本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种沼气发酵系统运行稳定性的判别方法。
背景技术：
近年来，严重的能源危机和环境污染，使生物质能源——沼气生产技术成为世界各国研究热点。沼气发酵是一个由多种微生物联合，交替作用的复杂生化过程，但是人们对沼气发酵微生物，尤其是厌氧微生物的生理生化特性及代谢特点的认识程度和驾驭能力极其有限。及时、深入了解厌氧反应过程中微生物菌群的结构、功能及动态变化是优化和稳定厌氧发酵系统的前提和必要条件。
目前，在沼气生产中，普遍是将沼气产量、气体组成、ph、碱度、挥发性有机酸（vfas）等作为控制系统中的监测参数，还不能直接在线检测微生物的生长、菌群组成和群落动态变化等信息，因此，急需采用现代生物学技术开展对厌氧发酵过程中微生物多样性变化和动态研究，了解微生物群落构成与工艺参数之间的关系。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用微生物学方法来判定沼气发酵系统运行稳定性及其应用，该方法可以作为其他常规检测指标的有益补充，保证和促进反应器系统的稳定和高效运行。
本发明采用如下技术方案：
一种沼气发酵系统运行稳定性的判别方法，通过测定沼气发酵系统中厚壁菌门和拟杆菌门两个菌群丰度之比，判定沼气发酵系统的运行状态。
进一步的，所述沼气发酵系统为全混式半连续发酵系统。
进一步的，所述沼气发酵系统中厚壁菌门和拟杆菌门微生物菌群丰度采用基于分子生物学的高通量测序技术获得。
进一步的，当厚壁菌门和拟杆菌门两个菌群丰度之比≥1.0时，系统运行稳定。
进一步的，当厚壁菌门和拟杆菌门两个菌群丰度之比为1.0~0.8时，系统处于临界范围，运行趋于不稳定，有酸化趋势。
进一步的，当厚壁菌门和拟杆菌门两个菌群丰度之比≤0.8时，系统运行不稳定或超负荷运行。
进一步的，其具体包括如下步骤：
（1）样品采集：沼气发酵过程中采集发酵液，离心去上清液，得到待测样品；
（2）基因组dna提取：采用dna提取试剂盒对样本的基因组dna进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳和nanodrop检测dna的纯度和浓度。取dna于ep管中，使用无菌水稀释至10ng/μl，得到稀释后的基因组dna；
（3）pcr扩增：以稀释后的基因组dna为模板，使用带barcode的特异引物进行pcr扩增；
（4）pcr产物纯化和定量：根据pcr产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，对目的条带进行回收，并用nanodrop进行浓度和质量的测定；
（5）文库构建和上机测序：使用建库试剂盒进行文库构建，使用测序试剂盒和测序仪进行上机测序；
（6）生物信息学分析：包括测序数据处理、otu聚类和16srrna多样性分析；
（7）计算厚壁菌门和拟杆菌门两个菌群丰度之比，即厚壁菌门otu数量与拟杆菌门otu数量之比，判定沼气发酵系统的运行状态。
进一步的，所述步骤（3）中，所述引物对如seqidno.1和seqidno.2，或如seqidno.1和seqidno.3所示。
进一步的，所述步骤（3）中，pcr循环程序为：95℃5min，95℃15个循环40s，56℃40s，72℃50s；72℃延伸10min，冷却至4℃。
进一步的，所述步骤（6）中，所述16srrna多样性分析为16srrna序列根据样品特异性条形码进行分类，进一步去除低质量嵌合序列以及对非冗余序列进行对齐，随后通过构建一个两两矩阵对所有微生物群落进行生态分析。
进一步的，所述步骤（6）中，所述otu聚类为根据平均邻近聚类算法，以16srrna基因序列97%相似度作为分类操作单元的划分标准。
一种上述沼气发酵系统稳定性的判别方法在沼气工程中的应用。
具体的，该方法作为预测沼气工程中运行稳定性的辅助监测。
具体的，所述沼气工程的发酵工艺为全混式半连续发酵工艺（即每天定时进料和出料）。
具体的，所述沼气工程以畜禽粪污、秸秆或园林废弃物为原料。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种新的判定沼气厌氧发酵系统稳定运行微生物学方法，该方法可以作为其他常规检测指标的有益补充。其次，沼气工程普遍采用的ph值、沼气产量等指标表征厌氧发酵系统的稳定性常具有滞后性，往往在系统发生异常之后才会表现出明显变化，而厌氧发酵系统内各个指标的变化都与微生物菌群动态变化相关，该方法能够更真实准确地反映厌氧发酵系统运行稳定性，进而为沼气工程的精密控制提供技术和数据支撑；第三，该方法将现代先进的分子生物学技术与工程运行联系起来，有助于在实际生产中加强对系统微生物菌群的认识，为功能微生物高效生长和功能发挥创造良好条件，并进一步对保证和促进反应器系统的稳定和高效运行奠定基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1-6
分别以鸡粪、猪粪、牛粪、秸秆等为原料，采用5l厌氧罐，分别设进样口、出料口、集气口等，中温35±2℃，半连续发酵系统，水力停留时间20-30d。每天定时测定产气量、甲烷含量、ph值等，及时判断厌氧发酵系统运行稳定性和所处运行阶段。
样品采集：厌氧发酵过程中，分别从起始阶段（低负荷）1、稳定运行阶段（相对高负荷）2、超负荷运行阶段3、降低有机负荷阶段（恢复正常运行）4取样，每个样品5个重复，离心去上清，样品保存在-80℃备用。有测序平台的自己高通量测序，没有的可以送基因测序公司进行高通量测序检测。
基因组dna提取：采用土壤dna提取试剂盒对样本的基因组dna进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳和nanodrop检测dna的纯度和浓度。取提到的的适量dna样品于ep管中，使用无菌水稀释样品至10ng/μl，保存在-80℃冰箱以备后续实验使用。
pcr扩增：以稀释后的基因组dna为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物，和高效高保真的酶进行pcr，确保扩增效率和准确性。
引物对应v4区域，细菌16s引物：
515f（seqidno.1）：5'-gtgccagcmgccgcggtaa-3'；
909r（seqidno.2）：5'-ccccgycaattcmtttragt-3'；
或者515f（seqidno.1）：5-gtgccagcmgccgcggtaa-3；
806r（seqidno.3）：5-ggactacvsgggtatctaat-3。
pcr循环程序：95ºc5min，95ºc15个循环40s，56ºc40s，72ºc50s；72ºc延伸10min，冷却至4ºc。
pcr产物纯化和定量：pcr产物使用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据pcr产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，对目的条带使用生工公司提供的胶回收试剂盒回收产物，并用nanodrop进行浓度和质量的测定。
文库构建和上机测序：使用建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过qubit和qpcr定量，文库合格后，使用v2测序试剂盒（2×250bp）和miseq测序仪进行上机测序。
生物信息学分析：测序数据处理、otu聚类、alpha多样性分析、beta多样性分析等。16srrna序列通过mothur软件分析，根据样品特异性条形码进行分类。通过mothur软件进一步去除低质量嵌合序列。相对于silva数据库校正（http：//www.arb-silva），在mothur软件中利用needleman-wunsch和nast算法对非冗余序列进行对齐。随后通过构建一个两两矩阵对所有微生物群落进行生态分析。根据平均邻近聚类算法，以16srrna基因序列97%相似度作为分类操作单元（otus）的划分标准。另外也可由测序公司提供分析报告。
otu（operationaltaxonomicunits）操作分类单元，是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。通常按照97%的相似性阈值将序列划分为不同的otu，每一个otu通常被视为一个微生物物种。相似性小于97%就可以认为属于不同的种，相似性小于93%~95%，可以认为属于不同的属。样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对otu的分析。即通过otu分析，就可以知道样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。
本发明中，厚壁菌门和拟杆菌门两个菌群丰度之比，是指高通量测序中，厚壁菌门otu数量与拟杆菌门otu数量之比。
表1
本发明所述判定方法的验证结果如表1所示。结果表明，在低负荷稳定运行阶段，几种原料厌氧发酵过程中f/b值均较高，显著高于1.0，说明系统运行稳定，可以增加有机负荷；在高负荷稳定运行阶段的f/b值显著低于低负荷稳定运行阶段，此时f/b值接近1.0，处于临界范围，不能再大幅度增加有机负荷，但可以进行适当微调，其中实施例6，f/b值为0.81，虽然还能稳定运行，但已经处于临界状态，不能再增加有机负荷，建议适当降低有机负荷会有助于系统稳定运行；在超负荷不稳定运行阶段，f/b值显著下降，低于0.8，此时建议尽快降低有机负荷或者延长水力停留时间，以使系统尽快恢复稳定运行；在降低有机负荷后的恢复稳定运行阶段，f/b值又显著提高，大于超负荷不稳定运行阶段的f/b值。不同原料在厌氧发酵不同阶段，f/b值不完全相同，但其变化趋势完全一致。进一步说明厚壁菌群和拟杆菌群丰度比（f/b值）与现有技术中利用ph和溶积产气率判定沼气发酵工艺运行的稳定性得到的结果一致，可以作为指示沼气发酵工艺过程运行稳定性，进而作为ph值、甲烷含量、沼气产量、挥发性脂肪酸等在线监测指标的有效补充。
实施例7
三个有效容积1000-2000m3的正在运行的沼气工程，原料均为猪粪，中温35±2℃半连续发酵。沼气工程1为刚启动，运行时间不足1个月，ph值6.9~7.2，容积产气量0.8m3/d﹒m3；沼气工程2正常运行，运行时间大于2~3年，ph值7.0~7.8，容积产气量1.2m3/d﹒m3；沼气工程3，运行时间大于2年，但是近期日产量显著下降，ph值小于7.0~7.3，容积产气率0.6m3/d﹒m3。分别从三个沼气工程取样品，通过高通量测序分析厚壁菌群和拟杆菌群丰度比（f/b比），如表2所示。
表2
综合上述实施例1~7，本发明将分子生物学的基因组测序技术用于厌氧发酵特别是沼气发酵过程，分析关键微生物种群特征和动态变化，进而判定或预测系统运行稳定性。不仅在实际生产中有助于加强对厌氧消化反应器系统微生物菌群的认识，为功能微生物高效生长和功能发挥创造良好条件，而且对保证和促进反应器系统的稳定和高效运行，实现对沼气工程的精密控制奠定基础。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限于此，本领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神，并作出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>河北省科学院生物研究所
<120>一种沼气发酵系统运行稳定性的判别方法及其应用
<130>2019
<160>3
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
gtgccagcmgccgcggtaa19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
ccccgycaattcmtttragt20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
ggactacvsgggtatctaat20