橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针与流程

本发明涉及农林业和植物检疫技术领域，具体涉及一种橘臀纹粉蚧的实时荧光pcr检测方法；此外，本发明还涉及检测橘臀纹粉蚧的引物和探针。

背景技术：

橘臀纹粉蚧planococcuscitris（risso）又名橘粉蚧、柑橘臀纹粉蚧，隶属于同翅目（homoptera）粉蚧科（pseudococcidae）臀纹粉蚧属（planococcus），是热带、亚热带观赏性植物、水果的主要害虫，其主要为害寄主植物的茎、叶片、花果等幼嫩部位，轻者叶片变黄，重者干枯脱落，使植株发育不良，严重影响水果的经济价值和观赏性植物的品相。同时，橘臀纹粉蚧与另一种重要的检疫性粉蚧大洋臀纹粉蚧p.minor(maskell)形态相近，且常在一种寄主上混合发生，极易混淆，区分两者难度较大，因此建立快速准确鉴定橘臀纹粉蚧方法十分必要。

《gb/t35340-2017大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧检疫鉴定方法》中列出了区分大洋臀纹粉蚧和橘臀纹粉蚧的传统形态学鉴定方法，传统形态学鉴定方法需2—3天，鉴定时间长；传统形态学检测方法需要先制作玻片，观察形态学特征才能鉴定，并且鉴定者需要一定鉴定经验，存在人工误差，影响鉴定准确率。

中国专利申请cn2011100500314公开了南洋臀纹粉蚧的实时荧光pcr引物、探针及检测方法，其检测目标是南洋臀纹粉蚧，与本发明的检测目标橘臀纹粉蚧种类不同，且设计的引物和探针、pcr反应体系和反应条件均不同。南洋臀纹粉蚧与橘臀纹粉蚧在外部形态上有区别，因此容易区分。

本发明橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧不仅在外部形态上近似，两者在分子水平上的差异也较小，这对橘臀纹粉蚧实时荧光特异性taqman探针的设计造成一定难度，是本领域的技术难题。因此，本领域亟需解决这一技术难题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种橘臀纹粉蚧的实时荧光pcr检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。利用橘臀纹粉蚧检测引物及探针可以快速、准确地对橘臀纹粉蚧进行检测鉴定。

本发明根据橘臀纹粉蚧的mtdna中部分基因的序列设计特异性引物和探针，建立了橘臀纹粉蚧的实时荧光pcr检测方法，以达到快速准确检测鉴定橘臀纹粉蚧的目的。

在本发明的一方面，提供一种橘臀纹粉蚧的实时荧光pcr检测方法，包括如下步骤：

(1)设计引物和探针；

该引物的序列为：

上游引物pcf3：5’-gattttgattattaattccatcac-3’，如seqidno：6所示序列或其互补链；

下游引物pcr3：5’-ttggattaccatttcctaatgg-3’，如seqidno：9所示序列或其互补链；

该探针的序列为：

橘臀纹粉蚧探针pc-mgb：5’-ttgaacactttaccctccttta-3’，如seqidno：10所示序列或其互补链；荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端；

(2)提取橘臀纹粉蚧dna；

(3)采用步骤（1）设计的引物和探针进行实时荧光pcr检测，用以区分橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）具体为：取橘臀纹粉蚧单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品dna。

作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中，所述实时荧光pcr检测的反应体系为25μl，包括2×premixextaq12.5μl，50×roxreferencedye0.5μl，步骤（1）设计的上下游引物pcf3/pcr3(5μmol/l)各1.0μl，pc-mgb探针1.0μl(5μmol/l)，dna模板2.0μl，超纯水补至25μl。

作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中，所述实时荧光pcr检测的反应程序为：预变性95℃30sec；然后95℃5sec，60℃30sec循环40次。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测橘臀纹粉蚧的引物，其序列为：

上游引物pcf3：5’-gattttgattattaattccatcac-3’，如seqidno：6所示序列或其互补链；

下游引物pcr3：5’-ttggattaccatttcctaatgg-3’，如seqidno：6所示序列或其互补链。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测橘臀纹粉蚧的探针，其序列为：pc-mgb：5’-ttgaacactttaccctccttta-3’，如seqidno：10所示序列或其互补链；荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端。

上述实时荧光pcr检测方法采用taqman探针。taqman荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。常用的荧光基团是fam，tet，vic，hex。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、检测时间大大缩短，可以在6个小时内完成检测，传统的形态学鉴定方法需2—3天；《gb/t35340-2017大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧检疫鉴定方法》中列出了区分大洋臀纹粉蚧和橘臀纹粉蚧的形态学鉴定方法，相较于gb/t35340-2017，本发明检测方法检测时间大大缩短，可以在6个小时内完成检测。

2、对橘臀纹粉蚧的鉴定准确率增大，传统的形态学鉴定方法需要先制作玻片，观察形态学特征才能鉴定，并且鉴定者需要一定鉴定经验，存在人工误差，影响鉴定准确率。本发明检测方法则大大提高了对橘臀纹粉蚧的鉴定准确率。

3、橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧不仅在外部形态上近似，两者在分子水平上的差异也较小，这对橘臀纹粉蚧实时荧光特异性taqman探针的设计造成一定难度，部分探针会有假阳性扩增（见实施例1）。不同引物的选择对同一探针的扩增效率有所影响，部分引物的扩增效率较低，部分会有假阳性扩增，因此本实验在最终确定方法时，选择了其中扩增效率较高，同时重复性好的pcf3/pcr3作为扩增引物。其特异性有引物和探针双重保证，为橘臀纹粉蚧的鉴定提供了一种新方法，检测准确度高，分析简单快捷，可用于基层实验室橘臀纹粉蚧快速鉴定（见实施例2）。经过实施例2的对比实验，筛选到pcf3/pcr3及探针pc-mgb可以检测到橘臀纹粉蚧，可以作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物和探针。经实验验证，橘臀纹粉蚧特异性引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb具有特异性好、灵敏度高的特点，检测的最低dna浓度可达pg级水平，和套式pcr的灵敏度相当，达到了预料不到的技术效果（见实施例3）。

附图说明

图1是本发明实施例1中引物citri-f/citri-r和探针citri-p在橘臀纹粉蚧的mtdna上的位置示意图；

图2是本发明实施例1中应用引物citri-f/citri-r和探针citri-p对不同来源的9个臀纹粉蚧属样品实时荧光pcr扩增的结果示意图；

图3是本发明实施例2中引物pcf1、pcf2、pcf3、pcr1、pcr2、pcr3和探针pc-mgb在橘臀纹粉蚧的mtdna上的位置示意图；

图4是本发明实施例2中应用不同引物和探针pc-mgb对cs-1a样品实时荧光pcr扩增的结果示意图；

图5是本发明实施例2中应用引物pcf3/pcr1和探针pc-mgb对3个臀纹粉蚧属样品实时荧光pcr扩增的结果示意图；

图6是本发明实施例2中应用引物pcf3/pcr2和探针pc-mgb对3个臀纹粉蚧属样品实时荧光pcr扩增的结果示意图；

图7是本发明实施例2中应用引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb对3个臀纹粉蚧属样品实时荧光pcr扩增的结果示意图；

图8是本发明实施例3中的引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb在橘臀纹粉蚧的mtdna上的位置示意图；

图9是本发明实施例3中应用本发明的引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb对不同来源的9个臀纹粉蚧属样品实时荧光pcr扩增的结果示意图；

图10是本发明实施例3中不同稀释浓度的橘臀纹粉蚧样品实时荧光pcr扩增的结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.设计引物和探针

根据橘臀纹粉蚧的mtdna（线粒体dna）中部分基因的序列设计如下引物citri-f/citri-r和探针citri-p（引物和探针由上海基康公司合成）：

上游引物citri-f：5’-tccccgattaaataattttagattttg-3’，如seqidno：1所示；

下游引物citri-r：5’-gatctaaaaatagaagaaattccatttaaatg-3’，如seqidno：2所示序列；

探针citri-p：5’-ttgaacactttaccctccttta-3’，如seqidno：3所示序列；

上述引物及探针的检测原理如图1所示。探针citri-p是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，引物citri-f/citri-r与橘臀纹粉蚧mtdna完成高温变性、低温复性延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，同时加入的探针citri-p与橘臀纹粉蚧mtdna互补，在低温复性延伸阶段，反应体系中的taq酶的5'－3'外切酶活性将探针citri-p酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。

2、提取橘臀纹粉蚧dna

取橘臀纹粉蚧单头虫样（样品来源见表1）放入研钵，加液氮磨成粉末状，用dneasy®blood&tissuekit(qiagen公司)提取样品dna。

供试样品材料包括上海辰山植物园（简称scsbg）、云南西双版纳热带植物园（简称xtbg）兰花上采集的橘臀纹粉蚧，以及上海海关（简称shcc）截获标本。外群应用大洋臀纹粉蚧(p.minor)、南洋臀纹粉蚧(p.lilacinus)，为上海海关截获标本。

表1样品具体信息

3、实时荧光pcr检测

实时荧光pcr扩增体系25μl（大连宝生物公司takarapremixextaqtm）：2×premixextaq12.5μl，50×roxreferencedye0.5μl，上下游引物citri-f/citri-r(5μmol/l)各1.0μl，citri-p探针(5μmol/l)1.0μl，dna模板2.0μl，超纯水补至25μl。实时荧光pcr扩增在7500real-timepcrsystem定量pcr扩增仪上进行。打开“7500fastsystemsoftware”，设置pcr反应条件，两步法扩增反应程序：预变性95℃30sec；然后95℃5sec，60℃30sec循环40次。点击运行，进行pcr反应，1h左右反应结束，保存文件，打开分析软件。

经pcr扩增，橘臀纹粉蚧特异性引物citri-f/citri-r和探针citri-p对供试的21个橘臀纹粉蚧样品（样品号见表1）均出现荧光增长曲线，有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增，但供试的6个（样品号见表1）的大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧样品也有阳性扩增，且th-1a及th-3a呈强阳性扩增，空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，部分样品扩增曲线参照图2。由图2表明引物citri-f/citri-r和探针citri-p可以检测橘臀纹粉蚧，但对近似种检测会出现假阳性扩增，不能作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物和探针。

实施例2引物筛选

1.设计引物和探针

根据橘臀纹粉蚧的mtdna（线粒体dna）中部分基因的序列设计如下特异性引物pcf1、pcf2、pcf3/pcr1、pcr2、pcr3和探针pc-mgb（本发明所公开的引物及探针，引物和探针由上海基康公司合成）：

上游引物

pcf1：5’-ctatacctatcattattggaag-3’，如seqidno：4所示序列；

pcf2：5’-catcagatttaatttttccccg-3’，如seqidno：5所示序列；

pcf3：5’-gattttgattattaattccatcac-3’，如seqidno：6所示序列；

下游引物

pcr1：5’-gctcttgataaaattggaatag-3’，如seqidno：7所示序列；

pcr2：5’-gtaattgctcttgataaaattgg-3’，如seqidno：8所示序列；

pcr3：5’-ttggattaccatttcctaatgg-3’，如seqidno：9所示序列；

橘臀纹粉蚧探针pc-mgb：5’-ttgaacactttaccctccttta-3’，如seqidno：10所示序列；

上述引物及探针的检测原理如图3所示。探针pc-mgb是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，引物与橘臀纹粉蚧mtdna完成高温变性、低温复性延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，同时加入的探针pc-mgb与橘臀纹粉蚧mtdna互补，在低温复性延伸阶段，反应体系中的taq酶的5'－3'外切酶活性将探针pc-mgb酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。

2、提取橘臀纹粉蚧dna

同实施例1。

3、引物筛选

将上述6条引物依次进行组合，以cs-1a为dna模板，应用探针pc-mgb进行实时荧光pcr检测，通过比较扩增效率筛选最优引物。实时荧光pcr扩增体系及反应条件同实施例1。

经实时荧光pcr扩增，引物pcf3/pcr1、pcf3/pcr2、pcf3/pcr3扩增效率较高（如图4所示）。

分别应用引物pcf3/pcr1、pcf3/pcr2、pcf3/pcr3及探针pc-mgb，对cs-1a、vn-1a、th-1a进行实时荧光pcr扩增，结果显示：

①应用引物pcf3/pcr1、pcf3/pcr2及探针pc-mgb对橘臀纹粉蚧cs-1a、vn-1a有阳性扩增，对近似种大洋臀纹粉蚧th-1a也有阳性扩增，空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，扩增曲线参照图5、图6。由此表明引物pcf3/pcr1、pcf3/pcr2及探针pc-mgb可以检测到橘臀纹粉蚧，但对近似种检测会出现假阳性扩增，引物pcf3/pcr1、pcf3/pcr2不能作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物。

②应用引物pcf3/pcr3及探针pc-mgb对cs-1a、vn-1a有阳性扩增，对近似种th-1a、空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，扩增曲线参照图7。由此表明pcf3/pcr3及探针pc-mgb可以检测到橘臀纹粉蚧，可以作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物和探针。

实施例3橘臀纹粉蚧特异性引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb的验证与检测灵敏度测试

根据橘臀纹粉蚧的mtdna（线粒体dna）中部分基因的序列设计如下特异性引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb（本发明所公开的引物及探针，引物和探针由上海基康公司合成）：

上游引物

pcf3：5’-gattttgattattaattccatcac-3’，如seqidno：6所示序列；

下游引物

pcr3：5’-ttggattaccatttcctaatgg-3’，如seqidno：9所示序列；

橘臀纹粉蚧探针pc-mgb：5’-ttgaacactttaccctccttta-3’，如seqidno：10所示序列；

上述引物及探针的检测原理如图8所示。探针pc-mgb是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，引物pcf3/pcr3与橘臀纹粉蚧mtdna完成高温变性、低温复性延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，同时加入的探针pc-mgb与橘臀纹粉蚧mtdna互补，在低温复性延伸阶段，反应体系中的taq酶的5'－3'外切酶活性将探针pc-mgb酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。

2、提取橘臀纹粉蚧dna

同实施例1。

3、橘臀纹粉蚧特异性引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb的验证与检测灵敏度测试

经pcr扩增，橘臀纹粉蚧特异性引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb对供试的21个橘臀纹粉蚧样品（样品号见表1）均出现荧光增长曲线，有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增，而供试的6个（样品号见表1）大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧样品和空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，部分样品扩增曲线参照图9。由此表明此次实时荧光pcr检测到的是橘臀纹粉蚧，表明引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb可以特异性检测橘臀纹粉蚧。

将cs-1a样品dna进行10倍梯度稀释，进行检测限位测试。经实时荧光pcr测定（反应体系和反应条件与试验样品相同），荧光信号曲线如图10所示，ct值分别为1号17.68、2号19.95、3号23.90、4号26.92、5号30.62、6号34.53、7号39.48。由于7号的ct值在>35，无法确定是否为阳性。所以，橘臀纹粉蚧特异性探针pc-mgb的检测限位cs-1adna浓度7.78mg/μl×10-5，即7.78×10-2ng/μl。

由上述3个实施例可以看出，橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧不仅在外部形态上近似，两者在分子水平上的差异也较小，这对橘臀纹粉蚧实时荧光特异性taqman探针的设计造成一定难度，部分探针会有假阳性扩增（见实施例1）。不同引物的选择对同一探针的扩增效率有所影响，部分引物的扩增效率较低，部分会有假阳性扩增，因此本实验在最终确定方法时，选择了其中扩增效率较高，同时重复性好的pcf3/pcr3作为扩增引物。其特异性有引物和探针双重保证，为橘臀纹粉蚧的鉴定提供了一种新方法，检测准确度高，分析简单快捷，可用于基层实验室橘臀纹粉蚧快速鉴定（实施例2）。经过实施例2的对比实验，筛选到pcf3/pcr3及探针pc-mgb可以检测到橘臀纹粉蚧，可以作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物和探针。

橘臀纹粉蚧特异性引物pcf3/pcr3和探针pc-mgb具有特异性好、灵敏度高的特点，检测的最低dna浓度可达pg级水平，和套式pcr的灵敏度相当，达到了预料不到的技术效果（见实施例3）。

序列表

<110>上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心

<120>橘臀纹粉蚧的实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针

<130>wh-np-18-100110

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

tccccgattaaataattttagattttg27

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

gatctaaaaatagaagaaattccatttaaatg32

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>3

ttgaacactttaccctccttta22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

ctatacctatcattattggaag22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

catcagatttaatttttccccg22

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

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<400>6

gattttgattattaattccatcac24

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

gctcttgataaaattggaatag22

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

gtaattgctcttgataaaattgg23

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

ttggattaccatttcctaatgg22

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>10

ttgaacactttaccctccttta22