一种用于早期肺癌诊断及一线化疗反应评估预警的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种基于血小板mrnas：max、mturn、hla-b的早期肺癌诊断及一线化疗反应评估预警的试剂盒研发，属于医疗卫生领域。

背景技术：

肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其起病隐匿，早期临床表现缺乏特异性，大部分患者在确诊时已处于局部晚期或发生远处转移，预后往往较差，5年生存率仅2％。因此，现在迫切的需要一种较为灵敏的诊断标记物，为发生远处转移的nsclc的早期诊断、早期治疗及预后判断提供客观依据。

肿瘤微环境教育的血小板（tumor-educatedplatelets，teps）已经被证明可以促进癌症进展，血小板受到肿瘤细胞和肿瘤微环境的“教育”，其功能可能发生改变，因而帮助肿瘤细胞逃避免疫监测，促进肿瘤生长和转移。这些受肿瘤教育的血小板（tumor-educatedplatelets，tep）的功能发生了明显改变，表明其rna谱和蛋白质谱有所改变，使得以tep为基础的液体活检用于癌症诊断成可能。血小板的分离及其在临床中的使用可替代侵入性手术以诊断。此外，teps易于在血液样本中获得，并便于贮存，可以在循环血液中被稳定检测到，使其成为肺癌诊断的理想生物标志物。

血小板是起源于骨髓巨核细胞的多功能无核细胞碎片，在外周血中其含量丰富仅次于红细胞。血小板参与了肿瘤的发展和转移，肿瘤细胞及其微环境可以直接或间接地改变血小板rna和蛋白质的含量。这些受到肿瘤教育的血小板功能发生改变，可以通过多种方式促进肿瘤细胞的存活和转移。肿瘤细胞通过不同的信号分子间接或通过不同的受体（如血小板活化受体p-选择素）直接与血小板相互作用。血小板活化后可以释放多种生长因子和促血管生成因子，如血小板衍生因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子等。血小板可以在转移生态位释放这些因子，提供促肿瘤生长的微环境。此外，血小板rna表达谱具有动态性和瞬时性，受肿瘤细胞和/或肿瘤微环境教育的血小板（tumor-educatedplatelets，teps）的功能发生明显改变，表明其mrna的表达有所改变并具有肿瘤特异性，在肿瘤检测和诊断方面具有一定的潜力。

技术实现要素：

针对上述问题及现状，本发明提供了一种使用方便、快捷、特异性高的用于早期诊断肺癌的试剂盒。

一种用于早期肺癌诊断及一线化疗反应评估预警的标志物，所述标志物为血浆血小板mrna中的max、mturn、hla-b或其联合。

一种用于早期肺癌诊断的试剂盒，包括：标志物、逆转录反应体系、荧光定量pcr反应体系和内参体系。

所述的荧光定量pcr反应体系中包括分别针对max、mturn或hla-b的正向引物和反向通用引物、sybrgreen混合液、纯水。

所述内参体系中包括内参actb的正向和反向引物。

所述逆转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶双蒸水。

一种评估肺癌一线化疗反应评估预警的试剂盒，包括：标志物、逆转录反应体系、荧光定量pcr反应体系和内参体系。

所述的荧光定量pcr反应体系中包括分别针对max、mturn或hla-b的正向引物和反向通用引物、sybrgreen混合液、纯水。

所述内参体系中包括内参actb的正向和反向引物。

所述逆转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶双蒸水。

本发明有益效果

1、肺癌患者血浆血小板中mrna:max、mturn、hla-b表达水平显著升高

本发明首次提出相比于健康供者，肺癌患者血浆血小板中mrna:max、mturn、hla-b表达水平显著升高，联合诊断roc曲线分析显示，auc为0.74，灵敏度为82.9％，特异性为62.4％，优于单独诊断。

2、早期肺癌患者中血浆血小板中mrna:max、mturn、hla-b表达显著升高

相比于健康供者，在早期肺癌患者中mrna:max、mturn、hla-b表达显著升高，具有良好的早期诊断能力。联合诊断roc曲线分析显示，auc为0.765，灵敏度为75％，特异性为84.1％，优于单独诊断。

3、肺癌一线化疗反应评估预警

采用卡方检验对一线化疗肺癌患者血浆血小板的mrna:max、mturn、hla-b水平进行定量，结果显示mrna:max、mturn、hla-b表达水平与一线化疗效果有关，可以用于评估肺癌一线化疗反应结果。

附图说明

图1：肺癌患者与健康人之间血浆血小板maxmrna的表达差异；

图2：肺癌患者与健康人之间血浆血小板mturnmrna的表达差异；

图3：肺癌患者与健康人之间血浆血小板hla-bmrna的表达差异；

图4：早期肺癌患者和健康人之间血浆血小板maxmrna的表达差异；

图5：早期肺癌患者和健康人之间血浆血小板mturnmrna的表达差异；

图6：早期肺癌患者和健康人之间血浆血小板hla-bmrna的表达差异；

图7：max、mturn、hla-b三者联合在肺癌患者和健康人之间的诊断效能；

图8：max、mturn、hla-b三者联合在早期肺癌患者和健康人之间的诊断效能；

图9：maxmrna低表达和高表达组一线化疗后的pr和non-pr比例；

图10：mturn低表达和高表达组一线化疗后的pr和non-pr比例；

图11：hla-b低表达和高表达组一线化疗后的pr和non-pr比例。

具体实施方式

以下实施用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施案例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

实施案例1：mrnas：max、mturn、hla-b在诊断早期肺癌中的应用

1、实验设计

该实验设计为采集山东省肿瘤医院诊断为肺癌初治病人以及健康志愿者血浆样本，分离富集血小板并获得血小板rna。通过qpcr的方法检测max、mturn、hla-b表达，统计分析其表达在健康志愿者与肺癌、早期肺癌之间的差异，并分析其诊断效能。

2、实验所涉及的病人及样本

纳入山东大学附属山东肿瘤医院于2016年1月至2018年10月收治的184名健康对照者以及223名肺癌患者，并基于术后病理学检查进行tnm分类。本研究纳入的临床资料主要包括年龄，性别，ajcc肿瘤分期（第8版），饮酒，吸烟史以及肺癌的病理类型等。肺癌患者共80例，年龄27~89岁，健康对照者共184例，年龄29~74岁。所有患者均接受纤维支气管镜检查、经皮穿刺或手术活检。于化疗，放疗和手术治疗前采集受试者外周血样品约2ml，置于含edta抗凝剂的真空管中混匀，并在120g，室温离心10分钟，取上清，反复两次。之后360g，20分钟。然后收集血小板样品于离心管中并储存在-80℃，备用。

3、血浆中血小板max、mturn、hla-b水平的测定

使用qpcr方法分析肺癌患者和健康志愿者的血浆中血小板max、mturn、hla-b的表达水平，具体步骤如下：

3.1、总rna的提取

向低速离心法获得的血小板沉淀中加入0.5mltrizolreagent，反复吹打并放置10min-20min，使血小板裂解充分；加入100μl三氯甲烷，震荡混匀，孵育10min。4℃12000g离心15min（混合物分离成下层红色酚-氯仿液相，中间层为白色絮状物，上层为无色的水相，rna分布于水相中）。用移液器将上层水相转移至新无rnaseep管内（注意不要吸到中间层）。加入250μl异丙醇，孵育10min后，4℃12000g离心10min，出现白色可见rna沉淀物，去除上层液体。加入750μl75%乙醇，震荡混匀，4℃7500g离心5min，洗涤rna，去除上层液体。空气干燥rna管5min～10min，加入15μl～20μl无rnase水溶解rna，用移液器反复吹打，55～60℃水浴孵育5min～10min，使rna充分溶解。将rna样品置于-80℃保存备用。用asp-3700分析软件检测样品浓度和纯度。

3.2、逆转录反应及qpcr

（1）基因组dna去除反应：反应体系：2μl5×gdnaeraserbuffer、1μlgdnaeraser、7μltotalrna。反应条件：42℃2min（或者室温5min-30min）4℃保持。

（2）逆转录反应：反应体系：10μl步骤1的反应液、1μlprimescriptrtenzymemixi、1μlrtprimermix、4μl5×primescriptbuffer2（forrealtime）、4μlrnasefreedh2o。反应条件：37℃15min，85℃5sec，4℃保持。根据样本数量，按下表反应体系，配置好混合反应液，震荡混匀。

表1逆转录反应体系

（3）内参系统：内参actb的正向和反向引物。

于生物安全柜内，将以上配置完成的反应液，分别加入相对应的pcr扩增板的孔内，注意避免污染，之后附上透明膜。注意每个样本均做1个副孔，实验重复3次。小心离心，并混匀。上机操作，使用lightcycler480定量pcr仪进行检测，按下表设定的程序进行反应。

表2pcr反应条件

4、数学统计分析

使用spss22.0和graphpadprism6.0软件进行统计学分析。计量资料比较若服从正态分布用参数检验并以平均数±标准差表示；若不服从正态分布用非参数检验用mann-whitney检验并以中位数，四分位间距表示。三组之间的比较使用dkruskal-wallishtest。频数之间的比较使用卡方检验。使用二元逻辑回归建立诊断组合，通过受试者工作特征曲线（roc曲线）和曲线下面积（auc）确定差异表达的mrnas。以p＜0.05为差异有统计学意义。

5、肺癌患者病例特征总结以及与max、mturn、hla-b表达水平之间的关系

表3结果分析了肺癌患者的临床特征，包括年龄，性别，吸烟饮酒状况，组织学类型和肿瘤大小。max、hla-b的表达水平与年龄，性别，吸烟状况和组织学类型无关(p>0.05)，差异无统计学意义。mturn的表达水平除与性别、吸烟、饮酒有关之外，与其他临床特征无关。mturn在肺癌患者女性中的血浆血小板mrna中表达水平显著高于男性(p=0.004)，差异有统计学意义;mturn在非吸烟肺癌患者血浆血小板中mrna中表达水平显著高于吸烟者(p=0.0197)，差异有统计学意义;mturn在非饮酒肺癌患者血浆血小板mrna中表达水平显著高于饮酒者(p=0.0194)，差异有统计学意义。

表3肺癌病例特征总结以及与max、mturn、hla-b表达水平之间的关系

6、早期肺癌患者病例特征与max、mturn、hla-b表达水平之间的关系

表4结果分析了早期肺癌患者的临床特征，包括年龄，性别，吸烟饮酒状况，组织学类型和肿瘤大小。结果显示max、mturn、hla-b的表达水平均与年龄，性别，吸烟饮酒状况和组织学类型，肿瘤大小无关(p>0.05)。差异无统计学意义。

表4早期肺癌病例特征总结以及与max、mturn、hla-b表达水平之间的关系

7、血浆血小板mrnamax、mturn、hla-b在健康人与肺癌患者水平差异

采用qpcr的方法对肺癌患者和健康供体的血浆血小板的mrnamax、mturn、hla-b水平进行定量，以确定mrnamax、mturn、hla-b是否可作为诊断肺癌的生物标记物。结果显示mrnamax、mturn、hla-b的表达水平在肺癌患者中均显著下降，差异具有统计学意义（p<0.0001，p<0.0001andp=0.0016），见图1，2，3。同理，采用qpcr的方法对早期肺癌患者和健康供体的血浆血小板的mrnamax、mturn、hla-b水平进行定量，以确定mrnamax、mturn、hla-b是否可作为诊断早期肺癌的生物标记物。结果显示mrnamax、mturn、hla-b的表达水平在早期肺癌患者中均显著下降，差异具有统计学意义（p=0.0101，p<0.0001andp=0.007）见图4，5，6。

8、血浆血小板mrnamax、mturn、hla-b三者联合对肺癌的诊断效能

本发明进而利用roc曲线分析，检测mrnamax、mturn、hla-b对肺癌的诊断效能，roc曲线分析显示，auc为0.74，灵敏度为82.9％，特异性为62.4％，优于单独诊断。见图7。

9、血浆血小板max联合mturn和hla-b对早期肺癌的诊断效能

本发明进而利用roc曲线分析，检测mrnamax联合mturn和hla-b对早期肺癌的诊断效能，联合诊断roc曲线分析显示，auc为0.765，灵敏度为75％，特异性为84.1％，优于单独诊断。见图8。

实施案例2：mrnas：max、mturn、hla-b评估肺癌一线化疗药物反应

1、实验设计

该实验设计为采集山东省肿瘤医院诊断为肺癌初治病人以及健康志愿者血浆样本，分离富集血小板并获得血小板mrna。通过qpcr的方法检测max、mturn、hla-b表达，统计分析其血浆血小板mrna的表达水平与一线化疗药物反应间的关系，从而预测其化疗反应。

2、实验所涉及的病人及样本

纳入山东大学附属山东肿瘤医院于2016年1月至2018年10月收治的37名肺癌患者，年龄36~71岁，于化疗，放疗和手术治疗前采集受试者外周血样品约2ml，置于含edta抗凝剂的真空管中混匀，并在120g，室温离心10分钟，取上清，反复两次。之后360g，20分钟。然后收集血小板样品于离心管中并储存在-80℃，备用。此外，37名肺癌患者基于一线化疗后根据实体瘤疗效评价标准进行疗效评估，即靶病变最大径之和缩小≥30%为pr(部分缓解);靶病变最大径之和增大≥20%或出现新病灶为pd（疾病进展）;变化处于部分缓解和进展之间为sd（疾病稳定）。在max基因中，有23个病人为pr，13个病人为非pr(pd+sd);在mturn基因中，有17个病人为pr，8个病人为非pr(pd+sd);在hla-b基因中，有16个病人为pr，7个病人为非pr(pd+sd)。

3、血浆中血小板max、mturn、hla-b水平的测定

同案例1

4、统计学分析

使用spss22.0和graphpadprism6.0软件进行统计学分析。计量资料比较若服从正态分布用参数检验并以平均数±标准差表示；若不服从正态分布用非参数检验用mann-whitney检验并以中位数，四分位间距表示。频数之间的比较使用卡方检验。使用二元逻辑回归建立诊断组合，通过受试者工作特征曲线（roc曲线）和曲线下面积（auc）确定差异表达的mrnas。以p＜0.05为差异有统计学意义。

5、血浆血小板mrnamax与一线化疗反应间的关系

结果分析了肺癌患者mrnamax表达水平与一线化疗药物反应间的关系，卡方检验结果显示，肺癌患者高表达组中pr的例数低于non-pr，低表达组中pr的例数高于non-pr，为0.030(p<0.05)，差异有统计学意义。从而说明maxmrna表达水平与化疗反应有关，可能预测化疗反应。

表5mrnamax表达水平与一线化疗反应间的关系

6、血浆血小板mturn与一线化疗反应间的关系

结果分析了肺癌患者mrnamturn表达水平与一线化疗反应间的关系，卡方检验结果显示，肺癌患者高表达组中pr的例数低于non-pr，低表达组中pr的例数高于non-pr，为0.023(p<0.05)，差异有统计学意义。从而说明mturnmrna表达水平与化疗反应有关，可能预测化疗反应。

表6mrnamturn表达水平与一线化疗反应间的关系

7、血浆血小板hla-b与一线化疗反应间的关系

结果分析了肺癌患者mrnahla-b表达水平与一线化疗反应间的关系，卡方检验结果显示，肺癌患者高表达组中pr的例数低于non-pr，低表达组中pr的例数高于non-pr，为0.011(p<0.05)，差异有统计学意义。从而说明hla-bmrna表达水平与化疗反应有关，可能预测化疗反应。

表7mrnahla-b表达水平与一线化疗反应间的关系