一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其在生产低聚异麦芽糖和抗性糊精中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

α-葡萄糖苷酶在工业上可应用于低聚异麦芽糖(imos)的生产。低聚异麦芽糖又称分支低聚糖，是一种以淀粉为原料采用全酶法工艺生产的糖浆，由2-10个葡萄糖残基构成，分子中至少有1个α-1,6糖苷键，其他为α-1,4糖苷键。低聚异麦芽糖是世界上功能性低聚糖中生产和销售量很高的产品，它主要具有促进人体肠道内有益菌群增殖，抑制许多病原菌和腐败菌的生长，增强人体免疫力降低血清胆固醇、甘油三酯及游离脂肪酸的含量，消除心血管疾患的病因；抗龋齿性甚佳，很难或不被人体消化吸收，提供的能量很低或根本没有，可作为糖尿病人、肥胖病人和低血糖病人的保健甜味剂。

目前工业化生产的低聚异麦芽糖是由黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶发酵生成的，虽然其转苷能力较强，其转化率能达到60％左右，但水解能力也很强，最终生成的葡萄糖仍然很多，限制了含α-1,6键的低聚糖含量。其次，黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶生成的低聚异麦芽糖中的异麦芽糖含量较高，而异麦芽糖属于二糖，目前被认为不属于膳食纤维，降低了该低聚异麦芽糖产品的保健价值。

抗性糊精由淀粉经过高温酸热降解，然后加工提纯而制成，它含有α-1,2与α-1,3键，还含有α-1,4和α-1,6键，甚至在某些还原末端上含有β-1,6键的结构。其中α-1,3，α-1,2，α-1,6键不能被存在于人体内的各种消化酶分解，而且进入到人体消化道之后也不能被小肠消化和吸收，所以能够进入到人体内大肠，被存在于人体大肠内的各种益生菌作为养料所发酵，可以发挥膳食纤维的各种生理作用。抗性糊精还可以让人们感觉到饱腹感，适合患有肥胖病的人使用，抗性糊精没有甜味，能够保持原味，且极易溶于水呈中性，不仅能够增加如饮料等的口感风味，作为食品添加剂添加到食品中也具有独特的优势。抗性糊精还有许多益处，比如血糖反应较低，释放热量的时间也较长，还有它对肠道的蠕动和健康也非常有益，利于排便；2012年期间我国卫生部门第16号公告中明确表示已经将抗性糊精视为普通食品，这将使得抗性糊精在食品行业中的应用越来越广阔。

目前抗性糊精的生产工艺一般为：淀粉-高温酸热水解-焦糊精-酶水解-提纯-喷雾干燥。一般淀粉经过高温酸热水解后的焦糊精中抗性含量可以达到50％，工业生产中用糖化酶处理后，可形成抗性成分80％以上的成品，但此生产方法反应条件剧烈、操作复杂、不利于环保。

因此，提供一种成本低、操作简单且环保的低聚异麦芽糖和抗性糊精生产方法，对于工业制备低聚异麦芽糖和抗性糊精有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种α-葡萄糖苷酶突变体，含seqidno.1所示的氨基酸序列。以构巢曲霉(aspergillusnidulans)的α-葡萄糖苷酶(ncbi:xp_682222.1)为野生酶，该酶突变体是将第85位的缬氨酸突变为亮氨酸，第230位的缬氨酸突变为色氨酸，第291位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第403位的亮氨酸突变为缬氨酸，第543位的亮氨酸突变为缬氨酸，第594位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，第675位的丝氨酸突变为丙氨酸，第778位的天冬氨酸突变为谷氨酸，第835位的异亮氨酸突变为亮氨酸，第848位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，第893位的异亮氨酸突变为缬氨酸，突变位点包括v85l、v230w、y291f、l403v、l543v、m594l、s675a、d778e、i835l、e848q和i893v。

本发明的第二个目的是提供编码上述α-葡萄糖苷酶突变体的基因，含seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供一种重组毕赤酵母，表达上述α-葡萄糖苷酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，以pichiapastoriskm71为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，以ppic9k为表达载体。

所述重组毕氏酵母的构建方法如下：

(1)将来源于构巢曲霉(aspergillusnidulans)的α-葡萄糖苷酶基因agdb基因进行11个氨基酸的突变(v85l、v230w、y291f、l403v、l543v、m594l、s675a、d778e、i835l、e848q和i893v)，合成目的基因agdb(-)，在基因的5'和3'末端分别引入ecorι和notι酶切位点。

(2)将合成的目的基因seqidno.2连接到pmd19t，称作pmd19t-agdb(-)，转化e.colijm109进一步克隆，酶切后将目的基因连接表达载体ppic9k，命名为agdb(-)-ppic9k。

(3)将重组质粒agdb(-)-ppic9k通过电转进入毕氏酵母pichiapastoriskm71，获得毕氏酵母α-葡萄糖苷酶基因工程菌。

本发明的第五个目的是提供一种生产α-葡萄糖苷酶的方法，应用了上述重组毕赤酵母进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，是挑取重组毕赤酵母单菌落接种到ypd培养基中，28-32℃、200-220rpm，培养20-30h；将培养液按5-10％的接种量接种到bmgy培养基中，先于28-32℃、200-220rpm，培养20-30h，离心，弃上清，收集菌体，用bmgy培养基重悬菌体，加入甲醇诱导诱导产酶，28-32℃、200-220rpm，培养110-130h，发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组α-葡萄糖苷酶。

本发明的第六个目的是提供上述α-葡萄糖苷酶突变体或表达α-葡萄糖苷酶突变体的细胞在制备低聚异麦芽糖中的应用。

所述利用重组α-葡萄糖苷酶以麦芽糖为底物，制备低聚异麦芽糖的具体方法如下：在初始反应温度42-50℃，起始ph5-6，麦芽糖为200-300g/l的情况下，加酶量控制为5-10u/g麦芽糖；设置温度为42-50℃、转速150-200r/min。从2h开始每隔2h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。产物用hplc进行检测。

本发明的第七个目的是提供上述α-葡萄糖苷酶突变体或表达α-葡萄糖苷酶突变体的细胞在制备抗性糊精中的应用。

所述利用重组α-葡萄糖苷酶以焦糊精为底物，提高抗性含量的具体方法如下：以15-30％(w/v)焦糊精为底物时，采用分支酶，α-cgt酶，α-葡萄糖苷酶三酶复配来提高抗性成分，先在38-42℃下，ph6-7，加入1200-2000u/g分支酶作用10-15h后ph调至5-6后同时加入5-10u/gα-cgt酶和5-10u/gα-葡萄糖苷酶反应20-30小时。从2h开始每隔2h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。抗性含量根据国标gb/t22224-2008食品中膳食纤维的测定酶重量法和酶重量法-液相色谱法中的第二法进行检测。

本发明的第八个目的是提供上述α-葡萄糖苷酶突变体或表达α-葡萄糖苷酶突变体的细胞在食品、饲料或制药领域中的应用。

本发明通过将来源于构巢曲霉的α-葡萄糖苷酶突变体基因转入毕氏酵母中表达，获得一种重组α-葡萄糖苷酶。将重组α-葡萄糖苷酶用于制备低聚异麦芽糖和抗性糊精，在酶反应条件(45℃、ph5.5、加酶量5u/g、底物浓度300g/l)下，重组α-葡萄糖苷酶催化麦芽糖生成低聚异麦芽糖的产量达216g/l，转化率为72％。以20％(w/v)焦糊精为底物时，采用分支酶，α-cgt酶，重组酶三酶复配来提高抗性糊精成分，酶反应条件为，先在40℃下，ph6.5，加入1500u/g分支酶，作用12h后ph调至5.5后同时加入5u/gα-cgt酶和5u/gα-葡萄糖苷酶反应24小时，可以使焦糊精的抗性成分从原先的44％提高至70％。此方法有效提高了生产效率，降低了生产成本。

附图说明

图1：agdb(-)-ppic9k重组菌摇瓶发酵sds-page电泳图，m：generaysds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)中分子量标准蛋白；1：摇瓶发酵后表达的重组α-葡萄糖苷酶。

图2：构巢曲霉α-葡萄糖苷酶催化生成imos的hplc色谱图。

图3：构巢曲霉α-葡萄糖苷酶不同反应时长催化生成imos的产量。

图4：构巢曲霉α-葡萄糖苷酶不同反应时长催化生成抗性糊精的产量。

图5：黑曲霉α-葡萄糖苷酶催化imos的hplc色谱图。

具体实施方式

(一)培养基

lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l。

md固体培养基：葡萄糖20g/l，ynb13.4g/l，生物素4×10^-4g/l，琼脂粉20g/l。

ypd培养基：酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，固体培养基添加琼脂粉20g/l。

bmgy培养基：ynb13.4g/l，酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，甘油10g/l，生物素4×10^-4g/l。

bmmy培养基：ynb13.4g/l，酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，生物素4×10^-4g/l。

(二)酶活的定义及测定方法

酶活测定方法：利用α-葡萄糖苷酶可以麦芽糖为底物生成异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖来检测α-葡萄糖苷酶转苷酶活，反应体系为：以3％麦芽糖为底物，在40mm乙酸钠缓冲液ph5.5，45℃下反应5min后煮沸10min灭活，反应液离心后过0.22μm滤膜过滤后，用hplc检测产物的生成量。

一个酶活单位定义为酶每分钟催化转苷1μmol葡萄糖基,即每生成1μmol异麦芽糖就有1μmol葡萄糖基发生转苷，生成1μmol潘糖也是1μmol葡萄糖基发生转苷，而生成1μmol异麦芽三糖有2μmol葡萄糖基发生转苷，通过hplc计算各产物的生成量计算酶活。

α-葡萄糖苷酶转苷酶活定义：以麦芽糖为底物1ml发酵液每分钟转苷1μmol葡萄糖苷为一个酶活力单位(u/ml)。

酶活计算公式：酶活(u/ml)＝稀释倍数×转苷葡萄糖苷(μmol/ml)/转化时间(min)。

(三)hplc检测产物含量

采用hplc检测最终反应体系中的葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的含量。

色谱条件为：agilent1200hplc色谱仪，agilent自动进样器，色谱柱nh2p-504e(4.6mm×250mm)，示差检测器为安捷伦g1362a；流动相采用75％(v/v)乙腈和水的混合溶液，流速为0.8ml/min，柱温设定为30℃。采用外标法，根据保留时间和峰面积确定相应糖的浓度。

(四)抗性含量根据国标gb/t22224-2008食品中膳食纤维的测定酶重量法和酶重量法-液相色谱法中的第二法进行检测。

实施例1：构巢曲霉来源的α-葡萄糖苷酶基因的克隆及表达载体的构建

将合成的目的基因agdb(-)(核苷酸序列如seqidno.2所示)与克隆载体pmd19t连接，称作pmd19t-agdb(-)，转化e.colijm109进一步克隆，酶切回收目的基因将其与表达载体ppic9k于16℃连接过夜，转化e.colijm109，涂布含有kana(30μg/ml)抗性的lb平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定dna序列，阳性克隆子即agdb(-)-ppic9k。

实施例2：重组质粒adgb(-)-ppic9k的转化

将质粒adgb(-)-ppic9k电转到提前制备好的pichiapastoriskm71感受态中，得到基因工程菌pichiapastoriskm71/agdb(-)-ppic9k，在30℃下md平板上培养3-4天，长出转化子后挑至不同浓度的g418/ypd平板上进行阳性克隆子的筛选，经30℃培养24h。挑选单菌落至10ml的ypd液体培养基中，30℃培养24h，保存甘油管，贮存于-80℃冰箱。验证正确后进行摇瓶发酵产酶。

实施例3：摇瓶发酵产酶

将实施例2中得到的重组毕氏酵母菌株接种于ypd培养基中，在30℃下培养24h后以5％接种量转接到50mlbmgy培养基中于30℃恒温摇床中培养24h，然后5000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，用25mlbmmy培养基垂悬菌体，加入1.5％的甲醇诱导菌体产酶，于30℃恒温摇床中培养120h，每24h补加1.5％甲醇进行诱导发酵结束后，5000rpm离心20min，上清即为重组α-葡萄糖苷酶。测得上清液中α-葡萄糖苷酶酶活力可达16u/ml，提高至野生酶的1.58倍。摇瓶发酵至od600为40的蛋白含量为0.4g/l。蛋白电泳结果显示在74kda和55kda各处有一条与理论分子量一致的条带(图1)。

实施例4：酶转化生成低聚异麦芽糖

在初始反应温度45℃，起始ph5.5，麦芽糖为300g/l的情况下，加酶量控制为5u/g麦芽糖。设置水浴摇床温度为45℃、转速150r/min，从2h开始每隔2h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。产物用hplc进行检测，色谱峰图见图2。

在此条件下进行酶转化反应，如图3所示，当反应进行到2h后转化率可达到72％，低聚异麦芽糖的产量达216g/l，其中异麦芽糖含量为18.7％。

转化率(％)＝100﹣dp1-dp2-dp3

dp1：反应液中最后葡萄糖占总糖的含量；

dp2：反应液中最后麦芽糖占总糖的含量；

dp3：反应液中最后麦芽三糖占总糖的含量。

实施例5：酶转化提高焦糊精中抗性含量

即在20％(w/v)焦糊精底物浓度下，首先反应条件调控在40℃，ph6.5，分支酶加酶量1500u/g焦糊精，反应12小时后，重新调整ph至5.5，同时加入α-葡萄糖苷酶3.4u/g，加入5u/g的cgt酶，在45℃下反应24h。而用上述条件可以使抗性含量由原先的44％左右提高至70％，如图4所示。

对比例1：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中重组表达

以黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶基因(genbankid:4991096)为目的基因，在毕赤酵母中重组表达。其余条件同实施例1-5。如图5所示，反应24h后，重组酶催化生成低聚异麦芽糖的转化率为60％，产量为180g/l，其中异麦芽糖含量为24.4％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

<120>一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用

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