修饰的核苷酸间键合”指与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键合相比，具有一种或多种化学修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，修饰的核苷酸是非天然存在的键合。在一些实施方案中，修饰的核苷酸间键合对其中存在修饰的核苷酸间键合的核酸赋予一种或多种期望的特性。

修饰的核苷酸：如本文使用的，术语“修饰的核苷酸”指与选自以下的相应参考核苷酸相比，具有一种或多种化学修饰的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸苷脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸具有在其糖、核碱基和/或磷酸酯基中的一种或多种化学修饰。在一些实施方案中，修饰的核苷酸具有与相应的参考核苷酸缀合的一个或多个化学部分。在一些实施方案中，本文提供的修饰的核苷酸可以促成改善的热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。

具有缺口的四环结构：“具有缺口的四环结构”是rnai寡核苷酸的结构，其特征在于存在分开的有义链（过客）和反义链（引导），其中有义链具有与反义链互补的区域，并且其中至少一条链，一般是有义链，具有配置为稳定在至少一条链内形成的相邻茎区的四环。

寡核苷酸：如本文使用的，术语“寡核苷酸”指例如长度小于100个核苷酸的短核酸。寡核苷酸可以是单链或双链的。寡核苷酸可以具有或不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可以是但不限于小干扰rna（sirna）、微小rna（mirna）、短发夹rna（shrna）、dicer酶底物干扰rna（dsirna）、反义寡核苷酸、短sirna或单链sirna。在一些实施方案中，双链寡核苷酸是rnai寡核苷酸。

突出端：如本文使用的，术语“突出端”指起因于延伸超出互补链的末端的一条链或区域的末端非碱基配对核苷酸，所述一条链或区域与互补链形成双链体。在一些实施方案中，突出端包含在双链寡核苷酸的5'末端或3'末端处，从双链体区域延伸的一个或多个未配对的核苷酸。在某些实施方案中，突出端是在双链寡核苷酸的反义链或有义链上的3'或5'突出端。

磷酸酯类似物：如本文使用的，术语“磷酸酯类似物”指模拟磷酸酯基的静电和/或空间特性的化学部分。在一些实施方案中，寡核苷酸具有在5′末端核苷酸处的糖的4′-碳位置处的磷酸酯类似物（称为“4′-磷酸酯类似物”）。4′-磷酸酯类似物的实例是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子与糖部分（例如在其4′-碳处）或其类似物结合。

降低的表达：如本文使用的，术语基因的“降低的表达”指与适当的参考细胞或受试者相比，由细胞或受试者中的基因编码的rna转录物或蛋白质的量中的减少和/或基因活性的量中的减少。例如，用双链寡核苷酸（例如，具有与ldhamrna序列互补的反义链的双链寡核苷酸）处理细胞的行为，可以导致与未用双链寡核苷酸处理的细胞相比，（例如，由ldha基因编码的）mrna转录物、蛋白质和/或酶促活性的量中的减少。类似地，如本文使用的，“降低表达”指导致基因（例如ldha）的表达降低的行为。

互补性区域：如本文使用的，术语“互补性区域”指核酸（例如，双链寡核苷酸）的核苷酸序列，其与反向平行的核苷酸序列充分互补，以允许在适当的杂交条件下，例如在磷酸盐缓冲液、细胞等中，两个核苷酸序列之间的杂交。

核糖核苷酸：如本文使用的，术语“核糖核苷酸”指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其含有在其2'位置处的羟基。修饰的核糖核苷酸是这样的核糖核苷酸，其具有除在2'位置处外的原子的一种或多种修饰或取代，包括在核糖、磷酸酯基或碱基中的修饰或取代。

rnai寡核苷酸：如本文使用的，术语“rnai寡核苷酸”指（a）具有有义链（过客）和反义链（引导）的双链寡核苷酸，其中反义链或反义链的部分被argonaute2（ago2）核酸内切酶用于靶mrna的切割中，或（b）具有单条反义链的单链寡核苷酸，其中该反义链（或该反义链的部分）被ago2核酸内切酶用于靶mrna的切割中。

链：如本文使用的，术语“链”指通过核苷酸间键合（例如，磷酸二酯键合、硫代磷酸酯键合）连接在一起的核苷酸的单个邻接序列。在一些实施方案中，链具有两个自由端，例如5'端和3'端。

受试者：如本文使用的，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一个实施方案中，受试者是人或非人灵长类动物。术语“个体”或“患者”可以与“受试者”互换使用。

合成的：如本文使用的，术语“合成的”指这样的核酸或其它分子，其是人工合成的（例如，使用机器（例如，固态核酸合成仪）），或并非衍生自通常产生该分子的天然来源（例如细胞或生物）。

靶向配体：如本文使用的，术语“靶向配体”指这样的分子（例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质），其选择性地结合目的组织或细胞的同源分子（例如，受体），并且可与另一种物质缀合，用于将其它物质靶向目的组织或细胞的用途。在一些实施方案中，靶向配体包含galnac部分。

四环：如本文使用的，术语“四环”指增加通过核苷酸的侧翼序列的杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。稳定性中的增加可检测为相邻茎双链体的解链温度（tm）中的增加，其高于平均的由一组随机选择的核苷酸序列组成的可比较长度的环所预期的相邻茎双链体的tm。例如，四环可以对包含长度为至少2个碱基对的双链体的发夹赋予在10mmnahpo4中至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的解链温度。在一些实施方案中，四环环可以通过堆叠相互作用来稳定相邻茎双链体中的碱基对。另外，四环的核苷酸中的相互作用包括但不限于非沃森-克里克碱基配对、堆叠相互作用、氢键合和接触相互作用（cheong等人，nature1990aug.16；346（6285）:680-2；heus和pardi，science1991jul.12；253（5016）:191-4）。在一些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由3至6个核苷酸组成，并且通常为4至5个核苷酸。在某些实施方案中，四环包含三、四、五或六个核苷酸，或者由三、四、五或六个核苷酸组成，所述核苷酸可以是或不是修饰的（例如，其可以与靶向部分缀合或不缀合）。在一个实施方案中，四环由四个核苷酸组成。如在cornish-bowden（1985）nucl.acidsres.13:3021-3030中描述的，标准iupac-iub符号可以用于指四环核苷酸。例如，字母“n”可以用于意指任何碱基均可以在该位置中，字母“r”可以用于显示a（腺嘌呤）或g（鸟嘌呤）可以在该位置中，并且“b”可以用于显示c（胞嘧啶）、g（鸟嘌呤）或t（胸腺嘧啶）可以在该位置中。四环的实例包括uncg四环家族（例如uucg）、gnra四环家族（例如gaaa）、以及cuug四环（woese等人，procnatlacadsciusa.1990november；87（21）:8467-71；antao等人，nucleicacidsres.1991nov.11；19（21）:5901-5）。dna四环的实例包括d（gnna）四环家族（例如d（gtta））、d（gnra）四环家族、d（gnab）四环家族、d（cnng）四环家族、以及d（tncg）四环家族（例如d（ttcg））。参见例如：nakano等人biochemistry，41（48），14281-14292，2002.shinji等人nipponkagakkaikoenyokoshu第78卷；第2期；第731页（2000），所述参考文献关于相关公开内容引入本文作为参考。在一些实施方案中，四环包含在具有缺口的四环结构内。

治疗：如本文使用的，术语“治疗”指例如通过向受试者施用治疗剂（例如，寡核苷酸），向有此需要的受试者提供护理的行为，用于就现有病况（例如疾病、病症）而言、或者就预防或减少病况发生的可能性而言，改善受试者的健康和/或幸福的目的。在一些实施方案中，治疗涉及降低由受试者经历的病况（例如疾病、病症）的至少一种体征、症状或促成因素的频率或严重性。

ii.基于寡核苷酸的ldha表达抑制剂

i.寡核苷酸序列

在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸具有引导（反义）链，其具有序列ucagauaaaaaggacaacaugg（seqidno：1）。在一些实施方案中，提供了与反义链形成双链体的有义链。在一些实施方案中，有义链包含在其3'端处的茎环。在某些实施方案中，有义链包含（例如在其3'端处）如下所示的茎环s1-l-s2，其中s1与s2互补，并且其中l在s1与s2之间形成长度范围为2至6个核苷酸的环。在一些实施方案中，在s1与s2之间形成的双链体为长度4、5、6、7或8个碱基对。在一些实施方案中，茎环的环（l）是四环（例如在具有缺口的四环结构内）。四环可以含有核糖核苷酸、修饰的核苷酸和/或其组合。通常，四环具有4至5个核苷酸。然而，在一些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由3至6个核苷酸组成，并且通常由4个核苷酸组成。在某些实施方案中，四环包含三、四、五或六个核苷酸，或者由三、四、五或六个核苷酸组成。

在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸具有序列auguuguccuuuuuaucugagcagccgaaaggcugc（seqidno：2）的有义链。在一个实施方案中，寡核苷酸包含序列ucagauaaaaaggacaacaugg（seqidno：1）的反义链、以及序列auguuguccuuuuuaucugagcagccgaaaggcugc（seqidno：2）的有义链。

ii.寡核苷酸修饰

在一些实施方案中，本公开内容的寡核苷酸可以包括一种或多种合适的修饰。在一些实施方案中，修饰的核苷酸具有在其碱基（或核碱基）、糖（例如核糖、脱氧核糖）或磷酸酯基中的修饰。在本文提供的寡核苷酸的某些实施方案中，寡核苷酸的所有或基本上所有核苷酸都是修饰的。在某些实施方案中，多于一半的核苷酸是修饰的。在某些实施方案中，少于一半的核苷酸是修饰的。

a.糖修饰

在一些实施方案中，修饰的糖（在本文中也称为糖类似物）包括修饰的脱氧核糖或核糖部分。在一些实施方案中，糖中的核苷酸修饰包括2'-修饰。2'-修饰可以是2'-氨基乙基、2'-氟、2'-o-甲基、2'-o-甲氧基乙基、或2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。通常，修饰是2'-氟或2'-o-甲基。在一些实施方案中，糖中的修饰包含糖环的修饰，其可以包含糖环的一个或多个碳的修饰。

在一些实施方案中，下述位置中的一个或多个用2'-o-甲基进行修饰：有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26或31-36和/或反义链的位置1、6、8、11-13、15、17或19-22。在某些实施方案中，有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26和31-36，和/或反义链的位置1、6、8、11-13、15、17和19-22都用2'-o-甲基进行修饰。在一些实施方案中，下述位置中的一个或多个用2'-氟进行修饰：有义链的位置3、5、8-11、13、15或17和/或反义链的位置2-5、7、9、10、14、16或18。在某些实施方案中，有义链的位置3、5、8-11、13、15和17，和/或反义链的位置2-5、7、9、10、14、16和18都用2'-氟进行修饰。

在一些实施方案中，末端3'-端基（例如3'-羟基）是磷酸酯基或其它基团，其可以用于例如附着接头、衔接子或标记。

b.5’末端磷酸酯

在一些实施方案中，寡核苷酸的5’末端磷酸酯基增强了与argonaut2的相互作用。然而，包含5'-磷酸酯基的寡核苷酸可能易受经由磷酸酶或其它酶的降解的影响，这可以限制其在体内的生物利用度。在一些实施方案中，寡核苷酸包括抵抗这样的降解的5'磷酸酯类似物。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有在糖的4'-碳位置处的磷酸酯类似物（称为“4'-磷酸酯类似物”）。参见例如，于2017年9月1日提交的名称为4′-phosphateanalogsandoligonucleotidescomprisingthesame的国际申请号pct/us2017/049909，其关于磷酸酯类似物的内容引入本文作为参考。

在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含在5’末端核苷酸处的4'-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯，其中所述氧甲基的氧原子与糖部分（例如，在其4'-碳处）或其类似物结合。在其它实施方案中，4'-磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中所述硫代甲基的硫原子或所述氨基甲基的氮原子与糖部分或其类似物的4'-碳键合。在某些实施方案中，4'-磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯。

在某些实施方案中，附着至寡核苷酸的磷酸酯类似物是甲氧基膦酸酯（mop）。在某些实施方案中，附着至寡核苷酸的磷酸酯类似物是5'单甲基保护的mop。在一些实施方案中，例如在引导（反义）链的第一个位置处可以使用包含磷酸酯类似物的下述尿苷核苷酸：

，

所述修饰的核苷酸称为[mephosphonate-4o-mu]或5'-甲氧基,膦酸酯-4'氧基-2'-o-甲基尿苷。

c.修饰的核苷酸间键合

在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代可以导致包含至少一个（例如，至少1、至少2、至少3或至少5个）修饰的核苷酸间键合的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的任何一种寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，本文公开的任何一种寡核苷酸的至少一个修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键合。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有在以下一个或多个之间的硫代磷酸酯键合：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21、以及反义链的位置21和22。在某些实施方案中，寡核苷酸具有在以下每一个之间的硫代磷酸酯键合：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21、以及反义链的位置21和22。

iii.靶向配体

在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸进行修饰，以促进特定组织、细胞或器官的靶向，例如促进寡核苷酸对肝的递送。在某些实施方案中，本文公开的寡核苷酸可以进行修饰，以促进寡核苷酸对肝脏的肝细胞的递送。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含与一个或多个靶向配体缀合的核苷酸。在某些实施方案中，靶向配体是一个或多个galnac部分。galnac是关于无唾液酸糖蛋白受体（asgpr）的高亲和力配体，其主要在肝细胞的窦状表面上表达，并且具有在循环糖蛋白的结合、内化和随后清除中的主要作用，所述循环糖蛋白含有末端半乳糖或n-乙酰半乳糖胺残基（无唾液酸糖蛋白）。在一些实施方案中，galnac部分与本公开内容的寡核苷酸的缀合用于将这些寡核苷酸靶向在这些肝细胞细胞上表达的asgpr。在一些实施方案中，本公开内容的寡核苷酸与单价galnac部分直接或间接缀合。在一些实施方案中，本公开内容的寡核苷酸与一个或多个二价galnac、三价galnac或四价galnac部分缀合。

在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含附着至胍核苷酸的单价galnac，称为[ademg-galnac]或2'-氨基二乙氧基甲醇-胍-galnac，如下所示：

。

在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含附着至腺嘌呤核苷酸的单价galnac，称为[adema-galnac]或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-galnac，如下所示：

。

在一些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自缀合至galnac部分。在一些实施方案中，茎环的环（l）的2至4个核苷酸各自缀合至分开的galnac。例如，寡核苷酸可以包含在有义链的3'端处的茎环，并且该环的所有四个核苷酸都可以个别地缀合至单价galnac部分。下文显示了关于环的此类缀合的实例，所述环包含5'至3'核苷酸序列gaaa（l=接头，x=杂原子）茎附着点。此类环可以存在于例如图1a中所示的分子的位置27-30处。在化学式中，是与寡核苷酸链的附着点。

。

适当的方法或化学（例如点击化学）可以用于将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，接头是不稳定的接头。然而，在其它实施方案中，接头是更稳定的。在一些实施方案中，使用点击接头将靶向配体缀合至核苷酸。在一些实施方案中，基于缩醛的接头用于将靶向配体缀合至本文所述的寡核苷酸的核苷酸。基于缩醛的接头例如公开于国际专利申请公开号wo2016100401a1中，所述国际专利申请公开于2016年6月23日公开，并且其关于此类接头的内容引入本文作为参考。

下文显示了关于包含5'至3'核苷酸gaaa的环的实例，其中galnac部分使用缩醛接头附着至环的核苷酸。此类环可以存在于例如图1a中所示的分子的位置27-30处。在化学式中，是与寡核苷酸链的附着点。

iii.制剂

本文提供了制剂以促进寡核苷酸使用。例如，本文提供了包含用于降低ldha表达的寡核苷酸的组合物。可以适当地配制此类组合物，使得当施用于受试者时，进入靶细胞的直接环境内或全身性地，足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低ldha表达。在一些实施方案中，如本文公开的，寡核苷酸制剂可以用于递送寡核苷酸，用于ldha的降低。在一些实施方案中，如本文公开的制剂包含赋形剂。

在一些实施方案中，将药物组合物配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括但不限于皮下、皮内、经粘膜、静脉内和直肠施用。

iv.使用方法

i.降低细胞中的ldha表达

在一些实施方案中，提供了用于将有效量的本文公开的任何一种寡核苷酸递送至细胞的方法，用于降低细胞中的ldha表达的目的。本文提供的方法可用于任何适当的细胞类型。在一些实施方案中，细胞是表达ldha的任何细胞。在一些实施方案中，寡核苷酸递送至其的细胞是离体的或体外的（即，可以递送至培养中的细胞或细胞位于其中的生物）。在特定实施方案中，提供了用于将有效量的本文公开的任何一种寡核苷酸递送至细胞的方法，用于降低肝细胞中的ldha表达的目的。

可以通过评估细胞或受试者的一种或多种特性的适当测定、或通过评估指示ldha表达的分子（例如rna、蛋白质、酶活性、代谢产物水平、草酸盐水平等）的生物化学技术，来确认抑制的后果。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸降低ldha表达水平的程度通过比较表达水平（例如ldha的mrna或蛋白质水平与适当的对照（例如寡核苷酸未递送至其或阴性对照已递送至其的细胞或细胞群体中的ldha表达水平）来评估。在一些实施方案中，ldha表达的适当对照水平可以是预定水平或值，使得无需每次测量对照水平。预定水平或值可以采取各种形式，在一些实施方案中，预定水平或值可以是单个截断值，例如中值或平均值。

在一些实施方案中，如本文所述的寡核苷酸的施用导致细胞中的ldha表达水平的降低。在一些实施方案中，ldha表达水平的降低可以是与ldha的适当对照水平相比，降低至1%或更低、5%或更低、10%或更低、15%或更低、20%或更低、25%或更低、30%或更低、35%或更低、40%或更低、45%或更低、50%或更低、55%或更低、60%或更低、70%或更低、80%或更低、或者90%或更低。适当的对照水平可以是未与如本文所述的寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的ldha表达水平。在一些实施方案中，在有限的时间段后，评价根据本文公开的方法将寡核苷酸递送至细胞的效应。例如，可以在将寡核苷酸引入细胞后的至少8小时、12小时、18小时、24小时；或至少一、二、三、四、五、六、七、十四、二十一、二十八、三十五或更多天，分析细胞中的ldha水平。

ii.治疗方法

在一些实施方案中，本文公开的rnai寡核苷酸可用于降低受试者，例如患有原发性高草酸尿症的患者中的肝草酸盐产生。在一些实施方案中，本文公开的rnai寡核苷酸可用于降低尿草酸盐水平。在一些实施方案中，本文公开的rnai寡核苷酸可用于治疗原发性高草酸尿症，包括ph1、ph2和/或ph3，以及特发性高草酸尿症。相应地，本公开内容的方面涉及在草酸盐累积的治疗中用于降低ldha表达的方法。在一些方面，提供了用于治疗原发性高草酸尿症，包括ph1、ph2和/或ph3，以及特发性高草酸尿症的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括向有此需要的受试者施用有效量的本文公开的任何一种寡核苷酸。此类处理可以用于例如减弱或停止草酸盐累积。本公开内容提供了治疗处于（或易感）与草酸盐累积有关的疾病或病症的危险中的受试者的预防方法和治疗方法两者。

在一些实施方案中，待治疗的受试者是将在治疗上获益于例如肝中的草酸盐累积降低的受试者。在一些实施方案中，待治疗的受试者是患有或怀疑患有病况的受试者，所述病况导致草酸盐累积、肾疾病或原发性高草酸尿症（包括ph1、ph2和/或ph3）、以及特发性高草酸尿症。

本文所述的方法通常涉及向受试者施用有效量的寡核苷酸，即能够产生期望的治疗结果的量。治疗上可接受的量可以是能够治疗疾病或病症的量。用于任何一个受试者的适当剂量取决于某些因素，包括受试者的大小、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、一般健康、以及同时施用的其它药物。通常，本文公开的寡核苷酸静脉内或皮下施用。

作为一组非限制性实例，本公开内容的寡核苷酸通常将每季度（每三个月一次）、每两个月（每两个月一次）、每月或每周施用一次。例如，寡核苷酸可以每一周、两周或三周施用一次。在一些实施方案中，寡核苷酸可以每月施用一次。

在一些实施方案中，待治疗的受试者是人。在一些实施方案中，待治疗的受试者是非人灵长类动物或其它哺乳动物受试者（例如，小鼠或大鼠）。在一些实施方案中，待治疗的受试者是被改造成表达人ldha转录物（例如，来自aav递送的表达载体）的非人灵长类动物或其它哺乳动物受试者。

实施例

实施例1：可用于ldha的特异性敲减的特异性rnai寡核苷酸

评估具有序列ucagauaaaaaggacaacaugg（seqidno：1）的反义链、以及序列auguuguccuuuuuaucugagcagccgaaaggcugc（seqidno：2）的有义链的rnai寡核苷酸敲减ldhamrna表达的能力。在rnai寡核苷酸中，下述位置用2'-o-甲基（显示为2'-ome）进行修饰：有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-26和31-36，以及反义链的位置1、6、8、11-13、15、17和19-22。下述位置用2'-氟（显示为2'-f）进行修饰：有义链的位置3、5、8-11、13、15或17，以及反义链的位置2-5、7、9、10、14、16和18。rnai寡核苷酸具有在以下每一个之间的硫代磷酸酯键合：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21、以及反义链的位置21和22。图1b是图1a中所示的过客（有义）链的位置27-30的化学结构的表示，并且图1c是在同一分子中的引导（反义）链的位置1处显示的修饰尿苷的化学结构的表示。图3是rnai寡核苷酸的化学结构。具有这种化学结构的rnai寡核苷酸已被称为ldha-1。将galnac糖缀合至在有义链上包含位置27至30的核苷酸。使用人ldhaaav小鼠模型，在体内评估了健康雌性小鼠的肝中通过ldha-1的ldhamrna敲减的剂量应答和持续时间。人ldhamrna通过aav9病毒转导在甲状腺激素结合球蛋白启动子的控制下表达。为了建立小鼠模型，4-6周龄的雌性cd-1小鼠用控制滴度的aav9病毒进行静脉内（iv）给药，以生成稳定的人ldhamrna表达。图2a是显示了这种评估的时间线的示意图。如所示的，aav注射（剂量为100µl中的7.5x10¹¹个基因组拷贝）在第-1周时发生，并且一周后以0.5mg/kg（n=20只小鼠）、1mg/kg（n=30只小鼠）、3mg/kg（n=30只小鼠）或6mg/kg（n=30只小鼠）皮下注射单个剂量的ldha-1。在1、2、4、6、8和10周时，收集4mm肝活组织检查穿孔器，并且在模块和rnalater（thermofisherscientific）中速冻，用于mrna敲减分析。

图2b是证实了图2a中描述的研究结果的子集的图。关于1、3或6mg/kg剂量，以剂量后周数显示了剩余的hldhamrna百分比。这些结果针对时间匹配的pbs（n=40只小鼠）进行标准化。结果显示了，在表达人ldha的健康小鼠中，在1、3或6mg/kgldha-1的单个sc剂量后，实现异位表达的ldhamrna的快速而持久的敲减。

与剂量后一周的pbs对照相比，6mg/kgldha-1的单个sc剂量使肝脏中的人ldhamrna表达降低了90%（p≤0.05）。人ldhamrna的剂量依赖性降低在单个剂量后持续4周。ldha表达在单个剂量后6周恢复。

与剂量后一周的pbs对照相比，3mg/kgldha-1的单个sc剂量使肝脏中的人ldhamrna表达降低了63%。人ldhamrna敲减的程度对于单个剂量后4周保持恒定，伴随单个剂量后6周基线ldha表达的恢复。

与剂量后一周的pbs对照相比，1mg/kgldha-1的单个sc剂量使肝脏中的人ldhamrna表达降低了50%。人ldhamrna敲减的程度在剂量后4周维持在45%敲减。ldhamrna表达到单个剂量后6周恢复至基线。

用于实施例1的材料和方法

动物：雌性cd-1小鼠（出生日期8/9/2016，接受日期9/13/2016）购自charlesriverlaboratories（kingston，ny，品系代码022）。在开始给药前，允许小鼠适应至少3天。将小鼠保持在无特定病原体的饲养条件下，伴随对实验室食物和水的随意接近。

rnai寡核苷酸ldha-1：在无菌磷酸盐缓冲盐水（pbs）中的具有galnac功能性的化学合成的双链双链体rna寡核苷酸。将寡核苷酸贮存于-20℃下。在使用前，将寡核苷酸解冻并充分混合（轻轻涡旋），然后平衡至室温至少30分钟。

通过rt-qpcr的ldhamrna测量：使用tissuelyserii（qiagen，valencia，ca），将大约50mg样品在0.75ml基于苯酚/胍的qiazollysisreagent（qiagen，valencia，ca）中匀浆化。用1-溴-3-氯丙烷（sigma-aldrich，st.louis，mo）提取匀浆物。根据制造商的说明书，使用magmaxtechnology（thermofisherscientific，waltham，ma），从0.2ml水相中提取rna。使用分光光度法，在260和280nm处定量rna。来自integrateddnatechnologies（coralville，ia）的rt-qpcr测定、以及来自thermofisherscientific（waltham，ma）和bioradlaboratories（hercules，ca）的试剂，用于测量ldhamrna水平，伴随针对aav9质粒水平的标准化。ldha-1处理组中的ldhamrna降低的程度计算为相对于同一天时pbs对照组的平均表达水平的表达百分比（针对通过dna的qpcr测定的aav9质粒拷贝数标准化），其中pbs对照组的ldhamrna表达设定为100%。使用graphpadprism生成图并且分析数据。执行了使用dunnett多重比较检验的单因素方差分析（anova），以相对于同一时间点的pbs对照组，比较ldha-1处理组中的ldhamrna水平（针对aav9拷贝数标准化）。

实施例2：在幼年和青年食蟹猴中的靶向ldha的ldha-1的毒性和毒代动力学研究

设计了5周重复剂量的皮下毒性和毒代动力学研究，以证实靶向ldha的寡核苷酸在幼年和青年食蟹猴中的效应，所述食蟹猴给予30、100或300mg/kg的实施例1中所述的ldha-1的两次皮下施用（也参见图3）。雄性和雌性的幼年和青年食蟹猴接受在第1天和第29天时的0（在1天时的无菌注射用水swfi，在第29天时的无菌盐水）、30、100或300mg/kgldha-1的皮下（sc）注射。在终末处死时（第31天）和恢复处死时（第57天）收集肝脏组织，用于通过rt-qpcr分析ldhamrna水平，通过蛋白质印迹分析来分析ldh蛋白水平，并且通过酶促测定分析ldh活性。

研究设计显示于表1中。在终末处死时（第31天）和恢复处死时（第57天）从食蟹猴中收集肝脏组织，并且在液氮中速冻用于蛋白质印迹和ldh活性测定、或在rnalater中温育并冷冻用于rt-qpcr分析。

在两个剂量的30、100或300mg/kgldha-1的施用后，猴ldhamrna表达、ldh蛋白浓度和ldh活性，在第31天时的终末处死时在所有剂量水平下都显著降低（p≤0.0001），不伴随明显的剂量应答。在第57天时的恢复处死时可见类似的发现（如所示的，p<0.0001、p≤0.001、p≤0.01，使用未配对t检验计算统计显著性）；没有观察到ldhamrna、ldh蛋白和ldh活性的敲减的恢复（图4）。如通过蛋白质印迹测量的，剂量对肝ldh蛋白水平的作用显示于图5中。在最终处死（第31天）和恢复处死（第57天）两者时，ldh蛋白水平在所有剂量水平下都显著降低。

结果显示，在第31天时，与对照相比，ldha-1展示在所有剂量水平下，在降低猴ldhamrna表达、ldh蛋白浓度和ldh活性方面的有力活性，不伴随明显的剂量应答。降低持续直到第57天，没有明显的靶敲减恢复。

表1.毒性和毒代动力学研究的研究设计

另外，在给予10、30、100或300mg/kg的实施例1中所述的ldha-1的十次sc施用的幼年和青年食蟹猴中，进行了靶向ldha的寡核苷酸的39周重复剂量的皮下毒性和毒代动力学研究，以评估ldhamrna水平的降低，并且定量掺入rna诱导沉默复合物（risc）内的ldha-1浓度。在研究第1、29、57、85、113、141、169、197、225和253天时，幼年猴接受0（盐水）、30、100或300mg/kgldha-1的皮下（sc）注射，而青年猴接受0（盐水）或300mg/kgldha-1的sc注射。在终末处死时（第255天，最后一个剂量后2天）和恢复处死时（第309天，最后一个剂量后8周）收集肝脏组织，用于通过rt-qpcr分析ldhamrna水平。在第255天收集的肝脏样品还用于定量掺入rna诱导沉默复合物（risc）内的ldha-1浓度，该浓度通过argonaute蛋白2（ago2）免疫沉淀，随后为茎-环（sl）-rt-qpcr进行测量。

在给药期结束时（第255天），ldha-1的有力药效活性是显而易见的。在所有剂量水平下，猴ldhamrna表达都是降低的（91.4%至86.1%的降低，p≤0.0001）。加载到risc复合物内的ldha-1浓度是剂量相关的，其中与30mg/kg（2.1ng/g）相比，在300mg/kg（5.6ng/g）的剂量水平下浓度明显更高（p≤0.05）。如通过ldhamrna表达的显著降低（92.0%至86.2%）所示，ldha-1的药效学效应在剂量后持续至少8周，其中未观察到恢复（图6）。在第309天的ldhamrna降低的测定被视为足以评价药效学恢复，因此没有评价在第309天加载到risc复合物内的ldha-1浓度。

在图7(关于每个剂量组的平均值±sd的图形表示)中报道了在研究第255天掺入risc中的ldha-1的定量。在第255天时，肝脏中risc掺入的ldha-1浓度随剂量增加而增加。与30mg/kg剂量相比，ldha-1浓度在300mg/kg剂量下显著增加（p<0.05）。在risc复合物中掺入的ldha-1浓度在以300mg/kg给药的幼年猴和青年猴之间是可比较的。

在给药期结束时（第255天），ldha-1的有力的药效学活性是显而易见的。与对照相比，猴ldhamrna表达在所有剂量水下都降低。相比之下，掺入risc复合物内的ldha-1浓度是剂量相关的，其中与30mg/kg相比，在300mg/kg的剂量水平下浓度明显更高。如通过ldhamrna中的降低测量的，ldha-1的药效学效应持续直到第309天（剂量后8周），其中没有显而易见的恢复。

用于实施例2的材料和方法

通过rt-qpcr的ldhamrna测量：使用tissuelyserii（qiagen，valencia，ca），将大约50mg的每种样品在0.75ml基于苯酚/胍的qiazollysisreagent（qiagen，valencia，ca）中匀浆化。用1-溴-3-氯丙烷（sigma-aldrich，st.louis，mo）提取匀浆物。根据制造商的说明书，使用magmaxtechnology（thermofisherscientific，waltham，ma），从0.2ml水相中提取rna。使用分光光度法，在260和280nm处定量rna。rt-qpcr测定以及来自thermofisherscientific（waltham，ma）的试剂，用于测量ldhamrna水平，伴随针对肽基脯氨酰顺反异构酶b（ppib）mrna水平的标准化。ldha-1处理组中的ldhamrna降低的程度计算为相对于同一天时对照组的平均表达水平的表达百分比（针对ppibmrna水平标准化），其中对照组中的ldhamrna表达设定为100%。

ldh蛋白质印迹：使用tissuelyserii（qiagen，valencia，ca）与t-pertissueproteinextractionreagent和蛋白酶抑制剂混合物（thermofisherscientific，waltham，ma），来制备组织裂解产物。通过bcaproteinassay（thermofisherscientific，waltham，ma）测量总蛋白质浓度，并且通过nupage4-12%bis-trissds-page（thermofisherscientific，waltham，ma）分辨相等的蛋白质浓度。使用iblotdryblottingsystem（thermofisherscientific，waltham，ma），将经过电泳的蛋白质转移到硝酸纤维素膜，并且用odysseyblockingbuffer（pbs）（li-corbiosciences，lincoln，ne）封闭。然后使膜与兔抗ldha抗体（cellsignalingtechnology，danvers，ma）和小鼠抗甘油醛3-磷酸脱氢酶抗体（abeam，cambridge，ma）一起温育。抗兔irdye680和抗小鼠irdye800二抗（li-corbiosciences，lincoln，ne）用于检测，并且使用odysseyinfraredimagingsystem（li-corbiosciences，lincoln，ne）测量信号强度。对于每个条带测量整合强度（信号量级及其分布区域的度量）。“平均背景或中值背景”方法用于校正噪声信号。ldha-1处理组中的ldh蛋白降低的程度计算为相对于同一天时对照组的平均表达水平的表达百分比（针对gapdh蛋白水平标准化），其中对照组中的ldh蛋白表达设定为100%。

ldh活性测定：根据制造商的说明书，使用lactatedehydrogenaseassaykit（abeam，inc.，cambridge，ma），就ldh活性评估在节段6.2.2中制备用于ldh蛋白质印迹的组织提取物的标准化的蛋白质浓度。简言之，将组织提取物在t-pertissueproteinextractionreagent中稀释至50μg/ml的浓度，然后通过将10μl样品加入40μlldhassaybuffer中，一式两份地5倍稀释到96孔板内。根据制造商的说明书，制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nadh）和ldh阳性对照的一系列标准溶液。将板混合，避光，并且在室温下温育30分钟。使用spectramaxms板阅读器（moleculardevices，sunnyvale，ca），在反应混合物添加后0和30分钟，测量在450纳米处的吸光度。ldha-1处理组中的ldh活性降低的程度计算为相对于同一天时对照组的平均活性水平的活性百分比，其中对照组中的ldh活性设定为100%。

使用s1-rt-qpcr测量ago2-相关的寡核苷酸：使用dynabeadsproteing，执行来自速冻的猴肝脏样品的ago2蛋白的免疫沉淀。在样品中的ago2蛋白分离后，基于研究的sl-rt-qpcr方法用于定量与ago2复合物相关的ldha-1浓度。为了控制免疫沉淀中的样品间变化性，将加载到ago2复合物内的mir-16（内源性微小rna）用作标准化剂。程序的细节呈现于附录10.2中。仅分析来自第255天的样品，以获得关于在高剂量下risc加载的ldha-1的剂量比例性的信息，在所述高剂量下，ldhamrna降低是饱和的。在第309天的ldhamrna降低的测定被视为足以评价药效学恢复。

数据分析：使用graphpadprism生成图并且分析数据。执行了使用dunnett多重比较检验的单因素anova，以比较ldha-1处理组与同一时间点的对照组的ldhamrna水平（针对ppibmrna水平标准化）、ldh蛋白水平（针对gapdh蛋白水平标准化）、以及ldh活性水平。具有多重比较的单因素anova用于比较risc中掺入的ldha-1浓度，其中α=0.05。对关于mir-16标准化的ldha-的各个动物数据执行rout离群值分析，并且鉴定1个离群值且从所有分析中排除。

实施例3：关于在原发性高草酸尿症的治疗中靶向ldha的rnai寡核苷酸在人中的研究的概念验证

这项研究的目的是评估单个递增剂量的实施例1的rnai寡核苷酸ldha-1在人中的安全性、耐受性、药代动力学和药效学。次要终点包括评估距离基线的24小时尿草酸盐排泄中的改变，定义为在筛选期间的两次24小时收集的平均值。该研究分成两组：

a组被设计为在英国的单个地点招募的25个正常健康志愿者（nhv）中的安慰剂对照的单盲1期研究。b组被设计为实施例1中所述的ldha-1寡核苷酸在16个ph患者中的标签公开的多中心研究，其中包括以1.5、3和6mg/kg给药的三个ph1患者队列，以及具有弹性给药的第四个仅ph2队列。b组患者正在欧盟（eu）的五个地点和美国的一个地点进行招募。

在第一个b组队列（1.5mg/kg）中，在rnai寡核苷酸的单次施用之后的初步结果显示，迄今为止，四个成年患者中的三个达到在第43天至第57天之间的接近正常的尿草酸盐浓度（≤60mmol/24小时）。其基线尿草酸盐水平为2.28mmol/24小时的第四个成人显示出明显的降低，其中在第71天后的观察显示关于该患者的显著降低（尿草酸盐（uox）<1.0mmol/24小时）。结果概括于图8a和8b中。

在第二个b组队列（3mg/kg）中，迄今为止，四个成年患者中的两个达到在第29天至第43天之间的正常尿草酸盐浓度（≤0.46mmol/24小时）。其它两个患者也均具有明显的草酸盐降低。该组中的一个患者具有升高的血浆草酸盐水平。然而，在用ldha-1治疗期间，血浆草酸盐降低至正常水平。结果概括于图8a和8b中。

在第四个b组队列中的一个患有ph2的成年患者在至少一个采样日（第57天）时，也经历了24小时尿草酸盐排泄中的明显降低（超过35%）。

进一步地，仅观察到三个轻度至中度的注射部位反应。所有这些都是短暂的（<72小时），且无需干预而消退。

总之，在8个评价的原发性高草酸尿症1型和2型（ph1和ph2）患者的大部分中，ldha-1的施用使尿草酸盐水平达到正常范围（定义为24小时排泄≤0.46mmol）、或接近正常范围（定义为24小时排泄≤0.6mmol）。所有评价的患者都经历了尿草酸盐中的明显和临床上显著的降低（定义为与基线相比的>30%降低）。评价的患者是关于其的数据直到第6周或第43天可获得的那些患者。所有评价的患者都是成年人，并且包括7个ph1患者和1个ph2患者。

上文这些数据构成了实施例1的rnai寡核苷酸ldha-1在人中的临床概念验证，并且还显示了ldha-1是安全和良好耐受的。结果证实了在单个剂量施用之后的效力和作用持续时间，并且与对受试者的每季度施用一次相一致且支持对受试者的每季度施用一次。

尿草酸盐降低的量级加上作用的持续时间，证实了乳糖酶脱氢酶的治疗靶向，所述酶涉及肝草酸盐生产中的最终步骤。基于这种作用机制，ldha-1可以用于治疗所有类型的原发性高草酸尿症。尿草酸盐中的明显降低确认了该平台可以有效地降低人中的靶基因表达，以及此类rnai治疗剂治疗多重形式的原发性高草酸尿症的用途。

用于实施例3的材料和方法

ldha-1分子结构（还参见实例1、图1a和图3）

药物开发

药物产品是用于sc施用的无菌液体药物产品，其由作为wfi（注射用水）中的溶液的ldha-1组成。基于ph、渗透压浓度（200-300mosm/kg）、粘度以及与施用途径的相容性，来选择使用的制剂（在wfi中在ph6.2-8.2下170mg/ml的ldha-1浓度）。

诊断和纳入/排除标准

a组的纳入标准：

1.受试者必须已理解了研究的全部性质和目的，包括可能的风险和副作用，并且愿意且能够遵守所有的研究程序和限制。

2.18至55岁之间（包括端点在内）的男性或女性受试者。

3.受试者必须具有19.0至32kg/m2（包括端点在内）的体重指数（bmi）。

4.不吸烟者，至少1个月无烟，并且愿意直到eos保持无烟。受试者还必须没有含尼古丁的产品（例如尼古丁贴片）。

5.受试者必须在其它方面是健康的。健康状态基于pi的意见通过以下进行定义：根据详细的医学和手术史，不存在任何临床上显著、活跃或慢性疾病的证据，全面体格检查，包括生命体征、12导联ecg、血液学、血液化学、血清学和尿分析。

6.受试者必须具有在正常范围内的血液学和临床化学测试以及尿分析，除非异常已由研究者或合格的指定人员分类为非临床上显著的（ncs）。肝脏评审测试（alt和ast）必须是正常的。对于肝脏评审结果可以进行一次再测试。

7.具有生育潜力的男性和女性以及男性受试者的女性伴侣，必须愿意从知情同意的日期直到imp的最后一个剂量后12周使用高度有效且认可的避孕方法。高度有效的避孕方法定义为满足下述中的至少一种：

a.严格禁欲：当这符合患者优选且习惯的生活方式时[周期性禁欲（例如安全期、排卵、症状体温、排卵后方法）和体外射精并非可接受的避孕方法]。

b.手术绝育（已经历下述外科手术之一：子宫切除术、双侧输卵管结扎、双侧卵巢切除术或双侧输卵管切除术），以及绝育后至少6周。

c.在筛选就诊之前至少1个月以稳定剂量的组合激素口服避孕药（雌激素和孕酮）、植入式或可注射避孕药加上屏障方法。只有当它与排卵抑制结合时，组合激素避孕才被视为高度有效的避孕方法。如果与排卵抑制结合，则仅孕酮激素避孕也被视为高度有效的避孕方法。

d.宫内节育器加避孕套。在筛选就诊之前至少1个月插入激素宫内节育器（iud）。

e.双重屏障方法[例如，避孕套和闭塞帽（隔膜帽或宫颈/拱形帽）伴随杀精子泡沫/凝胶/薄膜/乳膏/栓剂]。值得注意的是，女性安全套和男性安全套、或两个男性安全套，不应该一起使用，因为两者之间的摩擦可以导致任一产品失效。

f.在筛选就诊之前的切除输精管的伴侣（手术后至少6个月）。

8.绝经后女性：定义为在筛选之前12个月没有月经，以及在筛选就诊时的血清fsh>26iu/l。

9.对于女性：在筛选和第0天就诊时妊娠测试阴性。

b组-ph患者纳入标准

ph患者必须已满足所有下述标准，以对于参与本研究是合格的。

1.患者和/或如果患者是未成年人（根据当地法规，定义为<18岁或小于成年年龄的患者），则为患者的父母或监护人，

a.必须已理解了研究的全部性质和目的，包括可能的风险和副作用。

b.必须愿意且能够遵守所有的研究程序，包括24小时尿样品的收集。

c.必须已提供了知情同意书。青少年（根据当地法规，年龄12至<18岁，或大于12岁，但小于成年年龄）必须能够提供书面同意书用于参与。对于小于12岁的儿童，同意书将基于当地法规。

2.在获得知情同意书时至少6岁的男性或女性。

3.患者必须具有25kg的最低体重。

4.通过基因分型确认的记录的ph1或ph2诊断（历史上可用的基因型信息对于研究合格性是可接受的）。

5.在筛选期中进行的两次评价的至少一次时，24小时尿草酸盐排泄对于18岁及以上的患者≥0.7mmol，或对于小于18岁的患者≥0.7mmol/1.74m2体表面积（bsa），其中在两次草酸盐测量之间的变化小于30%。

6.使用成人（年龄≥18岁）中的肾病饮食修正（mdrd）公式、或6至<18岁的患者中的施瓦茨（schwartz）公式计算的针对1.73m2bsa标准化的egfr≥30ml/分钟。

7.男性、具有生育潜力的女性以及具有生育潜力的男性患者的女性伴侣，必须愿意从知情同意的日期直到imp的最后一个剂量后12周使用高度有效且认可的避孕方法。高度有效的避孕方法已定义为满足下述中的至少一种：

a.严格禁欲：当这符合患者优选且习惯的生活方式时[周期性禁欲（例如安全期、排卵、症状体温、排卵后方法）和体外射精并非可接受的避孕方法]。

b.手术绝育（已经历下述外科手术之一：子宫切除术、双侧输卵管结扎、双侧卵巢切除术或双侧输卵管切除术），以及绝育后至少6周。

c.在筛选就诊之前至少1个月以稳定剂量的组合激素口服避孕药（雌激素和孕酮）、植入式或可注射避孕药加上屏障方法。只有当它与排卵抑制结合时，组合激素避孕才被视为高度有效的避孕方法。如果与排卵抑制结合，则仅孕酮激素避孕也被视为高度有效的避孕方法。

d.宫内节育器加避孕套。在筛选就诊之前至少1个月插入激素iud。

e.双重屏障方法[例如，避孕套和闭塞帽（隔膜帽或宫颈/拱形帽）伴随杀精子泡沫/凝胶/薄膜/乳膏/栓剂]。值得注意的是，女性安全套和男性安全套、或两个男性安全套，不应该一起使用，因为两者之间的摩擦可以导致任一产品失效。

f.在筛选就诊之前的切除输精管的伴侣（手术后至少6个月）。

8.绝经后女性：定义为在筛选之前12个月没有月经，以及在筛选时的血清fsh>26iu/l。

9.对于wocp：在筛选和第0天时妊娠测试阴性。

10.在研究进入之前至少4周接受以稳定剂量的吡哆醇的ph1患者必须愿意在研究期间保持相同的稳定剂量。在ph2患者正在接受吡哆醇的极少数情况下，这应该在研究进入之前中断至少4周。

a组-nhv排除标准

符合下述标准中任一种的正常健康志愿者从本研究中排除：

1.存在干扰研究依从性或数据解释或潜在地影响受试者安全的任何医学病况或共病，包括但不限于：

a.严重的并发病

b.在给药之前30天内和直到eos就诊的常规疫苗接种

c.活动性肝病/损伤或转氨酶升高的已知原因（例如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病/脂肪性肝炎（nafld/nash））

d.关于过量饮酒的医生关注

e.每天多于3克扑热息痛的常规或长期使用。

2.肾结石史。

3.在本研究期间或在imp的最后一次给药后90天内，怀孕、哺乳或计划尝试怀孕的女性。

4.具有在本研究期间或在imp的最后一次给药后90天内，计划尝试怀孕的女性伴侣的男性。

5.在研究用药的第一个剂量前的90天内的任何研究试剂的使用。如果受试者已参与先前的sirna或抗体研究，则需要在本研究中的第一个施用剂量前至少6个月的清除期。

6.在剂量施用之前的48小时（2天）内和直至eos就诊或第29天，剧烈运动、日光浴和接触运动。

7.在临床研究中心中的给药之前的90天内多于450ml的血液捐献史，或在接受imp后少于30天的计划捐献。

8.在给药的7天内和整个研究中的血浆或血小板捐献。

9.如由研究者测定的，每周在男性中超过多于21单位、在女性中超过多于14单位的饮酒史。在进入临床设施之前48小时且直至研究结束时，禁止饮酒。

10.对于乙型肝炎表面抗原（hbsag）、抗丙型肝炎病毒（hcv）抗体、或抗人免疫缺陷病毒（hiv）1和2抗体的阳性筛选测试。如果受试者在过去3个月中已进行测试，则可以使用历史数据。

11.对基于寡核苷酸的疗法的一种或多种下述反应史

a.重度血小板减少症

b.肝毒性

c.导致疗法中断的重度流感样症状

d.导致疗法中断的由于注射的局限性皮肤反应（3级或更高）

e.凝血病/临床上重要的凝血时间延长。

其它限制：

所有常规的非局部用药和非常规用药（包括非处方用药、健康补充剂和草药例如圣约翰草提取物的长期给药），都必须在进入临床研究中心之前至少14天直到且包括eos就诊停止。扑热息痛（对乙酰氨基酚）是例外，其被允许直到进入临床研究中心。然而，nsaid例如布洛芬、阿司匹林、萘普生等必须在进入临床研究中心之前至少14天停止。在研究参与期间（即，在筛选和eos就诊之间），受试者不应该从事激烈运动。在研究自始至终，要求受试者避免富含草酸盐的食物，并且摄入适量的蛋白质和钙，不超过国家饮食指南。必须避免蛋白质奶昔（proteinshake）。

b组–ph患者排除标准

符合下述标准中任一种的ph患者从本研究中排除：

1.先前的肾和/或肝移植。

2.当前正在接受透析。

3.全身性草酸盐沉积症的临床表现的记录证据。

4.在入选前4个月内参与任何临床研究，在其中他们接受了研究医学产品。对于具有还原uox和/或血浆草酸盐潜力的imp，这些浓度必须已恢复到历史基线水平。

a.如果患者参与本研究中的早期队列，则必须在重新入选之前过去最少8周，并且尿草酸盐排泄必须已恢复到基线的≥80%。

5.存在干扰研究依从性或数据解释或潜在地影响患者安全的任何医学病况或共病，包括但不限于：

a.严重的并发病

b.在给药之前30天内和直到eos就诊的常规疫苗接种

c.活动性肝病/损伤或转氨酶升高的已知原因（例如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病/脂肪性肝炎（nafld/nash）

d.关于过量饮酒的医生关注

e.每天多于3克对乙酰氨基酚的常规或长期使用。

6.如由研究者测定的，每周在男性中超过多于21单位、在女性中超过多于14单位的饮酒史。

7.在本研究期间或在imp的最后一次给药后90天内，怀孕、哺乳或计划尝试怀孕的女性。

8.肝功能测试（lft）异常：关于年龄和性别，alt和/或ast>1.5倍的uln。

9.对基于寡核苷酸的疗法的一种或多种下述反应史

a.重度血小板减少症

b.肝毒性

c.导致疗法中断的重度流感样症状

d.导致疗法中断的由于注射的局限性皮肤反应（3级或更高）

e.凝血病/临床上重要的凝血时间延长。

其它限制：

患者还应该已避免在24小时尿样本收集前24小时内和在24小时尿样本收集期间，以及在pd血液收集前24小时内服用维生素c补充剂。在研究参与期间（即，在筛选和eos就诊之间），患者不应该从事激烈运动。在研究自始至终，患者应该已被要求避免富含草酸盐的食物，并且摄入适量的蛋白质和钙，不超过国家饮食指南。必须避免蛋白质奶昔。

尿草酸盐（uox）水平的测量

从患者获得24小时尿样品，并且将等分试样酸化，以改善草酸盐的溶解度。一般地，草酸盐是不溶性的，并且形成在酸性条件下可以溶解的晶体。然后使溶解的uox经受hplc分析，以测定其水平。

本文说明性描述的公开内容可以适当地在不存在本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下进行实践。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一种都可以替换为另外两个术语中的任一。已采用的术语和表达用作描述性术语，而不是限制性术语，并且在此类术语和表达的使用中，并不预期排除所显示和描述的特点或其一部分的任何等价物，而是应认识到，各种修改在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已通过优选实施方案具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的任选特点、修改和变化，并且此类修改和变化被视为在如由描述和所附权利要求限定的本发明的范围内。

另外，在根据马库什组或其它替代分组来描述本发明的特点或方面时，本领域技术人员将认识到，由此还根据马库什组或其它组的任何个别成员或成员的子组来描述本发明。

在描述本发明的上下文中（尤其是在随附权利要求的上下文中），除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则术语“a”和“an”和“the”和类似对象的使用应解释为覆盖单数和复数两者。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语（即，意指“包括但不限于”）。除非本文另有说明，否则在本文中值范围的叙述仅仅预期充当个别地提及落入该范围内的每个分开值的简写方法，并且每个分开值均引入说明书内，如同它在本文中个别地叙述一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任何合适的次序执行。除非另有要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言（如，“例如”）的使用，仅仅预期更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围造成限制。说明书中的任何语言都不应该被解释为指示任何未请求保护的要素对于本发明的实践是必要的。

本文描述了本发明的实施方案，包括本发明人已知的用于进行本发明的最佳模式。在阅读前文的描述后，那些实施方案的变化对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。

本发明人期望熟练的技术人员适当地采用此类变化，并且本发明人预期本发明以不同于如本文具体描述的方式进行实践。相应地，本发明包括如由适用法律所允许的对其附加的权利要求中所述主题的所有修改和等价物。此外，除非本文另有说明或与上下文另外明显矛盾，否则上述要素以其所有可能变化的任何组合都由本发明涵盖。使用不超过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。此类等同方案预期由随附权利要求涵盖。