一种杂色曲霉HY12的筛选方法与流程

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种杂色曲霉hy12的筛选方法。

背景技术：

自发明化学农药之后，化学农药以每年5％惊人速度增长。虽然在过去的几十年中，化学农药在农业增产和害虫防治中起到了重要作用，但化学农药的大量使用，带来了严重的“3r”问题(即抗药性resistance，农药残留residence，再猖獗resurgence)，也带来了一系列的生态环境问题。长期大量使用化学农药导致抗药性害虫增加，特别是近10年来，棉铃虫、蚜虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、叶螨类等多发性害虫对菊酯类、有机磷类化学农药的抗药性增加了几百乃至数千倍。化学农药的施用，使农产品中农药残留量增加，严重污染了环境，危及人类建康及生命。随着人们生活水平的提高，人们对环境的要求越来越高，因此迫使人们寻找一种害虫防治替代方法。

斜纹夜蛾(spodopteralitura)属鳞翅目夜蛾科，危害寄主相当广泛，除十字花科蔬菜外，还可危害包括瓜、茄、豆、葱、韭菜、菠菜以及粮食、经济作物等近100科、300多种植物，是一种重要的农作物害虫，以幼虫咬食叶片、花蕾、花及果实，初龄幼虫啮食叶片下表皮及叶肉，仅留上表皮呈透明斑。斜纹夜蛾4龄以后进入暴食，咬食叶片，仅留主脉，在包心椰菜上，幼虫还可钻入叶球内危害，把内部吃空，并排泄粪便，造成污染，使之降低乃至失去商品价值。斜纹夜蛾虫害在国内各地都有发生，对生产带来了极大的损害。为了规避杀虫剂抗性的问题，也使农民和种植者能够回应消费者对农药残留问题，需要一个有效的方法来控制斜纹夜蛾而不涉及化学药品残留。现在研究阶段，均把研究方向转向了杀虫菌剂，但是对斜纹夜蛾强感病性菌株大多来源于土样自然分离，此种分离方法分离率低，且实验周期长，针对斜纹夜蛾的感病率也较低，且此方法并不可控。

因此，提供一种实验室可控的，能够高效率快速稳定的分离强致病斜纹夜蛾的菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种杂色曲霉hy12的筛选方法，克服了传统利用土样法自然分离致病菌株效率低、针对性低、不可控、不易重复的缺陷，本发明从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，从幼虫体内腐烂的内脏中分离致病菌株，所得到的杂色曲霉hy12的发酵物可感染斜纹夜蛾，使其提前进入蛹期，对化蛹期间的斜纹夜蛾具有较高的致死率和致畸率，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，为新杀虫菌剂的创制提供新颖的模板。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种杂色曲霉hy12(aspergillusversicolor)的筛选方法，所述杂色曲霉hy12菌株于2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为cgmccno：14790；具体筛选步骤如下：

(1)感病斜纹夜蛾幼虫的处理

从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，用消毒灭菌后的挑针挑取虫体上的霉层，放于预先准备好的heck培养基上，划线处理或将表面没有霉层的感病斜纹夜蛾幼虫浸入75％酒精2s，消毒体表后，无菌条件下将其已腐烂的内脏制成匀浆，用无菌水稀释涂布培养；

(2)感病斜纹夜蛾的菌株初筛选

将步骤(1)所述匀浆利用无菌水按梯度稀释成10倍液、100倍液、1000倍液，并涂布在筛选培养基平板表面，并涂布在筛选培养基平板表面，25-28℃培养45-50h，挑取单菌落于sday真菌培养基平板上纯培养，获得13个真菌菌株并对真菌进行纯培养，经形态学观察初步鉴定，它们分别为白僵菌属(beauverja)2株，镰刀菌属(fusarium)2株，曲霉属(aspergullus)3株，木霉属(trichoderma)1株，青霉属(penicillium)1株，枝孢属(cladosporium)1株、未鉴定真菌3株。

(3)进行虫体接种试验

将步骤(2)所述若干菌株，在所述真菌培养基平板上培养至充分产孢，利用分生孢子配制相应的孢子悬浮液后，分别感染斜纹夜蛾3龄幼虫；

(4)筛选出对斜纹夜蛾强致病性菌株并进行分子生物学鉴定

进行毒力回归分析筛选出对斜纹夜蛾强致病性菌株，并进行分子生物学鉴定。

其中，毒力回归分析方法为以虫生真菌对斜纹夜蛾的累积死亡率的概率值为因变量(y)，处理浓度对数为自变量(x)，用多重线性回归方法建立各菌株的毒力回归线性模型，再利用此模型求得致死中浓度(lt50)。

本发明筛选出的杂色曲霉hy12对斜纹夜蛾致病性(感染性)强，从接种至斜纹夜蛾起，接种菌株hy12的试虫行动迟缓，且提前进入蛹期，化蛹期间试虫畸形率和死亡率最高。

进一步的，步骤(1)所述消毒方法为将表面没有霉层的所述幼虫浸入75％的酒精2-5s。

进一步的，所述筛选培养基为heck培养基；所述heck培养基包括下列重量份数的组分：葡萄糖4份、蛋白胨2份，高锰酸钾0.025份，放线菌酮0.5份，庆大霉素0.2份，氨苄青霉素0.048份，琼脂2份和水100份。

本发明以heck培养基为筛选培养基，本发明公开的筛选培养基经过改进，能够有效地抑制杂菌的生长而高效地获得杂色曲霉。

进一步的，所述真菌培养基为sday培养基，其中所述sday培养基包括以下重量份数的组分，葡萄糖4份，蛋白胨1份，酵母浸出粉1份，琼脂2份，庆大霉素0.2份和水100份。

进一步的，步骤(3)中所述孢子悬浮液的制备方法为：在无菌条件下，挑取所述分生孢子粉，加入0.05％tween80溶液配制成孢子悬浮液，使之达到10⁸个/ml。

孢子悬浮液为10⁸个/ml，能将孢子较好的分散，便于下一步的吸取和接种，如果孢子悬浮液的浓度过大，则浓影响计数的精确性；反之，浓度过小过则降低接种成功率。

进一步的，步骤(3)中所述孢子悬浮液感染斜纹夜蛾3龄幼虫的方法为：将所述斜纹夜蛾3龄幼虫置于底部垫吸水纸的培养皿中，吸取所述孢子悬浮液滴在所述斜纹夜蛾3龄幼虫体壁周围；待所述斜纹夜蛾3龄幼虫体壁干时，添加干净红薯叶，然后盖上纱布，置于室温下培养，每隔6h添加新鲜红薯叶。

本发明公开了利用孢子悬浮液感染斜纹夜蛾3龄幼虫，其中1-3龄斜纹夜蛾幼虫易受真菌侵染，且以2龄幼虫的侵染率为最高,侵染率随处理时间延长、接种浓度增加而增大，被侵染斜纹夜蛾幼虫死亡通常发生在处理后的下一个龄期，故本发明选择较大的3龄虫作为试虫，验证hy12的优越性。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种杂色曲霉hy12的筛选方法，具有如下技术优点：本发明提供了一种杂色曲霉hy12的筛选方法，克服了传统利用土样法自然分离致病菌株效率低、针对性低、不可控、不易重复的缺陷，本发明从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，从幼虫体内腐烂的内脏中分离致病菌株，所得到的杂色曲霉hy12的发酵物可感染斜纹夜蛾，使其提前进入蛹期，对化蛹期间的斜纹夜蛾具有较高的致死率和致畸率，对斜纹夜蛾的繁衍具有较好的抑制作用，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，为新杀虫菌剂的创制提供新颖的模板。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的杂色曲霉hy12菌株的菌落图；

图2附图为本发明提供杂色曲霉hy12的rdnaits区段pcr凝胶电泳图；

图3附图为本发明提供的菌株hy12亲缘关系相近菌株的系统发育树。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

杂色曲霉hy12菌株筛选

从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，筛选表面没有霉层的感病斜纹夜蛾幼虫，并将其浸入75％酒精2s，消毒体表后，无菌条件下剥离出幼虫体内腐烂的内脏，并将已腐烂的内脏制成匀浆。匀浆液用无菌水按梯度稀释成10倍液、100倍液、1000倍液，并涂布在筛选培养基平板表面，25.6℃下培养5天。其中筛选培养基为heck培养基，包括下列重量份数的组分：葡萄糖4份、蛋白胨2份，高锰酸钾0.025份，放线菌酮0.5份，庆大霉素0.2份，氨苄青霉素0.048份，琼脂2份和水100份。

挑取heck培养基中的单菌落，然后在真菌培养基上采用平板划线法进行分离纯化，获得纯化的生长菌株。其中真菌培养基为sday培养基，包括葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g，琼脂20g，适量抗生素。经过筛选共获得13个真菌菌株，经形态学观察初步鉴定，它们分别为白僵菌属(beauverja)2株，镰刀菌属(fusarium)2株，曲霉属(aspergullus)3株，木霉属(trichoderma)1株，青霉属(penicillium)1株，枝孢属(cladosporium)1株、未鉴定真菌3株。将每个菌株保存至斜面试管中编号，保存于4℃冰箱中，后期用于接种试验。以上操作均在超净工作台上保持无菌状态进行。

虫体接种试验

供试试虫采用斜纹夜蛾的3龄幼虫，第一代幼虫采自湖南农业大学耘园基地，连续室内饲养2代后用于试验。

将上述得到的菌株在sday培养基平面上培养15d充分产孢后，用灭菌水(0.05％吐温-80)配制成3.13×10⁹个/ml的孢子悬浮液。选用虫龄、生长状况一致并且健康的斜纹夜蛾3龄幼虫置于直径为90cm的培养皿中，底部垫有一层吸水纸，用移液枪吸取已配制好的孢子悬浮液均匀滴在虫体体壁周围，以充分接触为宜。待斜纹夜蛾幼虫体壁较干时添加干净红薯叶，然后盖上纱布，置于室温中；同时以灭菌水喷洒斜纹夜蛾体壁作对照，每皿处理10头，每个处理3次重复。

将接种处理后的斜纹夜蛾置于室内常温下培养，每隔6h定量添加新鲜红薯叶，每天定时观察记录斜纹夜蛾的发病和死亡情况，如斜纹夜蛾体壁颜色变化、湿润程度和行为特征和取食情况等。连续观察15d，记录相应的数据，根据记录的原始数据，计算各处理中始见虫体死亡时间、虫体的累计死亡率。

其中，对照组的斜纹夜蛾生长发育正常，全部都能正常化蛹。用纯培养的13个菌株接种斜纹夜蛾3龄幼虫后观察，有6个菌株(cz-6青霉属、yjh2青霉属、hy-7木霉属、hy-9曲霉属、hy-10木霉属和ny-1木霉属)没有引起发病，其取食和生长发育未受到影响。其他7个菌株对斜纹夜蛾幼虫表现出不同程度的致病性，见表1。

表1分离出的不同菌株对斜纹夜蛾3龄幼虫的影响

由表1可知，其中曲霉属菌株(hy12)对斜纹夜蛾致病性较强，分别从接种后4h、5h和3d开始出现虫体死亡，到第15d的累积死亡率达到93.33％。

利用筛选出的曲霉属菌株(hy12)、孢霉菌属(bs)和枝孢属(hl)，对斜纹夜蛾的毒性测定数据进行毒力回归分析：以虫生真菌对斜纹夜蛾的累积死亡率的概率值为因变量(y)，处理浓度对数为自变量(x)，用多重线性回归方法建立各菌株的毒力回归线性模型，再利用此模型求得致死中浓度(lt50)。其中利用筛选出的菌株做毒力测定试验，利用灭菌水处理后，观察斜纹夜蛾生长发育情况。结果如表2。

表2不同菌株对斜纹夜蛾的毒力测定结果

利用筛选出的曲霉属菌株(hy12)、孢霉菌属(bs)和枝孢属(hl)，分别接种斜纹夜蛾幼虫，统计从接种起到幼虫化蛹的时间，所化蛹的畸形率(12d)及蛹的死亡率(20d)，见表格3。

表3不同菌株对斜纹夜蛾的影响

斜纹夜蛾在接种曲霉属菌株(hy12)后在初期症状没有明显的差异，从第3d开始就开始有幼虫死亡，lt50时间最短为8.14d，从接种第1d起，接种菌株hy12的试虫行动迟缓，提前进入蛹期，化蛹期间试虫畸形率最高，死亡率与其他两种菌相当，但是h12从感染到化蛹的时间缩短为5.73d，在生产实际中，极大地缩短了害虫对作物的为害时间，从而可以挽回部分产量上的损失。

实施例2

杂色曲霉hy12菌株鉴定

将实施例1分离得到的曲霉属菌株(hy12)接种到在sday培养基上，于25.6℃恒温培养箱中培养，观察其菌落性状、颜色，并从菌落上挑菌丝制片镜检，观察其菌丝、分生孢子梗和产孢轴等颜色和性状；待菌落产孢后，挑取分生孢子镜检观察其分生孢子的性状、色泽、测量其大小并拍照，结果如图1所示。由图1可知，在sday培养基上培养14d，菌落直径达到66.3mm，菌落呈圆形，白色棉絮状菌丝，菌落较厚，质地致密柔软；后期大量产生分生孢子，孢子为棕色粉状，粉层厚，有同心轮纹隆起。

用接种环挑取上述培养的杂色曲霉hy12菌丝，用灭菌后的小匙刮取分生孢子置于研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉，研磨2-3次确保研成细粉状。将研钵中的细粉迅速转移至1.5ml的离心管中，加入1ml65℃预热的dna提取液，充分混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液混匀，65℃下水浴30min，5-10min轻柔振荡一次；12000rpm常温离心5min。后取上清液于新的离心管中，吸取速度要慢且匀，加入等体积氯仿：异戊醇(24/1)混合液再抽提一次，12000rpm离心5min，缓慢吸取上清液于一新离心管中，加入1/10体积3m醋酸钠，2/3体积预冷异丙醇，室温静置15min；12000rpm离心10min，弃上清液；再加入75％乙醇洗涤沉淀；斜拿离心管，用移液枪从沉淀的对面紧贴管壁处轻轻吸出乙醇，敞盖于室温中15min干燥；最后将所得沉淀复溶于50μlte中；7μl点样，并使用λ-hindiiidigestdnamarker，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2。由图2可知，经琼脂糖凝胶电泳检测后用its1和its4引物进行pcr扩增所得rdnaits区段大小约为500bp，序列为seqidno.1。其中，rdnaits区段的pcr扩增采用通用引物its1和its4；

引物its1的序列为：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；its4的序列为：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’；

将所提取的样品dna溶液分别稀释作为模板，pcr反应依据下列反应条件进行：95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次；72℃补充延伸10min；

pcr反应体系如下：

将pcr产物纯化后，送往基源生物科技公司测序，对曲霉属菌株(hy12)进行鉴定，进行blast(basiclocalalignmentsearchtool)比对，结合病原菌的形态学特征由此确定该曲霉属菌株(hy12)的分类地位，结果如图3所示。由图3可知曲霉属菌株(hy12)与曲霉属的多株真菌相似性较高，与aspergillusversicolor相似性系数达到99％，购买杂色曲霉(上海研生生化试剂有限公司)作为对照组，根据rdnaits序列，再结合其形态学将菌株hy12鉴定为杂色曲霉真菌(aspergillusversicolor)。

购买杂色曲霉(上海研生生化试剂有限公司)作为对照组，在sday培养基上培养14d菌落直径48.7mm,菌落呈圆形，表面绒状，菌丝灰白色，分生孢子墨绿色，有辐射纹。

本发明中的杂色曲霉hy12菌株在sday培养基上培养14d菌落直径66.3mm。菌落呈圆形，白色棉絮状菌丝，菌落较厚，质地致密柔软；后期大量产生分生孢子，孢子为棕色粉状，粉层厚，有同心轮纹隆起，hy12生长速度比对照杂色曲霉要快，且其分生孢子形态以及颜色相差较大。

本发明提供了一种杂色曲霉hy12的筛选方法，克服了传统利用土样法自然分离致病菌株效率低、针对性低、不可控、不易重复的缺陷，本发明从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，从幼虫体内腐烂的内脏中分离致病菌株，所得到的杂色曲霉hy12的发酵物可感染斜纹夜蛾，使其提前进入蛹期，对化蛹期间的斜纹夜蛾具有较高的致死率和致畸率，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，为新杀虫菌剂的创制提供新颖的模板。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>一种杂色曲霉hy12的筛选方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>436

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggctggcgcccggccggccctaatcgagcgggtgacaaagccccatacgctcgaggaccg60

gacacggtgccgccgctgccttttgggcccgtcccccgggggggacgacgacccaacaca120

caagccgggcttgatgggcagcaatgacgctcggacaggcatgccccccggaatgccagg180

gggcgcaatgtgcgttcaaagactcgatgattcactgaattctgcaattcacattactta240

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