使用羊毛硫氨酸C样蛋白2配体和用其制备的细胞的疗法的制作方法
本发明涉及疾病和病症的医学治疗领域。更具体地，本发明涉及生物活性化合物和用其制备的细胞的类别，所述生物活性化合物和所述细胞可以用于治疗和预防如感染性疾病、过度增殖性病症、先天性代谢缺陷、慢性免疫代谢性疾病、自身免疫疾病、器官移植排斥、炎性病症和慢性疼痛等的病状。
背景技术：
羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白2(lancl2)(也称“羊毛硫氨酸c样蛋白2”或“羊毛硫氨酸合成酶组分c样蛋白2”)是在整个身体并且特别在gi道以及免疫系统、神经系统和内分泌系统的细胞内表达的信号传导蛋白。lancl2的活化有助于改变细胞的代谢过程，并且减少如细胞因子和趋化因子等炎症介质的产生，同时增加抗炎细胞因子。先前，已经在体外系统和体内系统中检查了这些效果，探索了从糖尿病模型中的葡萄糖耐量到炎性肠病模型中的肠道炎症减轻的影响。
细胞代谢对免疫细胞分化成炎性亚群、增殖和产生炎性细胞因子和介质的能力加以控制(o'neill,l.a.,r.j.kishton和j.rathmell,免疫学家免疫测量指南.《自然·综述：免疫学(natrevimmunol)》,2016.16(9):第553-65页)。靶向免疫和代谢两者的治疗在如癌症等疾病的临床试验中取得了成功(mullard,a.,癌症代谢管道开辟新领域.《自然·综述：药物发现(natrevdrugdiscov)》,2016.15(11):第735-737页)。在发现lancl2在炎症中的作用之前，首先示出lancl2的活化(bt-11背后的作用机制)在非免疫细胞中发挥代谢作用，其用作天然和膳食化合物aba的受体(sturla,l.,等人,lancl2对人粒细胞和大鼠胰岛素瘤细胞中脱落酸结合和信号传导是必需的.《生物化学期刊(jbiolchem)》,2009.284(41):第28045-57页)，以及用作用于产生代谢激素的信号转导子(lu,p.,等人,靶向羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白2的新型类别的抗炎药物的基于计算建模的发现.《公共科学图书馆综合(plosone)》,2012.7(4):第e34643页)。lancl2代谢作用与免疫作用的结合是bt-11和靶向lancl2的其它新型化合物的关键作用机制。
本发明提供了一系列类别的化合物的使用，所述化合物被鉴定为靶向、结合和活化lancl2，以在各种细胞中引发有益的免疫代谢反应，以治疗疾病状况，包含但不限于感染性疾病、过度增殖性病症、先天性代谢缺陷、慢性免疫代谢疾病、自身免疫疾病、器官移植排斥、炎性病症和慢性疼痛等。
技术实现要素：
本发明涉及疾病和病症的医学治疗领域。更具体地说，本发明涉及用于活化用于治疗感染性疾病、过度增殖性病症、先天性代谢缺陷、慢性免疫代谢性疾病、自身免疫疾病、器官移植排斥、炎性病症和慢性疼痛等的细胞中的有益免疫代谢性效果的化合物类别的用途。
用于本文所描述的治疗的化合物包含式z-y-q-y'-z'的化合物或其药学上可接受的盐或酯，其中：
z是：
y是：
q是哌嗪-1,4-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷-2,5-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2,5-二基；1,4-二氮杂环庚烷-1,4-二基；苯-1,4-二胺-n1,n4-二基；乙烷-1,2-二胺-n1,n2-二基；n1,n2-二烷基乙烷-1,2-二胺-n1,n2-二基；丙烷-1,3-二胺-n1,n3-二基；n1,n3-二烷基丙烷-1,3-二胺-n1,n3-二基；1,4-二氨蒽-9,10-二酮-1,4-二基；c6芳烃-1,4-二胺-n1,n4-二基，其中所述芳烃在2、3、5或6位被一到四个取代基取代，并且其中所述取代基独立地选自由以下组成的组：-c(o)o(c1到c6)烷基、oh、o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、cf3、f、cl和br；或者经过取代的哌嗪-1,4-二基，其中所述哌嗪在2、3、5或6位被一到八个取代基取代，并且其中所述取代基独立地选自由以下组成的组：(c1到c6)烷基、芳基、芳基(c1到c6)烷基、c(o)oh和c(o)o(c1到c6)烷基；
y'是：
或单键；并且
z'是：
或r5；
其中：
只有当z'是r5时，y'才是单键；
如果存在的话，则a1和a1'各自独立地是n、n(c1到c6)烷基、o、s或cr6；
如果存在的话，则a2和a2'各自独立地是n或cr7；
如果存在的话，则a3和a3'各自独立地是nr8、o或s；
如果存在的话，则a4和a4'各自独立地是n或cr9；
如果存在的话，则a5和a5'各自独立地是n或cr10；
如果存在的话，则a6和a6'各自独立地是n或cr11；
如果存在的话，则r1、r1'、r2、r2'、r3、r3'、r4、r4'、r5、r6、r7、r8、r9、r10和r11在每个实例中独立地选自由以下组成的组：氢；烷基；卤代；三氟甲基；二烷基氨基，其中每个烷基被独立地选择；-nh2；烷基氨基；芳基烷基；杂芳基烷基；杂环烷基；经过取代的杂环烷基，所述经过取代的杂环烷基被独立地选自由以下组成的组的1到2个取代基取代：-c(o)oh、-c(o)o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、-cf3、f、cl和br；以及经过取代的杂芳基烷基；
其中所述经过取代的杂芳基烷基被独立地选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：-nh2；-nh(c1到c6)烷基；-n((c1到c6)烷基)2，其中每个烷基被独立地选择；烷基；卤代；芳基；经过取代的芳基，所述经过取代的芳基被独立选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：-so2r12、-or13、-卤代、-cn、-cf3、氨烷基-、-s(o)r14和烷基；杂环烷基；杂芳基；经过取代的芳基，所述经过取代的芳基被独立选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：烷基、-cf3、f、cl和br；烷基氨基-；杂环烷基-烷基-氨基-；烷基氨基烷基氨基-；-nhc(o)or15；-nhc(o)nr16r17；-c(o)nr16r17；以及经过取代的杂芳基，所述经过取代的杂芳基被选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：烷基卤代、cn、nh2、-nh(c1-c6烷基)、-n(c1-c6烷基)2，其中每个烷基被独立地选择、-cf3以及经过取代的芳基，所述经过取代的芳基被独立地选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：-s(o)2r15和-cn；
其中r12、r13、r14、r15、r16和r17各自独立地选自由以下组成的组：c1-c6烷基；二烷基氨基，所述二烷基氨基包括独立选择的c1-c6烷基；-nh2；烷基氨基；杂环烷基以及经过取代的杂环烷基，所述经过取代的杂环烷基被独立地选自由-c(o)o(c1-c6烷基)和-c1-c6烷基组成的组的一到两个取代基取代。
在一些化合物中，a4是n。在一些化合物中，a3是nr8并且a4是n。在一些化合物中，a3和a3'中的至少一个是o或s。在一些化合物中，a1和a1'中的一个或两个是n。在一些化合物中，如果存在的话，则a5和a5'各自独立地是cr10，并且如果存在的话，则a6和a6'各自独立地是cr11。在一些化合物中，a1、a2、a1'和a2'中的至少一个是n。在一些化合物中，a2和a2'中的一个或两个是ch，a3是nh，a4是n，a5是ch，并且a6是ch。在一些化合物中，a2和a2'中的一个或两个是ch，a3和a3'中的一个或两个是nh，a4和a4'中的一个或两个是n，a5和a5'中的一个或两个是ch，并且a6和a6'中的一个或两个是ch。在一些化合物中，q是哌嗪-1,4-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.1.]庚烷-2,5-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2,5-二基；1,4-二氮杂环庚烷-1,4-二基；n1,n2-二烷基乙烷-1,2-二胺-n1,n2-二基；n1,n3-二烷基丙烷-1,3-二胺-n1,n3-二基；1,4-二氨蒽-9,10-二酮-1,4-二基；c6芳烃-1,4-二胺-n1,n4-二基，其中所述芳烃在2、3、5或6位被一到四个取代基取代，并且每个取代基独立地选自由以下组成的组：-c(o)o(c1到c6)烷基、oh、o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、cf3、f、cl和br；或者经过取代的哌嗪-1,4-二基，其中所述哌嗪在2、3、5或6位被一到八个取代基取代，并且每个取代基独立地选自由以下组成的组：(c1到c6)烷基、芳基、芳基(c1到c6)烷基、c(o)oh和c(o)o(c1到c6)烷基。在一些化合物中，如果存在的话，则r1、r1'、r2、r2'、r3、r3'、r4、r4'、r5、r6、r7、r8、r9、r10和r11在每个实例中独立地选自由以下组成的组：氢；烷基；卤代；三氟甲基；二烷基氨基，其中每个烷基相同或不同；-nh2；烷基氨基；芳基以及芳基烷基。
适用于本文所描述的处理的其它化合物包含包括式a-b-c的化合物或其药学上可接受的盐或酯，其中：
a是：
b是：
c是：
其中：
a7、a8、a9、a10、a11、a12、a13和a14各自独立地选自ch、cr18和n；
a15、a16、a17、a18、a19和a20各自独立地选自ch、cr19、n、nr20、o和s，条件是a15、a16和a17中的仅一个可以是n、nr20、o或s，并且a18、a19和a20中的仅一个可以是n、nr20、o或s；
r18和r19各自独立地选自c1-c6烷基；c1-c6二烷基氨基，其中每个c1-c6烷基被独立地选择；-nh2；烷基氨基；杂环烷基；以及经过取代的杂环烷基，其中所述经过取代的杂环烷基被独立地选自由以下组成的组的一到两个取代基取代：-c(o)o(c1-c6烷基)和c1-c6烷基；其中在具有多于一个cr18的化合物中，每个r18被独立地选择，并且在具有多于一个cr19的化合物中，每个r19被独立地选择；并且
r20是c1-c6烷基。
适用于本文所描述的治疗的其它化合物包含美国专利9,556,146中公开的任何式中公开或由其涵盖的任何化合物。美国专利9,556,146通过引用以其整体并入本文。
本发明提供了用本文所描述的化合物中的任何一种或多种化合物处理动物的病状的方法。所述方法可以包括向动物施用有效量的本文所描述的化合物中的一种或多种化合物。
本发明还提供了用本文所描述的化合物由前体细胞产生制备细胞的方法。所述方法可以包括使所述前体细胞与本文所描述的所述化合物中的一种或多种化合物在体外接触以产生所述制备细胞。
本发明还提供了分离细胞，所述分离细胞是通过使前体细胞与本文所描述的所述化合物中的一种或多种化合物体外接触以产生所述制备细胞而产生的。
本发明还提供了用如本文所描述的制备细胞处理动物的病状的方法。所述方法包括以足以处理所述病状的量向所述动物施用所述制备细胞。
可用本文所描述的所述化合物或细胞处理的所述病状可以包含感染性疾病、过度增殖性病症、先天性代谢缺陷、慢性免疫代谢性疾病、自身免疫疾病、器官移植排斥、炎性病症和慢性疼痛。在一些版本中，感染性疾病包括细菌性疾病。在一些版本中，细菌性疾病包括艰难梭菌感染(c.difficileinfection)。在一些版本中，过度增殖性病症包括癌症。在一些版本中，癌症包括胃肠道癌症。在一些版本中，胃肠道癌症包括结直肠癌。在一些版本中，过度增殖性病症包括家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatouspolyposis)。在一些版本中，先天性代谢缺陷包括糖原贮积病。在一些版本中，糖原贮积病包括安德森氏病(andersendisease)。在一些版本中，慢性免疫代谢性疾病包括心血管疾病。在一些版本中，心血管疾病包括动脉粥样硬化。在一些版本中，慢性免疫代谢性疾病包括高血压。在一些版本中，自身免疫包括狼疮和多发性硬化中的至少一种。在一些版本中，自身免疫疾病包括癌症免疫疗法诱导的自身免疫疾病。在一些版本中，癌症免疫疗法诱导的自身免疫疾病包括癌症免疫疗法诱导的风湿性疾病。在一些版本中，炎性病症包括急性结肠憩室炎。在一些版本中，炎性病症包括辐射诱导的胃肠道炎症。在一些版本中，辐射诱导的胃肠道炎症包括放射性直肠炎、放射性肠炎和放射性直肠乙状结肠炎(radiationproctosigmoiditis)中的至少一种。在一些版本中，慢性疼痛包括纤维肌痛。在一些版本中，病状包括炎性肠病，如克罗恩氏病(crohn'sdisease)或溃疡性结肠炎。
本发明的目的和优点将通过本发明的优选实施例的结合附图做出的以下详细说明而变得更加充分明显。
附图说明
图1a-1f。bt-11抑制了mdr1a-/-结肠炎模型的疾病发展。bt-11减少了疾病活动指数(图1a，小图a)。在用媒剂处理的动物(图1a，小图b)和用bt-11处理的动物(图1a，小图c)中，十周龄时的经h&e染色的结肠切片的代表性显微照片。在十周龄时，在结肠黏膜固有层(图1b，小图d-f)和肠系膜淋巴结(图1c，小图g-i)中，分别对th1(cd3+cd4+cd8-nk1.1-tbet+ifnγ+)细胞、th17(cd3+cd4+cd8-nk1.1-rorγt+il17+)细胞和treg(cd3+cd4+cd25+foxp3+il10+)细胞进行免疫分型。ifnγ(图1d，小图j)、il17a(图1d，小图k)、mcp1(图1e，小图l)、tnfa(图1e，小图m)、lancl2(图1f，小图n)和il6(图1f，小图o)的全结肠的qrt-pcr归一化为β-肌动蛋白。处理组(n＝10)的统计显著性由*(p<0.05)和**(p<0.01)标记。
图2a-2c。cd4+t细胞中lancl2的损失消除了dss模型中的bt-11效应。在用dss激发七天，再用标准水激发三天后的疾病活动(图2a，小图a)和体重变化(图2a，小图b)。在用媒剂和bt-11处理的野生型小鼠以及在用媒剂和bt-11处理的lancl2δt小鼠中，dss激发第七天时的经h&e染色的结肠切片的代表性显微照片(图2b，小图c)。在dss激发第7天时，在结肠黏膜固有层(图2c，小图d-f)中，分别对th1(cd3+cd4+cd8-nk1.1-tbet+ifnγ+)细胞、th17(cd3+cd4+cd8-nk1.1-rorγt+il17+)细胞和treg(cd3+cd4+cd25+foxp3+il10+)细胞进行免疫分型。ifnγ(图2c，小图g)、il17a(图2c，小图h)、tnfa(图2c，小图i)和il6(图2c，小图j)的全结肠的qrt-pcr归一化为β-肌动蛋白。处理组(n＝10)的统计显著性由*(p<0.05)和**(p<0.01)标记，并且基因型组(n＝10)的统计显著性由#(p<0.05)标记。
图3a-3c。bt-11通过调节性cd4+t细胞产生主要影响。从转移之日起到转移后6周，来自rag2-/-小鼠的疾病活动指数使与无调节性cd4+t细胞、wt调节性cd4+t细胞或lancl2-/-调节性cd4+t细胞组合的wt效应cd4+t细胞(图3a，小图a)和lancl2-/-效应cd4+t细胞(图3a，小图b)转移。组织病理学检查转移后六周时的结肠切片内白细胞浸润的汇总评分(图3b，小图c)。在结肠黏膜固有层(图3b，小图d-e；图3c，小图f-h)中，分别对th1细胞(cd3+cd4+cd8-nk1.1-tbet+ifnγ+)和嗜中性粒细胞(gr1hicd11b+)进行免疫分型。处理组(n＝10)的统计显著性由*(p<0.05)和**(p<0.01)标记。
图4。在体外分化的treg中，bt-11诱导增加的稳定性和抑制功能。通过cfse染色测量24小时细胞增殖(小图a)，并且通过与用bt-11(0μm、0.00975μm、0.039μm、0.625μm)处理的体外分化的treg共培养的cd4+t细胞的流式微珠阵列(cytometricbeadarray)测量tnfα(小图b)和ifnγ(小图c)的产生。用bt-11处理48小时后treg内socs2(小图d)、irf7(小图e)、ikzf2(小图f)、capn3(小图g)、lag3(小图h)、p2rx7(小图i)的基因表达。处理组(n＝9)的统计显著性由*(p<0.05)和**(p<0.01)标记。
图5a-5b。bt-11影响后期糖酵解以影响treg分化。在用bt-11(0μm、0.00975μm、0.039μm、0.625μm)处理的wttreg和lancl2-/-treg中pkm2(图5a，小图a)和eno1(图5a，小图b)的基因表达。在用bt-11(0μm、0.00975μm、0.039μm、0.156μm、0.625μm；从左到右)处理的wttreg中丙酮酸激酶(图5a，小图c)和丙酮酸脱氢酶(图5b，小图f)的酶活性。在用bt-11(0μm、0.00975μm、0.039μm、0.156μm、0.625μm；从左到右)处理的wttreg中的细胞内pep浓度(图5b，小图d)。用ps-48处理(0μm、0.00975μm、0.156μmbt-11；从左到右)的细胞内pep浓度(图5b，小图e)和丙酮酸脱氢酶活性(图5b，小图g)。在存在ps-48、毒胡萝卜素或dasa-58和bt-11(0μm、0.00975μm、0.039μm、0.156μm、0.625μm；从左到右)的情况下，wt和lancl2-/-cd4+t细胞分化成treg(图5b，小图h)。处理组(n＝9)的统计显著性由*(p<0.05)和**(p<0.01)标记。
图6a-6c。bt-11的免疫代谢性效果的体外验证。在分别用ps-48施用和没有ps-48施用的情况下，在用媒剂处理的小鼠(图6a，小图a、c)和用bt-11处理的小鼠(图6a，小图b、d)中，十周龄时的经h&e染色的结肠切片的代表性显微照片。十周龄时的结肠的组织学评分(图6b，小图e-g)。在十周龄时，在结肠固有层(图6b，小图h-j)中分别对总体cd4+细胞、treg(cd3+cd4+cd25+foxp3+il10+)细胞、th17(cd3+cd4+cd8-nk1.1-rorγt+il17+)细胞进行免疫分型。在十周龄时，全结肠内的pep浓度(图6c，小图k)和丙酮酸脱氢酶活性(图6c，小图l)。ifng(图6c，小图m)、tnfa(图6c，小图n)、foxp3-e2(图6c，小图o)、foxp3(图6c，小图p)、socs2(图6c，小图q)和capn3(图6c，小图r)的全结肠的qrt-pcr归一化为β-肌动蛋白。小图e-r的病状为(从左到右)媒剂、bt-11(8mg/kg)、具有ps-48的媒剂和具有ps-48的bt-11(8mg/kg)。处理组(n＝10)的统计显著性由*(p<0.05)和**(p<0.01)标记。
图7a-7e。bt-11的免疫代谢性效果的人pbmc验证。在用bt-11(0μm、0.00975μm、0.0195μm、0.039μm、0.156μm、0.625μm)培养24小时后来自克罗恩氏病供体的pbmc内的il10+(图7a，小图a)、foxp3+(图7a，小图b)、tnfα+(图7b，小图c)和ifnγ+(图7b，小图d)的细胞百分比。在用bt-11(0μm、0.00975μm、0.0195μm、0.039μm、0.156μm、0.625μm)培养24小时后在lancl2沉默内的il10+(图7c，小图e)和ifnγ+(图7c，小图f)的细胞百分比。在存在bt-11的情况下，在与分化成treg的人pbmc分离的原初cd4+t细胞内的lag3(图7d，小图g)、socs2(图7d，小图h)、irf7(图7d，小图i)、p2rx7(图7d，小图j)、capn3(图7d，小图k)、ikzf2(图7d，小图l)的基因表达。体外分化的人treg的丙酮酸激酶活性(图7e，小图m)。在用bt-11(0μm、0.00975μm、0.0195μm、0.039μm、0.156μm、0.625μm)培养24小时后并且在存在毒胡萝卜素或外部pep的情况下，foxp3+(图7e，小图n)和ifnγ+(图7e，小图o)的百分比。处理组(n＝9)的统计显著性由*(p<0.05)和**(p<0.01)标记。
图8。由作为lancl2配体的bt-11处理引起的艰难梭菌感染的小鼠和未感染的lancl2敲除小鼠的微生物组的变化。
图9。在对照物、经万古霉素处理和经bt-11处理的碎肉培养基中的艰难梭菌菌落形成单位、毒素a(tcda)和毒素b(tcdb)的产生以及孢子形成。
图10a-c。bt-11在减少艰难梭菌感染的炎症、死亡率和严重性方面的作用。
图11a-11b。il-2和bt-11增强cd25+foxp3+t细胞的分化。从野生型小鼠的脾中分离原初cd4+t细胞，并且在存在媒剂处理或bt-11(10nm、100nm)处理的情况下，所述原初cd4+t细胞分化成调节性cd4+t细胞。通过流式细胞术在含有il-2(10ng/ml)的标准分化培养基或分化培养基中分化成cd25+foxp3+(图11a，小图a)细胞和cd25+tbet+(图11b，小图b)细胞。通过流式细胞术在标准分化培养基或含有il-12(10ng/ml)的分化培养基中分化成cd25+foxp3+(图11a，小图c)细胞和cd25+tbet+(图11b，小图d)细胞。数据显示为sem(n＝8)的平均值。处理的统计显著性(p<0.05)由星号(*)表示，并且il-2/il-12存在的统计显著性由(#)表示。
图12a-12d。bt-11增加stat5磷酸化以建立稳定的cd25+细胞分化。在活动性疾病期间的10周龄时，通过从经媒剂和bt-11处理的mdr1a-/-小鼠中隔离的cd4+t细胞中的qrt-pcr而进行的stat5a(图12a，小图a)、pten(图12a，小图b)、foxo1(图12a，小图c)和phlpp1(图12a，小图d)的表达。在利用具有或不具有il-2(10ng/ml)或il-12(10ng/ml)的媒剂或bt-11(10、100nm)体外分化treg中通过蛋白印迹(westernblot)的p-stat5a(图12b，小图e)和p-foxo1(图12b，小图f)的归一化表达。通过流式细胞术在含有il-2(10ng/ml)或抑制剂sf1670或stat5i的分化培养基中分化成cd25+foxp3+(图12c，小图g)细胞和cd25+tbet+(图12c，小图h)细胞。通过流式细胞术在含有il-12(10ng/ml)或抑制剂sf1670或stat5i的分化培养基中分化成cd25+foxp3+(图12d，小图i)细胞和cd25+tbet+(图12d，小图j)细胞。数据显示为sem(n＝8)的平均值。处理的统计显著性(p<0.05)由星号(*)表示，并且抑制剂存在的统计显著性由(#)表示。
图13。调节性cd4+t细胞的离体处理刺激体内调节性作用的增加。小鼠是用bt-11或媒剂离体处理12小时的过继性转移的效应t细胞(teff)和调节性cd4+t细胞(treg)。接受bt-11处理的treg的小鼠在转移后五周时具有较低的累积疾病活动(肠道炎症)并且出现结肠cd4+t细胞群的转移。
具体实施方式
除非另有说明，否则术语“烷基”，其本身或作为另一个取代基的一部分，意指具有指定碳原子数目(例如，c1-c10包含性地意指一到十个碳原子)的完全饱和的直链或支链烃基或环状烃基，或其组合，并且可以含有二价基和多价基。烷基的实例包含但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、以及同系物和其异构体，例如正戊基、正己基、正庚基和正辛基等。除非另有说明，否则术语“烷基”还包含在下文中更详细地定义为“杂烷基”和“环烷基”的那些烷基衍生物。
术语“烯基”意指如上定义的烷基，除了其含有一个或多个双键之外。烯基的实例包含乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)等以及更高级的同系物和异构体。
术语“炔基”意指如上定义的烷基或炔基，除了其含有一个或多个三键之外。炔基的实例包含乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基等，包含更高级的同系物和异构体。
术语“亚烷基”、“亚烯基”和“亚炔基”，单独或作为另一个取代基的一部分，分别意指衍生自烷基、烯基或炔基的二价基，如-ch2ch2ch2ch2-例示的。
通常，烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基和亚炔基将具有1到24个碳原子。本发明中优选具有10个或更少的碳原子的那些基团。术语“低级”当应用于这些基团中的任何基团，如应用于“低级烷基”或“低级亚烷基”时，指定具有10个或更少碳原子的基团。
“经过取代的”是指如本文所描述的化学基团，其进一步包含一个或多个取代基，如低级烷基、芳基、酰基、卤素(例如，烷基卤如cf3)、羟基、氨基、烷氧基、烷基氨基、酰氨基、硫代氨基、酰氧基、芳氧基、芳氧基烷基、巯基、硫杂、氮杂、氧代、饱和环烃和不饱和环烃两者、杂环等。这些基团可以附接到烷基部分、烯基部分、炔基部分、亚烷基部分、亚烯基部分和亚炔基部分的任何碳或取代基。另外，这些基团可以从碳链本身垂悬，或者可以整合到碳链本身。
术语“芳基”在本文中用于指芳香族取代基，所述芳香族取代基可以是单个芳香族环或稠合在一起、共价连接或连接到如重氮、亚甲基或乙烯部分等常见基团的多个芳香族环。所述常见连接基团还可以是如在二苯酮中的羰基。所述一个或多个芳香族环可以包含例如苯基、萘基、联苯、二苯基甲基和二苯酮等。术语“芳基”涵盖“芳基烷基”和“经过取代的芳基”。对于苯基，芳基环可以是单取代的、二取代的、三取代的、四取代的或五取代的。较大的环可以是未取代的或携带一个或多个取代基。
“经过取代的芳基”是指如刚才所描述的包含一个或多个官能团，如低级烷基、酰基、卤素、烷基卤代(例如，cf3)、羟基、氨基、烷氧基、烷基氨基、酰氨基、酰氧基、苯氧基、硫醇以及饱和环烃和不饱和环烃两者，所述一个或多个官能团稠合到所述一个或多个芳香族环、共价连接或连接到如重氮、亚甲基或乙烯部分等常见基团。所述连接基团还可以是如在环己基苯基甲酮中的羰基。术语“经过取代的芳基”涵盖“经过取代的芳基烷基”。
术语“卤素”或“卤代”在本文中是指氟原子、溴原子、氯原子和碘原子。
术语“羟基”在本文中用于指基团-oh。
术语“氨基”用于指定nrr'，其中r和r'独立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基或其经过取代的类似物。“氨基”涵盖“烷基氨基”，其表示仲胺和叔胺，并且“烷基氨基”描述基团rc(o)nr'。
在本发明的方法的过程中，治疗有效量的本发明化合物可以以多种方式向包含哺乳动物和人的动物施用。虽然在优选实施例中，本发明的化合物是口服或胃肠外施用的，但还可以设想其它形式的(如通过医用化合物或气溶胶)施用。
对于口服施用，有效量的化合物可以以例如固态、半固态、液态或气态施用。具体实例包含片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂。然而，所述化合物并不限于这些形式。
为了将本发明的化合物调配成片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或悬浮剂，优选将化合物与粘合剂、崩解剂和/或润滑剂混合。如果需要，则可以使用已知方法将所产生的组合物与稀释剂、缓冲剂、渗透剂、防腐剂和/或香料混合。粘合剂的实例包含结晶纤维素、纤维素衍生物、玉米淀粉、环糊精和明胶。崩解剂的实例包含玉米淀粉、马铃薯淀粉和羧甲基纤维素钠。润滑剂的实例包含滑石和硬脂酸镁。进一步地，还可以使用已常规使用的添加剂，如乳糖和甘露醇。
本发明的化合物还可以经直肠施用。对于直肠施用，可以使用栓剂。所述栓剂可以通过将本发明的化合物与药学上合适的赋形剂混合来制备，所述赋形剂在体温下熔化但在室温下保持固体。实例包含但不限于可可脂、碳蜡和聚乙二醇。可以使用本领域已知的方法将所产生的组合物模制成任何期望的形式。
对于肠胃外施用，本发明的化合物可以通过注射施用。对于注射施用，本发明的化合物可以皮下注射、皮内注射、静脉内注射或肌肉内注射。可以通过将本发明的化合物溶解、悬浮或乳化到含水或非含水溶剂，如植物油、合成树脂酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中，通过已知方法制备此类注射的药物。如果期望，则还可以添加常规使用的添加剂，如增溶剂、渗透调节剂(osmoregulatingagent)、乳化剂、稳定剂或防腐剂。虽然不是必需的，但优选的是，所述组合物是无菌或灭菌的。
为了将本发明的化合物调配成悬浮液、糖浆或酏剂，可以使用药学上合适的溶剂。这些药剂中包含水的非限制性实例。
本发明的化合物还可以与具有其它药学上合适活性的另外的化合物一起使用，以制备药物。含有本发明化合物作为独立化合物或作为组合物的一部分的药物可以用于治疗有需要的受试者。
本发明的化合物还可以以气溶胶或吸入剂的形式施用，所述气溶胶或吸入剂是通过以液体或精细粉末的形式将化合物，连同气体或液体喷雾剂并且如果需要，已知的辅助剂(如发泡剂)装入非加压容器，如气溶胶容器或雾化器中而制备的。例如二氯氟甲烷、丙烷或氮的加压气体可以用作喷雾剂。
本发明的化合物可以作为药物组合物如片剂、胶囊、溶液或乳剂施用给有需要的动物，包含哺乳动物和人。本发明还设想以单剂量或多剂量施用本发明描述的化合物的其它形式，包含但不限于其酯、其药学上合适的盐、其代谢物、其结构相关的化合物、其类似物和其组合。
本文使用的术语“预防”、“处理”、“保护”或“改善”以及类似术语包含预防治疗和完全或部分治疗。术语还可以包含减轻症状、改善症状、降低症状的严重性、降低疾病的发生率、诱导缓解、维持缓解或患者病状中改善治疗结果的任何其它改变。
本发明所描述的新化合物优选地以组合物的形式使用和/或施用。合适的组合物优选是药物组合物、食品或食品补充剂。这些组合物提供了递送化合物的方便形式。本发明的组合物可以包括有效量的抗氧化剂，以提高化合物关于氧化或溶解度的稳定性。
在本发明的方法中施用或用于在本发明的使用中施用的化合物的量是任何合适的量。所述化合物的量优选地是约0.00001g到约20g(更优选地0.01g到1g，如0.05g到0.5g)化合物每天。因此可以调配合适的组合物。生物活性剂给药领域的技术人员将能够基于已知和众所周知的参数为各种受试者研发特定的给药方案。
根据本发明的优选组合物是如呈片剂、丸剂、胶囊、囊片、多颗粒(包含颗粒、头状物、小丸和微囊化颗粒)、粉末、酏剂、糖浆剂、悬浮剂、如炎症靶向水凝胶等水凝胶和溶液形式等的药物组合物。药物组合物通常将包括药学上可接受的稀释剂或载剂。药物组合物优选适于胃肠外或口服施用。可口服施用的组合物可以呈固体或液体形式并且除其它事项之外，还可以采取片剂、粉末、悬浮液和糖浆的形式。任选地，组合物包含一种或多种调味剂和/或着色剂。通常，治疗组合物和营养组合物可以包括不显著干扰化合物对受试者的作用的任何物质。
适用于在此类组合物中使用的药学上可接受的载剂在药学领域中是众所周知的。本发明的组合物可以含有0.01-99重量％的本发明化合物。本发明的组合物通常以单位剂型制备。优选地，本发明描述的化合物的单位剂量为1mg到1000mg(更优选地为50mg到500mg)。用于制备这些组合物的赋形剂是本领域已知的赋形剂。
组合物的产品形式的另外的实例是食品补充剂，如呈包括选自由以下组成的组的包封材料的软凝胶或硬胶囊形式：明胶、淀粉、变性淀粉、淀粉衍生物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖。包封材料可以任选地含有交联剂或聚合剂、稳定剂、抗氧化剂、用于保护光敏填料的光吸收剂、防腐剂等。优选地，食品补充剂中的化合物的单位剂量为1mg到1000mg(更优选地为50mg到500mg)。
通常，术语“载剂”可以在整个本申请中使用以表示所描述的化合物可以与其混合的组合物，不论所述组合物是药物载剂、食品、营养补充剂还是膳食助剂。出于本发明的目的，上述材料可以被视为载剂。在本发明的某些实施方案中，载剂对本发明的化合物几乎没有生物活性或没有生物活性。
剂量：本发明的方法可以包括向有需要的动物施用治疗有效量的化合物。化合物的有效量取决于施用的化合物的形式、施用持续时间、施用途径(例如，口服或肠胃外)、动物的年龄以及动物(包含哺乳动物和人)的病状。
例如，有效治疗或预防本文所述的动物病状的化合物的量的范围可以为0.1-10,000mg/kg/天。化合物的优选有效量为1mg/kg/天到5,000mg/kg/天，更优选的剂量为2mg/kg/天到100mg/kg/天。要施用的有效量的上限并不重要，因为如我们的毒理学数据证明，化合物是无毒的。当向动物施用范围在约7天到100天的周期，其中优选的周期是15天到50天，并且最优选的周期是30天到42天时，化合物的有效量是对治疗或预防本文描述的动物的病状最有效的。
对预防导致自身免疫、炎症或代谢疾病的免疫系统过度活化或失调最有效的化合物的量的范围可以在0.1mg/kg/天到500mg/kg/天的范围内，优选剂量为1mg/kg/天到150mg/kg/天。
当本发明化合物的有效量以治疗、医学或兽医组合物的形式施用时，药物产品的优选剂量的范围为约0.01％到2.0％wt/wt。
在某些其它实施例中，本发明提供了结合lancl2的化合物以及结构相关化合物，如选自由以下组成的组的化合物在治疗和预防免疫代谢性疾病方面的用途：化合物、其酯、其药学上合适的盐、其代谢物、其结构相关化合物或其组合。
另外，通常，本发明涉及在免疫代谢途径方面预防缺陷或恢复内稳态，所述免疫代谢途径有助于拦截自身免疫、炎症、代谢或感染性疾病，其中相关途径包含葡萄糖代谢和储存、脂肪酸代谢和储存、氨基酸代谢和储存、钙通量、环amp代谢、控制促炎性细胞因子(肿瘤坏死因子α、干扰素γ、白细胞介素-6和单核细胞化学吸引蛋白1)的产生的炎症途径如tlr和nlr信号传导或nf-κb信号传导，以及调节途径如foxp3活性或il-10信号传导。所述作用是由于化合物暴露在人体内各种细胞类型而引起的，所述暴露诱导生物效应。细胞可以包含但不限于来自gi道组织、免疫细胞(即，巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞)、肌肉细胞、内皮细胞或上皮细胞的细胞。在某些实施例中，本发明提供了用例如口服施用的本发明的化合物治疗受试者，以减少或预防与感染性疾病如艰难梭菌感染相关的炎症。
当被实践时，本发明的方法可以是借助于使用如上述的任何可接受的形式通过任何可接受的施用途径向受试者施用化合物，并且使受试者的身体能够通过自然过程将化合物分布到靶细胞。如上所述，施用同样可以通过直接注射到含有靶细胞(即，要处理的细胞)的部位(例如，器官、组织)或在将细胞注射回身体中之前用化合物培养将用于细胞疗法的细胞来进行。
此外，施用可以遵循任何数量的方案。因此，施用可以包括实验化合物的单剂量或给药，或在一定时间段内的多剂量或给药。因此，处理可以包括重复施用步骤一次或多次，直到达到期望的结果。在某些实施例中，处理持续的时间段可以延长，如数周、数月或数年。本领域的技术人员完全能够基于本领域已知的参数容易地为个体研发合适的给药方案。本发明化合物的剂量可以用于本发明这些实施例的方法中。为了治疗免疫代谢疾病，优选地，化合物以约0.001毫克/天到9,000毫克/天的量施用。
要施用的量将根据受试者、疾病或病症的阶段、受试者的年龄、受试者的一般健康状况以及医学领域技术人员已知和常规考虑的各种其它参数而变化。一般而言，将施用足够量的化合物，以便使受影响部位的炎症量或受影响代谢物或信号转导物的浓度发生可检测的变化。对于没有经历活动性症状的患者，人们可能寻找的变化可能涉及免疫细胞参数，如免疫细胞中tnfα的表达或血液中调节性t细胞的百分比，或代谢参数，如细胞的葡萄糖摄取或细胞内糖原的量。本文公开了合适的量，并且另外合适的量可以由本领域的技术人员在没有过度或过多实验的情况下基于本文公开的量鉴定。
鉴于上述方法，显而易见的是，本发明通过用于接触细胞的结合lancl2的化合物提供免疫代谢治疗，如治疗受试者的细胞。以上讨论集中于将本发明的化合物用作组合物的一部分以供在通常被认为是药物或医疗环境中使用。
本发明描述的用于治疗免疫代谢疾病和描述的其它病状的化合物可以调配成药物营养组合物、功能性食品组合物、饮食辅助物或在细胞疗法中调配，如上文更详细描述的。
作为通过直接施用化合物来治疗病状的方法的替代方案或除了所述方法之外，可以用从具有化合物的前体细胞产生的制备细胞来治疗病状。可以治疗的病状包含本文或美国专利9,556,146中描述的任何病状。治疗中使用的化合物可以包含本文公开的或由本文公开的任何式涵盖的任何化合物，或美国专利9,556,146中公开的任何化学式中公开的或由其涵盖的任何化合物。
术语“前体细胞”在本文中通常用于指作为起始细胞的任何细胞，所述起始细胞经处理以产生制备细胞。细胞可以是产生制备细胞的分化谱系中的具有例如全能性、多能性或单能性的细胞上游，如干细胞、祖细胞或“前体细胞”(如所述术语在本领域中用于指干细胞与分化细胞之间的中间体)，但不一定必须如此。因此，在一些版本中，由前体细胞产生制备细胞涉及将前体细胞分化成制备细胞。在其它版本中，由前体细胞产生制备细胞仅涉及诱导如基因表达变化等变化。
制备细胞可以通过使前体细胞与本发明的化合物中的一或多种化合物在体外接触而由前体细胞产生，以由此产生制备细胞。术语“体外”和“离体”与“体内”形成对照，可互换使用，并且是指在活有机体之外的状态。
本发明的前体和/或制备细胞可以包括免疫细胞。示例性免疫细胞包含粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、t细胞和b细胞等。示例性粒细胞包含嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞。
本发明的前体和/或制备细胞可以包括白血细胞(白细胞)。示例性白血细胞包含嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞(嗜酸细胞)、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。
本发明的前体和/或制备细胞可以包括外周血单核细胞(pbmc)或固有层单核细胞(lpmc)。示例性pbmc和lpmc包含淋巴细胞(t细胞、b细胞、nk细胞)和单核细胞。
本发明的前体和/或制备细胞可以包括t细胞。t细胞分为两大类：cd8+t细胞或cd4+t细胞，基于细胞表面存在哪种蛋白。t细胞执行多种功能，包含杀死感染细胞和活化或募集其它免疫细胞。cd8+t细胞也称为细胞毒性t细胞或细胞毒性淋巴细胞(ctl)。所述细胞对于识别和除去病毒感染细胞和癌细胞至关重要。主要的cd4+t细胞亚群是原初cd4+t细胞、th1细胞、th2细胞、th17细胞和treg细胞，其中“th”是指“t辅助细胞”原初cd4+t细胞是不分化为任何th1细胞、th2细胞、th17细胞和treg细胞中的任何细胞的t细胞。调节性t细胞(treg)监测并抑制其它t细胞的活性。所述细胞阻止不利的免疫活化并且保持耐受性，或保持阻止针对身体自身细胞和抗原的免疫反应。在一些版本中，前体细胞包括原初cd4+t细胞，并且制备细胞包括treg细胞。
由前体细胞产生制备细胞可以包括接触本发明的一定量的一种或多种组合物，并且持续有效诱导制备细胞中相对于前体细胞的化合物依赖性差异的时间。如本文所使用的，“化合物依赖性差异”是指制备细胞相对于前体细胞的由使前体细胞与本发明的一个或多个化合物接触引起的差异。化合物依赖性差异可以通过在存在或不存在本发明的一种或多种化合物的情况下使细胞与培养基接触来测定，其中化合物依赖性差异是仅在存在本发明的一种或多种化合物的情况下细胞与培养基接触的情况下出现的特性。化合物依赖性差异可能不仅是种类上的差异，还可能是程度上的差异。
制备细胞中的化合物依赖性差异可以包含基因表达的差异。除非另有明确说明，“基因表达”在本文中广泛用于指任何或所有转录或转译。因此，基因表达的差异可以是mrna产生的差异、蛋白产生的差异或两者都有。除非另有明确说明，否则具有差异表达的基因可在本文中通过参考从基因(例如，foxp3)产生的蛋白或通过参考基因本身(例如，lag3)来鉴定。在本发明的各个版本中，基因表达的化合物依赖性差异可以包括以下中的一或多个：il-10或其直系同源物表达增加、foxp3或其直系同源物表达增加、tnfα或其直系同源物表达减少、ifnγ或其直系同源物表达减少、tbet或其直系同源物的表达减少、lag3或其直系同源物的表达增加、socs2或其直系同源物的表达增加、irf7或其直系同源物的表达增加、p2rx7或其直系同源物的表达增加、capn3或其直系同源物的表达增加、ikzf2或其直系同源物的表达增加、stat5a或其直系同源物的表达增加、pten或其直系同源物的表达增加、foxo1或其直系同源物的表达增加和/或phlpp1或其直系同源物的表达增加。直系同源物可以包含动物物种中的直系同源物。直系同源物可以包含哺乳动物物种中的直系同源物。直系同源物(如上述小鼠基因的直系同源物)可以包含灵长类动物中的直系同源物。直系同源物(如上述小鼠基因的直系同源物)可以包含人中的直系同源物。
制备细胞中的化合物依赖性差异可以包含其它可检测的差异，如stat5a或其直系同源物的磷酸化的增加、foxo1磷酸化或其直系同源物的增加和/或丙酮酸激酶活性的增加。
在产生制备细胞时，前体细胞与化合物接触的量可以为约100nm、约10nm、约1nm或更少到约1μm、约10μm、约100μm、约1mm或更多。前体细胞可以与化合物接触约12小时、6小时、1小时、约30分钟或更短到约24小时、约48小时、约72小时或更长的时间。
在一些版本中，pbmc或lpmc大部分与本发明的化合物接触。pbmc或lpmc可以从动物中分离出来。在一些版本中，pbmc或lpmc的亚型，如t细胞可以从pbmc或lpmc中分离出来，并且然后与本发明的化合物接触。在一些版本中，pbmc或lpmc与本发明的化合物接触，并且然后细胞亚型，如t细胞或t细胞的特定类型从其中分离出来。用于分离pbmc、lpmc和其亚型的方法是本领域已知的。参见例如，majowicz等人.2012(majowicza,vandermarels,teveldeaa,meijersl,petryh,vandeventersj,ferreirav.在体外用pma/离子霉素和抗cd3活化的鼠cd4+cd25-细胞获取调节功能并改善体内实验性结肠炎。《bmc胃肠病学(bmcgastroenterol.)》2012年12月3日；12:172)以及canavan等人20016(canavanjb,scottàc,
产生制备细胞可以包括由前体细胞中分化制备细胞。例如，制备细胞(如treg细胞)可以由前体细胞(如原初cd4+t细胞)中分化。这种分化可以包括使前体细胞与除了本发明化合物中的一种或多种化合物之外的分化因子接触。各种分化因子可以包含全反式视黄酸、tgf-β、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbolmyristateacetate)、离子霉素、雷帕霉素和/或il-2。在一些版本中，分化可以包括相对于前体细胞中的部分扩大制备细胞中的treg细胞的比例。
本发明的前体细胞和/或制备细胞可以是分离细胞。术语“分离”或“纯化”意指从其原始环境，例如自然环境中除去的材料。当材料以浓度高于或低于在一个或多个纯化步骤之前存在的浓度存在于特定组合物中时，所述材料据称为“纯化”。
用本发明的制备细胞治疗病状可以包括以足以治疗病状的量向动物施用细胞。制备细胞可以使用化合物的上述任何途径或方法，包含肠胃外或肠内进行施用。肠胃外施用的非限制性形式包含注射或输注。制备细胞可以直接注射或输注到血流或身体的其它部分中。肠内施用的非限制性形式包含口服和直肠给药，使得制备细胞进入胃肠道。制备细胞对经处理的动物(即，从取自制备细胞用于处理的同一动物中的细胞产生的动物)可以是自体的，或者经处理的动物(即，从制备细胞用于处理的不同动物产生的动物)是异源的。如上所述制备的细胞可以用于治疗本文所述的病状中的任何病状的方法。示例性病状包含肠道炎症。肠道炎症的示例性类型包含炎性肠病。炎性肠病的示例性类型包含克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。
在本发明的一个实施例中，治疗免疫代谢疾病的方法包括在不造成目前可获得的治疗(即他汀类、抗生素、皮质类固醇、阿霉素、甲氨蝶呤)中常见的可辨别的副作用，如显著的体重增加、全身免疫抑制(systemicimmunesuppression)、库欣样外观(cushingoidappearance)、骨质减少/骨质疏松症、细胞毒性或胰腺炎的情况下进行治疗。也就是说，已经发现，与未接受治疗的其它类似受试者相比，至少部分通过影响一些细胞中的lancl2和/或其它免疫代谢性途径的表达和/或活化而提供治疗效果的根据本发明的治疗方法提供了有益效果，而不会在正在治疗的受试者中例如通过流体滞留而造成体重显著增加。
如此，本发明的免疫代谢方法可以通过影响免疫细胞的代谢来提供用于减轻炎症的治疗。所述方法可以全身性(即，在整个受试者身体内)或局部(例如，在施用部位或炎性细胞部位，包含但不限于t细胞和巨噬细胞)减轻炎症。在通过免疫代谢治疗或预防炎症中，可以观察到的一种影响是葡萄糖代谢的转变。具体地，所述转变可以是乳酸从丙酮酸产生向进入到与免疫炎症作用相关的三羧酸循环中转变。更具体地，这种代谢的改变可能与cd4+cd25+foxp3+或其它调节性cd4+t细胞相对于效应cd4+t细胞(如il17+th17细胞或ifnγ+th1细胞)的比例增加相关联。另一个观察到的影响可能是由厌氧代谢减少和免疫检查点途径增加的组合引起的细胞增殖减少。治疗性触发的代谢转变的另一个影响可能是由脂肪酸加工和储存的改变引起的炎症趋化因子(如mcp-1、il-8或cxcl9)的表达降低。因此，所述方法还可以被认为是影响或改变向其施用治疗的受试者的免疫反应，由此阻断炎症、疾病和病理的方法。
本发明提供了抑制gi道炎症的方法，其中相关组分包含胃、小肠、大肠和直肠。
本发明提供了治疗或预防受试者患有ibd，或以其它方式预防健康个体(可能具有克罗恩氏病或溃疡性结肠炎遗传倾向)发展ibd的方法。所述方法还可能涉及治疗患有缓解型ibd的患者。根据本发明，术语“患有ibd的受试者”用于指患有显示ibd典型的一种或多种临床症状的疾病或病症的受试者(例如，动物、人)。通常，根据本发明此方面的治疗或预防方法包括向受试者施用一定量的化合物或细胞疗法，所述一定量的化合物或细胞疗法对治疗或预防ibd的一种或多种症状或临床表现或对预防一种或多种此类症状或表现的发展是有效的。
因此，根据本发明的方法，本发明可以提供治疗ibd、与肠道感染相关联的炎症和与自身免疫疾病相关联的炎症的方法。治疗方法可以是预防性方法。在某些实施例中，所述方法是治疗ibd、与肠道感染相关联的炎症和与自身免疫疾病相关联的炎症的方法。在其它实施例中，所述方法是预防ibd的方法。在实施例中，所述方法是预防缓解型ibd变得活跃的方法。在仍其它实施例中，所述方法是改善患有ibd、与肠感染相关联的炎症和与自身免疫疾病相关联的炎症的受试者的健康状况的方法。造成胃肠感染的生物包含，但不限于：大肠杆菌、志贺氏杆菌、沙门氏菌、致病性弧菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersinaenterocolitica)、弓形虫、溶组织内阿米巴(entamoebahistolytica)和蓝氏贾第鞭毛虫(giardialamblia)。因此，在某些实施例中，本发明提供了一种保护受试者的健康、器官和/或组织免于患有ibd、与肠道感染相关的炎症和与自身免疫疾病相关联的炎症，或有发展ibd、与肠道感染相关联的炎症和与自身免疫疾病相关联的炎症的风险的方法。
在本发明的一个实施例中，治疗ibd的方法包括在不造成目前可获得的ibd治疗(即皮质类固醇、肿瘤坏死因子α抑制剂)中常见的可辨别的副作用，如显著的体重增加、全身免疫抑制、库欣样外观、骨质减少/骨质疏松症或胰腺炎的情况下治疗ibd。也就是说，已经发现，与未接受治疗的其它类似受试者相比，至少部分通过影响一些细胞中的lancl2的表达和/或活化而提供治疗效果的根据本发明的治疗方法提供了有益效果，而不会在正在治疗的受试者中例如通过流体滞留而造成体重显著增加。
如此，本发明的方法可以提供减轻炎症的方法。所述方法可以全身性(即，在整个受试者身体内)或局部(例如，在施用位点或包含但不限于t细胞和巨噬细胞的炎性细胞位点)减轻炎症。在根据本发明的方法治疗或预防炎症中，可以看到的一个影响是浸润肠的血液单核细胞或巨噬细胞和淋巴细胞的数量减少。另一个影响可能是调节性免疫细胞群，如cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞的增加，或淋巴细胞或巨噬细胞调节特性增加(例如，白细胞介素4(il-4)或il-10增加或tnf-α和il-6减少)。另一个影响可能是炎症基因和/或粘附分子的减少。因此，所述方法还可以被认为是影响或改变向其施用治疗的受试者的免疫反应的方法。受试者可能患有炎性肠病或t细胞的免疫调节或细胞粘附分子的下调是期望结果的另一种病状。
本发明还提供了用本文所描述的化合物或细胞治疗感染性疾病的方法。此类感染性疾病的非限制性实例包含病毒感染、细菌感染和真菌感染。
病毒感染的非限制性实例包含来自以下的感染：腺病毒科属中的病毒，如腺病毒；疱疹病毒科属中的病毒，如单纯疱疹，1型、单纯疱疹，2型、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus)、人巨细胞病毒(humancytomegalovirus)、人疱疹病毒(humanherpesvirus)和8型；乳头瘤病毒科属中的病毒，如人乳头瘤病毒；多瘤病毒科属中的病毒，如bk病毒和jc病毒；痘病毒科属中的病毒，如天花；肝病毒科属中的病毒，如乙型肝炎病毒；细小病毒科属中的病毒，如人博卡病毒(humanbocavirus)和细小病毒b19；星状病毒科属中的病毒，如人星状病毒(humanastrovirus)；杯状病毒科属中的病毒，如诺沃克病毒(norwalkvirus)；微小核糖核酸病毒科属中的病毒，如柯萨奇病毒(coxsackievirus)、甲型肝炎病毒(hepatitisavirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)和鼻病毒(rhinovirus)；冠状病毒科属中的病毒，如急性呼吸综合征病毒；黄病毒科属中的病毒，如丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus)、黄热病病毒(yellowfevervirus)、登革热病毒(denguevirus)和西尼罗病毒(westnilevirus)，披膜病毒科属中的病毒，如风疹病毒；肝炎病毒科属中的病毒，如戊型肝炎病毒(hepatitisevirus)；逆转录病毒科属中的病毒，如人免疫缺陷病毒(hiv)；正粘病毒科属中的病毒，如流感病毒；砂粒病毒科属中的病毒，如瓜纳瑞托病毒(guanaritovirus)、胡宁病毒(juninvirus)、拉沙病毒(lassavirus)、马丘波病毒(machupovirus)和萨比亚病毒(sabiávirus)；布尼雅病毒科属中的病毒，如克里米亚-刚果出血热病毒(crimean-congohemorrhagicfevervirus)；丝状病毒科属中的病毒，如埃博拉病毒(ebolavirus)和马尔堡病毒(marburgvirus)；副粘病毒科属中的病毒，如麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)、人偏肺病毒(humanmetapneumovirus)、亨德拉病毒(hendravirus)和尼帕病毒(nipahvirus)；弹状病毒科属中的病毒，如狂犬病病毒；未分配的病毒，如丁型肝炎病毒(hepatitisdvirus)；以及呼肠孤病毒科属中的病毒，例如轮状病毒、轮状病毒、钶钽铁矿石病毒(coltivirus)和版纳病毒(bannavirus)等。
细菌感染的非限制性实例包含除了以下之外还用上述细菌的感染：炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌、百日咳杆菌、伯氏疏螺旋体、流产布鲁氏菌(brucellaabortus)、犬布鲁氏菌(brucellacanis)、羊布鲁氏菌(brucellamelitensis)、猪布鲁氏菌空肠弯曲菌(brucellasuiscampylobacterjejunichlamydiapneumoniae)、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体(leptospirainterrogans)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、绿脓杆菌、立克次氏体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内志贺氏菌(shigellasonnei)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(yersiniapseudotuberculosis)以及来自上述生物属的其它物种。
真菌感染的非限制性实例包含用以下的感染：引起曲霉病的曲霉属真菌，如烟曲霉菌；引起芽生菌病的芽生菌属真菌，如皮肤芽生菌；引起念珠菌病的念珠菌属真菌，如白色念珠菌；引起球孢子菌病(谷热病)的球孢子菌属真菌；引起隐球菌病的隐球菌属真菌，如新隐球菌(cryptococcusneoformans)和加氏隐球菌(cryptococcusgattii)；引起癣菌病的皮肤真菌；引起真菌性角膜炎的真菌，如镰刀菌(fusarium)物种、曲霉(aspergillus)物种和念珠菌(candida)物种；引起组织胞浆菌病的组织胞浆菌属真菌，如荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)；引起毛霉菌病的毛霉目真菌；酵母属真菌，如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)；引起肺囊虫肺炎的肺囊虫属真菌，如耶氏肺孢子虫(pneumocystisjirovecii)；以及引起孢子丝菌病的孢子丝菌属真菌，如申克孢子丝菌(申克孢子丝菌)。
本发明还提供了用本文所述的化合物或细胞治疗过度增殖性病症的方法。过度增殖性病症包含涉及细胞不受控制生长的病状，如癌症或涉及肿瘤、腺瘤或息肉生长的病状。过度增殖性病症的非限制性实例包含结肠直肠癌、家族性腺瘤性息肉病(pap)、喉癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠道癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞白血病、肝细胞癌、胃肠间质瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓增生性病症、高嗜酸细胞综合征、肥大细胞增多症等。
本发明还提供了用本文所述的化合物或细胞治疗先天性代谢缺陷的方法。先天性代谢缺陷的非限制性实例包含威尔逊病、安德森病或其它糖原贮积病、胱氨酸尿(cystinuria)、法布里病(fabrydisease)、成人发病的瓜氨酸血症ii型(adult-onsetcitrullinemiatypeii)、泽尔韦格氏综合征(zellwegersyndrome)、支链酮酸尿症(branched-chainketoaciduria)、莱施-奈恩综合征(lesch-nyhansyndrome)、尼曼-皮克病(niemann-pickdisease)、范科尼-比克尔病(fanconi-bickeldisease)、冯-吉尔克氏病(vongierke'sdisease)、遗传性果糖不耐受、苯丙酮尿症、中链酰基辅酶a脱氢酶缺乏症(mediumchainacyl-coadehydrogenasedeficiency)等。
本发明还提供了用本文所述的化合物或细胞治疗慢性免疫代谢疾病的方法。慢性免疫代谢疾病的非限制性实例包含心血管疾病，如动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、肺心病、心内膜炎、心肌炎和高血压。
本发明还提供了用本文所述的化合物或细胞治疗自身免疫疾病，如炎性自身免疫疾病的方法。自身免疫疾病的非限制性实例包含炎性肠病(ibd)(例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、狼疮、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、1型糖尿病、牛皮癣、多发性硬化和癌症免疫疗法诱导的自身免疫疾病等。癌症免疫疗法诱导的自身免疫疾病的非限制性实例包含癌症免疫疗法诱导的风湿性疾病。
本发明还提供了用本文所述的化合物或细胞治疗慢性炎性疾病的方法。慢性炎性疾病的非限制性实例包含代谢综合征、肥胖症、糖尿病前期、心血管疾病和2型糖尿病等。
本发明还提供了用本文所述的化合物或细胞治疗炎性病症如急性结肠憩室炎和辐射诱导的胃肠道炎症的方法。辐射诱导的胃肠道炎症的非限制性实例包含放射性直肠炎、放射性肠炎和放射性乙状结肠炎。
本发明还提供了用本文所述的化合物或细胞治疗糖尿病的方法，所述糖尿病包含1型糖尿病、2型糖尿病和其它类型的糖尿病。术语“糖尿病(diabetes/diabetesmellitus)”用于涵盖受试者患有高血糖(即，高血糖症)的代谢紊乱。高血糖病状有各种病因，如胰腺未产生足够的胰岛素，或者细胞对所产生的胰岛素没有反应。存在若干种公认的糖尿病亚型。1型糖尿病由身体完全不能产生胰岛素或身体不能产生足够的胰岛素来表征。2型糖尿病通常由胰岛素耐受性，一种细胞不能正确使用胰岛素的病状引起的。2型糖尿病有时伴有胰岛素缺乏。妊娠糖尿病在没有糖尿病病史的孕妇出现高血糖时发生。较不常见的糖尿病形式包含先天性糖尿病(由于与胰岛素分泌相关的遗传缺陷导致)、囊性纤维化相关的糖尿病、由高剂量糖皮质激素诱导的类固醇糖尿病以及若干种形式的单基因糖尿病(包含年轻人的成年型糖尿病)。单基因糖尿病涵盖由(与导致高血糖症的更复杂的多基因病因相比)单个常染色体显性基因突变导致的若干种遗传形式的糖尿病。
本发明还提供了用本文所述的化合物或细胞治疗慢性疼痛的方法。慢性疼痛疾病的非限制性实例包含纤维肌痛、神经损伤、偏头痛、背痛、腹痛等。
本发明还提供了用本文所述的化合物或细胞治疗另外病状的方法。这些病状包含慢性炎性疾病，如慢性肉芽肿病、移植物抗宿主病和肿瘤坏死因子受体相关联的周期性综合征；肌肉萎缩，如肌萎缩性侧索硬化、杜兴肌营养不良(duchennemusculardystrophy)、脊柱侧凸和进行性肌肉萎缩；以及其它病状。
无论是否明确描述，本文描述的要素和方法步骤可以以任何组合使用。
除非由引用组合的上下文另有说明或明确暗示相反，否则如本文所使用的方法步骤的所有组合可以以任何顺序执行。
如本文所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”、和“所述”包含复数指示物。
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本文引用的所有专利、专利出版物和同行评审出版物(即“参考文献”)以相同的程度通过引用明确并入本文，其程度如同具体且独立地指示每个独立的参考值通过引用并入。在本公开与并入的参考文献之间存在冲突的情况下，应以本公开为准。
应当理解，本发明不限于本文展示和描述的部件的特定构型和布置，而是包括落入权利要求范围内的其如此修改的形式。
分子建模和lancl2结合实例
美国专利9,556,146提供了示出将bt-11和相关化合物与lancl2结合的实例，所述美国专利的全部内容通过引用并入本文。表1a和表1b示出了bt-11与其它相关化合物(通过表面等离子体共振(spr))的预测结合和实际结合。
表1a.bt-11与相关化合物的预测spr结合和实际spr结合
表1b.bt-11与相关化合物的预测spr结合和实际spr结合
事实上，筛选了另外的化合物以将lancl2与autodockvina结合(trott等人.《计算化学杂志(j.computchem)》,2010,31(2):455-61.)。为每种化合物确定最高结合剂量的结合能。先前报告的方案和参数(lu等人.《分子模型杂志(jmolmodel)》,2011,17(3):543-53)适于本发明分析。表2示出了一些测试化合物和其预测的lancl2结合能。
表2.化合物的lancl2结合能。
表3示出了bt-11变体的预测的lancl2亲和力(以kcal/mol为单位的最高结合剂量的结合能)。表2中每种化合物的bt-11基本结构的变化是根据为本文的式z-y-q-y'-z'提供的变量定义的。
表3.bt-11变体的lancl2亲和力。
如表1a、1b、2和3所示，bt-11可以适应广泛的修饰，并且仍然以高亲和力结合lancl2。
药物化学实例
由美国专利9,556,146提供了示出bt-11与相关化合物的合成的实例，所述美国专利的全部内容通过并入本文。
实验研究实例
bt-11在炎症期间改变免疫代谢途径
介绍
涵盖克罗恩氏病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)的炎性肠病(ibd)危害着160万北美人和全球400万人，在过去五年内增长了近15％[1,2]。由于ibd的复杂性和多因素性质，并且症状、风险因素和严重性随谱而变化，故有效治疗的研发是一个漫长、艰巨的过程[3]。目前，占主导地位的市场疗法仅惠及总人口的一小部分[4]，反应丧失率很高[5]，或诱导高比率的副作用，包含癌症、感染和死亡[6,7]。因此，临床上仍然需要更安全并且更有效的ibd疗法。
与ibd发展相关的一系列因子中包括炎性cd4+t细胞的失衡和扩增[8]。所述一系列因子自发产生高水平的ifnγ、tnfα和il17以及其它细胞因子是随机爆发炎症的主要驱动因素[9]。相比之下，调节性cd4+t(treg)细胞的主要作用是阻止此扩增、活化和细胞因子的产生。尽管有这些明显的益处，但与健康的对照物相比，treg细胞在ibd患者[10]的gi中经历了预期的代偿性增强，并在体外显示出正常的抑制功能[11]，从而引起了关于其在疾病中的实际影响的争议。最近的证据表明，虽然由传统标记物表征的treg在数量上确实有所增加，但这些细胞可能是炎性细胞因子或原位不稳定表达foxp3的细胞的共产生者[12-14]。此共产生产生了一种中间表型，所述中间表型与效应/炎性cd4+t细胞而不是典型的treg细胞更密切相关联。另外，treg的扩增已经与当前ibd治疗的反应性有关[15]。潜在地，靶向完全定型的treg图谱的稳定性可以恢复gi粘膜内天然和诱导的treg细胞功能的功效。
最近，在人疾病研究和免疫靶向疗法的发展中，细胞代谢和免疫的交织性质变得更加突出[16]。具体地，炎性疾病和自身免疫疾病，如ibd和其它疾病，已经被鉴定为免疫代谢调节剂效力的主要实例[17]。效应t细胞和调节性cd4+t细胞在代谢功能上有显著差异，其中效应细胞有利于乳酸产生和葡萄糖利用[18]，而调节细胞类型在脂肪酸与葡萄糖氧化之间保持平衡的代谢图谱[19]。免疫与代谢之间的界面(称为免疫代谢)获得更高的分辨率和可信度，因为新的代谢酶和底物被鉴定为具有影响从己糖激酶[20]和gapdh[21]到烯醇酶[22]和磷酸烯醇丙酮酸盐[23]的免疫行为的兼职功能。在对il-1β和ifnγ的产生、foxp3的表达和钙信号传导产生影响的情况下，曾被认为只能产生能量的这些要素对免疫功能有许多潜在影响。通过控制免疫细胞的代谢，免疫代谢疗法可以有效地阻止分化和极化为炎症亚群[24-27]。
先前鉴定的lancl2介导的肠内分泌和肌肉细胞[28]中的代谢调节表明lancl2和bt-11处理功效的一个重要方面可能在于bt-11在gi道中潜在的免疫代谢作用机制。即，在发现其在炎症中的作用[29]之前，首先示出lancl2的活化，bt-11功效背后的关键第一步以作为天然和膳食化合物的受体aba[28]以及用于产生代谢激素的信号转导子，在非免疫细胞中发挥代谢作用。然而，lancl2途径的代谢作用与免疫作用之间的结合还有待证实。如此，lancl2和其它免疫代谢靶标值得作为跨越炎性疾病和自身免疫疾病的创新型免疫调节方法而进行机制评估。
bt-11已经示出了通过表面等离子体共振靶向lancl2并已通过体外评估和疾病的dss模型证明对ibd[30,31]具有治疗作用。口服施用后，bt-11的作用高度局限于gi粘膜，其中全身生物利用度<10％并且血浆半衰期为3.1小时。进一步地，对大鼠进行的初步安全特性研究表明，清洁的安全特性高达1,000mg/kgp.o.[32]的极限剂量。功效的早期评估限定了疾病活动评分的改善和用dss激发的小鼠结肠中炎症标记物的减少。除了活化lancl2值外，目前还未限定ibdbt-11降低ibd中疾病严重性的潜在作用机制。
以下实例表明，由bt-11进行的lancl2活化通过免疫代谢机制扩增并诱导调节性cd4+t细胞内的稳定性，以抑制gi粘膜中的过度炎症。以下实施例还提供了bt-11的通过活化lancl2的免疫代谢作用的第一证据。这些数据表明，在许多疾病或病症，尤其是与其相关联的炎症的免疫代谢治疗中使用了bt-11。
材料与方法
小鼠。
c57bl/6背景上的rag2-/-从杰克逊实验室获得。fvb背景上的mdr1a-/-从塔科尼克生物科学公司获得。c57bl/6背景上的lancl2-/-和lancl2fl/fl是通过与商业来源协作产生的。将lancl2fl/fl小鼠培育成cd4-cre转基因小鼠以产生t细胞特异性lancl2敲除动物(lancl2δt)。安乐死是通过co2麻醉，然后继发颈椎脱位进行的。实验动物在进入实验时年龄、性别和体重相匹配。所有研究都是在iacuc的批准下进行的。
实验ibd的诱导。
mdr1a-/-模型。mdr1a-/-小鼠发展自发性结肠炎。在4周龄时，mdr1a-/-小鼠开始通过经口强饲法接受每日用bt-11(8mg/kg)处理。每周称重小鼠并评分，以监测结肠炎的发展。在10周龄时，处死mdr1a-/-，以收集用于下游测定的组织。dss模型。向lancl2δt表达对照物和lancl2表达对照物给予葡聚糖硫酸钠的饮用水，并持续七天。七天之后，返回标准饮用水。每天对小鼠称重并评分。在实验时间线的第7天和第10天时，对小鼠进行安乐死以收集组织。过继转移模型。通过磁性分选，粉碎并富集wt和lancl2-/-供体脾以获得cd4+级分。通过facsaria细胞分选仪分选cd4+cd45rbhicd25-(teff)细胞和cd4+cd45rblocd25+(treg)细胞。基于指示的实验组，rag2-/-受体小鼠通过腹膜内注射接受来自wt或lancl2-/-来源的4x105teff细胞和1x105treg细胞。转移之后，小鼠每天接受bt-11处理。每周对小鼠称重并评分，直到转移后8周进行安乐死。
流式细胞术。
将结肠和肠系膜淋巴结(mln)收集到含有胶原酶(300u/ml)和dnase(50u/ml)的rpmi/fbs缓冲液中进行消化。在过滤所得单细胞悬浮液后，通过percoll密度梯度纯化免疫细胞。在96孔板中，在连续的活体染色中，用细胞外抗体(cd45、cd3、cd4、cd8、cd19、nk1.1、cd25、f4/80、cd11b、cx3cr1、cd64)和细胞内抗体(tbet、rorγt、foxp3、ifnγ、il17、il10)的混合物对细胞进行标记。使用具有facsdiva软件的facscelesta流式细胞仪获取数据。
基因表达。
使用qiagenrneasy微型试剂盒产生来自结肠和细胞中的总rna。使用bioradiscriptcdna合成试剂盒产生cdna。通过用taqdna聚合酶对来自标准pcr反应的纯化产物进行系列稀释，然后使用qiagenminelutepcr纯化试剂盒进行纯化来产生标准曲线。通过用bioradcfx96热循环仪上的sybrgreensupermix定量实时pcr获得表达水平，然后对如先前所述的β-肌动蛋白的表达进行归一化[33]。
组织病理学。
从收集到10％福尔马林缓冲液中并包埋在石蜡中的结肠部分制备经h&e染色的结肠切片。通过olympus显微镜，由经委员会认证的兽医病理学家检查载玻片并用image-pro软件收集图像。针对白细胞浸润、上皮糜烂和粘膜增厚，对样本进行评分(0-4)。
代谢分析。
将结肠和细胞悬浮在测定特异性缓冲液中并均质化10秒。匀浆以10,000xg离心10分钟。对于酶活性测定，收集并平铺上清液。样品与酶显影剂和底物混合。结合gen5软件，使用biotekμquant平板阅读器对nadh产量进行比色检测。对于pep测定，使用高氯酸介导的纯化使上清液去蛋白。样品平铺并与探针、转换器、显影剂混合物混合。通过平板读数器上的吸光度定量来测量pep浓度。
体外cd4+t细胞培养。
切除并粉碎来自wt和lancl2-/-小鼠的脾以产生单细胞悬浮液。cd4+t细胞级分借助于利用bdimag系统进行磁性分选通过阴性选择来富集。原初cd4+t细胞通过用生物素化的cd62l抗体温育，然后与链霉亲和素包被的磁珠结合而获得。初始细胞在含全反式视黄酸和纯化的tgf-β的完整的imdm培养基中的抗cd3包被的组织培养板中温育48小时，以刺激分化为[18]。将细胞平铺在含有bt-11的指示浓度的培养基中，并且持续0小时到48小时。在0小时时加入代谢调控剂，ps-48(5μm)、dasa-58(10μm)和毒胡萝卜素(10nm)。对于共测定，cd4+级分和treg如所述产生并在有2x105个细胞的同一孔中以1:1的比率平铺，cd4+级分和treg各自不利用bt-11，并在一起温育24小时。在测定前六小时，用pma和离子霉素刺激细胞。从平板收集细胞，以通过流式细胞术、基因表达和代谢测定进行下游分析。
人pbmc的分离和培养。
新鲜的未鉴定的全血从商业供应商处获得。通过leukosep管稀释和纯化血液以获得pbmc级分。通过低渗裂解来裂解剩余的红细胞。将细胞平铺在完整rpmi培养基中的抗cd3包被的孔中，并与bt-11一起温育24小时。对于sirna实验，细胞首先与origene3-merlancl2sirna或悬浮在viromergreen转染试剂内的乱序对照物一起温育6小时。六小时后，细胞被洗涤并重新悬浮在含有bt-11的新鲜培养基中。在测定前六小时，用pma和离子霉素刺激细胞。经过48小时的bt-11处理后，收集细胞以进行流式细胞术、基因表达和代谢测定。
统计分析。
数据表示为平均值和sem。使用anova对参数数据进行分析，然后对其进行雪费多重比较测试(scheffe′multiple-comparisonstest.)。使用sas(sasinstitute，北卡罗莱纳州)的一般线性模型程序执行anova。使用比较基因型和进行治疗的2×2因子排列。统计显著性测定为p<0.05。
结果
在ibd的mdr1a-/-模型中，bt-11降低炎症的组织病理学、细胞和分子标记物。
mdr1a-/-小鼠从四周龄开始，在六周周期内每天填喂8mg/kg的bt-11或媒剂。用bt-11的口服治疗在整个六周周期内预防疾病的发展(图1a，小图a)，并在10周龄时减少结肠白细胞浸润、上皮糜烂和粘膜增厚(图1a，小图b-c)。通过流式细胞术，使用bt-11处理，结肠固有层(lp)(图1b，小图d-e)和肠系膜淋巴结(mln)(图1c，小图g-h)内出现的th1(cd4+tbet+ifnγ+)细胞和th17(cd4+rorγt+il17+)细胞显著减少(p<0.05)。相比之下，bt-11增加了在结肠lp中产生il-10的细胞亚群(包含cx3cr1+巨噬细胞(cx3cr1+f4/80hicd11b+cd64+))并且结肠lp和mln中诱导treg细胞(cd4+foxp3+il10+)(图1b，小图f；图1c，小图i)。炎性细胞因子ifnγ(图1d，小图j)、il17a(图1d，小图k)、il6(图1f，小图o)、tnfα(图1e，小图m)和mcp1(图1e，小图l)的下调通过结肠基因表达和流式微珠阵列得到验证。进一步地，用bt-11口服处理使全结肠lancl2上调(图1f，小图n)。除了预防功能之外，当给予治疗时，从在7周龄时出现症状后开始，bt-11显示出功效。
cd4+t细胞中lancl2的表达是bt-11处理功效所必需的。
具有cd4特异性缺失lancl2(lancl2fl/flcd4cre+；lancl2δt)的小鼠是使用cre-lox技术产生的。将lancl2δt表达对照物和lancl2表达对照物暴露于为期七天的dss中，并用口服bt-11或媒剂对照物处理。cd4+t细胞中lancl2的缺失消除了bt-11的功效(图2a-2c)。lancl2δt显示了疾病活动增加、体重减轻并且结肠组织病理学损伤的严重性增加(图2a，小图a-b；图2b，小图c)。在细胞水平上，用bt-11处理的lancl2δt不能诱导结肠lp中th1细胞和th17细胞中的特性减少，也不能扩增产生il-10的cx3cr1+巨噬细胞(图2c，小图d-f)。经bt-11处理的和未处理的lancl2δt小鼠在结肠内表现出更高的炎性细胞因子水平(图2c，小图g-j)。
用bt-11的口服治疗抑制treg依赖机制中的炎症。
为了进一步表征bt-11的细胞作用机制和其治疗功效的t细胞依赖性，我们采用了将效应t细胞(teff)和调节性(treg)cd4+t细胞从野生型(wt)供体或lancl2-/-(ko)供体共转移到rag2-/-小鼠中(图3a-3c)。在转移wtteff的实验组中，只有共转移的wttreg组跨所有量度均经历了来自bt-11处理的炎症的一致性减少，所述测量包含结肠lp中的疾病活动(图3a，小图a-b)、组织病理学评估(图3b，小图c)、th1(图3b，小图d)和嗜中性粒细胞(图3b，小图e)群以及炎性细胞因子的表达(图3c，小图f-h)。值得注意的是，wtteff/kotreg组在炎症的细胞或组织病理学特性方面没有展示出bt-11处理的益处。类似地，口服bt-11处理在wttreg细胞的受体中呈现了功效，甚至在koteff共转移的情况下，亦是如此。这些小鼠具有与wtteff/wttreg组同等水平的疾病活动、白细胞浸润、th1和嗜中性粒细胞量度。结合用dss激发的lancl2δt小鼠中的功效丧失的这些发现进一步验证了bt-11的作用机制是通过treg细胞内的lancl2活化。
用bt-11处理treg增加了抑制能力和表型稳定性。
为了直接验证来自过继转移模型的发现，对cd4+细胞和treg细胞进行共测定。分离来自wt供体和ko供体的treg细胞，以在treg分化培养基(atra，tgfβ)内培养，并且用bt-11进行为期两天的治疗。两天后收集细胞，并用新收集的cfse标记的cd4+t细胞平铺。除了如通过流式细胞术珠阵列测量出的tnfα和ifnγ的表达之外，用bt-11处理的wttreg还降低了wt细胞和ko细胞两者的增殖指数(图4，小图a-c)。相比之下，用bt-11对kotreg进行预治疗并没有引起任一量度的变化。在24小时共测定期之后，用bt-11预处理的wttreg也显示出更大的treg(foxp3+il10+)表型保留。为了检验所述现象，我们测定了一板基因的表达，所述基因限定了treg表型[34]，包含socs2、capn3、irf7、lag3、ikzf2和p2rx7的稳定性(图4，小图d-i)。在bt-11处理48小时后，socs2、capn3、irf7和lag3显示出wttreg的剂量依赖性增加，导致在剂量为0.625μmbt-11时的显著表达上调。p2rx7在较低剂量下没有示出任何影响，但在0.625μmbt-11的剂量下显著上调(p<0.05)。同时，ikzf2是唯一显示出显著基因型差异的基因。结合对treg细胞表型保留的观察，这些表达结果表明，由bt-11活化lancl2诱导treg相关联基因的稳定表达。
bt-11通过葡萄糖流量控制的免疫代谢机制诱导treg细胞稳定性。
由于lancl2在葡萄糖代谢[35,36]中的先前含义以及代谢图谱对cd4+t细胞分化的重要性，检查了bt-11对糖酵解的影响。两种糖酵解酶pkm2和eno1的表达由于体外treg细胞中lancl2的缺失而显著改变(图5a，小图a-b)。功能酶活性利用bt-11处理提供了深刻变化。当测定酶活性时，用0.625μm处理的wttreg显示丙酮酸激酶活性增加(图5a，小图c)。与用媒剂处理的对照物相比，丙酮酸激酶的底物磷酸烯醇丙酮酸(pep)的浓度在经bt-11处理的treg中显著降低(图5b，小图e)。另外，如丙酮酸脱氢酶(pdh)的活性所证明的，进入三羧酸(tca)循环是通过bt-11处理刺激的，特别是在0.156μm和0.625μm的剂量下(图5b，小图f)。通过用ps-48(pdh的一种小分子抑制剂)处理消除了bt-11诱导的pep和pdh活性的降低(图5b，小图g-h)。这表明bt-11介导对糖酵解途径的作用依赖于底物向tca循环的有效进展。用ps-48处理消除了由bt-11产生的treg分化增加(图5b，小图d)。另外，通过毒胡萝卜素对serca信号传导的抑制减少了bt-11诱导的treg细胞分化的增加，而用dasa-58刺激丙酮酸激酶活性促进了处理细胞和未处理细胞两者中的高水平分化，从而证明末端糖酵解过程对cd4+t细胞分化的重要性。
抑制bt-11的代谢作用消除对患有ibd的mdr1a-/-小鼠的功效。
为了验证体外免疫代谢发现，每周给mdr1a-/-小鼠腹腔注射ps-48或媒剂对照物。如先前所观察的，用bt-11口服治疗并给予媒剂注射的小鼠在疾病活动、组织病理学(图6a，小图a-d)和cd4+t细胞群(图6b，小图e-g)方面显示出预期趋势。在10周龄时用bt-11处理验证了结肠内的体外代谢变化，其中pep浓度降低并且pdh活性增加(图6b，小图h-i)。另外，利用bt-11处理上调与treg细胞稳定性相关联的基因的表达(图6b，小图j；图6c，小图k-o)。跨临床量度、细胞量度和代谢量度，ps-48有效地阻断了bt-11诱导的变化。在用ps-48注射的情况下，非bt-11处理的小鼠和bt-11处理的小鼠在组织学、cd4+t细胞群和代谢量度方面没有可观察到的差异。在dss模型内观察到类似的模式。
bt-11在从克罗恩氏病供体中分离的pbmc中诱导抗炎作用。
全血取自临床分类为轻度疾病到中度疾病的克罗恩氏病患者。当用bt-11处理时，分离的pbmc具有较高的il-10+细胞和foxp3+细胞百分比和较低的tnfα+细胞和ifnγ+细胞百分比(图7a，小图a-b；图7b，小图c-d)。为了证明人细胞中bt-11的lancl2特异性，用lancl2sirna或乱序对照物对pbmc进行转染。在sirna转染之后，bt-11对il10+细胞和ifnγ+细胞的作用消失(图7c，小图e-f)。从pbmc级分，获得原初cd4+t细胞，并在存在bt-11的情况下将所述细胞分化为treg。如在小鼠细胞内观察到的，在剂量依赖性级分中，bt-11诱导上调稳定性相关联的treg标记物(图7d，小图g-l)。另外，在人treg中观察到丙酮酸激酶和丙酮酸脱氢酶活性的代谢模式(图7e，小图m)。毒胡萝卜素阻止了在用bt-11处理的pbmc中对foxp3+细胞的诱导的增加(图7e，小图n)。同时，在存在增强pep浓度的情况下，bt-11阻止细胞对效应子表型的定型增加(图7e，小图o)。这些结果显示了bt-11功效对人的可译性。
讨论
bt-11是一种用于治疗ibd和其它炎症病状的口服的活动性局部作用的一流治疗剂。通过此研究，我们在ibd的三个单独的小鼠模型中证明了治疗功效并且限定了bt-11通过lancl2作用的新型免疫代谢机制。bt-11是一种具有物理化学性质的小分子治疗剂，所述物理化学性质为gi内的局部作用而设计和优化，从而最小化全身副作用的风险。大鼠中高达1,000mgbt-11/kg的极限剂量的良性安全特性[32]进一步表明潜在副作用的风险较低。bt-11靶向lancl2途径，所述途径未观察到具有使其活化无效的任何基因突变，由此利用了在上皮细胞和免疫细胞中的gi粘膜中强烈表达的新型免疫调节机制。在本稿件中，我们鉴定出bt-11通过影响ibd中的一个根本问题(效应t细胞与调节性cd4+t细胞的不平衡)来起作用。进一步地，我们证明了bt-11能够提高和补救lancl2在gi道中的低水平表达，从而恢复由ibd中的炎症诱导的任何功能异常。
缺乏明确的动物模型是研发多因素疾病(如ibd)的新型治疗剂中的典型问题。为此，我们在涵盖化学、细胞和遗传诱导方法的建立已久的模型中验证了bt-11的功效。在dss模型中，甚至在上皮细胞屏障功能缺失和细菌易位的情况下，bt-11也能抑制强烈的炎症，从而表明在存在暂时性上皮损伤的情况下有能力维持粘膜内稳态。同时，在过继转移模型中，bt-11显示出在未被识别的环境中阻断t细胞驱动的炎症的能力。随着对无害抗原(ibd发病机理的一种通常提出的要素)的识别的缺失，此能力对于成功治疗至关重要。
mdr1a-/-模型具体地是一种有前景的人可译性模型。与产生免疫受损小鼠的其它疾病遗传模型不同，mdr1a-/-小鼠具有免疫活性[37]，其中缺失反而影响细胞流出分子和阻止细胞应激的能力。废物和副产物的积累导致上皮细胞生命周期失调以及炎性细胞因子和趋化因子的分泌增加。因此，所述积累导致慢性和自发性疾病发作，其中主要起始事件发生在上皮内。另外，mdr1基因是ibd新出现的风险等位基因并且影响对基于糖皮质激素的治疗的反应性[38,39]。mdr1基因1236t的特定多态性也与cd患者中切除手术风险的增加相关联[40]。bt-11在缺少此基因的情况下提供治疗功效的能力是在存在遗传异常的情况下稳健性的重要指示，并且表明在人转译中的功效。
免疫代谢跨学科领域的发展与理解自身免疫疾病、消化系统病症和癌症的发展越来越多地联系在一起，并为治疗发展提供了新的未开发的机会。晚期糖酵解中bt-11的作用机制的参与在treg细胞的分化和稳定性以及诱导缓解方面具有特定的三重重要性。第一，增加的eno1转录降低了foxp3-e2(与更大的抑制能力[22]相关联的foxp3同种型)的表达。虽然游离烯醇化酶本身可能与改变的foxp3表达有关，但mbp1，foxp3启动子的转录阻遏物，是一种从eno1基因转录的替代性同种型[41]。糖酵解内酶同种型的总体eno1转录和占据减少，由此减少了mbp1的表达并阻止抑制foxp3的表达。第二，乳酸盐产生与进入tca循环之间的平衡是teff(导致自身免疫疾病)与treg(治疗或预防自身免疫疾病)cd4+t细胞亚群之间的关键分歧，其中控制此分歧的多因子与产生和保持treg群的能力以及受自身免疫疾病或炎性疾病影响的组织中的耐受性相关。第三，高效地将pep加工成丙酮酸盐的能力是不受阻碍的serca信号传导的要求[19,23]。通过serca途径的适当的信号传导是foxp3的转录活化剂活性的检查点，从而影响stat3通过组蛋白乙酰化[42]与cns2区域(沉默位点)结合的能力。这些组蛋白修饰对于foxp3在分裂treg细胞中的表达至关重要，并且所述组蛋白修饰的丢失会导致无法抑制肠道炎症[43,44]。在甲基化模式发生改变的情况下，treg更易受到炎性细胞因子的共同产生和与ibd相关联的中间表型的影响[45]。细胞内pep的积累可以促进从乳酸盐的产生到内质网应激的产生[46,47]的多种炎症途径，从而有助于炎性免疫细胞的产生和上皮细胞的存活。虽然serca信号传导在cd4+t细胞中的影响目前在ibd尚未被探索，但抑制的serca功能先前与结肠和小肠收缩性降低有关，导致机械感觉行为改变[48]。
一整板treg细胞稳定性相关联基因的表达的增加表明，bt-11直接影响foxp3活性或转录因子的上游控制。虽然基因一起表明更大的抑制能力和稳定性，但这些下游靶标对疾病有重要的个体影响。irf7可以增加foxp3表达[49]并且其缺失会加重结肠炎的严重性[50]。lag3是抑制能力的关键表面分子并且其表达极大地增强了ibd中基于treg的治疗[51]的功效。socs2可以下调ifnγ表达[52]，并且活化抗原呈递细胞[53]。总体而言，bt-11增加了促进建立更稳定和抗炎的treg细胞群的调节性和抗炎行为。
我们提供证据表明，除了通过在共测定中增加对cd4+增殖的抑制的treg细胞分化之外，bt-11处理有益于treg细胞的行为。虽然此稿件内的结果主要集中于itreg的作用上，但是bt-11对自然发生的treg群的评估提供了另外的治疗见解。值得注意的是，由ikzf2基因和用于区分ntreg和itreg的候选标记物[54,55]编码的helios受lancl2表达的影响，表明lancl2活化在ntreg细胞产生中具有潜在作用。ibd的发作和疾病严重性的突然爆发与饮食摄入的微小变化和自发发展对传统无害抗原的反应性的共生肠道微生物群有关。根据当前知识，用bt-11口服治疗有望在这些情形下诱导和恢复局部耐受性。
除了在经验证的小鼠细胞和ibd模型中的治疗功效外，并且为了支持bt-11在人转译方面的潜力，bt-11还促进了在人pbmc中的有效作用。bt-11减少了在从患有中度到重度疾病的克罗恩氏病患者中获得的细胞中的两种突出的炎性细胞因子tnfα和ifnγ的产生。诱导tnfα表达的天然减少的能力表明具有占据与中度到重度克罗恩氏病患者内的抗tnfα生物制剂类似的治疗空间。除了细胞因子产生和细胞分化的急剧转变之外，我们还证明了在lancl2特异性和免疫代谢途径方面，所鉴定的作用机制从鼠细胞转译到人细胞。共享的作用机制为从疾病和病理的临床前模型向临床试验的治疗功效的转译建立了可行性。通过此研究和之前的努力[31,32]，bt-11已经成为一种有前景的治疗剂，以解决对用于治疗克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和其它病状更安全、更有效的口服治疗剂的未满足的临床需求。通过lancl2利用新型免疫代谢机制，bt-11占据了独特的治疗空间。
所述数据表明本文所述的bt-11或其它lancl2结合化合物或用本文所述的bt-11或其它lancl2结合化合物活化的细胞对用于治疗以下的功效：感染性疾病如艰难梭菌感染、其它细菌性疾病和其它感染性疾病；过度增殖性病症，如家族性腺瘤性息肉病、结肠直肠癌、其它胃肠道癌症和其它癌症；先天性代谢缺陷，如安德森病、其它糖原累积病和其它先天性代谢缺陷；慢性免疫代谢疾病，如动脉粥样硬化、其它心血管疾病、高血压和其它免疫代谢疾病；自身免疫疾病，如狼疮、多发性硬化、癌症免疫疗法诱导的风湿性疾病、其它癌症免疫疗法诱导的自身免疫疾病和其它自身免疫疾病；器官移植排斥；炎性病症，如急性结肠憩室炎和辐射诱导的胃肠道炎症，如放射性直肠炎、放射性肠炎和放射性乙状结肠炎，以及其它炎性病症；和慢性疼痛，如纤维肌痛和其它类型的慢性疼痛。
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通过口服施用bt-11使用免疫代谢机制治疗艰难梭菌感染
介绍
艰难梭菌感染(cdi)率的增加强调了抗生素选择因素、失败的感染对照物量度以及当前疗法的不足。万古霉素和甲硝哒唑的抗微生物疗法产生了85-90％的预期反应率，伴随着两种药物存在20-25％的复发风险[1-3]。甲硝哒唑是首选的一线疗法，因为成本低并且对万古霉素耐药性的选择性压力减小。然而，两种治疗方法都完全破坏了正常的结肠菌群，所述菌群提供了对艰难梭菌的定殖抗性[4,5]。最近的研究对甲硝哒唑在次优的主要反应和高出预期的复发率方面治疗cdi的功效提出了质疑[6,7]。因此，对不含抗生素并且促进抗生素管理和微生物保存的化合物进行优化是新颖、及时并且迫切需要的。以下实例利用免疫代谢作用来治疗艰难梭菌感染。
方法
艰难梭菌动物模型。
本研究遵循先前报道的艰难梭菌感染模型[11,13,14]。在细菌激发之前，在感染前一天，用饮用水中的以下抗生素混合物处理小鼠：粘菌素850u/ml(4.2mg/kg)、庆大霉素0.035mg/ml(3.5mg/kg)、甲硝唑0.215mg/ml(21.5mg/kg)、万古霉素0.045mg/ml(4.5mg/kg)，然后腹腔注射32mg/kg克林霉素。感染激发是通过强饲法，在布鲁氏菌肉汤中利用艰难梭菌菌株vpi10463(atcc43255)107cfu/小鼠。
流式细胞术。
将结肠和肠系膜淋巴结(mln)收集到含有胶原酶(300u/ml)和dnase(50u/ml)的rpmi/fbs缓冲液中进行消化。在过滤所得单细胞悬浮液后，通过percoll密度梯度纯化免疫细胞。在96孔板中，在连续的活体染色中，用细胞外抗体(cd45、cd3、cd4、cd8、cd19、nk1.1、cd25、f4/80、cd11b、cx3cr1、cd64)和细胞内抗体(tbet、rorγt、foxp3、ifnγ、il17、il10)的混合物对细胞进行标记。使用具有facsdiva软件的facscelesta流式细胞仪获取数据。
基因表达。
使用qiagenrneasy微型试剂盒产生来自结肠和细胞中的总rna。使用bioradiscriptcdna合成试剂盒产生cdna。通过用taqdna聚合酶对来自标准pcr反应的纯化产物进行系列稀释，然后使用qiagenminelutepcr纯化试剂盒进行纯化来产生标准曲线。通过用bioradcfx96热循环仪上的sybrgreensupermix定量实时pcr获得表达水平，然后对如先前所述的β-肌动蛋白的表达进行归一化[12]。
组织病理学。
从收集到10％福尔马林缓冲液中并包埋在石蜡中的结肠部分制备经h&e染色的结肠切片。通过olympus显微镜，由经委员会认证的兽医病理学家检查载玻片并用image-pro软件收集图像。针对白细胞浸润、上皮糜烂和粘膜增厚，对样本进行评分(0-4)。
细菌重新分离。
从切除的结肠收集结肠含量。将样品在布鲁氏菌肉汤(brucellabroth)中均质化并在68℃下温育一小时。样品以10,000rpm离心30秒，并且收集上清液。将上清液连续稀释(1:10、1:100、1:1000)并且平铺在含艰难梭菌选择性补充物的艰难梭菌琼脂平板上。使用bdez厌氧容器系统试剂盒在37℃厌氧条件下培养平板2天。对菌落计数，并将其与样品重量进行比较，以进行归一化。
结果
lancl2影响胃肠道微生物。
与媒剂相比，艰难梭菌感染的小鼠中lancl2的活化显著增加dpi4上的baicd含量(图8，小图a)。在未感染的小鼠中，随着lancl2的丢失，主要的产丁酸属(butyrogenicfamily)，毛螺菌科和瘤胃菌科减少(图8，小图b)。此外，发现抗微生物肽defb1和s100a8的表达随cdi上调[11]。因此，共生微生物群动态受到对艰难梭菌有反应而存在的炎症的阻碍，从而表明基于免疫调节的疗法对微生物群介导抑制艰难梭菌的扩增和定殖具有积极的作用[9]。
bt-11对艰难梭菌不具有抗微生物特性。
艰难梭菌在厌氧条件下在含有bt-11、媒剂或万古霉素作为阳性对照物的切碎的肉培养基中培养。在1ug/ml、10ug/ml和100ug/ml下对bt-11进行了测试。结果示于图9中。在接种后24小时，没有检测出bt-11浓度诱导菌落形成单位的减少。同时，10ug/ml的万古霉素使菌落形成单位减少了95％，从400万减少到200,000以下。暴露于bt-11不会改变毒素a或毒素b的产生或艰难梭菌形成孢子的能力。
bt-11降低了疾病的严重性并且防止死亡率。
艰难杆菌的小鼠在感染后施用了8mg/kg/dbt-11。结果示于图10a-10c中。从第2天开始，经过bt-11处理的小鼠表现出较低的症状水平，导致较低的疾病活动评分。bt-11提供了全面的防死亡率保护，所述死亡率在媒剂处理对照物中在60％存活率时观察到。然而，bt-11并没有诱导结肠内艰难梭菌的负担。bt-11减少了结肠病理，包含减少结肠内白细胞的浸润。在固有层内，bt-11减少了嗜中性粒细胞、th1细胞和th17细胞，同时增加了调节性t细胞。
讨论
lancl2已经成为免疫介导疾病[8]和感染性疾病[9]的治疗靶标。lancl2在胃肠(gi)道中的上皮细胞和免疫细胞中表达。lancl2活化和bt-11处理调控免疫与代谢的界面中的反应，并且这些免疫代谢机制发挥治疗作用。这些数据证明了用bt-11活化免疫代谢机制以改善cdi的可行性。鉴于cdi中的疾病发病机制部分是由其毒素引起的，但也是由于失调的促炎性免疫反应引起的，我们已经评估了用bt-11靶向lancl2作为抗炎艰难梭菌疗法的功效。数据表明，用bt-11的口服治疗提供了全面的防死亡率保护，减少疾病活动并且减少患有cdi的小鼠中的炎症。
在cdi中疾病发病机制的免疫学因素中，最重要的是炎性细胞、组织损伤性th17细胞和调节性treg细胞之间的不平衡。重要的是，我们在本文中已经表明，bt-11影响cd4+t细胞内的免疫代谢途径，以促进调节细胞类型的分化和稳定性。增加foxp3表达稳定性的这些免疫代谢途径对于在cdi期间提供治疗作用至关重要。由于高度有效的细菌衍生的毒素，gi粘膜变为越来越炎性环境。环境中的这种转变使涉及内稳态和对微生物群耐受性的细胞失去这些能力，这加剧了共生微生物群的异常。通过bt-11和免疫代谢机制，bt-11处理促进了在存在炎症病状的情况下保持抑制功能并预防疾病的调节细胞。在加速补充抗生素后共生菌群的情况下，微生物群本身能够超越艰难梭菌并抑制其生长。
我们预测，向动物施用本发明的制备细胞将模拟直接施用本实例所示的bt-11的影响。
参考文献
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bt-11在治疗结肠直肠癌方面的治疗作用
结肠直肠癌是全球第三大常见癌症，2015年影响了940多万人。癌症发展过程中的代谢对肿瘤细胞本身的行为以及肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用两者都有贡献。肿瘤细胞的众所周知的特性是沃伯格效应(warburgeffect)，即使在存在氧气的情况下，也倾向于厌氧糖酵解。这种葡萄糖代谢为乳酸对癌细胞有多方面的益处：为细胞生长和增殖提供快速能量来源，酸化微环境并消耗细胞毒性免疫细胞必需的代谢底物。最近，已经阐明靶向此处理是控制肿瘤进展、生长和转移的有效手段。癌细胞能够在免疫细胞中诱导无反应性和凋亡，从而阻止向氧化磷酸化的转变，所述氧化磷酸化帮助在识别后消除癌细胞。代谢图谱的这种转变实现可以增强来自cd8+细胞的抗肿瘤反应的记忆性t细胞的发展。因此，靶向免疫代谢代表了一种用于限制肿瘤细胞生长，同时实现免疫介导消除癌细胞的治疗。
bt-11为结直肠癌和其它癌症的治疗提供了一种安全、无细胞毒性的选择。与其它直接以杀死癌细胞为目的的治疗不同，bt-11能够诱导有效的免疫代谢效应，所述免疫代谢效应限制细胞增殖，同时刺激来自免疫系统的记忆反应。向细胞施用bt-11降低了乳酸脱氢酶的活性和乳酸的产生，同时增加了氧化磷酸化途径。乳酸代谢的bt-11介导抑制进一步与细胞增殖的减少有关，这限制了肿瘤细胞进展的扩增。另外，这些代谢影响阻止了肿瘤微环境的调控，从而降低了完全建立的免疫规避策略的可能性。进一步地，bt-11对免疫细胞代谢的直接影响增加了氧化磷酸化，并允许细胞向记忆状态转变。bt-11已经被证明能够诱导记忆cd4+t细胞发育。利用肿瘤和免疫细胞结合的效力，bt-11是治疗结肠直肠癌和其它癌症的一种可行的化疗替代方案。我们预测，向动物施用本发明的制备细胞将模拟本实例所述的bt-11的影响。
动脉粥样硬化斑块形成和动脉炎症的预防
动脉粥样硬化是一种心血管疾病，其特征是通过动脉壁内的纤维斑块使动脉狭窄。动脉粥样硬化是美国由肥胖、高血压和不良饮食引起并导致心脏病发作、中风和肾衰竭的发生的主要死亡原因。动脉粥样硬化是一种最重要的免疫代谢疾病，其是由内皮细胞分泌的炎症介质和高浓度的低密度脂蛋白引起的白细胞活化导致的。随着时间的推移，这种活化导致血小板、胆固醇和结晶钙在动脉壁中沉积。在高脂血症的条件下，持续暴露于经过修饰的脂蛋白导致由细胞内压力的慢性累积导致的炎性巨噬细胞的极化。关键转录因子，如srebp、lxr和ppar的改变刺激导致核nf-κb、nlr和其它炎症途径的活化。心血管疾病中的免疫代谢的另一个关键调节因子是ampk。二次免疫细胞的炎性介质表达的增加降低了免疫细胞中的ampk活性并且降低了脂质过氧化的速率。ampk活性的降低导致直接破坏有益的免疫反应，如creb转录因子活性的活化和抗炎性il-10的产生。信号传导的中断还通过减少利用脂肪酸以获取能量并且使细胞钙流量失调直接导致斑块的形成。
lancl2是一种与ampk和creb活动以及il-10的产生和钙信号传导的调节相连的上游信号传导元素。lancl2天然存在的配体(脱落酸)与高脂肪喂养期间ppar活性和抗炎反应的调控有关。当向人外周血单个核细胞施用时，bt-11能够降低促炎性、动脉粥样硬化相关联细胞因子ifnγ和tnfα的表达，并且还增加il-10的产生。与这些效应交织在一起，bt-11增加了免疫细胞中的氧化能力，从而表明具有在热量过剩的环境中维持代谢内稳态的能力。通过影响受动脉粥样硬化影响的免疫途径和代谢途径两者，bt-11处理动脉粥样硬化病理和疾病，并且阻止动脉壁中的细胞、细胞片段和代谢物的持续募集和沉积。我们预测，向动物施用本发明的制备细胞将模拟本实例所述的bt-11的影响。
安德森病中糖原代谢的调控
安德森病是一种与糖原储存缺陷有关的先天性代谢缺陷。安德森病是由gbe1基因的缺陷和突变引起的，所述基因编码负责糖原分支的酶。未分支的糖原溶解度较低，这导致心脏和肝脏内的沉淀和累积。另外的证据表明，免疫细胞开始对此异常糖原进行反应。已从安德森病和拉福拉病患者的心脏和肝脏组织中分离出对聚葡萄糖有反应的抗体。免疫细胞对多聚葡萄糖的摄取和反应可能会加剧对心脏和肝脏组织的损害，从而加速恶化患者健康。安德森病患者体内壳三糖酶的升高进一步支持了这一点。壳三糖酶是由巨噬细胞在防御反应和慢性肝病期间产生的一种酶和炎性标记物。
bt-11和其它相关的lancl2配体与有效和受控的葡萄糖氧化相一致，而lancl2的活化与葡萄糖的内稳态有关。通过bt-11或其它配体活化lancl2减轻了安德森病患者中糖原的累积。而且，有助于bt-11或其它相关配体的益处的是对防御反应的调控。抗体和壳三糖酶的产生表明免疫系统将未分支的糖原识别为异物，导致炎症加重。bt-11和其它相关配体能够诱导对典型抗原的耐受性。在保持免疫耐受性的情况下，未分支糖原能够从体内分泌并排出。我们预测，向动物施用本发明的制备细胞将模拟本实例所述的bt-11的影响。
纤维肌痛的代谢和炎性异常的恢复
纤维肌痛是一种引起全身广泛疼痛的病症。这种疾病危害着美国300多万人而且无法治愈。目前的治疗包含血清素摄取抑制剂、止痛药和非甾体抗炎药，其旨在减轻由疾病引起的慢性疼痛、疲劳和情绪变化。最近，纤维肌痛患者被鉴定为具有升高的炎性标记物水平，如嗜中性粒细胞吸引趋化因子、il-8和广泛的炎性标记物c-反应蛋白。具体地，纤维肌痛患者的神经胶质细胞产生改变的趋化因子和细胞因子图谱，表明免疫系统参与了疾病的症状和发病机制。另外，与健康的对照物相比，纤维肌痛患者体内免疫细胞的代谢发生了转变。结合超氧化物形成和脂质过氧化的增加，纤维肌痛单核细胞的线粒体膜电位和辅酶q10降低。这些变化是高度炎性免疫细胞和总氧化应激的象征。进一步地，在患有与调节反应相关联单核细胞亚群的纤维肌痛患者中，疼痛的严重性与其它症状的严重性呈负相关。
靶向lancl2或其它免疫代谢途径的bt-11和其它相关化合物减少了由免疫细胞内某些代谢途径引起的氧化应激。这种氧化应激和超氧化物产生的减少可以减少神经细胞的过度活化并且减少刺激神经胶质细胞以产生炎性趋化因子。而且，lancl2的活化可以影响单核细胞和其它单核细胞向调节亚群的极化。这些细胞亚群与抗炎反应、组织内稳态和伤口愈合相关联。对免疫细胞的代谢图谱和调节性单核细胞亚群的极化的组合效应使bt-11成为治疗纤维肌痛和其它慢性疼痛病症的新的和理想的候选药物。我们预测，向动物施用本发明的制备细胞将模拟本实例所述的bt-11的影响。
用于治疗炎性疾病的cd4+t细胞的离体治疗
bt-11通过免疫代谢信号传导改变体外细胞表型图谱和体内免疫反应。具体地，bt-11使cd4+t细胞成型以增加foxp3的表达，增加抑制能力并且增加这些调节细胞在炎性病状中的稳定性。因此，用bt-11离体处理的细胞的过继转移有益于治疗炎性疾病和cd4+t细胞反应不足的病症，如炎性肠病、移植物抗宿主病和本文所述的其它疾病。
方法
通过磁性分选从小鼠脾脏中分离出原初cd4+t细胞。分离处的细胞在treg分化培养基中的抗cd3/抗cd28包被的96孔板中温育。treg分化培养基是添加有胎牛血清、hepes、青霉素/链霉素、l-谷氨酰胺和分化剂的iscove改良杜氏培养基(imdm)培养基(赛默飞世尔科技公司)。treg分化剂为10nm全反式视黄酸和5ng/ml的tgf-β。进行另外的实验，比较在加入和不加入10ng/mlil-2或il-12的情况下treg分化培养基中的分化。在测定前，细胞在分化培养基中与媒剂、10nm或100nm的bt-11温育48小时。在测定前，用pma和离子霉素刺激细胞6小时。
在转移实验中，通过磁性分选，粉碎并富集供体脾以获得cd4+级分。通过facsaria细胞分选仪分选cd4+cd45rbhicd25-(teff)细胞和cd4+cd45rblocd25+(tregg)细胞。分离出的treg在媒剂或bt-11(100nm)存在的情况下培养12小时。分离出的teff在媒剂中培养12小时。基于指示的实验组，rag2-/-受体小鼠通过腹膜内注射接受来自媒剂或bt-11处理组的4x105teff细胞和1x105treg细胞。每周对小鼠称重并评分，直到转移后5周进行安乐死。
将结肠固有层淋巴细胞和培养细胞平铺在96孔板(6x105细胞/孔)中，并通过如先前所述的流式细胞术进行免疫表型分析。简言之，细胞与细胞外标记物的以下荧光染料缀合抗体一起温育：cd45、cd4、cd3、cd25、cd8。需要二次染色的样品与二次抗体或链霉亲和素缀合的荧光染料一起温育。然后样品被固定并渗透。细胞与细胞内标记物的以下抗体一起温育：tbet、ifnγ、il10、foxp3、il17、rorγt。数据用bdfacscelesta流式细胞仪获取并且使用facsdiva软件(bdpharmingen)进行分析。
结果
鉴于cd25+foxp3+调节性cd4+t细胞对bt-11的功效的重要性，我们旨在确定bt-11对其分化和在炎性病状中保持表型能力的直接影响。根据上述方法，在存在或缺少il-2的情况下，在体外将原初cd4+t细胞分化为treg。在缺少il-2的情况下，bt-11处理(100nm)显著增加了cd25+foxp3+亚型的建立，这种差异通过添加il-2而进一步增强(图11a，小图a)。在低至10nm的浓度下，在缺少il-2的情况下，bt-11诱导显著更多的cd25+foxp3+细胞。在这些分化病状下，仅观察到低水平的混合cd25+tbet+亚型，并且这在统计学上未被bt-11改变(图11b，小图b)。值得注意的是，在添加il-2(其在bt-11存在时缺失)的情况下，经过媒剂处理的对照物出现了轻微的数字增加。同时，在经过il-12处理的样品中，bt-11保持显著更高的cd25+foxp3+细胞水平(图11a，小图c)。这与在缺少bt-11的情况下，在经过il-12处理的样品中cd25+foxp3+细胞的抑制形成对比(图11a，小图c)。添加il-12还诱导所有组中cd25+tbet+细胞的增加，但是bt-11提供了对此混合亚群的剂量依赖性保护(图11b，小图d)。
为了鉴定在体内由bt-11调控的信号传导途径，我们从在10周龄时出现结肠炎的媒剂处理和bt-11处理的mdr1a-/-小鼠中分离了结肠cd4+t细胞。在cd4+t细胞中，口服bt-11处理显著提高il-2信号传导途径的两个成员stat5a(图12a，小图a)和foxo1(图12a，小图c)的表达。同时，pten(图12a，小图b)和phlpp1(图12a，小图d)的表达略有增加，但并不显著。在体外，在基础treg分化培养基和在补充有il-2或il-12的treg分化培养基中，在经过bt-11处理的样品中以更大的比率对stat5a进行磷酸化(图12b，小图e)。foxo1在基础treg分化培养基和含有il-2的treg分化培养基两者中都受到类似影响，但在含有il-12的treg分化培养基中不受影响(图12b，小图f)。细胞还在缺少抑制剂pten(sf1670)或stat5(stat5i)的存在下分化。在含有il-2(图12c，小图g、h)或il-12(图12d，小图i、j)两者的treg分化培养基中，加入stat5i阻止bt-11对cd25+foxp3+细胞和cd25+tbet+细胞的影响。相比之下，sf1670仅阻止bt-11对含有il-2的培养基中的cd25+tbet+细胞的影响(图12c，小图h)。
rag2-/-小鼠缺乏成熟的t淋巴细和b淋巴细胞。因此，这些小鼠未能发展自身耐受性、微生物体内稳态和总体免疫调节的机制。将原初cd4+t细胞转移到rag2-/-小鼠中通过离体扩增转移的细胞并且以类似于活动炎性自身免疫疾病中经历的炎症表型的方式分化成炎症表型诱导由缺少这些机制引起的肠道炎症。我们假设用bt-11离体处理的调节细胞的转移将赋予受体动物内稳态和免疫调节的机制，我们发现这是事实。
用bt-11(100nm)离体处理的treg的过继转移降低了总体疾病严重性并且维持免疫益处直至转移后5周的测试极限持续时间(图13)。除了疾病的总体改善，用bt-11离体治疗treg导致结肠固有层细胞表型改变。在经过bt-11处理的treg组中，产生ifnγ以及il-17+rorγt+cd4+t细胞减少。同时，cd25+treg增加，表明稳定性增加，并且作为调节细胞的建立者群的能力增加。进一步地，与il-2/stat5信号轴的相互作用促进了细胞因子和趋化因子微环境中增强转移细胞的作用的重要变化。
这些结果表明，当在体内给药时，bt-11对免疫细胞的作用可以在离体治疗免疫细胞时复制。我们预测，向动物施用本发明的制备细胞将对治疗炎性疾病如ibd之外的本文所述的病状中的任何病状有效。
本发明各方面的示例性实施例
1.一种用通过使前体细胞与化合物接触产生的所述化合物或制备细胞治疗动物病状的方法，所述方法包括向所述动物施用治疗有效量的所述化合物或所述制备细胞，其中所述病状包括感染性疾病、过度增殖性病症、先天性代谢缺陷、慢性免疫代谢疾病、自身免疫疾病、器官移植排斥、炎性病症和慢性疼痛中的至少一种，并且其中所述化合物包括：
化合物，所述化合物是式z-y-q-y'-z'化合物，或其药学上可接受的盐或酯，其中：
z是：
y是：
q是哌嗪-1,4-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷-2,5-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2,5-二基；1,4-二氮杂环庚烷-1,4-二基；苯-1,4-二胺-n1,n4-二基；乙烷-1,2-二胺-n1,n2-二基；n1,n2-二烷基乙烷-1,2-二胺-n1,n2-二基；丙烷-1,3-二胺-n1,n3-二基；n1,n3-二烷基丙烷-1,3-二胺-n1,n3-二基；1,4-二氨蒽-9,10-二酮-1,4-二基；c6芳烃-1,4-二胺-n1,n4-二基，其中所述芳烃在2、3、5或6位被一到四个取代基取代，并且其中所述取代基独立地选自由以下组成的组：-c(o)o(c1到c6)烷基、oh、o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、cf3、f、cl和br；或者经过取代的哌嗪-1,4-二基，其中所述哌嗪在2、3、5或6位被一到八个取代基取代，并且其中所述取代基独立地选自由以下组成的组：(c1到c6)烷基、芳基、芳基(c1到c6)烷基、c(o)oh和c(o)o(c1到c6)烷基；
y'是：
或单键；并且
z'是：
或r5；
其中：
只有当z'是r5时，y'才是单键；
如果存在的话，则a1和a1'各自独立地是n、n(c1到c6)烷基、o、s或cr6；
如果存在的话，则a2和a2'各自独立地是n或cr7；
如果存在的话，则a3和a3'各自独立地是nr8、o或s；
如果存在的话，则a4和a4'各自独立地是n或cr9；
如果存在的话，则a5和a5'各自独立地是n或cr10；
如果存在的话，则a6和a6'各自独立地是n或cr11；
如果存在的话，则r1、r1'、r2、r2'、r3、r3'、r4、r4'、r5、r6、r7、r8、r9、r10和r11在每个实例中独立地选自由以下组成的组：氢；烷基；卤代；三氟甲基；二烷基氨基，其中每个烷基被独立地选择；-nh2；烷基氨基；芳基烷基；杂芳基烷基；杂环烷基；经过取代的杂环烷基，所述经过取代的杂环烷基被独立地选自由以下组成的组的1到2个取代基取代：-c(o)oh、-c(o)o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、-cf3、f、cl和br；以及经过取代的杂芳基烷基；
其中所述经过取代的杂芳基烷基被独立地选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：-nh2；-nh(c1到c6)烷基；-n((c1到c6)烷基)2，其中每个烷基被独立地选择；烷基；卤代；芳基；经过取代的芳基，所述经过取代的芳基被独立选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：-so2r12、-or13、-卤代、-cn、-cf3、氨烷基-、-s(o)r14和烷基；杂环烷基；杂芳基；经过取代的芳基，所述经过取代的芳基被独立选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：烷基、-cf3、f、cl和br；烷基氨基-；杂环烷基-烷基-氨基-；烷基氨基烷基氨基-；-nhc(o)or15；-nhc(o)nr16r17；-c(o)nr16r17；以及经过取代的杂芳基，所述经过取代的杂芳基被选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：烷基卤代、cn、nh2、-nh(c1-c6烷基)、-n(c1-c6烷基)2，其中每个烷基被独立地选择、-cf3以及经过取代的芳基，所述经过取代的芳基被独立地选自由以下组成的组的1到3个取代基取代：-s(o)2r15和-cn；
其中r12、r13、r14、r15、r16和r17各自独立地选自由以下组成的组：c1-c6烷基；二烷基氨基，所述二烷基氨基包括独立选择的c1-c6烷基；-nh2；烷基氨基；杂环烷基以及经过取代的杂环烷基，所述经过取代的杂环烷基被独立地选自由-c(o)o(c1-c6烷基)和-c1-c6烷基组成的组的一到两个取代基取代；或者
化合物，所述化合物包括式a-b-c或其药学上可接受的盐或酯，其中：
a是：
b是：
c是：
其中：
a7、a8、a9、a10、a11、a12、a13和a14各自独立地选自ch、cr18和n；
a15、a16、a17、a18、a19和a20各自独立地选自ch、cr19、n、nr20、o和s，条件是a15、a16和a17中的仅一个可以是n、nr20、o或s，并且a18、a19和a20中的仅一个可以是n、nr20、o或s；
r18和r19各自独立地选自c1-c6烷基；c1-c6二烷基氨基，其中每个c1-c6烷基被独立地选择；-nh2；烷基氨基；杂环烷基；以及经过取代的杂环烷基，其中所述经过取代的杂环烷基被独立地选自由以下组成的组的一到两个取代基取代：-c(o)o(c1-c6烷基)和c1-c6烷基；其中在具有多于一个cr18的化合物中，每个r18被独立地选择，并且在具有多于一个cr19的化合物中，每个r19被独立地选择；并且
r20是c1-c6烷基。
2.根据实施例1所述的方法，其中所述感染性疾病包括细菌性疾病。
3.根据实施例2所述的方法，其中所述细菌性疾病包括艰难梭菌感染。
4.根据实施例1所述的方法，其中所述过度增殖性病症包括癌症。
5.根据实施例4所述的方法，其中所述癌症包括胃肠道癌症。
6.根据实施例5所述的方法，其中所述胃肠道癌症包括结直肠癌。
7.根据实施例1所述的方法，其中所述过度增殖性病症包括家族性腺瘤性息肉病。
8.根据实施例1所述的方法，其中所述先天性代谢缺陷包括糖原贮积病。
9.根据实施例8所述的方法，其中所述糖原贮积病包括安德森病。
10.根据实施例1所述的方法，其中所述慢性免疫代谢性疾病包括心血管疾病。
11.根据实施例10所述的方法，其中所述心血管疾病包括动脉粥样硬化。
12.根据实施例1所述的方法，其中所述慢性免疫代谢性疾病包括高血压。
13.根据实施例1所述的方法，其中所述自身免疫包括系统性红斑狼疮和多发性硬化中的至少一种。
14.根据实施例1所述的方法，其中所述自身免疫疾病包括癌症免疫疗法诱导的自身免疫疾病。
15.根据实施例14所述的方法，其中所述癌症免疫疗法诱导的自身免疫疾病包括癌症免疫疗法诱导的风湿性疾病。
16.根据实施例1所述的方法，其中所述炎性病症包括急性结肠憩室炎。
17.根据实施例1所述的方法，其中所述炎性病症包括辐射诱导的胃肠道炎症。
18.根据实施例17所述的方法，其中所述辐射诱导的胃肠道炎症包括放射性直肠炎、放射性肠炎和放射性直肠乙状结肠炎中的至少一种。
19.根据实施例1所述的方法，其中所述慢性疼痛包括纤维肌痛。
20.根据实施例1所述的方法，其中所述病状包括炎性肠病。
21.根据实施例1所述的方法，其中所述病状包括克罗恩氏病。
22.根据实施例1所述的方法，其中所述病状包括溃疡性结肠炎。
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