辐射敏感基因标记物及在鉴别高LET射线辐射中的应用的制作方法

本发明属于辐射生物学射线类型检测领域，具体涉及辐射敏感基因标记物及在鉴别高let射线辐射中的应用。

背景技术：

线性能量传递(linearenergytransfer)是描述单位长度的电离密度或能量传递，其单位定义为一个带电粒子穿越1μm空间距离所释放的平均能量，即kev/μm。let是评价射线质的一个参数。在单位长度上电离密度大的let高，称为高let射线，反之则称低let射线。高线性能量传递射线(以下简称：高let射线)，系指快中子、负π介子以及氦、碳、氮、氧、氖等重粒子。除快中子不带电外，其他粒子都带电，可经同步或回旋加速器加速到几百mev/u能量量级。高let射线在组织中有一定射程，具有特征性的电离吸收峰型剂量曲线(即低剂量平台区域与布拉格峰)。不同与光子射线(如x射线、电子线)，该物理学特性为精准放射治疗提供了可能：单一照射野就可以得到较好的剂量分布，简化了射野设计，提高肿瘤治疗剂量的准确性。细胞对高let射线与低let射线放射敏感性不同。有两方面原因：①高let射线的氧增强比较低let射线为低，即高let射线放射敏感性对细胞中含氧程度依赖性较小；②细胞分裂周期的影响，主要是g0期细胞对高let射线抗拒性较小。因此，高let射线是克服放疗中乏氧细胞和g0期细胞对放射不敏感的一个重要途径。

除了在医学上的应用，高let射线也在核工业、核武器防护、反恐、航空航天等诸多领域也受到广泛关注。原子核在裂变、衰变等核反应过程中释放出的各种微观粒子和电磁辐射或“能量”产生的辐射作用，被称作核辐射。核辐射作用于物质可引起物质的电离和激发，故称为电离辐射。所有的核辐射均为电离辐射，反之就不然。如x射线，由于它不是产生于原子核，尽管是属于电离辐射，但不是核辐射。核武器爆炸导致的是最严重的核辐射事件，在核武器(原子弹)爆炸场区，释放的主要放射性核素达20种之上，产生的核辐射种类主要有高let射线(如α粒子、中子等)与低let射线(如β粒子、γ射线等)。核脏弹袭击是另一类潜在的核辐射威胁，核脏弹是带有放射性物质的常规爆炸爆炸装置，其没有核裂变反应，因此造成的核污染和核辐射种类较为单一，取决于制造脏弹所采用的放射物质。不同种类核辐射，其作用于生物体的相对生物效应有显著的差异。宇宙射线也伴随着大量高let粒子射线，如质子、α粒子、碳、氧、氮离子，因此对空间站驻站人员与实验动植物也将构成一定影响。美国宇航局(nasa)长岛辐射生物学实验室自上个世纪“冷战”时期以来一直致力于该研究领域的发展。

核辐射健康危害的风险与严重程度取决于射线类型、剂量率、机体吸收剂量以及个体的敏感性等。高let因其较高的相对生物学效应(relativebiologicaleffectiveness,rbe)因而导致更大的辐射损伤与晚期效应或远后效应，如在受照后数月甚至数年后发生恶性腺癌、肉瘤、血液系统肿瘤、白内障、慢性放射性皮炎、放射性纤维化、心血管系统疾病等等。因此，生物体受到高let射线暴露后如何快速、准确鉴别与检测出高let射线具有实际应用价值。目前国内尚无针对高let射线特异性的生物学检测方法。

技术实现要素：

基于现有技术存在的问题，本发明的第一目的在于提供辐射敏感基因标记物，该辐射敏感基因标记物被申请人证实仅针对于高线性能量传递(high-linearenergytransfer,let)射线(如：重粒子射线等)具有高度特异的辐射敏感性，对低线性能量传递(low-linearenergytransfer,let)射线(如x射线等)无辐射敏感性。

本发明的第二目的在于提供该辐射敏感基因标记物在鉴别高let射线辐射中的应用。基于检测被辐射的生物体内辐射敏感基因标记物的基因表达水平，从而用于鉴别被辐射的生物体是否被高let射线(如：重离子射线等)辐射导致，从而提供辐射剂量参考。

本发明的第三目的在于提供一种用于鉴别生物体是否被高let射线辐射的试剂盒及其应用，采用含有本发明辐射敏感基因标记物的试剂盒能够更加快速、便捷和准确的鉴别高let射线并提供剂量参考。

本发明的第四目的在于提供一种获得本发明辐射敏感基因标记物的方法。

本发明的目的通过以下技术手段得以实现：

第一方面，本发明提供的辐射敏感基因标记物，该辐射敏感基因标记物包括10个辐射敏感基因：loxl1(lysyloxidasehomolog1，人赖氨酰氧化酶样蛋白)、zfp385a、(zincfingerprotein385a，锌指蛋白385a)slc39a13(solutecarrierfamily39member13，溶质载体转运蛋白家族39成员a13)、smurf1(smadspecifice3ubiquitinproteinligase1，e3泛素连接酶)、katnb1(kataninp80subunitb1，剑蛋白p80亚基b1)、col24a1(collagentypexxivalpha1chain，胶原蛋白24α1链)、smap2(stromalmembrane-associatedgtpase-activatingprotein2，基质膜相关gtp酶激活蛋白2)、aebp1(adipocyteenhancer-bindingprotein1，脂肪细胞增强子结合蛋白1)、tcfe3(transcriptionfactore3，转录因子e3)和tlr1(tolllikereceptor1，toll样受体1)。

上述的辐射敏感基因标记物中，优选地，所述loxl1的核苷酸序列如下：

ctggatgccagaccctgtcttgtacctacttctcctctacaacaccatgg(如seqidno：1所示)(5’-3’)；

所述zfp385a的核苷酸序列如下：

agtcgggacagggtgtaaccaagggtgaagggggaacttcagtcccagct(如seqidno：2所示)(5’-3’)；

所述slc39a13的核苷酸序列如下：

ggcccttgtcctttgggttaagagtaagatgggggtggtgagggctccac(如seqidno：3所示)(5’-3’)；

所述smurf1的核苷酸序列如下：

aaggcgcggcagggccccggctgttcaccattcacctgatagacgccaat(如seqidno：4所示)(5’-3’)；

所述katnb1的核苷酸序列如下：

gtggagtctgcatggtcagccagcaacgggagcaacagggtacacaatgc(如seqidno：5所示)(5’-3’)；

所述col24a1的核苷酸序列如下：

caggccacctaaatccagtggtaggtttggattagaaactggtgtttgtg(如seqidno：6所示)(5’-3’)；

所述smap2的核苷酸序列如下：

ggatctggcctgtgactagaagaccaacccctacgaggaaatgtggagct(如seqidno：7所示)(5’-3’)；

所述aebp1的核苷酸序列如下：

aagccctgcccaattcaaactaaggcagcacctcccaagcctgtgccagc(如seqidno：8所示)(5’-3’)；

所述tcfe3的核苷酸序列如下：

ggcagggcctgggaggaatggtggcaaaggtataatgtatccgtgttttg(如seqidno：9所示)(5’-3’)；

所述tlr1的核苷酸序列如下：

ggcctgggaccactcatctcctgctgttgtttctggagccccttgatagg(如seqidno：10所示)(5’-3’)。

第二方面，本发明还提供上述辐射敏感基因标记物在鉴别高let射线辐射中的应用。

上述的应用中，优选地，该应用包括以下步骤：

检测被辐射的生物体内辐射敏感基因标记物loxl1、zfp385a、slc39a13、smurf1、katnb1、col24a1、smap2、aebp1、tcfe3和tlr1的基因表达水平，当其表达水平均出现显著高调，则可鉴别确定被辐射的生物体为高let射线辐射暴露。

上述的应用中，所述生物体可以包括人、动物等。

上述的应用中，优选地，所述高let射线包括快中子射线、负π介子射线和重离子射线等中的一种或多种。

上述的应用中，优选地，所述重离子射线包括氦离子射线、碳离子射线、氮离子射线、氧离子射线和氖离子射线等中的一种或多种。

上述的应用中，优选地，所述敏感基因标记物的基因表达水平为其转录水平差异表达倍数的平均值。

第三方面，本发明还提供一种用于鉴别生物体是否被高let射线辐射的试剂盒，所述试剂盒含有上述辐射敏感基因标记物。

第四方面，本发明还提供上述的试剂盒在鉴别高let射线辐射中的应用。

第五方面，本发明还提供一种以非治疗目的获取上述辐射敏感基因标记物的方法，包括如下步骤：

对小鼠进行不同射线类型、不同剂量单次梯度剂量照射和分次梯度剂量照射后，提取新鲜肺组织做基因芯片或实时定量聚合酶链式反应，基于全基因组基因表达阵列对24周肺组织全基因组表达水平进行分析，分析不同射线照射，辐射剂量与基因表达的趋势关系，获得基因表达量随高let射线辐射剂量升高而升高，且不随低let射线辐射剂量变化而变化的表达基因组合，即该辐射敏感基因标记物。

上述的方法中，不同射线类型、不同剂量单次梯度剂量照射和分次梯度剂量照射可以采取如下方式，例如：x线梯度剂量单次照射(0、10.5、12.5、14.5、17.5gy)、x线梯度剂量分次照射(0、10、20、30、40gy分5次照射)、碳离子(carbon-ions)梯度剂量单次照射(0、7.5、10.5、12.5、14.5gy)、碳离子(carbon-ions)梯度剂量分次照射(0、5、10、15、20gy分5次照射)。

上述的方法中，优选地，所述不同射线类型包括低let射线和高let射线；所述低let射线包括x射线、β射线和γ射线等中的一种或多种。

本发明是通过碳离子射线或其他高let射线照射后，根据小鼠肺组织相关辐射敏感基因转录水平应激性改变而建立的一种生物学剂量评估手段。

本发明利用小鼠接受不同let射线全肺照射后24周的全基因组转录组学分析筛选出相关敏感基因组合。该特异性基因组合对低let射线无反应，但接受高let射线照射后能够驱动该基因组合出现显著高调，并通过该生物学效应，根据基因表达水平-x射线预测模型快速进行x射线辐射鉴别。

本发明采取的小鼠模型为小鼠放射性肺损伤模型，其是研究放射性肺炎、肺纤维化与辐射剂量关系、正常组织辐射反应、呼吸系统疾病与免疫应答反应机制的重要工具，在放射生物学、放射治疗学与抗肺损伤药物研发中具有不可替代的作用。放射性肺损伤早期主要表现为放射性肺炎(通常继发于照射后3个月内)，由于大量t淋巴细胞受到激活产生免疫应答反应，一种淋巴细胞性肺泡炎；晚期可发展为间质性肺纤维化(照射后6个月左右)。小鼠放射性肺损伤的病理生理学过程与人类极为相似，因此可以作为可靠的参考实验模型。

本发明中，若生物体所接受的为混合射线，即同时含有高let射线、低let射线的情形，本发明方法可以准确鉴别高let射线部分。

本发明的有益效果：

(1)本发明的辐射敏感基因标记物仅针对于高线性能量传递(high-linearenergytransfer,let)射线(如：重粒子射线等)具有高度特异的辐射敏感性，对低线性能量传递(low-linearenergytransfer,let)射线(如x射线等)无辐射敏感性，基于检测被辐射的生物体内辐射敏感基因标记物的基因表达水平，从而用于鉴别被辐射的生物体是否被高let射线(如：快中子射线、负π介子射线和重离子射线等)辐射暴露，从而提供辐射剂量参考，用于核辐射损伤风险评估。

(2)采用含有本发明辐射敏感基因标记物的试剂盒能够更加快速、便捷和准确的鉴别高let射线并提供剂量参考。

附图说明

图1为本发明实施例1中c57bl/6小鼠接受不同射线类型、不同剂量单次梯度剂量照射和分次梯度剂量照射后，24周肺组织全基因组转录水平分析后获得剂量依赖的上调基因(dose-dependentup-regulationgenes)子集维恩图[x线梯度剂量单次照射(0、10.5、12.5、14.5、17.5gy)、x线梯度剂量分次照射(0、10、20、30、40gy分5次照射)、碳离子(carbon-ions)梯度剂量单次照射(0、7.5、10.5、12.5、14.5gy)、碳离子(carbon-ions)梯度剂量分次照射(0、5、10、15、20gy分5次照射)]。

图2为本发明实施例1中维恩图分析获得的67个碳离子特异性基因热图。

图3为本发明实施例1中维恩图分析最显著(top10)碳离子特异性基因组成的高let射线生物学鉴别基因组合的基因热图。

图4为本发明实施例2中筛获得的10个特异性敏感基因在碳离子射线照射后24周的表达量(log2fold-change)。

图5为本发明实施例2中筛获得的10个特异性敏感基因在梯度剂量x射线、碳离子射线照射后24周的基因表达值(p<0.0001)。

图6为本发明实施例2中10个特异性敏感基因在梯度剂量x射线、重离子照射后24周的基因表达值。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

以下实施例中所采用的化学试剂等，若无特殊说明，均为市售获得。

实施例1辐射敏感基因标记物的筛选获取

1、动物实验照射及分组：采用8-10周龄c57bl6雌性小鼠，spf级饲养，饲养条件为，温度(23±1)℃，相对湿度55％±5％，压力差≤10pa，每日光照12h，自由摄食饮水。

2、照射前经异氟烷诱导麻醉后，转移至专用小鼠胸部照射装置并妥善固定。采用重离子(碳离子，carbon-ions)及x线进行全肺野照射。x线是低let射线的代表之一，是经医用直线加速器加速后照射(能量6-10mv)。作为高let射线的主要代表，重离子射线是经回旋加速器(直径达20-30米)加速后引流的碳粒子束流(能量280mev)，具有极高的能量与速度。

3、照射及分组包括x线梯度剂量单次照射：0、10.5、12.5、14.5、17.5gy、x线梯度剂量分次照射：0、10、20、30、40gy分5次照射、重离子梯度剂量单次照射：0、7.5、10.5、12.5、14.5gy、重离子梯度剂量分次照射：0、5、10、15、20gy分5次照射。

4、空白对照组不接受射线照射(0gy)。对照组与各剂量实验组每组均随机分配12只小鼠。

5、照射后第24周行取新鲜肺组织、经总rna抽提试剂(trizol)处理后采用rneasymini试剂盒分离提取总rna。为了避免dna污染，用dnasei处理rna。纯化的rna在45.0μl无核酸酶的水中洗脱，并-20.0℃储存。使用nanodropnd-1000分光光度计评估rna浓度和纯度。使用2100bioanalyzer和相应的rnananochip测定rna样品的完整性和纯度。基于全基因组基因表达阵列对样品进行分析。使用自带软件包进行表达矩阵的生成，数据注释和处理。在随后的统计测试中，对数据进行log2转换以说明基因的表达上升或者下降。为分析不同时间点辐射与基因表达趋势关系，采用r语言软件包进行聚类分析，包括主成分分析，层次聚类，k均值聚类和自组织映射来识别剂量相关基因表达。

基于全基因组基因表达阵列对24周肺组织全基因组表达水平进行分析，分析不同射线照射，辐射剂量与基因表达的趋势关系，获得基因表达量随高let射线辐射剂量升高而升高，且不随低let射线辐射剂量变化而变化的表达基因组合，即该辐射敏感基因标记物。

具体筛选过程如下：

参见图1和图2，x线梯度剂量单次照射(0、10.5、12.5、14.5、17.5gy)、x线梯度剂量分次照射(0、10、20、30、40gy分5次照射)、碳离子(carbon-ions)梯度剂量单次照射(0、7.5、10.5、12.5、14.5gy)、碳离子(carbon-ions)梯度剂量分次照射(0、5、10、15、20gy分5次照射)后24周，肺组织全基因组转录水平分析后获得剂量依赖的上调基因(dose-dependentup-regulationgenes)子集。维恩图分析获得67个碳离子特异性基因。

参见图3，分别对不同射线照射后小鼠肺组织基因表达水平进行热图分析显示：基因表达量随碳离子射线剂量增加而升高，呈剂量相关性；基因表达量不随x射线剂量变化而改变。筛选获得了10个辐射敏感基因组合：loxl1(lysyloxidasehomolog1，人赖氨酰氧化酶样蛋白)、zfp385a、(zincfingerprotein385a，锌指蛋白385a)slc39a13(solutecarrierfamily39member13，溶质载体转运蛋白家族39成员a13)、smurf1(smadspecifice3ubiquitinproteinligase1，e3泛素连接酶)、katnb1(kataninp80subunitb1，剑蛋白p80亚基b1)、col24a1(collagentypexxivalpha1chain，胶原蛋白24α1链)、smap2(stromalmembrane-associatedgtpase-activatingprotein2，基质膜相关gtp酶激活蛋白2)、aebp1(adipocyteenhancer-bindingprotein1，脂肪细胞增强子结合蛋白1)、tcfe3(transcriptionfactore3，转录因子e3)和tlr1(tolllikereceptor1，toll样受体1)。

上述的辐射敏感基因标记物中，优选地，所述loxl1的核苷酸序列如下：

ctggatgccagaccctgtcttgtacctacttctcctctacaacaccatgg(如seqidno：1所示)(5’-3’)；

所述zfp385a的核苷酸序列如下：

agtcgggacagggtgtaaccaagggtgaagggggaacttcagtcccagct(如seqidno：2所示)(5’-3’)；

所述slc39a13的核苷酸序列如下：

ggcccttgtcctttgggttaagagtaagatgggggtggtgagggctccac(如seqidno：3所示)(5’-3’)；

所述smurf1的核苷酸序列如下：

aaggcgcggcagggccccggctgttcaccattcacctgatagacgccaat(如seqidno：4所示)(5’-3’)；

所述katnb1的核苷酸序列如下：

gtggagtctgcatggtcagccagcaacgggagcaacagggtacacaatgc(如seqidno：5所示)(5’-3’)；

所述col24a1的核苷酸序列如下：

caggccacctaaatccagtggtaggtttggattagaaactggtgtttgtg(如seqidno：6所示)(5’-3’)；

所述smap2的核苷酸序列如下：

ggatctggcctgtgactagaagaccaacccctacgaggaaatgtggagct(如seqidno：7所示)(5’-3’)；

所述aebp1的核苷酸序列如下：

aagccctgcccaattcaaactaaggcagcacctcccaagcctgtgccagc(如seqidno：8所示)(5’-3’)；

所述tcfe3的核苷酸序列如下：

ggcagggcctgggaggaatggtggcaaaggtataatgtatccgtgttttg(如seqidno：9所示)(5’-3’)；

所述tlr1的核苷酸序列如下：

ggcctgggaccactcatctcctgctgttgtttctggagccccttgatagg(如seqidno：10所示)(5’-3’)。

实施例2

本实施提供实施例1筛选获得的辐射敏感基因标记物在鉴别高let射线辐射中的应用。

参见图4，10个基因在梯度剂量碳离子射线、x射线照射后的表达倍数差异，x射线照射组几乎无辐射反应。

参见图5，10个基因在梯度剂量碳离子射线、x射线照射24周的基因表达值差异，差异具有统计学意义(p<0.0001)。

参见图6，受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc)图，10个基因在梯度剂量x射线、碳离子射线照射后的基因表达平均值对x线的鉴别能力。曲线下面积(areaunderthecurve，auc)等于0.896，95％置信区间(confidenceinterval，ci)为0.806–0.986，且在上述10个基因表达平均值等于1.048时，鉴别重离子射线敏感度79.17％，特异度83.33％，表明上述10个基因平均表达值对重离子射线辐射有良好鉴别能力。

将本发明辐射敏感基因标记物做成用于鉴别是否被高let射线辐射的试剂盒，能够更加快速、便捷和准确的鉴别高let射线并提供剂量参考，有助于市场化销售使用。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神、所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

序列表

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>辐射敏感基因标记物及在鉴别高let射线辐射中的应用

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