一种治疗自身免疫疾病的间充质干细胞及其制备方法和应用与流程

文档序号:17448426发布日期:2019-04-17 06:15阅读:440来源:国知局
一种治疗自身免疫疾病的间充质干细胞及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种通过阻断il17/il17r传导通路,抑制il17通路介导的炎症反应,从而治疗相关自身免疫性疾病的间充质干细胞及其制备方法和应用,属于生物医药领域。



背景技术:

人白介素17(hil-17)是t辅助细胞th17活化产生的一种促炎症细胞因子,可通过直接或间接诱导多种细胞因子、趋化因子、炎症因子和抗微生物蛋白来识别介导自身免疫和慢性感染的靶基因,因此在炎症反应、免疫调节、微生物与寄生虫感染方面起重要作用,在人细胞因子免疫调节网络中起关键调节作用。白介素-17(il-17)已经发现的成员有6个,分别是:il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e(也被称为il-25)和il-17f。最新研究表明[1-2],il-17a(白细胞介素-17a)作为促炎症因子il-17家族重要成员,与其膜表面受体il-17ra(il-17a受体)结合后可激活效应细胞的nf-kb等炎症信号通路,从而引起下游一系列炎症因子(包括tnf-a、il-1β及il-6等)释放和炎症发生;il-17a通过诱导趋化因子的释放来诱导中性粒细胞募集至炎症部位,刺激前列腺素和金属蛋白酶产生、以及抑制蛋白多糖合成,同时il-17a可进一步促进趋化因子ccl20、cxcl1、3、5、6、8及vegf等分泌,进而导致免疫细胞异常分化、过度增殖和免疫细胞的激活。il-17a也可以通过降低细胞间黏附因子的表达从而破坏细胞屏障[1,3]。il-17a的受体由5个成员组成:il-17ra、il-17rb、il-17rc、il-17rd、il-17re[4]。il-17ra是il-17r家族中研究最多的分子,编码基因位于染色体22上,是由27个氨基酸的n-末端信号肽、287个氨基酸的胞外结构域、21个氨基酸的跨膜结构域和525个氨基酸异常长的胞质尾巴构成的单程跨膜蛋白[5]。il-17ra广泛表达于多个组织器官,通过与il-17a结合,诱导促炎细胞分泌趋化因子及炎性因子,参与组织重塑,参与急性期炎症反应。而最新开发的关节炎、银屑病治疗的新药中,secukinumab、brodalumab及ixekizumab等单抗药物均针对il-17/il-17ra信号通路而研发,通过阻断il-17a及其受体的结合从而抑制皮肤细胞的炎症反应,达到治疗银屑病的目的[1,6-7]。然而现有il17阻断性抗体等药物在人体内半衰期较短,单一疗程内需要反复多次大剂量注射,从而增加了治疗成本和药物毒副作用的发生。另外,临床研究也发现,用上述单抗治疗病人时有少数患者出现严重不良事件,包括冠状动脉疾病,充血性心力衰竭,病毒综合征,尿路感染,手术伤口蜂窝织炎和肝酶水平升高,这种不良反应更多发于高血糖、高血压及高血脂的病人。另外,上述抗体在使用过程中在部分病人(4%)血清中检测出抗单抗的抗体,提示靶向药物的耐药性仍是单抗药物无法突破的难题。

基于此,亟需一种新的途径解决上述单抗的不足,用于制备治疗自身免疫性疾病(如炎症性肠病、银屑病及类风湿性关节炎等)的药物。



技术实现要素:

为了解决现有技术的不足,本发明的目的在于利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力,通过基因修饰的方法,使间充质干细胞特异表达人白介素17受体类似物,通过竞争性抑制il-17与il-17受体的结合,从而达到阻断il17信号通路、调节人体免疫细胞功能、降低机体炎症反应,修复损伤的组织器官,最终治疗例如il17a/il17ra介导的自身免疫性疾病的目的。

术语“间充质干细胞”(mscs)来源于发育早期中胚层,因其具有的免疫调节及组织损伤修复双层功能,从而在自身免疫性疾病治疗中具有良好的临床应用前景。mscs对炎症部位有较好的归巢和靶向作用,并通过分泌大量的可溶性细胞因子(如转化生长因子β(tgf-β1)、肝细胞生长因子(hgf)、吲哚胺2,3-二氧化酶(ido)、前列腺素(pge2)等)从而抑制免疫细胞增殖、活化,抑制过激的淋巴细胞增殖和炎症因子释放,改善炎症局部微环境等[8-10]。同时间充质干细胞对损伤组织具有较强修复能力,其具有定向分化为内皮细胞替换损伤皮肤的能力,同时可通过分泌表皮生长因子(egf)、角蛋白生长因子(kgf)等因子促进皮肤组织的损伤修复[11-12]。然而,间充质干细胞是否能够抑制th17介导的炎症反应尚存在争议,且目前尚无报道将il17ra-ecd(受体胞外区)或il17ra-fc(抗体fc段)等受体类似物通过基因工程的方法表达于间充质干细胞中,从而阻断il-17a与其受体的结合,因此,我们的技术方法具有独创性。

如上所述,高表达人白介素17受体类似物的间充质干细胞具有治疗银屑病等自身免疫性疾病的临床机理并具有降低单抗药物毒副作用和耐药性的机制。其作用表现在:1.间充质干细胞可通过抑制免疫细胞增殖、活化而治疗自身免疫性疾病;2.间充质干细胞对心脏、肝脏等主要器官具有较好的保护作用,因此可降低单抗药物的毒副作用;3.间充质干细胞可促进皮肤、膝盖等组织的损伤修复,从而对银屑病、类风湿关节炎等疾病具有较好的恢复作用。

本发明的第一方面在于提供一种阻断th17信号通路治疗自身免疫病的间充质干细胞,所述间充质干细胞通过基因修饰的方法,特异表达人白介素17受体类似物,竞争性抑制il-17与il-17受体的接合,从而用于抑制il-17介导的炎症相关信号通路以及炎症反应。

作为本发明的一种实施方式,所述人白介素17受体选自il-17ra、il-17rb、il-17rc、il-17rd和il-17re,优选il-17ra;更优选地,特异表达的il-17ra类似物,可通过竞争性抑制il-17a与il-17受体的结合,从而阻断il17信号通路。

所述il-17a受体类似物选自人白介素17受体胞外区(il17ra-ecd)或其突变体、异构体,以及所述人白介素17受体胞外区(il17ra-ecd)或其突变体、异构体与免疫球蛋白g1、g2或g4的fc(可结晶片段(fragmentcrystallizable,fc)的融合蛋白,其可竞争性抑制il-17a与il-17a受体的结合,从而可用于抑制il-17a介导的炎症相关信号通路以及炎症反应。

作为本发明的一种实施方式,所述人白介素17受体类似物为人白介素17受体胞外区或人白介素17受体胞外区与igg1的fc片段融合蛋白。

研究证明,il17ra与igg1fc片段融合后,其在体内的半衰期延长,从而提高了其生物学活性。同时通过体外实验检测了其高表达量,以及验证其竞争性阻断il-17a与il-17ra结合的能力。

il-17a受体包括但不限于il-17a受体胞外区及其突变体或异构体等。

所述igg1的fc片段包括igg1的重链恒定区ch2、ch3以及铰链区。

作为本发明的一种实施方式,所述人白介素17受体胞外区为人il-17a受体胞外区fniii-d1/d2结构域,其蛋白序列来源于genebank,为seqno:1所示序列:

lrlldhralvcsqpglnctvknstclddswihprnltpsspkdlqiqlhfahtqqgdlfpvahiewtlqtdasilylegaelsvlqlntnerlcvrfeflsklrhhhrrwrftfshfvvdpdqeyevtvhhlpkpipdgdpnhqsknflvpdceharmkvttpcmssgslwdpnitvetleahqlrvsftlwnesthyqilltsfphmenhscfehmhhipaprpeefhqrsnvtltlrnlkgccrhqvqiqpffssclndclrhsatvscpempdtpepipdymplw;

作为本发明的一种实施方式,所述铰链区的氨基酸序列为seqno:2所示序列:dkthtcppcp;

所述ch2的氨基酸序列为seqno:3所示序列:apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiska;

所述ch3的氨基酸序列为seqno:4所示序列:kgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsls。

作为本发明的一种实施方式,编码所述人白介素17受体类似物的基因,全长为1548bp,编码516个氨基酸,分子量约为61kd,包括可溶性il17受体胞外区编码基因(1-864位碱基)、人免疫球蛋白igg1重链恒定区(含绞链区)(igg1fc)编码基因(895-1548位碱基)和连接短肽编码基因(865-894位碱基,核苷酸序列为seqno:5所示序列:5’-gacaaaactcacacatgcccaccgtgccca-3’)。

本发明中,所采用基因修饰干细胞的方法包括但不限于,病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑以及mrna转染等。用于基因修饰的间充质干细胞来源包括但不限于,骨髓组织、脂肪组织、脐带组织、胎盘组织等不同组织来源的间充质干细胞。

作为本发明的一种实施方式,所述基因修饰为病毒转染技术;优选地,所述基因修饰为慢病毒转染技术;更优选地,所述基因修饰采用第四代慢病毒转染技术,慢病毒转染系统购于origene公司。目的基因il17ra-ecd:fc其3'-末段连接有ires序列,后接增强绿色荧光蛋白(egfp)基因,形成il17ra-ecd:fc-i-egfp序列,即il17ra融合蛋白,共同处于cmv启动子下游。

作为本发明的一种实施方式,所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞,通过慢病毒转染技术将人白介素17受体类似物基因导入人脐带间充质干细胞中,从而使间充质干细胞可表达il17ra蛋白、igg1fc段蛋白及增强型绿色荧光蛋白(egfp)。

在一个特定的实施方案中,所述基因修饰人脐带间充质干细胞表达il17ra融合蛋白,可通过流式细胞法检测绿色荧光表达判断转染成功率,通过il17raelisa检测试剂盒检测il17ra表达情况,通过igg1elisa方法确定fc段表达情况。

本发明的第二方面在于提供一种人白介素17受体类似物,其特征在于,所述人白介素17受体类似物由哺乳动物细胞表达,并且选自人白介素17受体胞外区结构域或其突变体、异构体,以及所述人白介素17受体胞外区结构域或其突变体、异构体与免疫球蛋白g1、g2或g4的fc片段的融合蛋白。所述人白介素17受体类似物可竞争性抑制il-17a与il-17a受体的结合,从而可用于抑制il-17a介导的炎症相关信号通路以及炎症反应。

作为本发明的一种实施方式,所述人白介素17受体类似物为人白介素17受体胞外区结构域或所述人白介素17受体胞外区结构域与免疫球蛋白g1、g2或g4的fc片段的融合蛋白,所述人白介素17受体类似物可分泌至宿主细胞外的培养液中,所述哺乳动物细胞为间充质干细胞。

il-17a受体包括但不限于il-17a受体胞外区及其类似物等;

所述igg1的fc片段包括igg1的重链恒定区ch2、ch3以及铰链区。

作为本发明的一种实施方式,所述人白介素17受体胞外区为人il-17a受体胞外区fniii-d1/d2结构域,其蛋白序列来源于genebank,为seqno:1所示序列

lrlldhralvcsqpglnctvknstclddswihprnltpsspkdlqiqlhfahtqqgdlfpvahiewtlqtdasilylegaelsvlqlntnerlcvrfeflsklrhhhrrwrftfshfvvdpdqeyevtvhhlpkpipdgdpnhqsknflvpdceharmkvttpcmssgslwdpnitvetleahqlrvsftlwnesthyqilltsfphmenhscfehmhhipaprpeefhqrsnvtltlrnlkgccrhqvqiqpffssclndclrhsatvscpempdtpepipdymplw。

作为本发明的一种实施方式,所述铰链区的氨基酸序列为seqno:2所示序列:dkthtcppcp;

所述ch2的氨基酸序列为seqno:3所示序列:apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiska;

所述ch3的氨基酸序列为seqno:4所示序列:kgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsls。

作为本发明的一种实施方式,编码所述il17ra融合蛋白的基因,全长为1548bp,编码516个氨基酸,分子量约为61kd,包括可溶性il17受体胞外区编码基因(1-864位碱基)、人免疫球蛋白igg1重链恒定区(含绞链区)(igg1fc)编码基因(895-1548位碱基)和连接短肽编码基因(865-894位碱基,核苷酸序列为seqno:5所示序列:5’-gacaaaactcacacatgcccaccgtgccca-3’)。

本发明中,所采用基因修饰干细胞的方法包括但不限于,病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑以及mrna转染等。用于基因修饰的间充质干细胞来源包括但不限于,骨髓组织、脂肪组织、脐带组织、胎盘组织等不同组织来源的间充质干细胞。

作为本发明的一种实施方式,所述基因修饰为病毒转染技术;优选地,所述基因修饰为慢病毒转染技术;更优选地,所述基因修饰采用第四代慢病毒转染技术,慢病毒转染系统购于origene公司。目的基因il17ra-ecd:fc其3'-末段连接有ires序列,后接增强绿色荧光蛋白(egfp)基因,形成il17ra-ecd:fc-i-egfp序列,即il17ra融合蛋白,共同处于cmv启动子下游。

作为本发明的一种实施方式,,所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞,通过慢病毒转染技术将il17ra融合蛋白基因导入人脐带间充质干细胞中,从而使间充质干细胞可表达il17ra蛋白、igg1fc段蛋白及增强型绿色荧光蛋白(egfp)。

在一个特定的实施方案中,所述基因修饰人脐带间充质干细胞表达il17ra融合蛋白,可通过流式细胞法检测绿色荧光表达判断转染成功率,通过il17raelisa检测试剂盒检测il17ra表达情况,通过igg1elisa方法确定fc段表达情况。

本发明的第三方面在于提供一种根据本发明的间充质干细胞的制备方法,所述制备方法包括:

(1)利用病毒载体系统构建人白介素17受体类似物病毒表达质粒,

(2)将所述人白介素17受体类似物病毒表达质粒导入t细胞,收获病毒;以及

(3)将收获的病毒转染至间充质干细胞,筛选被病毒转染的间充质干细胞,其高表达人白介素17受体类似物。

作为本发明的一种实施方式,所述制备方法包括:

(1)利用第四代慢病毒载体系统构建人白介素17受体类似物慢病毒表达质粒,

(2)将所述人白介素17受体类似物慢病毒表达质粒分别与慢病毒pgag/pol、prev、pvsv-g框架质粒混合,通过ltx脂质体导入293t细胞,包装得到成熟慢病毒,收获病毒;

(3)将收获的病毒转染至间充质干细胞,24h后加入嘌呤霉素筛选被病毒转染的间充质干细胞,其高表达人白介素17受体类似物;优选地,所述人白介素17受体类似物选自人白介素17受体胞外区结构域或其突变体、异构体,以及所述人白介素17受体胞外区结构域或其突变体、异构体与免疫球蛋白g1、g2或g4的fc片段的融合蛋白。

作为本发明的一种实施方式,所述制备方法包括:

(1)利用第四代慢病毒载体系统构建il17ra融合蛋白慢病毒表达质粒,

(2)将所述il17ra融合蛋白慢病毒表达质粒分别与慢病毒pgag/pol、prev、pvsv-g框架质粒混合,通过ltx脂质体导入293t细胞,包装得到成熟慢病毒,收获病毒;

(3)将收获的病毒转染至间充质干细胞,24h后加入嘌呤霉素筛选被病毒转染的间充质干细胞,其高表达il-17受体胞外区与igg1的fc片段的il17ra融合蛋白。

作为本发明的一种实施方式,所述基因修饰为病毒转染技术;优选地,所述基因修饰为慢病毒转染技术;更优选地,所述基因修饰采用第四代慢病毒转染技术,慢病毒转染系统购于origene公司。目的基因il17ra-ecd:fc其3'-末段连接有ires序列,后接增强绿色荧光蛋白(egfp)基因,形成il17ra-ecd:fc-i-egfp序列,即il17ra融合蛋白,共同处于cmv启动子下游。

作为本发明的一种实施方式,所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞,通过慢病毒转染技术将il17ra融合蛋白基因导入人脐带间充质干细胞中,从而使间充质干细胞可表达il17ra蛋白、igg1fc段蛋白及增强绿色荧光蛋白(egfp)。

作为本发明的一种实施方式,基因修饰人脐带间充质干细胞表达il17ra融合蛋白,可通过流式细胞法检测绿色荧光表达判断转染成功率,通过igg1elisa方法确定融合蛋白fc段表达情况,通过il17a/il17ra阻断实验检测il17ra融合蛋白对il17a与其受体的结合抑制能力,从而阻断th17信号通路的激活,治疗相关自身免疫性疾病。

本发明的第四方面在于提供所述的间充质干细胞或人白介素17受体类似物在制备治疗免疫性疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式,所述免疫性疾病包括人银屑病(parapsoriasis,ps)、人类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,ra)、慢性阻塞性肺炎(chronicobstructivepneumonia,copd)、儿童多发性风湿性关节炎(jra)、克隆氏病(crohn’sdisease,cd)和系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,sle)等。

本发明具有以下突出的优点:

本发明所得到的经修饰的间充质干细胞能够高表达人白介素17受体类似物,所述人白介素17受体类似物包括il17a受体胞外区或所述il17a受体胞外区与免疫球蛋白g1的fc片段的il17ra:fc融合蛋白,利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力,通过基因修饰的方法,使间充质干细胞特异表达人白介素17受体类似物至炎症部位而发挥作用。通过il-17a/il17ra阻断实验,可以确定基因修饰后的间充质干细胞表达的人白介素17受体类似物可以显著阻断il17a与其受体的结合。因此,所述经修饰的间充质干细胞表达的人白介素17受体类似物,能够特异性阻断th17细胞介导的炎症信号通路,调节人体免疫细胞功能、降低机体炎症反应,修复损伤的组织器官,从而达到治疗th17轴介导的自身免疫性疾病的目的。

另外,现有il17阻断性抗体等药物在人体内半衰期较短,单一疗程内需要反复多次大剂量注射,从而增加了治疗成本和药物毒副作用的发生。体外实验显示,基因修饰的间充质干细胞可在体外培养时持续分泌人白介素17受体类似物至上清液中,且该人白介素17受体类似物具有阻断il17a与其受体结合的能力,因此当使用人白介素17受体类似物基因修饰的间充质干细胞治疗银屑病等自身免疫性疾病时,单次注射细胞后即可在病人体内持续分泌融合蛋白,达到持续阻断il17与其受体结合的目的,治疗效果更为持久、稳定,治疗成本和毒副作用更低。同时,间充质干细胞具有较好的免疫调节能力和组织损伤修复能力,因此该发明为银屑病等自身免疫性疾病的治疗提供了较为理想的新方法。

附图说明

图1.il17ra融合蛋白基因载体构建:目的基因il17ra-ecd及il17ra-ecd:fc3‘-末段连接有ires序列,后接增强绿色荧光蛋白(egfp)基因,形成il17ra-ecd:fc-i-egfp序列,共同处于cmv启动子下游。对照病毒为lv-egfp病毒,cmv启动子后表达egfp基因。

图2.流式细胞法检测基因修饰间充质干细胞表达绿色荧光。lv-egfp、il17ra-ecd(以下简称:il17ra)以及lv-il17ra-ecd:fc融合蛋白(以下简称:il17ra:fc)慢病毒转染后的间充质干细胞可表达增强绿色荧光蛋白(egfp),阳性细胞率均达90%以上,而正常间充质干细胞(对照)则不表达egfp。

图3.elisa检测il-17ra表达,确定il17ra及il17ra:fc基因修饰的间充质干细胞高表达il-17ra(分别为59.8±1.9ng/ml及67.5±2.8ng/ml),其中il17ra:fc-msc表达的il-17ra显著高于il17ra–msc(p>0.05);而正常间充质干细胞以及对照组lv-egfp转染细胞则不表达il-17ra。

图4.elisa检测igg1表达,发现il17ra:fc基因修饰的间充质干细胞高表达igg1(71.2±3.1ng/ml),而正常间充质干细胞、对照组lv-egfp及lv-il17ra基因修饰的间充质干细胞均不表达igg1。

图5.通过il17/il17r阻断实验,确定il17ra及il17ra:fc融合蛋白基因修饰后的间充质干细胞表达的il-17ra均可以显著阻断il17与其受体的结合;而正常间充质干细胞以及对照组lv-egfp转染细胞上清液则没有阻断作用。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明所述的实验方法,若无特殊说明,均为常规方法;所述的生物材料,若无特殊说明,均可从商业途径获得。

实施例1:il17ra-ecd:fc融合蛋白基因载体构建

我们通过genebank设计il17ra-ecd及il17ra-ecd:fc基因质粒,利用第四代慢病毒载体系统构建il17ra-ecd及il17ra-ecd:fc融合蛋白慢病毒表达质粒(lv-il17ra及lv-il17ra:fc),并以lv-egfp作为对照病毒(lv-null)。(图1为lv-egfp、lv-il17ra和lv-il17ra-fc慢病毒表达质粒结构)。

实施例2:人脐带间充质干细胞种子库建立

人脐带来源于健康足月妊娠剖宫产孕妇供者,由有资质的国家二甲以上医院提供,由孕妇或其家属签订知情同意书和脐带采集登记表。脐带间充质干细胞提取、培养及细胞库建立等工作均在本公司gmp生产车间完成。细胞经分离培养并传代扩增至第2代(p2)后进行外源微生物、病毒、内毒素等检测;同时检测细胞免疫表型、分化能力及细胞生物学效力等。检测合格的细胞作为种子库细胞,置于-196℃液氮罐中保存。

实施例3:il17ra-ecd:fc基因修饰间充质干细胞

将上述lv-il17ra及lv-il17ra:fc融合蛋白慢病毒表达质粒以及lv-egfp分别与慢病毒pgag/pol、prev、pvsv-g等框架质粒混合,通过ltx脂质体导入293t细胞,包装得到成熟慢病毒,收获病毒后感染mscs,24h后加入嘌呤霉素筛选感染成功的细胞。

实施例4:流式细胞法检测基因修饰干细胞表达增强绿色荧光蛋白

通过流式细胞法(bdcalibur)检测病毒转染效率,发现lv-egfp、lv-il17ra及lv-il17ra:fc均可成功转染mscs细胞,感染率达到90%以上(图2为流式细胞法检测基因修饰mscs转染效果)。

实施例5:elisa检测基因修饰的间充质干细胞表达il-17ra及igg1

收集24h细胞培养上清液,通过常规igg1以及il-17raelisa检测试剂盒检测正常培养msc及基因修饰后msc表达igg1及il-17ra的水平,上述igg1elisa检测试剂盒购于invitrogen公司,il-17raelisa检测试剂盒购于r&dsystems公司。

实验结果显示正常培养msc及对照病毒lv-null修饰的msc不表达igg1和il-17ra,而il17ra及il17ra:fc基因修饰的mscs则可高表达igg1及il-17ra(图3和图4分别为elisa检测il-17ra及igg1表达情况)。

实施例6:检测基因修饰的间充质干细胞表达il17ra融合蛋白及其功能

采用il7a/il17ra结合阻断实验检测基因修饰间充质干细胞表达的il17ra及il17ra:fc融合蛋白阻断il17a及其受体结合情况。具体方法如下:采用2ug/ml重组人il17a蛋白(购于r&dsystems)包被酶标板,样品孔加入基因修饰干细胞培养上清(正常msc上清作为对照,细胞培养液作为空白对照)孵育2h,然后用生物素(biotin)结合的il17ra(终浓度为1ug/ml,购于bpsbioscience公司)孵育1h,加入hrp结合的链霉亲和素(购于invitrogen公司)作为二抗孵育30min,最后加入底物进行显色。通过检测od450nm光吸收发现,正常msc上清及lv-egfp-msc上清组中biotin-il17ra均可与酶标板包被的il17a蛋白结合,od450nm光吸收值没有显著差异;而lv-il17ra-msc细胞及il17ra:fc-msc上清组则可竞争性抑制biotin-il17ra与il17a的结合,且抑制效果与上清液稀释倍数呈负相关(图5,*p<0.05:egfp-msc与il17ra-msc/il17ra:fc-msc比较;#p<0.05:il17ra-msc与il17ra:fc-msc比较)。

通过il17a/il17ra阻断实验,确定基因修饰后的间充质干细胞表达的il17ra融合蛋白可以显著竞争性抑制il17a与其受体的结合,从而阻断th17信号通路的激活,治疗相关自身免疫性疾病。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

以下出版物通过引用并入本文。这些出版物在本文中由下面提供的数字引用。在该出版物列表中包括任何出版物不应被视为承认本文提及的任何出版物是现有技术。

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序列表

<110>北京贝来生物科技有限公司

<120>一种治疗自身免疫疾病的间充质干细胞及其制备方法和应用

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