本发明涉及对蛋白激酶具有抑制活性的噻吩并[3,2-d]-嘧啶化合物，4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺及其药学上可接受的盐，以及包含其作为活性成分的药物组合物，用于治疗由细胞异常生长引起的疾病。
背景技术：
：蛋白激酶是一种酶，在通过酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基中存在的羟基基团的磷酸化介导信号转导中起关键作用，并因此参与细胞生长、分化和增殖的调节。众所周知，细胞内信号传导途径的“开启状态”和“关闭状态”之间的平衡对于维持细胞的体内稳态至关重要。当由于特定蛋白激酶的过度表达或突变而中断了细胞内信号的(例如主要持续的“开启状态”)正常细胞内信号传导途径时，可能会导致各种疾病的爆发，例如癌症、炎性疾病、代谢性疾病和脑部疾病。据估计，人类基因组包含518种蛋白激酶，其构成所有人类基因的约1.7％[manning等人，science，298，(2002)，1912]。蛋白激酶可分为酪氨酸蛋白激酶(90或更多种类型)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。酪氨酸蛋白激酶可分为受体酪氨酸激酶，其包括58种不同的激酶，其可进一步分类为20种亚型；以及胞质/非受体酪氨酸激酶，其包括32种不同的激酶，其可进一步分类为10种亚型。受体酪氨酸激酶在其表面上具有可结合生长因子的激酶结构域以及发生酪氨酸残基的磷酸化的活性位点。生长因子与受体胞外域的结合可导致受体酪氨酸激酶形成聚合物，这可导致胞质域中特定酪氨酸残基的自磷酸化。这可能通过细胞内蛋白质的磷酸化触发一系列事件，这些蛋白质最终将细胞外信号传递至细胞核，从而引起可参与细胞生长、分化、增殖等的各种基因的转录和合成。在各种胞质激酶中，raf是参与由受体蛋白激酶引发的线性ras-raf-mek-erk促分裂原活化蛋白激酶(mapk)途径的激酶之一，受体蛋白激酶被生长因子激活[solit，d.b.等人，nature，439,(2006)，358]。已知三种类型的raf同工型，a-raf、b-raf和c-raf(raf-1)[jansenhw等人，emboj，2，(1983)，1969；maraisr.等人，cancersurv，27，(1996)，101]。由于已在大约30％的人类癌症组织中观察到mapk途径的异常激活，并且在癌症组织中证实了显示异常激活的b-raf和c-raf的基因突变，因此，人们普遍认为在癌组织的mapk途径中，raf发挥着非常重要的作用。因此，已提出使用对raf激酶的异常活性具有抑制作用的化合物来治疗癌症的方法。因此，许多raf和修饰的raf激酶抑制剂目前正在开发中或在正在进行的临床研究中进行测试。此类raf激酶抑制剂的实例包括用于肝癌治疗的索拉非尼(sorafenib)(bayer)和已被批准用于治疗黑素瘤的维罗非尼(vemurafenib)(plx-4032，rg7204，roche)。目前正在临床试验中测试的raf激酶抑制剂的其它实例包括：bayer的瑞戈非尼(regorafenib)和rdea119；novartis的raf265；advanchem的e3810；decipherapharma.的dcc2036；chugaipharma.的cki-27；和roche的ro-5126766。但是，尽管这些药物具有良好的初始性能，但在一段时间内给药时，其功效受到质疑，因为在某些患者中，在初始给药的约7个月后观察到了耐药性。据推测，这种退化可能是由于b-raf抑制剂的耐药性所致，这是由于raf的变化、不同raf同工型之间的互补信号系统的激活或除mapk以外的多种受体激酶的激活(由于ras不同途径的激活所致，ras是信号传导级联系统中使用的关键蛋白，由k-ra、n-ras和h-ras亚型组成)，导致mapk途径异常激活所致。不涉及raf激酶的信号传导途径之一是c-fms(细胞性猫麦克唐纳氏肉瘤，cellularfelinemcdonoughsarcoma)，也称为集落刺激因子-1受体(csf-1r)，它是最初从猫肉瘤病毒susanmcdonough株中分离的基因家族的成员。fms是由c-fms原癌基因编码的巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)的受体，其与kit、flt-3和pdgfr一起属于iii类rtk。据报道，fms酪氨酸激酶参与癌症转移。另一个实例是称为盘状蛋白结构域受体(discoidindomainreceptor，ddr)的受体蛋白酪氨酸激酶，其是具有与凝集素盘状蛋白相关的细胞外结构域的受体酪氨酸激酶的亚家族。对于诸如人类的动物，存在两种类型的ddr蛋白，ddr1型和ddr2型，它们具有相似的氨基酸序列，但由不同的基因编码。据报道，ddr蛋白可能与癌症的生长和转移过程有关。另外，在一些肿瘤细胞中观察到ddr的表达上调，并且有报道指出ddr的表达上调引起mmp-1和mmp-2的表达升高，这已知与癌症的生长有关。因此，据信，抑制此类激酶可导致针对各种类型癌症的治疗作用。具有改善的蛋白激酶抑制活性的化合物在国际公开号wo2013/100632中公开。技术实现要素：技术问题本领域中持续需要，针对raf、fms以及ddr1和ddr2激酶具有抑制活性且提供了与常规的raf激酶抑制剂相比对包括耐药性癌症在内的各种癌症的改善的治疗的化合物。解决技术问题的技术方案因此，本发明提供具有有效药代动力学和药效学性质的化合物和包含该化合物的药物组合物，其通过抑制raf(细胞生长、分化和增殖的关键调节剂)、fms以及ddr1和ddr2激酶来预防或治疗难治性癌症，包括耐药性癌症。本发明的一个实施方案涉及式(i)的化合物，4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺，或其药学上可接受的盐或水合物：如本文所用的术语“其盐或水合物”及其变体是指式(i)的化合物涵盖式(i)的化合物的盐、式(i)的化合物的水合物以及式(i)的化合物的盐的水合物。在一些实施方案中，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的纯度为至少95.0％。在各种实施方案的任一项中，式(i)的化合物及其药学上可接受的盐和水合物具有针对蛋白激酶的抑制活性。在一个实施方案中，抑制活性针对a-raf、b-raf、c-raf、ddr1、ddr2和fms的一种或多种。在一个实施方案中，式(i)为泛raf抑制剂。在此类的实施方案中，抑制活性针对a-raf、b-raf和c-raf。在另一个实施方案中，抑制活性是针对fms。还在另一个实施方案中，活性针对ddr1和ddr2激酶。本发明的另一个方面还涉及包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的药物组合物。本发明的另一个方面还涉及用于预防或治疗由一种或多种蛋白激酶的异常激活介导的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物给药本发明所述的化合物或包含所述化合物的组合物的任一种。本发明的有利效果对于蛋白激酶具有抑制活性的本发明的化合物，4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺，可有效地抑制包括raf在内的各种蛋白激酶，并且因此可单独或组合地用于预防或治疗与异常细胞生长有关的疾病，所述疾病通过ras蛋白的突变或过表达或其相关蛋白激酶的过度激活所引起。具体实施方式现将详细参考本发明的某些实施方案，其实施例在所附的结构和式中示出。尽管将结合所列举的实施方案来描述本发明，但应当理解的是，它们并不旨在将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明旨在涵盖可包括在如权利要求所限定的本发明的范围内的所有替代、修改和等同形式。本领域技术人员将认识到许多与本文描述的方法和物质相似或等同的方法和物质，其可用于实施本发明。本发明决不限于所描述的方法和物质。若并入的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和物质可用于本发明的实践或测试中，但以下描述适合的方法和物质。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。本公开涉及式(i)的化合物4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺或其药学上可接受的盐或水合物：本公开的化合物具有针对蛋白激酶的抑制活性。在一个实施方案中，化合物为raf抑制剂，其具有针对a-raf、b-raf和c-raf同工型的至少一种的抑制活性。在一个实施方案中，化合物为泛raf抑制剂，其具有针对大于一种a-raf、b-raf和c-raf同工型的抑制活性。在另一个实施方案中，抑制活性针对fms。在另一个实施方案中，活性针对ddr1和ddr2激酶。在另一个实施方案中，活性为泛raf，针对ddr1和ddr2激酶，和针对fms。在一些实施方案中，本发明的式(i)的化合物及其药学上可接受的盐和水合物为固体形式。在一些实施方案中，本发明的式(i)的化合物及其药学上可接受的盐和水合物在于药学载体的溶液中。在一些此类的实施方案中，溶液中式(i)的浓度为至少0.01mg/ml、至少0.05mg/ml、至少0.1mg/ml、至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml或至少5mg/ml。在各种实施方案的任一项中，如hplc所测得的，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的纯度为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％。在各种实施方案的任一项中，如hplc所测得的，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的测定为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％。本发明的化合物还可形成药学上可接受的盐。此类盐可为含有阴离子的药学上可接受的无毒酸加成盐，但不限于此。例如，该盐可包括由如下酸形成的酸加成盐：无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸等；有机碳酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸等；以及磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸等。在一个具体的实施方案中，酸加成盐是由硫酸、甲磺酸或氢卤酸(例如盐酸)形成的。在一个实施方案中，式(i)盐是双盐酸盐。此外，式(i)的化合物的水合物涵盖于本发明的范围内。本发明的化合物可以通过通用方案1，分别使用以下所示的通用方案1中获得的中间体或市售的原料或中间体来获得。此外，可通过使用micromasszqtm(waters)进行所得的4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺的质量分析。包含作为活性成分的4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺或其盐或水合物的药物组合物可用于预防或治疗由一种或多种蛋白激酶的异常激活引起的细胞生长异常疾病。此外，本发明涉及用于预防或治疗由一种或多种蛋白激酶的异常激活介导的疾病的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药本发明化合物。例如，受试者为哺乳动物。蛋白激酶的实例包括alk、ampk、auroraa、aurorab、aurorac、axl、blk、bmx、btk、camk、cdk2/细胞周期蛋白e、cdk5/p25、chk1、ck2、a-raf、b-raf、c-raf、ddr1、ddr2、dmpk、egfr1、her2、her4、epha1、ephb1、fak、fgfr2、fgfr3、fgfr4、flt-1、flt-3、flt-4、fms(csf-1)、fyn、gsk3β、hipk1、ikkβ、igfr-1r、ir、itk、jak2、jak3、kdr、kit、lck、lyn、mapk1、mapkap-k2、mek1、met、mkk6、mlck、nek2、p70s6k、pak2、pdgfrα、pdgfrβ、pdk1、pim-1、pka、pkbα、pkcα、plk1、ret、rock-i、rsk1、sapk2a、sgk、src、syk、tie-2、tec、trk或zap-70。在一些实施方案中，一种或多种蛋白激酶包括a-raf、b-raf、c-raf、ddr1、ddr2和fms的一种或多种。在一些实施方案中，一种或多种蛋白激酶包括a-raf、b-raf和c-raf的一种或多种。在一些实施方案中，一种或多种蛋白激酶包括ddr1和/或ddr2。在一些实施方案中，蛋白激酶为fms。根据本发明的药物组合物针对以上激酶具有抑制活性。本发明的药物组合物可有效针对的一种或多种蛋白激酶的异常激活所引起的细胞异常生长疾病的实例包括胃癌、肺癌、肝癌、大肠癌、小肠癌、胰腺癌、脑癌、骨癌、黑素瘤、乳腺癌、硬化性腺病、子宫癌、子宫颈癌、头颈癌、食道癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、肉瘤、前列腺癌、尿道癌、膀胱癌、血液癌、淋巴瘤、纤维腺瘤、炎症、糖尿病、肥胖症、银屑病、类风湿性关节炎、血管瘤、急性和慢性肾病、冠状动脉再狭窄、自身免疫性疾病、哮喘、神经退行性疾病、急性感染和眼部疾病，其由血管生成引起。在一些实施方案中，所述癌症为黑素瘤或肝癌。本公开的药物组合物可包含选自以下的药物：细胞信号转导抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷基化试剂、抗代谢药、抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、抗激素剂、抗雄激素、细胞分化/增殖/存活抑制剂、凋亡抑制剂、炎症抑制剂和p-糖蛋白抑制剂。在将本发明的药物组合物制成制剂的情况下，其可以与所述药物组合使用或与所述药物制成组合的制剂。在一些实施方案中，所述药物为细胞信号转导抑制剂。在一些此类方面中，细胞信号转导抑制剂为mek抑制剂。mek抑制剂药物的非限制性实例包括以下。(考比替尼(cobimetinib))；(gdc-0973；genentech)；[3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯氨基)苯基]-[3-羟基-3-[(2s)-哌啶-2-基]氮杂环丁烷-1-基]甲酮；cas#934660-93-2。gdc-0623(genentech)；5-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-n-(2-羟基乙氧基)咪唑并[1,5-a]吡啶-6-甲酰胺；cas#1168091-68-6。ro4987655(hoffman-laroche)；ch4987655；3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯氨基)-n-(2-羟基乙氧基)-5-[(3-氧代氧氮杂环己烷-2-基)甲基]苯甲酰胺；cas#874101-00-5。ro5126766(hoffman-laroche)；3-[[2-[(甲基氨基磺酰基)氨基]-3-氟吡啶-4-基]甲基]-4-甲基-7-[(嘧啶-2-基)氧基]-2h-1-苯并吡喃-2-酮；cas#946128-88-7。曲美替尼(trametinib)(glaxosmithkline)；gsk1120212；n-[3-[3-环丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-3,4,6,7-四氢-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代吡啶并[4,3-d]嘧啶-1(2h)-基]苯基]-乙酰胺；cas#871700-17-3。匹马司替(pimasertib)(arraybiopharma以及astrazeneca)；as-703026；merck。司美替尼(selumetinib)；azd6244；6-(4-溴-2-氯苯氨基)-7-氟-n-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺；cas#606143-52-6。瑞法替尼(refametinib)(bayer)；rdea119；bay86-9766；n-[3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯氨基)-6-甲氧基苯基]-1-[(2s)-2,3-二羟基丙基]环丙烷-1-磺酰胺；cas#923032-37-5。pd184352(pfizer)；ci-1040；(2-氯-4-碘苯基氨基)-n-环丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺；cas#212631-79-3。比美替尼(binimetinib)(arraybiopharma以及novartis)；mek162；5-((4-溴-2-氟苯基)氨基)-4-氟-n-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1h-苯并[d]咪唑-6-甲酰胺；cas#606143-89-9。pd0325901(pfizer)；n-[(2r)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺；cas#391210-10-9。azd8330(astrazeneca)；2-(2-氟-4-碘苯基氨基)-n-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺；cas#869357-68-6。tak-733(millenniumpharmaceutical以及takedapharmaceuticalcompany)；(r)-3-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3h,8h)-二酮；cas#1035555-63-5。wx-554(wilex，ag)。hl-085(binjiangpharma)。瑞格菲尼(bayer)；4-(4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基)-3-氟苯氧基)-n-甲基吡啶酰胺；cas#755037-03-7。raf265(novartis)；chir-265；1-甲基-5-[2-[5-(三氟甲基)-1h-咪唑-2-基]吡啶-4-基]氧基-n-[4-(三氟甲基)苯基]苯并咪唑-2-胺；cas#927880-90-8。德立替尼(lucitanib)(advanchem)；e3810；6-((7-((1-氨基环丙基)甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基)氧基)-n-甲基-1-萘甲酰胺；cas#1058137-23-7。rebastanib(decipherapharm)；dcc2036；4-[4-[[[[3-(1,1-二甲基乙基)-1-(6-喹啉基)-1h-吡唑-5-基]氨基]羰基]氨基]-3-氟苯氧基]-n-甲基-2-吡啶甲酰胺；cas#1020172-07-9。ck-127(chugaipharma)；rg7304；(e)-5-(2-亚苄基-1-甲基肼基)哒嗪-3(2h)-酮；cas#213406-50-9。在一些实施方案中，所述药物为考比替尼。本发明的药物组合物可包含常规药学上可接受的赋形剂，包括载体、稀释剂、佐剂、添加剂和媒剂。药物组合物可以按照常规方法配制，并且可以制备成口服制剂形式，例如片剂、丸剂、散剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、微乳剂等，或肠道外制剂，例如肌内、静脉内或皮下给药。当将本发明的药物组合物制备成用于口服给药的制剂时，所用的载体可包括例如但不限于纤维素、硅酸钙、玉米淀粉、乳糖、蔗糖、右旋糖、磷酸钙、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、明胶、滑石粉、表面活性剂、悬浮剂、乳化剂、稀释剂及其组合。另外，当将药物组合物制备成用于口服给药的制剂时，所用的稀释剂可包括例如但不限于乳糖、甘露醇、糖类、微晶纤维素、纤维素衍生物、玉米淀粉及其组合。用于口服给药的制剂还可包括例如但不限于聚合物(例如亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮)、抗氧化剂、防腐剂、润湿剂、润滑剂、助流剂、加工助剂、制粒剂、分散剂、着色剂、调味剂。可通过在适合的机器中将自由流动形式的活性成分例如粉末或颗粒压制，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合来制备压制的片剂。模制片剂可通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物来制备。片剂可任选地被包衣或刻痕。片剂可不包衣或可通过包括微囊化在内的已知技术包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长的时间内提供持续作用。例如，可使用延时材料，例如单独使用单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或将其与蜡一起使用，并任选地配制以提供活性成分从中的缓慢或受控释放。当将本发明的药物组合物制备成注射剂时，所用的载体可包括例如但不限于水、盐水、葡萄糖水溶液、糖状水溶液、醇、二醇(例如，聚乙二醇400)、醚、油、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油酯、表面活性剂、悬浮剂、乳化剂及其组合。实施例实施例1：制备式(i)化合物式(i)化合物可根据如下的步骤1至4制备。在以下制备实施例、制备方法和实施例中使用以下缩写：缩写定义fe铁，粉末cdmt4-氯-2,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪nmm4-甲基吗啉tea三乙胺chcl3氯仿ipa异丙醇ea乙酸乙酯hex正己烷etoh乙醇meoh甲醇dmfn,n-二甲基甲酰胺pw净化水浓hcl35％盐酸水溶液mgso4硫酸镁nahco3碳酸氢钠盐水水中的氯化钠rbf圆底烧瓶nmr核磁共振本发明式(i)的化合物可通过通用方案1，分别使用以下所示的通用方案1中获得的中间体或市售的原料或中间体来制备。通用方案1在以下逐步反应中示例了上述反应过程。步骤1：制备1-氯-6-甲基异喹啉-5-胺将15.1g的铁粉(0.27mol，3.0当量)和0.3ml浓hcl(0.005mol，0.05当量)添加至300ml乙醇/净化水(15v/w)的1:1混合溶液中。将反应混合物加热至90℃，然后搅拌1小时。将20.0g的1-氯-6-甲基-5-硝基异喹啉(0.09mol，1.0当量)添加至反应混合物中，并搅拌回流5小时。将反应混合物通过(硅藻土)垫减压过滤，并用100ml氯仿/异丙醇(5v/w)的4:1混合溶液洗涤。减压蒸发滤液，并将残余物溶于200ml的氯仿/异丙醇(10v/w)的4:1混合溶液。将有机层用100ml碳酸氢钠水溶液(5v/w)和100ml盐水(5v/w)洗涤。将所得的有机层通过无水硫酸镁干燥并减压浓缩。将浓缩的固体在45℃的烘箱中干燥12小时，得到所需化合物为棕色固体(14.3g，83％)。1h-nmr光谱(300mhz,dmso-d6)δ8.12(m,2h),7.48(q,2h),5.87(s,2h),2.28(s,3h)。步骤2：制备4-氨基-n-(1-氯-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺将4-氨基噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-羧酸28.5g(0.15mol，1.0当量)溶于300mln,n-二甲基甲酰胺(10v/w)，然后在20-30℃添加25.7g的4-氯-2,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.15mol，1.0当量)和16.1ml的4-甲基吗啉(0.15mol，1.0当量)，然后搅拌20分钟。在20-30℃，将28.1g的1-氯-6-甲基异喹啉-5-胺(0.15mol，1.0当量)随后添加至反应混合物，然后搅拌12小时。向反应混合物中添加300ml净化水(10v/w)，并将反应混合物搅拌1小时。将反应混合物减压过滤，并用90ml净化水(3v/w)洗涤。将所得固体在45℃的烘箱中干燥12小时，得到所需化合物为棕色固体(33.2g，61％)。1h-nmr光谱(300mhz,dmso-d6)δ11.69(s,1h),8.95(s,1h),8.65(s,1h),8.37(m,2h),7.95(s,2h),7.88(m,2h),2.49(s,3h)。步骤3：制备4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺二盐酸盐将20g的4-氨基-n-(1-氯-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺(54.1mmol，1.0当量)和17.4g的4-氨基-2-氯-3-氟苯酚(108.2mmol，2.0当量)添加至密封管中，并在20-25℃将200ml异丙醇(10v/w)和13.5ml浓hcl(162.2mmol，3.0当量)添加至反应混合物中。将反应混合物加热至130℃，然后搅拌12小时。将反应溶液冷却至20-30℃。将固体减压过滤，然后用50ml异丙醇100ml(5v/w)洗涤，得到所需化合物为深棕色固体(23.5g，77％)。步骤4：制备4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺将23.5g的4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺二盐酸盐(41.4mmol，1.0当量)添加至1l圆底烧瓶中，并添加470ml甲醇(20v/w)。在20-25℃将12.7ml三乙胺(91.0mmol，2.2当量)添加至反应混合物中，然后搅拌2小时。将固体减压过滤，然后用100ml甲醇(5v/w)洗涤。将过滤的固体在45℃的烘箱中干燥12小时，得到所需化合物为棕色固体(11.7g，57％)。1h-nmr光谱(300mhz,dmso-d6)δ11.53(s,1h),10.48(br,1h),8.97(s,1h),8.92(d,1h),8.50(s,1h),8.32(d,1h),7.94(s,2h),7.79(d,1h),7.55(d,1h),7.20(t,1h),7.04(d,1h),6.82(d,1h),2.41(s,3h)。实施例2：制备式(i)化合物双盐酸盐步骤1：制备4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺二盐酸盐将11.7g的4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺(23.6mmol，1.0当量)添加至500ml圆底烧瓶中，并添加240ml的80％乙醇(20v/w)，然后在20-25℃添加5.9ml的浓hcl(70.9mmol，3.0当量)至反应混合物中。将反应混合物加热至90℃，然后搅拌2小时。将反应溶液冷却至20-30℃。将固体减压过滤，然后用58.5ml乙醇(5v/w)洗涤。将过滤的固体在45℃的烘箱中干燥12小时，得到所需化合物为棕色固体(10.9g，81％)。步骤2：提纯4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺二盐酸盐将10.9g的4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺二盐酸盐添加至3l圆底烧瓶中，并在20-25℃添加2l甲醇(200v/w)。将反应混合物加热至50℃，然后搅拌30分钟。将反应混合物冷却至20-30℃。添加1.1g的活性炭，然后搅拌3小时。将反应混合物通过硅藻土垫减压过滤，然后用100ml的甲醇(10v/w)洗涤。减压过滤(使用膜滤纸)滤液，然后用100ml的甲醇(10v/w)洗涤。减压蒸发滤液。向残余物中添加甲醇(200ml)，然后搅拌2小时。将固体减压过滤，然后用50ml的甲醇(5v/w)洗涤。将过滤的固体在45℃的烘箱中干燥12小时，得到所需化合物为淡棕色固体(7.7g，71％)。步骤3：提纯4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺二盐酸盐将7.7g的4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺二盐酸盐(13.6mmol，1.0当量)添加至250ml圆底烧瓶中，并在20-25℃将150ml的80％乙醇(20v/w)和2.3ml的浓hcl(27.1mmol，2.0当量)添加至反应混合物中。将反应混合物加热至90℃，然后搅拌1小时。将反应溶液冷却至20-30℃。将固体减压过滤，然后用38.5ml的乙醇(5v/w)洗涤。向所得固体中添加385ml的甲醇(50v/w)。将反应混合物加热至40℃，然后搅拌3小时。将固体减压过滤，然后用38.5ml的甲醇(5v/w)洗涤。将过滤的固体在45℃干燥12小时。将固体化合物随后在25℃、90％rh干燥12小时。将吸湿的固体随后在室温干燥6小时，得到所需化合物，为灰白色粉末(4.8g，62％)。纯度：hplc测得97.0％分析：hplc测得96.8％水分：4.7％1h-nmr光谱(300mhz,dmso-d6)δ11.60(s,1h),11.42(s,1h),9.47(s,1h),8.88(d,1h),8.62(s,1h),7.88(d,1h),7.56(d,1h),7.42(t,1h),7.32(d,1h),7.10(d,1h),2.50(s,3h)。实验例3：评估raf激酶活性根据制造商的说明，使用kinaseprofilingservice(thermofisherscientific，之前为invitrogen，美国)测试实施例2中制备的式(i)双盐酸盐(以下称为“化合物·2hcl”)针对raf的三种亚型，即raf1(c-raf)y340d/y341d、b-raf野生型和b-rafv600e的抑制活性。将化合物的酶促抑制水平计算为在各种浓度下的抑制百分数。基于抑制百分数，使用graphpadprism软件绘制剂量-反应曲线。表1列出了化合物·2hcl相对于c-rafyy340d/y341d、b-rafwt和b-rafv600e的ic50值，其中(维罗非尼，plx-4032，roche)用作对照。表1实验例4：评估对n-rasq61k突变细胞系sk-mel-30(人黑素瘤细胞)的细胞生长的抑制作用如下测试本发明化合物对增殖异常细胞的抑制活性。n-rasq61k突变体sk-mel-30黑素瘤细胞系(acc-151)从dsmz(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，德国)获得。sk-mel30细胞表达野生型b-raf和突变n-ras(q61k)。将sk-mel-30细胞在补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素(gibcobrl)的rpmi培养基中、于37℃、5％co2和95％空气中温育。将细胞以5,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并培养18小时或更长时间。然后，将细胞用0.1-10μm(1/10系列稀释)的测试化合物处理，并温育72小时。为了评估细胞活力，将sk-mel-30细胞系用10％tca(三氯乙酸)固定，并用srb(磺酰罗丹明b)染色，并在540nm处测量吸光度。然后，据此计算出gi50，即引起癌细胞增殖减少50％的药物浓度。通过等式1或2计算癌细胞的生长速率。等式1[(ti-tz)/(c-tz)]x100(对于ti≥tz)等式2[(ti-tz)/tz]x100(对于ti<tz)在等式1和2中，“tz”是指未处理细胞的密度，即0％细胞生长组的吸光度。“c”是指仅添加培养基培养的细胞密度，且“ti”是指经测试化合物处理的细胞密度。gi50值是等式1的值为50时的测试化合物的浓度，其表示将癌细胞的生长降低至50％所需的测试化合物的浓度。在每次测量中，将测试化合物与维罗非尼(plx-4032)对照进行比较。测量每种化合物的gi50值，并示于表2中。[表2]实施例sk-mel-30(gi50，nm)对照>10,000化合物·2hcl231如上所述，对蛋白激酶具有抑制活性的本发明化合物4-氨基-n-(1-((3-氯-2-氟-4-羟基苯基)氨基)-6-甲基异喹啉-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺可以有效地抑制包括raf在内的各种蛋白激酶，因此可以单独或组合用于预防和治疗与异常细胞生长相关的疾病，所述疾病由ras蛋白的突变或过表达或与其相关的蛋白激酶的过度激活引起。当前第1页12