一种重组质粒pZQ12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-PHA的重组菌及其应用的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种重组质粒pzq12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的重组菌及其应用。
背景技术：
：随着石油化石燃料的不断消耗以及石化塑料造成的环境污染日益严重，生物基材料的开发与合成备受关注。聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，简称pha)，作为碳源和能源的贮藏材料，是一类由微生物合成的生物聚酯。pha因具有生物可降解性、生物兼容性等优良性能，被越来越多地用作环境友好型材料，以替代传统的石油基塑料。pha的组成单体3-羟基脂肪酸(3-hydroxyalkanoate，简称3ha)种类繁多、性质各异。正因为pha单体结构的多样性，使得其产生材料的性能亦具有多样性(即从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体)，因而比其他生物可降解材料具有更广阔的应用前景。一般来说，中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl-pha)，含有6～14个碳原子。传统的mcl-pha单体结构和组成难以调控、生产成本较高、工业生产得率较低，而且已有的mcl-pha种类单一、应用范围有限，因此，适用于生物材料、精细化工、医药营养等领域的新型mcl-pha亟待开发合成。另外，只含有偶数碳链单体的mcl-pha已经显示出理想的物理和机械性能，如果在其中增加奇数碳链单体的组分能够赋予该种生物材料更高的强度和柔韧性，使其更具有新颖性和实用性。但目前合成的含奇数碳链单体的mcl-pha单体只有3hhp、3hn等，碳链长度短、单体种类单一且合成所用的碳源价格昂贵、对微生物细胞具有毒性，不利于细胞生长和mcl-pha的合成与积累。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种重组质粒pzq12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的重组菌，能够在仅利用葡萄糖为碳源的条件下进行发酵，合成奇偶数碳链单体共聚的mcl-pha。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种重组质粒pzq12，cima基因插入到质粒pacycduet-1的ncoi和bamhi多克隆位点处；leubcd基因插入到质粒pacycduet-1的bamhi和saci多克隆位点处；ilva基因插入到质粒pacycduet-1的saci和asci多克隆位点；thra*bc基因插入到质粒pacycduet-1的asci多克隆位点处；所述cima基因具有序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述leubcd基因具有序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列；所述ilva基因具有序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列；所述thra*bc基因具有序列表中seqidno.4所示的核苷酸序列。本发明提供了一种上述方案所述重组质粒pzq12的制备方法，包括如下步骤：1)采用ncoi和bamhi分别对质粒pacycduet-1和cima基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1和cima基因；2)将所述步骤1)的酶切后的pacycduet-1和cima基因连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima；3)采用bamhi和saci分别对所述步骤2)的重组质粒pacycduet-1-cima和leubcd基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima和leubcd基因；4)将所述步骤3)的酶切后的pacycduet-1-cima和leubcd基因连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd；5)采用saci和asci分别对所述步骤4)的重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因；6)将所述步骤5)的酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva；7)采用asci分别对所述步骤6)的重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因进行单酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因；8)将所述步骤7)的酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因连接，得到重组质粒pzq12。优选的，所述步骤1)中cima基因的制备方法包括如下步骤：a.提取甲烷细菌mb1的总dna；b.以所述步骤a的总dna为模板，采用引物cima-f和cima-r扩增cima基因，得到cima基因；所述引物cima-f具有序列表中seqidno.5所示的核苷酸序列；所述引物cima-r具有序列表中seqidno.6所示的核苷酸序列。优选的，所述步骤3)中leubcd基因的制备方法包括如下步骤：(1)提取大肠杆菌mg1655的总dna；(2)以所述步骤(1)的总dna为模板，采用引物leubcd-f和leubcd-r扩增leubcd基因，得到leubcd基因；所述引物leubcd-f具有序列表中seqidno.7所示的核苷酸序列；所述引物leubcd-r具有序列表中seqidno.8所示的核苷酸序列。优选的，所述步骤5)中ilva基因的制备方法包括如下步骤：①提取荧光假单胞菌picf7的总dna；②以所述步骤①的总dna为模板，采用引物ilva-f和ilva-r扩增ilva基因，得到ilva基因；所述引物ilva-f具有序列表中seqidno.9所示的核苷酸序列；所述引物ilva-r具有序列表中seqidno.10所示的核苷酸序列。优选的，所述步骤b、(2)和②中扩增的扩增程序独立为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。优选的，所述步骤7)中thra*bc基因的制备方法包括如下步骤：(s1)提取大肠杆菌mds42的总dna；(s2)以所述步骤s1的总dna为模板，采用引物thra-f1/thra-r1和thra-f2/thra-r2分别进行扩增，得到两条片段；(s3)将所述步骤s2得到的两条片段混合后，将得到的混合片段为模板，采用引物thra-f1和thra-r2进行扩增，得到定点突变后的thra*基因；(s4)以所述步骤s1的总dna为模板，采用引物thrbc-f/thrbc-r进行扩增，得到thrbc基因；(s5)以所述步骤s3的thra*基因和所述步骤s4的thrbc基因为模板，采用引物thra*bc-f/thra*bc-r进行扩增，得到thra*bc基因；所述引物thra-f1具有序列表中seqidno.11所示的核苷酸序列；所述引物thra-r1具有序列表中seqidno.12所示的核苷酸序列；所述引物thra-f2具有序列表中seqidno.13所示的核苷酸序列；所述引物thra-r2具有序列表中seqidno.14所示的核苷酸序列；所述引物thrbc-f具有序列表中seqidno.15所示的核苷酸序列；所述引物thrbc-r具有序列表中seqidno.16所示的核苷酸序列；所述引物thra*bc-f具有序列表中seqidno.17所示的核苷酸序列；所述引物thra*bc-r具有序列表中seqidno.18所示的核苷酸序列。本发明提供了一种用于合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的重组菌，采用如下方法制备：将上述方案所述的重组质粒pzq12和重组质粒pqq05转入大肠杆菌lz09中得到；所述大肠杆菌lz09为大肠杆菌lz05敲除乙酸合成基因acka、poxb、乳酸合成基因ldha后得到。本发明提供了一种上述方案所述的重组菌在合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha中的应用。本发明提供了一种重组质粒pzq12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的重组菌及其应用。在本发明中，所述重组质粒pzq12包括cima基因插入到质粒pacycduet-1的ncoi和bamhi多克隆位点处；leubcd基因插入到质粒pacycduet-1的bamhi和saci多克隆位点处；ilva基因插入到质粒pacycduet-1的saci和asci多克隆位点；thra*bc基因插入到质粒pacycduet-1的asci多克隆位点处。将cima、leubcd、ilva和thra*bc基因插入到质粒pacycduet-1的特定多克隆位点，该重组质粒能够过表达相关酶基因，为合成奇数碳链单体提供更多的前体-丙酰辅酶a，从而实现本发明所述的奇数碳链单体的合成。进一步的，本发明提供了一种用于合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的重组菌，包括将上述方案所述的重组质粒pzq12和重组质粒pqq05转入大肠杆菌lz09中得到。通过在大肠杆菌lz05中敲除乙酸合成基因acka、poxb、乳酸合成基因ldha，构建lz09菌株，从而抑制乙酸和乳酸等副产物的合成，并将能够合成偶数碳链单体及进行碳链延伸的重组质粒pqq05和能够合成奇数碳链单体的重组质粒pzq12转入大肠杆菌lz09中，使重组菌能够更好地利用碳源合成奇偶数碳链单体共聚的mcl-pha。实施例结果表明：奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的合成量约占细胞干重的3.9％。同时本发明提供的重组菌利用廉价且来源广泛的葡萄糖为唯一碳源，有效地避免了传统合成方法中所应用碳源的细胞毒性和价格昂贵等缺点且新合成的mcl-pha的碳链单体种类较丰富，涵盖了6-14的奇偶数碳原子数目。附图说明图1为pcr验证cima基因电泳图(其中m代表marker)；图2为pcr验证leubcd基因电泳图(其中m代表marker)；图3为pcr验证ilva基因电泳图(其中m代表marker)；图4为pcr验证敲除基因电泳图(其中m代表marker；图4-a为acka基因敲除的验证；图4-b为poxb基因敲除的验证；图4-c为ldha基因敲除的验证)；图5为pcr验证thra*基因电泳图(其中m代表marker)；图6为pcr验证thrbc基因电泳图(其中m代表marker)。具体实施方式本发明提供了一种重组质粒pzq12，cima基因插入到质粒pacycduet-1的ncoi和bamhi多克隆位点处；leubcd基因插入到质粒pacycduet-1的bamhi和saci多克隆位点处；ilva基因插入到质粒pacycduet-1的saci和asci多克隆位点；thra*bc基因插入到质粒pacycduet-1的asci多克隆位点处；所述cima基因具有序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述leubcd基因具有序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列；所述ilva基因具有序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列；所述thra*bc基因具有序列表中seqidno.4所示的核苷酸序列。在本发明中，所述cima基因为柠苹酸合酶基因，该酶用于合成柠苹酸。在本发明中，所述cima基因来源于甲烷细菌(methanobacteriumsp.mb1)。在本发明中，所述leubcd基因用于合成亮氨酸。在本发明中，所述leubcd基因来源于大肠杆菌(escherichiacolimg1655)。在本发明中，所述ilva基因为苏氨酸脱水酶基因，其作用为进行苏氨酸脱水反应。在本发明中，所述ilva基因来源于荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescenspicf7)。在本发明中，所述thra*bc基因用于合成苏氨酸。本发明提供的重组质粒pzq12可以提供合成奇数碳链单体的前体物，为进一步合成奇偶数碳链单体共聚的中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl-pha)奠定基础。本发明提供了一种上述方案所述重组质粒pzq12的制备方法，包括如下步骤：1)采用ncoi和bamhi分别对质粒pacycduet-1和cima基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1和cima基因；2)将所述步骤1)的酶切后的pacycduet-1和cima基因连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima；3)采用bamhi和saci分别对所述步骤2)的重组质粒pacycduet-1-cima和leubcd基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima和leubcd基因；4)将所述步骤3)的酶切后的pacycduet-1-cima和leubcd基因连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd；5)采用saci和asci分别对所述步骤4)的重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因；6)将所述步骤5)的酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva；7)采用asci分别对所述步骤6)的重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因进行单酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因；8)将所述步骤7)的酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因连接，得到重组质粒pzq12。采用ncoi和bamhi分别对质粒pacycduet-1和cima基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1和cima基因。在本发明中，所述cima基因的制备方法优选包括如下步骤：a.提取甲烷细菌mb1的总dna；b.以所述步骤a的总dna为模板，采用引物cima-f和cima-r扩增cima基因，得到cima基因；所述引物cima-f具有序列表中seqidno.5所示的核苷酸序列；所述引物cima-r具有序列表中seqidno.6所示的核苷酸序列。本发明优选提取甲烷细菌mb1的总dna。本发明对所述提取甲烷细菌mb1的总dna的方法没有特殊限定，采用本领域常规提取dna的方法即可。本发明实施例中采用tiangen生产的试剂盒进行提取。得到甲烷细菌mb1的总dna后，本发明优选以所述甲烷细菌mb1的总dna为模板，采用引物cima-f和cima-r扩增cima基因，得到cima基因；所述引物cima-f具有序列表中seqidno.5所示的核苷酸序列；所述引物cima-r具有序列表中seqidno.6所示的核苷酸序列。在本发明中，所述cima基因扩增的扩增体系优选为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，cima-f1μl，cima-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。在本发明中，所述cima基因扩增的扩增程序优选为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。本发明对所述采用ncoi和bamhi分别对质粒pacycduet-1和cima基因进行双酶切的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法进行酶切即可。得到酶切后的pacycduet-1和cima基因后，本发明优选将所述酶切后的pacycduet-1和cima基因连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima。在本发明中，所述连接优选为采用t4dna连接酶进行连接。在本发明中，所述连接的温度优选为25℃。所述连接的体系优选为10×t4dnaligasebuffer1μl，cima基因片段7μl，pacycduet-11μl，t4dnaligase0.5μl，ddh2o0.5μl，总体系为10μl。得到重组质粒pacycduet-1-cima后，本发明优选采用bamhi和saci分别对所述重组质粒pacycduet-1-cima和leubcd基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima和leubcd基因。在本发明中，所述leubcd基因的制备方法包括如下步骤：(1)提取大肠杆菌mg1655的总dna；(2)以所述(1)的总dna为模板，采用引物leubcd-f和leubcd-r扩增leubcd基因，得到leubcd基因；所述引物leubcd-f具有序列表中seqidno.7所示的核苷酸序列；所述引物leubcd-r具有序列表中seqidno.8所示的核苷酸序列。本发明优选提取大肠杆菌mg1655的总dna。本发明对所述提取大肠杆菌mg1655的总dna的方法没有特殊限定，采用本领域常规提取dna的方法即可。本发明实施例中采用tiangen生产的试剂盒进行提取。得到大肠杆菌mg1655的总dna后，本发明优选以所述大肠杆菌mg1655的总dna为模板，采用引物leubcd-f和leubcd-r扩增leubcd基因，得到leubcd基因；所述引物leubcd-f具有序列表中seqidno.7所示的核苷酸序列；所述引物leubcd-r具有序列表中seqidno.8所示的核苷酸序列。在本发明中，所述leubcd基因扩增的扩增体系优选为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，leubcd-f1μl，leubcd-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。在本发明中，所述leubcd基因扩增的扩增程序优选为：预变性；94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。本发明对所述采用bamhi和saci分别对质粒pacycduet-1-cima和leubcd基因进行双酶切的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法进行酶切即可。得到酶切后的pacycduet-1-cima和leubcd基因后，本发明优选将所述酶切后的pacycduet-1-cima和leubcd基因连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd。在本发明中，所述连接优选为采用t4dna连接酶进行连接。在本发明中，所述连接的温度优选为25℃。所述连接的体系优选为10×t4dnaligasebuffer1μl，leubcd基因片段7μl，pacycduet-1-cima1μl，t4dnaligase0.5μl，ddh2o0.5μl，总体系为10μl。得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd后，本发明优选采用saci和asci分别对所述重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因。在本发明中，所述ilva基因的制备方法优选包括如下步骤：①提取荧光假单胞菌picf7的总dna；②以所述步骤①的总dna为模板，采用引物ilva-f和ilva-r扩增ilva基因，得到ilva基因；所述引物ilva-f具有序列表中seqidno.9所示的核苷酸序列；所述引物ilva-r具有序列表中seqidno.10所示的核苷酸序列。本发明优选提取荧光假单胞菌picf7的总dna，本发明对所述提取荧光假单胞菌picf7的总dna的方法没有特殊限定，采用本领域常规提取dna的方法即可。本发明实施例中采用tiangen生产的试剂盒进行提取。得到荧光假单胞菌picf7的总dna后，本发明优选以所述荧光假单胞菌picf7的总dna模板，采用引物ilva-f和ilva-r扩增ilva基因，得到ilva基因；所述引物ilva-f具有序列表中seqidno.9所示的核苷酸序列；所述引物ilva-r具有序列表中seqidno.10所示的核苷酸序列。在本发明中，所述ilva基因扩增的扩增体系优选为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，ilva-f1μl，ilva-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。在本发明中，所述ilva基因扩增的扩增程序优选为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。本发明对所述采用saci和asci分别对质粒pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因进行双酶切的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法进行酶切即可。得到酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因后，本发明优选将所述酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva。在本发明中，所述连接优选为采用t4dna连接酶进行连接。在本发明中，所述连接的温度优选为25℃。所述连接的体系优选为10×t4dnaligasebuffer1μl，ilva基因片段7μl，pacycduet-1-cima-leubcd1μl，t4dnaligase0.5μl，ddh2o0.5μl，总体系为10μl。得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva后，本发明采用asci分别对所述重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因进行单酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因。在本发明中，所述thra*bc基因的制备方法优选包括如下步骤：(s1)提取大肠杆菌mds42的总dna；(s2)以所述步骤s1的总dna为模板，采用引物thra-f1/thra-r1和thra-f2/thra-r2分别进行扩增，得到两条片段；(s3)将所述步骤s2得到的两条片段混合后，将得到的混合片段为模板，采用引物thra-f1和thra-r2进行扩增，得到定点突变后的thra*基因；(s4)以所述步骤s1的总dna为模板，采用引物thrbc-f/thrbc-r进行扩增，得到thrbc基因；(s5)以所述步骤s3的thra*基因和所述步骤s4的thrbc基因为模板，采用引物thra*bc-f/thra*bc-r进行扩增，得到thra*bc基因；所述引物thra-f1具有序列表中seqidno.11所示的核苷酸序列；所述引物thra-r1具有序列表中seqidno.12所示的核苷酸序列；所述引物thra-f2具有序列表中seqidno.13所示的核苷酸序列；所述引物thra-r2具有序列表中seqidno.14所示的核苷酸序列；所述引物thrbc-f具有序列表中seqidno.15所示的核苷酸序列；所述引物thrbc-r具有序列表中seqidno.16所示的核苷酸序列；所述引物thra*bc-f具有序列表中seqidno.17所示的核苷酸序列；所述引物thra*bc-r具有序列表中seqidno.18所示的核苷酸序列。本发明优选提取大肠杆菌mds42的总dna。在本发明中所述大肠杆菌为(escherichiacolimds42)。本发明对所述提取大肠杆菌mds42的总dna的方法没有特殊限定，采用本领域常规提取dna的方法即可。本发明实施例中采用tiangen生产的试剂盒进行提取。得到大肠杆菌mds42的总dna后，本发明优选以所述大肠杆菌mds42的总dna为模板，采用引物thra-f1/thra-r1和thra-f2/thra-r2分别进行扩增，得到两条片段；所述所述引物thra-f1具有序列表中seqidno.11所示的核苷酸序列；所述引物thra-r1具有序列表中seqidno.12所示的核苷酸序列；所述引物thra-f2具有序列表中seqidno.13所示的核苷酸序列；所述引物thra-r2具有序列表中seqidno.14所示的核苷酸序列。在本发明中，所述采用thra-f1/thra-r1和thra-f2/thra-r2引物进行扩增的扩增体系优选为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，thra-f1或thra-f21μl，thra-r1或thra-r21μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。在本发明中，所述利用thra-f1/thra-r1和thra-f2/thra-r2引物扩增的扩增程序优选为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。得到两条片段后，本发明将所述两条片段混合，以得到的混合片段为模板，采用引物thra-f1和thra-r2进行扩增，得到定点突变后的thra*基因；所示定点突变为escherichiacolimds42的thra基因的799位进行了定点突变，将c替换成t。在本发明中，优选以所述大肠杆菌mds42的总dna为模板，采用引物thrbc-f/thrbc-r进行扩增，得到thrbc基因。所述引物thrbc-f具有序列表中seqidno.15所示的核苷酸序列；所述引物thrbc-r具有序列表中seqidno.16所示的核苷酸序列。在本发明中，所述thrbc基因扩增的扩增体系优选为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，thrbc-f1μl，thrbc-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。在本发明中，thrbc基因扩增的扩增程序优选为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。得到thra*基因和thrbc基因后，本发明优选将以所述thra*基因和所述thrbc基因为模板，采用引物thra*bc-f/thra*bc-r进行扩增，得到thra*bc基因。所述引物thra*bc-f具有序列表中seqidno.17所示的核苷酸序列；所述引物thra*bc-r具有序列表中seqidno.18所示的核苷酸序列。在本发明中，所述thra*bc基因扩增的扩增体系优选为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，thra*bc-f1μl，thra*bc-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。在本发明中，所述thra*bc基因扩增的扩增程序优选为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。本发明对所述采用asci分别对重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因进行单酶切的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法进行酶切即可。得到酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因后，本发明将所述酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因连接，得到重组质粒pzq12。在本发明中，所述连接优选为采用t4dna连接酶进行连接。在本发明中，所述连接的温度优选为25℃。所述连接的体系优选为10×t4dnaligasebuffer1μl，thra*bc基因片段6μl，pacycduet-1-cima-leubcd-ilva2μl，t4dnaligase0.5μl，ddh2o0.5μl，总体系为10μl。本发明提供了一种用于合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的重组菌，采用如下方法制备：将上述方案所述的重组质粒pzq12和重组质粒pqq05转入大肠杆菌lz09中得到；所述大肠杆菌lz09为大肠杆菌lz05敲除乙酸合成基因acka、poxb和乳酸合成基因ldha后得到。在本发明中，所述大肠杆菌lz05和重组质粒pqq05优选为采用(synthesisofpolyhydroxyalkanoatesfromglucosethatcontainmedium-chain-lengthmonomersviathereversedfattyacidβ-oxidationcycleinescherichiacoli,zhuang,etal.2014(24)：78-86)的方法进行制备。本发明对所述敲除乙酸合成基因acka、poxb和乳酸合成基因ldha的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规方法即可。在本发明中，所述敲除乙酸合成基因acka、poxb和乳酸合成基因ldha的具体过程包括：设计乙酸合成基因acka、poxb和乳酸合成基因ldha的上、下游引物，以质粒pkd3或pkd4为模板，扩增带有相应抗性基因的同源重组片段。制备电转化感受态细胞，将带有相应抗性基因的同源重组片段通过电转化过程，转入已制备的电转化感受态细胞，而后进行敲除菌株的筛选鉴定，并将电转化的辅助质粒和相应抗性基因敲除。在本发明中，敲除乙酸合成基因acka的引物优选为acka-pkd4-f和acka-pkd4-r；所述引物acka-pkd4-f具有序列表中seqidno.19所示的核苷酸序列；所述引物acka-pkd4-r具有序列表中seqidno.20所示的核苷酸序列。在本发明中，敲除poxb的引物优选为poxb-pkd3-f和poxb-pkd3-r；所述引物poxb-pkd3-f具有序列表中seqidno.21所示的核苷酸序列；所述引物poxb-pkd3-r具有序列表中seqidno.22所示的核苷酸序列。在本发明中，敲除乳酸合成基因ldha的引物优选为ldha-pkd4-f和ldha-pkd4-r；所述引物ldha-pkd4-f具有序列表中seqidno.23所示的核苷酸序列；所述引物ldha-pkd4-r具有序列表中seqidno.24所示的核苷酸序列。在本发明中，所述扩增带有相应抗性基因的同源重组片段的扩增体系优选为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。在本发明中，所述扩增带有相应抗性基因的同源重组片段的扩增程序优选为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。在本发明中将乙酸合成基因acka、poxb和乳酸合成基因ldha敲除，可以抑制乙酸和乳酸等副产物的合成，使碳源最大限度地用于奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的合成。在本发明中，敲除乙酸合成基因acka、poxb和乳酸合成基因ldha后优选采用pcr进行验证上述基因是否敲除，所述pcr验证的引物优选为acka-f、acka-r、poxb-f、poxb-r、ldha-f和ldha-r；所述acka-f具有序列表中seqidno.25所示的核苷酸序列；所述acka-r具有序列表中seqidno.26所示的核苷酸序列；所述poxb-f具有序列表中seqidno.27所示的核苷酸序列；所述poxb-r具有序列表中seqidno.28所示的核苷酸序列；所述ldha-f具有序列表中seqidno.29所示的核苷酸序列；所述ldha-r具有序列表中seqidno.30所示的核苷酸序列。本发明提供了一种上述方案所述的重组菌在合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha中的应用。在本发明中，所述合成奇、偶数碳链单体共聚mcl-pha的具体方法优选为将所述重组菌进行平板划线，挑取单克隆，接种到lb培养基中(具体成分为：tryptone10g、yeastextract5g、nacl10g补加蒸馏水至1000ml，ph值为7.0；所述lb培养基使用之前在121℃条件下，灭菌20min)，在36～38℃条件下培养至对数生长期，得到种子液，再将种子液以5％接种量接种到装液量100ml/500ml的发酵培养基(lb培养基)中，在28～31℃，240～260rpm条件下摇瓶培养70～75h，发酵结束后将发酵液离心，得到合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的菌体，冻干后取15-30mg菌体干粉用于后续产物单体组成和含量检测。下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1a.提取甲烷细菌(methanobacteriumsp.mb1)的总dna；b.以所述步骤a的总dna为模板，采用引物cima-f和cima-r扩增cima基因(扩增体系为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，cima-f1μl，cima-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。扩增程序为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min，得到cima基因。采用pcr进行验证，具体结果如图1所示。由图1可以看出，出现cima基因条带，即得到cima基因。(1)提取大肠杆菌(escherichiacolimg1655)的总dna；(2)以所述步骤(1)的总dna为模板，采用引物leubcd-f和leubcd-r扩增leubcd基因(扩增体系为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，leubcd-f1μl，leubcd-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。扩增程序为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min，得到leubcd基因。采用pcr进行验证，具体结果如图2所示。由图2可以看出，出现leubcd基因条带，即得到leubcd基因。①提取荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescenspicf7)的总dna；②以所述步骤①的总dna为模板，采用引物ilva-f和ilva-f扩增ilva基因，扩增体系为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，ilva-f1μl，ilva-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。扩增程序为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min，得到ilva基因。采用pcr进行验证，具体结果如图3所示。由图3可以看出，出现ilva基因条带，即得到ilva基因。1)采用ncoi和bamhi分别对质粒pacycduet-1和cima基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1和cima基因；2)将酶切后的pacycduet-1和cima基因采用t4dna连接酶进行连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima；3)采用bamhi和saci分别对重组质粒pacycduet-1-cima和leubcd基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima和leubcd基因；4)将酶切后的pacycduet-1-cima和leubcd基因采用t4dna连接酶进行连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd；5)采用saci和asci分别对重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因进行双酶切，得到酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因；6)将酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd和ilva基因采用t4dna连接酶进行连接，得到重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva。实施例2以质粒pkd3或pkd4为模板，采用引物acka-pkd4-f、acka-pkd4-r、poxb-pkd3-f、poxb-pkd3-r、ldha-pkd4-f和ldha-pkd4-r扩增带有相应抗性基因的同源重组片段。制备电转化感受态细胞，进行电转化过程，筛选敲除上述基因后的菌株，得到lz09菌株。将得到的lz09菌株采用pcr进行验证(所述pcr验证的引物为acka-f、acka-r、poxb-f、poxb-r、ldha-f和ldha-r)。具体结果如图4所示，由图4可以看出：a、b、c中均无电泳条带，表明，基因已经敲除。实施例3(s1)提取大肠杆菌(escherichiacolimds42)的总dna；(s2)以所述步骤s1的总dna为模板，采用引物thra-f1/thra-r1和thra-f2/thra-r2分别进行扩增，扩增体系为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，thra-f1或thra-f21μl，thra-r1或thra-r21μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。扩增程序优选为预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min，得到两条片段；(s3)将所述步骤s2得到的两条片段混合后，将得到的混合片段为模板，采用引物thra-f1和thra-r2进行扩增，得到定点突变后的thra*基因；(采用pcr进行验证，具体结果如图5所示。由图5可以看出，出现thra*基因条带，即得到thra*基因)(s4)以所述步骤s1的总dna为模板，采用引物thrbc-f/thrbc-r进行扩增，得到thrbc基因(扩增体系为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，thrbc-f1μl，thrbc-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。thrbc基因扩增的扩增程序为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。pcr进行验证，具体结果如图6所示。由图6以看出，出现thrbc基因条带，即得到thrbc基因；(s5)以所述步骤s3的thra*基因和所述步骤s4的thrbc基因为模板，采用引物thra*bc-f/thra*bc-r进行扩增(扩增体系优选为10×hifidnapolymerasebuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，模板1μl，thra*bc-f1μl，thra*bc-r1μl，hifidnapolymerase0.5μl，ddh2o37.5μl，总体系为50μl。扩增程序为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min，得到thra*bc基因。采用asci分别对实施例1的重组质粒pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和上述得到的thra*bc基因进行酶切，将酶切后的pacycduet-1-cima-leubcd-ilva和thra*bc基因采用t4dna连接酶进行连接，重组质粒pzq12。实施例4将实施例3得到的重组质粒pzq12和重组质粒pqq05转入大肠杆菌lz09中，得到重组菌。将重组菌进行平板划线，挑取单克隆，加入到含lb培养基的摇瓶中，在37℃条件下培养至对数生长期后，得到种子液，再将种子液以5％接种量接种到装液量100ml/500ml的发酵培养基(lb培养基)中，在30℃，250rpm条件下发酵72h，收集发酵液，以5000rpm的转速离心15min，离心之后分离上清和菌体沉淀。将菌体冻干，取20mg菌体干粉进行甲酯化反应1h。冷却至室温后，加入1ml双蒸水来提取水相中的细胞碎片。10mg·ml-1的十五烷酸溶解在乙醇里加入其中，作为内标。将上述混合液振荡涡旋，12000rpm离心10min。静置分层之后，取500μl有机(氯仿)相移到一个新的gc检测瓶中。然后用气相色谱进行样品分析采用gc检测分析菌体中mcl-pha含量和单体组成。gc分析程序设置如表1所示：表1gc分析程序设置柱温保留时间80℃1min以10℃/min的速率升温到230℃10min表2菌体中mcl-pha的单体组成和含量注：3hhx，c6单体；3hhp，c7单体；3ho，c8单体；3hn，c9单体；3hd，c10单体；3hud，c11单体；3hdd，c12单体；3htrd，c13单体；3htd，c14单体。由表2可以看出，奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的合成量约占细胞干重的3.9％即317mg/l(摇瓶培养)，得到的共聚物中富含奇数碳链单体，结构丰富。实验结果表明：本发明制备得到的重组菌能够仅利用葡萄糖为碳源进行发酵合成奇偶数碳链单体共聚的mcl-pha。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>齐鲁工业大学<120>一种重组质粒pzq12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-pha的重组菌及其应用<160>30<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1500<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>1atgaaagccagaatttttgataccaccctccgtgatggtgaacaaaccccgggaatatcc60ctgacaccggatgaaaaacgtttaatagcccgaaaacttgatgaattaggagttgatgta120attgaggccggatcagccattacatcccaaggagaaagggaaggtattaaaaaaattact180tctgaagggctttctgctgagatatgtagttttacccgggcagttcaggtagatatcgat240gctgccttggaatgtgatgtggatagtatccatctggtggtgcccacctctgatcttcac300ttacaatacaaactacgaaaatcaagggaagaagtaaaagaaatgacaataaaatccact360caatatgccgttgatcacggtttactggtggaattgtctgcagaagattccacacgtagt420gatatggcctatttgagagagatattccaggcaggtatagaggctggtgccaaacgtatc480tgtgcctgtgatacagtgggaatgctaaccccagaaaattcttatgaattttacagtcaa540ctttctgatttaaaagtccccttgagtgtgcactgtcacaatgacttcggcctcgcagta600gccaattcactcagtggattgagggcgggtgcaacccaggcccatgtcactgttaatgga660ataggagaaagagcaggtaatgcctccctggaagaattggtggtttccctttattcactt720tataatattaagaccaaagtaaacctagagatgttatatgaaatttctaaaactgtggcc780aggataactgggatatatttacagcctaacaaggccatagtaggtgaaaatgctttcgcc840cacgaatctggaattcatgccgatggagttatgaagaaagcagagacctacgaacccatc900acgccggaacttgtgggccacaagcgccgtttcgttatgggtaaacatgttggttcccac960atcatcaaagaacgtataaatgagatgggattccaggtggatgaagctaaatttgcccaa1020atattcaaccggataaaagccctgggtgatatgggcaaatgcgttactgatgttgattta1080caggccatagccgaggatgttatgggagtaatgtctgaaaaaccagtagaacttcaggaa1140ttaaccatagtatccgggaacaaggtcacacccacagcttcagtcaaactcaaaataggg1200gatgtggaaaaattagaagcaggaataggtgtgggtccagttgatgcagctataggggcc1260atcaaaaaaagcattgaagacattacaaatatagaacttgaagaataccacgtggatgcc1320atcactggaggaaccgatgcccttattgatgtggtggttaaactaaaacacgatggtaaa1380gtggtgagtgcccgaagcacccagccagacattataaacgccagtgtagaagccttttta1440ggtggtataaacaaggttttaaccgataagggattaacaagatctgaaaaatccccttaa1500<210>2<211>3099<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>2atgtcgaagaattaccatattgccgtattgccgggggacggtattggtccggaagtgatg60acccaggcgctgaaagtgctggatgccgtgcgcaaccgctttgcgatgcgcatcaccacc120agccattacgatgtaggcggcgcagccattgataaccacgggcaaccactgccgcctgcg180acggttgaaggttgtgagcaagccgatgccgtgctgtttggctcggtaggcggcccgaag240tgggaacatttaccaccagaccagcaaccagaacgcggcgcgctgctgcctctgcgtaag300cacttcaaattattcagcaacctgcgcccggcaaaactgtatcaggggctggaagcattc360tgtccgctgcgtgcagacattgccgcaaacggcttcgacatcctgtgtgtgcgcgaactg420accggcggcatctatttcggtcagccaaaaggccgcgaaggtagcggacaatatgaaaaa480gcctttgataccgaggtgtatcaccgttttgagatcgaacgtatcgcccgcatcgcgttt540gaatctgctcgcaagcgtcgccacaaagtgacgtcgatcgataaagccaacgtgctgcaa600tcctctattttatggcgggagatcgttaacgagatcgccacggaatacccggatgtcgaa660ctggcgcatatgtacatcgacaacgccaccatgcagctgattaaagatccatcacagttt720gacgttctgctgtgctccaacctgtttggcgacattctgtctgacgagtgcgcaatgatc780actggctcgatggggatgttgccttccgccagcctgaacgagcaaggttttggactgtat840gaaccggcgggcggctcggcaccagatatcgcaggcaaaaacatcgccaacccgattgca900caaatcctttcgctggcactgctgctgcgttacagcctggatgccgatgatgcggcttgc960gccattgaacgcgccattaaccgcgcattagaagaaggcattcgcaccggggatttagcc1020cgtggcgctgccgccgttagtaccgatgaaatgggcgatatcattgcccgctatgtagca1080gaaggggtgtaaatggctaagacgttatacgaaaaattgttcgacgctcacgttgtgtac1140gaagccgaaaacgaaaccccactgttatatatcgaccgccacctggtgcatgaagtgacc1200tcaccgcaggcgttcgatggtctgcgcgcccacggtcgcccggtacgtcagccgggcaaa1260accttcgctaccatggatcacaacgtctctacccagaccaaagacattaatgcctgcggt1320gaaatggcgcgtatccagatgcaggaactgatcaaaaactgcaaagaatttggcgtcgaa1380ctgtatgacctgaatcacccgtatcaggggatcgtccacgtaatggggccggaacagggc1440gtcaccttgccggggatgaccattgtctgcggcgactcgcataccgccacccacggcgcg1500tttggcgcactggcctttggtatcggcacttccgaagttgaacacgtactggcaacgcaa1560accctgaaacagggccgcgcaaaaaccatgaaaattgaagtccagggcaaagccgcgccg1620ggcattaccgcaaaagatatcgtgctggcaattatcggtaaaaccggtagcgcaggcggc1680accgggcatgtggtggagttttgcggcgaagcaatccgtgatttaagcatggaaggtcgt1740atgaccctgtgcaatatggcaatcgaaatgggcgcaaaagccggtctggttgcaccggac1800gaaaccacctttaactatgtcaaaggccgtctgcatgcgccgaaaggcaaagatttcgac1860gacgccgttgcctactggaaaaccctgcaaaccgacgaaggcgcaactttcgataccgtt1920gtcactctgcaagcagaagaaatttcaccgcaggtcacctggggcaccaatcccggccag1980gtgatttccgtgaacgacaatattcccgatccggcttcgtttgccgatccggttgaacgc2040gcgtcggcagaaaaagcgctggcctatatggggctgaaaccgggtattccgctgaccgaa2100gtggctatcgacaaagtgtttatcggttcctgtaccaactcgcgcattgaagatttacgc2160gcggcagcggagatcgccaaagggcgaaaagtcgcgccaggcgtgcaggcactggtggtt2220cccggctctggcccggtaaaagcccaggcggaagcggaaggtctggataaaatctttatt2280gaagccggttttgaatggcgcttgcctggctgctcaatgtgtctggcgatgaacaacgac2340cgtctgaatccgggcgaacgttgtgcctccaccagcaaccgtaactttgaaggccgccag2400gggcgcggcgggcgcacgcatctggtcagcccggcaatggctgccgctgctgctgtgacc2460ggacatttcgccgacattcgcaacattaaataaatggcagagaaatttatcaaacacaca2520ggcctggtggttccgctggatgccgccaatgtcgataccgatgcaatcatcccgaaacag2580tttttgcagaaagtgacccgtacgggttttggcgcgcatctgtttaacgactggcgtttt2640ctggatgaaaaaggccaacagccaaacccggacttcgtgctgaacttcccgcagtatcag2700ggcgcttccattttgctggcacgagaaaacttcggctgtggctcttcgcgtgagcacgcg2760ccctgggcattgaccgactacggttttaaagtggtgattgcgccgagttttgctgacatc2820ttctacggcaatagctttaacaaccagctgctgccggtgaaattaagcgatgcagaagtg2880gacgaactgtttgcgctggtgaaagctaatccggggatccatttcgacgtggatctggaa29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