一种高强度-多孔结构聚乙烯醇-单宁酸水凝胶的制备方法及应用与流程

本发明属于生物材料领域，特别是关节软骨修复领域，具体涉及一种具有高强度和多孔结构的聚乙烯醇-单宁酸水凝胶的制备方法及其在软骨修复领域的应用。

背景技术：

水凝胶是由高分子聚合物通过物理结合或化学交联得到的三维网络结构，由于其具有大量的亲水性基团，水凝胶对水具有很高的亲和力，可以吸收大量的水分，高含水量使得它们比其他合成生物材料更类似于天然活体组织。其中聚乙烯醇(pva)水凝胶由于具有化学性质稳定、无毒、无副作用、生物相容性良好等特点，被认为是理想的关节软骨替代材料。

尽管聚乙烯醇水凝胶一定程度上能够满足关节软骨替代材料的需要，但仍存在两个亟待解决的关键问题。一方面，聚乙烯醇水凝胶通常缺乏足够的生物活性，这主要归因于其缺乏足够的孔隙结构，孔隙尺寸通常在纳米到微米量级。研究认为，具有孔径分布在150-300μm的多孔水凝胶有利于软骨细胞的黏附、增殖和迁移，并利于软骨细胞分泌细胞外基质，与软骨组织长期结合，以获得良好的修复效果。为了获得较大孔径的多孔结构，通常采用成孔剂法、发泡法、相分离法、模板法等，其中冷凝胶法是一种低温冷冻下形成冰晶、解冻后冰晶融化留下孔隙的致孔方法，其制备方法简单、不引入有毒物质，常用于生物医药领域。使用冷凝胶法制备的多孔聚乙烯醇水凝胶通常仅具有10μm以下的孔径，与适合软骨细胞生长的多孔结构仍有较大差距。因此，如何在聚乙烯醇溶液中生成大尺寸冰晶以形成大孔结构是我们研究的重点之一。

另一方面，尽管聚乙烯醇水凝胶具有良好的力学性能，但多孔结构通常会大幅降低水凝胶的力学性能。对于关节软骨替代材料，良好的力学性能不仅能够维持材料的功能，并且对于材料的可使用性、耐用性有着重要影响。化学交联、纳米材料共混、双交联网络/半互穿网络水凝胶等方法常用以提升多孔水凝胶的力学性能，但这些方法多为材料带来毒性问题、孔结构问题，并且制备过程复杂。因此，在多孔结构的基础上维持甚至增强水凝胶的力学性能，以满足天然关节软骨的性能要求，是我们面临的另一大挑战。

本方法提出一种多孔结构-高强度聚乙烯醇-单宁酸水凝胶制备方法。在聚乙烯醇中引入单宁酸(ta)和微气泡，提升了水凝胶前驱溶液的冰晶形成能力，同时由于单宁酸与聚乙烯醇的分子间作用，极大地强化了水凝胶的力学性能，实现了“一步”制备兼具多孔结构和高强度的水凝胶。该法制备过程简单，所得的水凝胶具有满足软骨细胞黏附、增殖的多孔环境，以及与天然关节软骨相似的力学性能，可应用于关节软骨替代材料领域。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种兼具高强度与多孔结构的聚乙烯醇-单宁酸(pva-ta)水凝胶制备方法。采用聚乙烯醇为基体材料，利用冷凝胶法制备多孔结构，并通过冷冻解冻法交联成胶，避免了化学交联剂对材料生物相容性的影响。引入单宁酸，通过其与聚乙烯醇分子链之间的强氢键作用增强水凝胶的力学性能。通过盐与酸的反应生成气体，引入微气泡，与单宁酸共同增强冰晶的生成和生长能力。制备所得pva-ta水凝胶孔隙尺寸可达50-300μm，力学性能相比同等浓度纯聚乙烯醇水凝胶大幅提升。该制备方法操作简单，同时实现多孔结构的制备与力学性能的强化，制备所得的水凝胶具有良好的生物相容性，有利于其在关节软骨替代材料领域的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种高强度-多孔结构聚乙烯醇-单宁酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

第一步，将聚乙烯醇、单宁酸、碳酸钙、泊洛沙姆407按比例加入去离子水中，90-99℃恒温水浴加热，搅拌至聚乙烯醇完全融化且其余物质均匀混合，得到混合液a。

所述的聚乙烯醇的质量分数为10～20wt.％，单宁酸的质量分数0.1～4wt.％，碳酸钙的质量分数为0.5～5wt.％，泊洛沙姆407的质量分数为1wt.％。

其中，泊洛沙姆407为一种高分子非离子表面活性剂，用于稳定微气泡。

第二步，将混合液a置于室温下持续搅拌，温度降至20～50℃后备用。将酸类溶液逐滴加入上述混合液a，持续搅拌至碳酸钙与酸类充分反应产生微气泡，得到混合溶液b。所述的每100ml混合液a中，加入0.5～10ml酸类溶液。

所述的酸类溶液包括乙酸、盐酸、柠檬酸、硝酸中的一种，其中，盐酸、硝酸质量分数为15wt.％，乙酸、柠檬酸的质量分数为30wt.％。

第三步，将混合液b倒入模具中，对其进行冷冻解冻循环，得到聚乙烯醇水凝胶。所述冷冻解冻循环指混合液冷冻成型后取出解冻，再进行冷冻成型取出解冻，重复多次至形成pva-ta水凝胶。所述的冷冻温度为-18～-25℃，冷冻时间为12～20h，解冻温度为15～25℃，解冻时间为6～12h。循环次数为1次以上。

基于制备所得的pva-ta水凝胶进行压缩性能测试。将水凝胶切成1cm×1cm×1cm大小的立方体，并使其完全溶胀。进行单轴压缩实验，压缩速率为30％应变/分钟，设置最大应变率为0.6。

一种高强度-多孔结构聚乙烯醇-单宁酸水凝胶用于软骨修复领域。

基于制备所得的pva-ta水凝胶进行生物相容性测试。将大鼠关节软骨细胞接种于水凝胶，并置于5％二氧化碳培养箱培养7天。随后对水凝胶-软骨细胞共培养样品进行固定-脱水-干燥处理，使用扫描电子显微镜观察软骨细胞形态。

本发明提出的多孔结构-高强度pva-ta水凝胶的成胶机理：单宁酸(ta)是一种来源植物的天然酚类物质，其与聚乙烯醇(pva)极易形成强烈的分子间作用。pva-ta混合溶液中，由于pva分子链和ta分子链之间存在强氢键作用，促进了pva分子的局部聚集，减小了冰晶生长的空间位阻，同时微气泡的存在调节了冰晶的成核位点，使冰晶能够均匀分布。随着冷冻过程的进行，冰晶不断生长，同时pva分子链间通过氢键和范德华力紧密结合，形成结晶点，多次冷冻循环使先前未结合的部分进一步结合，强化了水凝胶的力学性能。并且由于ta与pva分子间强氢键作用的存在，使得pva-ta水凝胶的力学性能相较传统pva水凝胶大幅提升。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提出的多孔结构-高强度pva-ta水凝胶制备方法，在具备常规聚乙烯醇水凝胶高含水量、生物相容性良好、性质稳定等优势的基础上，通过引入单宁酸和微气泡，制备所得pva-ta水凝胶孔隙尺寸可达50-300μm，力学性能相比同等浓度纯pva水凝胶大幅提升。该制备方法操作简单，在获得适合软骨细胞生长的多孔结构的基础上，同时提升水凝胶的力学性能，成功解决了水凝胶多孔与高强度的兼具问题，有利于其在关节软骨替代材料领域的应用。

附图说明

图1为pva-ta水凝胶制备流程图；

图2为pva-ta水凝胶扫描电镜形貌图；

图3为pva-ta水凝胶压缩模量图；

图4为pva-ta水凝胶接种软骨细胞扫描电镜图。

具体实施方式

以下将结合技术实现方案和附图说明中的图1、图2和图3详细介绍本发明的具体实施方式。

图1是pva-ta水凝胶制备流程图，按照流程图操作可制备得到pva-ta水凝胶。图2是所制备水凝胶的断面形貌，将制备的水凝胶切块，冷冻干燥后观察切面结构，冷冻干燥可以保持水凝胶原始结构不被破坏。通过电镜照片我们发现所制备水凝胶中具备多孔结构，这一结构有利于软骨细胞的黏附、增殖、迁移以及修复材料与骨的生物连接。图3是所制备水凝胶的压缩性能图，选取应变0.1-0.2段计算压缩割线模量。从图中我们可以看出，相比于同等浓度的纯pva水凝胶，本方法制备所得的pva-ta水凝胶压缩模量大幅提升，可以满足关节软骨修复材料所需的力学性能。图4是pva-ta水凝胶-软骨细胞共培养扫描电镜图，软骨细胞在水凝胶表面及孔洞中均有生长，且细胞形态伸展，相互作用。表明该水凝胶对软骨细胞具有较好的粘附性和生物相容性。

实施例1

a)将10gpva、1gta、3g碳酸钙、1g泊洛沙姆407加入85ml去离子水中，90℃恒温水浴加热，搅拌至pva完全融化且其余物质均匀混合，得到混合液a。

b)将混合液a置于室温下持续搅拌，温度降至25℃后备用。将3ml乙酸按一定体积逐滴加入上述混合液a，持续搅拌至碳酸钙与乙酸充分反应产生微气泡，得到混合液b。

c)将混合液b倒入模具中，进行冷冻解冻循环，冷冻温度为-20℃，冷冻时间为15h，解冻温度为15℃，解冻时间为12h。循环次数为3次，得到聚乙烯醇水凝胶。

基于上述步骤制备的pva-ta水凝胶，对其进行形貌观察、力学性能、生物相容性实验。具体步骤如下：

1)形貌观察：将制备所得的水凝胶进行冷冻干燥处理，使用扫描电镜对其断面形貌进行观察。

2)力学性能实验：将制备所得的水凝胶切成1cm×1cm×1cm的立方体，使用万能试验机进行单轴压缩实验，设置最大应变率为0.6。

3)生物相容性实验：对水凝胶进行消毒处理，将大鼠关节软骨细胞接种于水凝胶，并置于5％二氧化碳培养箱培养7天。随后对水凝胶-软骨细胞共培养样品进行固定-脱水-干燥处理，使用扫描电子显微镜进行观察。

实施例2

a)将20gpva、4gta、2g碳酸钙、1g泊洛沙姆407加入73ml去离子水中，95℃恒温水浴加热，搅拌至pva完全融化且其余物质均匀混合，得到混合液a。

b)将混合液a置于室温下持续搅拌，温度降至40℃后备用。将3ml质量分数为15％的盐酸按一定体积逐滴加入上述混合液a，持续搅拌至碳酸钙与盐酸充分反应产生微气泡，得到混合液b。

c)将混合液b倒入模具中，进行冷冻解冻循环，冷冻温度为-18℃，冷冻时间为20h，解冻温度为20℃，解冻时间为4h。循环次数为2次，得到聚乙烯醇水凝胶。

基于上述步骤制备的pva-ta水凝胶，对其进行形貌观察、力学性能、生物相容性实验，具体步骤如实施例1。

实施例3

a)将13gpva、2gta、4g碳酸钙、1g泊洛沙姆407加入80ml去离子水中，99℃恒温水浴加热，搅拌至pva完全融化且其余物质均匀混合，得到混合液a。

b)将混合液a置于室温下持续搅拌，温度降至30℃后备用。将5ml柠檬酸按一定体积逐滴加入上述混合液a，持续搅拌至碳酸钙与乙酸充分反应产生微气泡，得到混合液b。

c)将混合液b倒入模具中，进行冷冻解冻循环，冷冻温度为-25℃，冷冻时间为18h，解冻温度为23℃，解冻时间为6h。循环次数为4次，得到聚乙烯醇水凝胶。

基于上述步骤制备的pva-ta水凝胶，对其进行形貌观察、力学性能、生物相容性实验，具体步骤如实施例1。

以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。