本发明属药物化学领域，涉及一类新型的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）及其药学上可接受的盐、其制备方法、药物组合物和在制备治疗和/或预防神经系统相关疾病药物中的用途，包括但不限于血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、hiv相关痴呆病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、神经性疼痛、青光眼、缺血性脑卒中、出血性脑卒中、以及脑外伤引起的神经损伤等疾病。
背景技术：
神经退行性疾病是指由慢性进行性中枢神经组织退行性变性而产生的疾病总称，包括阿尔茨海默氏病（alzheimer’sdisease,ad）、帕金森氏病（parkinson’sdisease,pd）、亨廷顿氏病（huntingtondisease,hd）、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophiclateralsclerosis,als）和多发性硬化症（multiplesclerosis,ms）等，其发病机制与氧化应激、神经炎症及相应的损伤密切相关。氧化应激是由活性氧（reactiveoxygenspecies,ros）自由基介导的，包括超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等。在正常生理条件下，ros生成水平与机体抗氧化能力处于动态平衡状态，当ros的产生超过细胞抗氧化能力则会发生氧化应激（oxidativestress），而大脑对氧化应激尤为敏感，从而诱发多种神经系统疾病。另有研究发现，血管性痴呆、hiv相关痴呆病、神经性疼痛、青光眼、缺血性脑卒中、出血性脑卒中以及脑外伤引起的神经损伤等也与机体的氧化应激和神经炎症相关。
血管性痴呆（vasculardementia,vd）是由各种类型的脑血管疾病（包括缺血性脑血管病、出血性脑血管疾病、急性和慢性缺氧性脑血管疾病等）所致的智能及认知功能障碍的临床综合征。血管性痴呆由于发病机制复杂，目前尚无能够阻滞疾病发展的药物，临床治疗以改善脑部血液循环和脑代谢，加强脑部营养为主。近年来的研究表明，在vd患者表现认知功能损伤的同时也经常伴有胆碱能系统的异常。vd患者海马区chat阳性神经元及纤维密度减低，脑内不同部位的chat活性下降，在vd患者脑脊液中的乙酰胆碱浓度明显低于正常水平，并且其浓度降低的程度与痴呆的严重程度呈正相关；而脑缺血可以导致脑内乙酰胆碱酯酶活性上升；同时也发现一些乙酰胆碱酯酶抑制剂可以保护缺血造成的神经元损伤，且可以促进脑缺血后神经损伤和脑功能的恢复。
阿尔茨海默症（老年痴呆症）是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，其发病率呈逐年上升趋势，成为仅次于心血管病和癌症的高发性疾病，在欧美等发达国家已上升为死亡原因的第四位。随着全球人口老龄化进程的加快，其发病率呈明显上升趋势，据alzheimer'sdiseaseinternational在2013年12月公布的《阿尔茨海默症的全球影响：2013-2050》报告中指出，ad将成为未来几十年全球面临的最大健康挑战，到2030年，患者人数将由2013年的4400万上升到7600万，到2050年，这一数值将达到惊人的1.35亿。由于ad临床表现为记忆能力、定向能力、思维和判断能力减退，以及日常生活能力降低，甚至出现异常精神行为症状等，使患者护理难度较大，给社会和家庭带来沉重负担。目前已批准用于治疗轻/中度ad的药物有乙酰胆碱酯酶（ache）抑制剂，以及用于重度ad治疗的n-甲基-d-天冬氨酸（nmda）受体拮抗剂。但临床使用表明，这些药物可通过提高患者体内乙酰胆碱水平或者抑制兴奋性氨基酸的兴奋毒性来缓解ad症状，但不能有效阻止或逆转病程，而且还会引起幻觉、意识混沌、头晕、头痛、恶心、肝脏毒性、食欲不振以及大便频繁等严重毒副作用，因而长期疗效不甚理想。因此，临床上迫切需要研发兼具ad症状改善和病程改变的新型ad治疗药物。
ad属多种因素引起的疾病，发病机理复杂，其发病机制至今还未完全阐明。但研究表明，患者脑内乙酰胆碱水平的下降、β-淀粉样蛋白的过度生成与沉积、脑血管内的血小板聚集、金属离子代谢紊乱、ca2+平衡失调、tau-蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结、谷氨酸受体活性过高、氧化应激产生大量活性氧（ros）和自由基以及神经炎症反应等多种因素在ad的发病过程中扮演重要角色。针对上述发病因素，研究人员采用传统“一药一靶”药物设计策略，发现了大量对某一靶点具有高活性和高选择性的药物，如：胆碱酯酶抑制剂和n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂等。但这些药物存在作用靶点单一、临床使用毒副作用较多、对ad患者的长期疗效欠佳等问题。
近年来，随着对ad致病机理的不断阐明，发现ad的发生和发展具有多机制、多因素作用的特点，不同机制之间又相互关联相互影响，构成了ad发生和发展过程中复杂的网络调控系统。显然，研发可同时作用于ad病理过程中多个环节的治疗药物是目前的必然选择。基于上述结果，研究人员提出了“多靶点导向药物”（multitarget-directedligands,mtdls）策略来研发抗神经退行性疾病药物。所谓“多靶点药物”是指单一化学实体同时作用于疾病网络中的多个靶点，对各靶点的作用可产生协同效应，使总效应大于各单效应之和，此类化合物也称为“multifunctional”或“multipotential”药物。多靶点药物与多药联合应用以及复方药物的主要区别在于：可减少服药量、提高治疗效果、避免药物之间的相互作用及由此带来的毒副作用，均一的药代动力学特性，便于使用等。因此，研究开发具有新型化学结构、新型作用机制，且具有多靶点作用、低毒副作用的抗神经退行性疾病治疗药物不仅符合社会老龄化进程的迫切需求，而且具有良好的市场前景。大量临床研究已证实，ache抑制剂能有效缓解ad患者症状，短期治疗疗效肯定；因此，在设计多靶点抗ad药物时通常需保留化合物的ache抑制活性（抑制该酶对改善ad患者症状至关重要），并在此基础上增加一个或多个具有药理协同作用的其它靶标或功能，以达到多靶点ad治疗作用。显然，设计并发现同时具有抑制乙酰胆碱酯酶、抑制β-淀粉样蛋白的过度生成与沉积、抗氧化应激以及抗单胺氧化酶-b的多靶点ad治疗药物仍是目前重要的研究方向。
技术实现要素：
本发明目的在于公开一类新型的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）及其药学上可接受的盐。
本发明另一目的在于公开该类查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）及其药学上可接受的盐制备方法。
本发明的又一目的在于公开包含该类查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）及其药学上可接受的盐的药物组合物。
本发明再一目的在于公开该类查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）及其药学上可接受的盐具有多靶点作用，可用于制备治疗和/或预防神经系统相关疾病药物中的用途，包括但不限于血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、hiv相关痴呆病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、神经性疼痛、青光眼、缺血性脑卒中、出血性脑卒中、以及脑外伤引起的神经损伤等疾病。
本发明所提供的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）的化学结构通式为：
式中：r1、r2、r3和r4各自独立地表示c1~c12烷基、苄基、取代苄基，nr1r2或nr3r4也表示四氢吡咯基、吗啉基、4-硫代哌啶基、哌啶基、4-位被c1~c12烷基所取代的哌啶基、4-位被苄基取代的哌啶基、哌嗪基、4-位被c1~c12烷基所取代的哌嗪基、4-位被苄基或取代苄基所取代的哌嗪基，分子中的oh在相应苯环的任意可能位置；所述“取代苄基”是指苯环上被1-4个选自下组的基团所取代的苄基：f、cl、br、i、c1-4烷基、c1-4烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二甲氨基，这些取代基在苄基的苯环上任意可能的位置。
本发明所提出的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）可通过以下方法制备得到：
式中：r1～r4、以及分子中oh位置的定义与查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）的化学结构通式相同。
以相应的羟基苯乙酮曼尼希碱类化合物（1）和羟基苯甲醛曼尼希碱类化合物（2）为起始原料，在溶剂和碱性条件下直接缩合，得相应的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）。其中，反应所用碱为：碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱土金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱土金属碳酸氢盐、c1-8醇的碱金属盐、有机叔胺类或季铵碱类（如：三乙胺、三丁胺、三辛胺、吡啶、n-甲基吗啉、n-甲基哌啶、三乙烯二胺、四丁基氢氧化铵），优选碱为：氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、三乙胺或吡啶；反应所用溶剂为：c1-8脂肪醇、乙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、1,4-二氧六环、苯、甲苯或乙腈，优选溶剂为：甲醇、乙醇、异丙醇、n,n-二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷或甲苯；羟基苯乙酮曼尼希碱类化合物（1）：羟基苯甲醛曼尼希碱类化合物（2）：碱的摩尔投料比为1.0：1.0~3.0：1.0~20.0，优选摩尔投料比为1.0：1.0~2.0：1.0~10.0；反应温度为0~150℃，优选反应温度为室温~120℃；反应时间为1~120小时，优选反应时间为2~72小时。
本发明的起始原料——羟基苯乙酮曼尼希碱类化合物（1）和羟基苯甲醛曼尼希碱类化合物（2）可用本领域常见的技术制得，即：以相应的羟基苯乙酮类化合物或羟基苯甲醛类化合物为底物，在酸催化下与甲醛（或多聚甲醛）、相应的仲胺类化合物经常规曼尼希反应制备得到。
按照上述方法所得之查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）分子中含有氨基，该氨基呈碱性，可与任何合适的酸通过药学上常规的成盐方法制得其药物学上可接受的盐，所述的酸为：盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、胺基磺酸、c1-6脂肪羧酸（如：甲酸、乙酸、丙酸等）、三氟乙酸、硬脂酸、扑酸、草酸、苯甲酸、苯乙酸、水杨酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、羟基马来酸、丙酮酸、谷氨酸、抗坏血酸、硫辛酸、c1-6烷基磺酸（如：甲基磺酸、乙基磺酸等）、樟脑磺酸、萘磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸或1,4-丁二磺酸。
本发明所公开的药物组合物包括治疗有效量的一种或多种查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）或其药学上可接受的盐，该药物组合物可进一步含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述“治疗有效量”是指引起研究者或医生所针对的组织、系统或动物的生物或医药反应的药物或药剂的量；所述“组合物”是指通过将一种以上物质或组份混和而成的产品；所述“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或载体，如：液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊物质，它们携带或转运某种化学物质。本发明所提供的药物组合物其理想的比例是，查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）或其药学上可接受的盐作为活性成分占总重量比5%～99.5%，其余部分为占总重量比95%以下。
本发明所公开的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）及其药学上可接受的盐进行了如下的生物活性筛选。
（1）查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制活性
向96孔板中依次加入1.0mmol/l碘化硫代乙酰胆碱或碘化硫代丁酰胆碱（均购自sigma公司）30μl、ph7.4的pbs缓冲液40μl、待测化合物溶液20μl（dmso含量小于1%）和10μl乙酰胆碱酯酶（大鼠脑皮层5%匀浆上清液，ph7.4的磷酸缓冲液作匀浆介质）或丁酰胆碱酯酶（大鼠血清25%上清液，ph7.4磷酸缓冲液作匀浆介质）溶液，加毕混匀后，37℃孵育15min，向各孔中加入0.2%的5,5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)（dtnb,购自sigma公司）溶液30μl显色，用酶标仪测定405nm处各孔的光密度（od值），与不加待测样品的空白孔比较，计算化合物对酶的抑制率（酶抑制率(%)=(1-样品组od值/空白组od值)×100%）；选择化合物的五至六个浓度，测定其酶抑制率，并以该化合物摩尔浓度的负对数与酶的抑制率线性回归，求得50%抑制率时的摩尔浓度即为该化合物的ic50。测定结果表明，本发明实施例中所公开的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）对乙酰胆碱酯酶均具有显著抑制作用，其ic50为5.6nm~10.0µm；并且该类查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）对乙酰胆碱酯酶的抑制活性显著高于对丁酰胆碱酯酶的抑制活性（选择性大于10倍以上），说明本发明所公开的化合物对乙酰胆碱酯酶具有选择性抑制作用。测定结果还表明，查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）的母核——二羟基查尔酮类化合物（即：ch2nr1r2和ch2nr3r4同时表示h，oh位于相应苯环的任意可能位置时所表示的化合物）、以及羟基苯乙酮曼尼希碱类化合物（1）和羟基苯甲醛曼尼希碱类化合物（2）对乙酰胆碱酯酶抑制的ic50均大于100µm。在进一步研究中，我们还发现，在该类查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）中，若将ch2nr1r2或ch2nr3r4两者之一用h替换，则相应化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性均显著降低（至少降低3倍以上）。
（2）查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）的抗氧化活性（orac-fl方法）
参照文献（qiang,x.m.etal.eur.jmed.chem.2014,76,314-331）所报道的方法进行测定，即：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（trolox）用ph7.4的pbs缓冲液配成10-80μmol/l的溶液，荧光素（fluorescein）用ph7.4的pbs缓冲液配成250nmol/l的溶液，2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（aaph）使用前用ph7.4的pbs缓冲液配成40mmol/l的溶液。向96孔板中加入50-10μmol/l的化合物溶液和荧光素溶液，混匀，37°c孵育15min，加入aaph溶液，使每孔总体积为200μl，混匀，立即置于varioskanflashmultimodereader(thermoscientific)仪中，在485nm激发波长和535nm发射波长下连续测定90min。计算出荧光衰减曲线下面积auc，其中以1-8μmol/l的trolox作为标准，以不加待测样品为空白，化合物的抗氧化活性结果表达为trolox的当量，其计算公式为：[(aucsample-aucblank)/(auctrolox-aucblank)]×[(concentrationoftrolox/concentrationofsample)]，每个化合物每次测定3个复孔，每组实验独立重复三次。测定结果表明，本发明实施例中所公开的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）的抗氧化活性为trolox的1.6～4.0倍，说明该类化合物具有强抗氧化活性。
（3）查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）对ab1-42自身聚集的抑制活性
参照文献（qiang,x.m.etal.eur.jmed.chem.2014,76,314-331）所报道的方法进行测定，即：预处理后的aβ1-42用dmso配成储备液，使用前用ph7.4的pbs缓冲液稀释至50μm；待测化合物用dmso配成2.5mm储备液，使用前用ph7.4的pbs缓冲液稀释至相应浓度，取20μl的aβ1-42溶液+20μl的待测化合物溶液、20μl的aβ1-42溶液+20μl的pbs缓冲液（含2%dmso）于96孔板中，37°c孵育24h，然后加入160μl含有5μm硫黄素t的50mm的甘氨酸-naoh缓冲液（ph=8.5），振摇5s后立即用多功能酶标仪在446nm激发波长和490nm发射波长下测定荧光值；aβ1-42+待测化合物的荧光值记为ifi，aβ1-42+pbs缓冲液的荧光值记为ifc，只含有pbs缓冲液的荧光值记为if0，化合物抑制aβ1-42自身聚集的抑制率为：100-(ifi-if0)/(ifc-if0)*100；选择化合物的五至六个浓度，测定其抑制率，每个化合物每个浓度复测三次，以姜黄素为阳性对照。测定结果表明，本发明实施例中所公开的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）对aβ1-42自身聚集均具有显著抑制活性，在25.0µm浓度下对aβ1-42自身聚集的抑制率均大于50.0%；而姜黄素在相同浓度下的抑制率为41.3%，临床上广泛使用的抗ad药物：多奈哌齐，卡巴拉汀，盐酸美金刚胺，化合物（i）的母核——二羟基查尔酮类化合物（即：ch2nr1r2和ch2nr3r4同时表示h，oh位于相应苯环的任意可能位置时所表示的化合物）、羟基苯乙酮曼尼希碱类化合物（1）以及羟基苯甲醛曼尼希碱类化合物（2）在25.0µm浓度下对aβ1-42自身聚集的抑制率均小于15%。
（4）查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）对单胺氧化酶a和b的抑制活性
用100mm的ph7.4磷酸钾缓冲液将重组人mao-a配成12.5μg/ml样品液，将mao-b配成75μg/ml样品液。向黑色96孔板中加入待测化合物溶液20μl，单胺氧化酶80μl，混匀，37°c于避光处孵育15min，加入200μmamplexred试剂，2u/ml辣根过氧化物酶，2mm对羟基苯乙胺（抑制mao-a）或2mm苯甲胺（抑制mao-b）引发反应，37°c孵育20min，在多功能酶标仪上，以固定激发波长545nm，测590nm处荧光发射强度，以磷酸钾缓冲液代替mao-a或mao-b为空白；化合物抑制单胺氧化酶的抑制率计算公式为：100-(ifi)/(ifc)*100，式中，ifi和ifc分别为存在抑制剂和无抑制剂下的荧光强度与空白荧光强度的差。每个化合物每次测定3个复孔，每组实验独立重复三次。选择化合物的五至六个浓度，测定其酶抑制率，并以该化合物摩尔浓度的负对数与酶的抑制率线性回归，求得50%抑制率时的摩尔浓度即为该化合物的ic50。测定结果表明，本发明实施例中所公开的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）对mao-b均具有显著抑制作用，其ic50为0.02µm~10.0µm；而对mao-a抑制的ic50均高于50.0µm，说明本发明所公开的化合物对mao-b具有选择性抑制作用。试验还发现，羟基苯乙酮曼尼希碱类化合物（1）和羟基苯甲醛曼尼希碱类化合物（2）对mao-b抑制的ic50均高于80.0µm；另外，在该类查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）中，若将ch2nr1r2或ch2nr3r4两者之一用h替换，则相应化合物对mao-b的抑制活性均显著降低（至少降低2倍以上）。
（5）查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响（以实施例化合物1-1为例）
spf级icr雄性小鼠，25-30g，随机分为：正常组、模型组、阳性对照组、受试药高低剂量组（15.0mg/kg、2.5mg/kg），每组10只动物。一次性灌胃给予受试药物，空白组和模型组给予溶媒0.5%cmc-na，给药体积均为0.1ml/10g；药后45min，正常组小鼠腹腔注射生理盐水，其余各组动物均注射东莨菪碱（5mg/kg），给药体积均为0.1ml/10g；造模30min后，将小鼠放入非电刺激y迷宫进行行为学测试。测试时将小鼠放于一臂末端，让其在迷宫内自由穿行8min，记录其进入各臂的次数和交替次数，按照以下公式计算交替率：交替率%=[交替次数/(总进入次数-2)]×100，结果以均数±标准差表示，组间差异采用单因素方差分析。测定结果表明，在该实验条件下，所测试的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）对东莨菪碱致小鼠获得性记忆障碍具有剂量依赖性的改善作用，与模型组比较均有统计学差异（p<0.01），且活性显著高于相同摩尔浓度下的临床用药物卡巴拉汀（p<0.01）。
具体实施方式
通过下面的实施例可对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
实施例1查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）的制备通法
在反应瓶中加入2.0mmol相应的羟基苯乙酮曼尼希碱类化合物（1）、2.5mmol相应的羟基苯甲醛曼尼希碱类化合物（2）和30ml乙醇，搅拌均匀后，滴加入30%koh水溶液15.0mmol，室温搅拌反应2.0～48.0小时（反应进程用tlc跟踪）；反应结束后，冷却至室温，用10%盐酸水溶液调节反应液ph至强酸性，再用饱和碳酸氢钠水溶液调节反应液ph至弱碱性，减压蒸除乙醇，残余液中加入80ml去离子水，用240ml二氯甲烷分三次萃取，有机层合并后用饱和氯化钠水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸除溶剂，残余物经柱层析纯化（洗脱液：二氯甲烷:丙酮=10:1v/v），得相应的查尔酮双曼尼希碱类化合物（i），收率25.3%-66.5%，其化学结构均经1h-nmr、13c-nmr和esi-ms确证；所得目标物的纯度经hplc测定均大于97.0%。采用上述通法制备得到的目标物结构如下：
实施例2查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）与酸成盐制备通法
在反应瓶中加入按照上述实施例1所得之查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）2.0mmol和丙酮50ml，搅拌均匀后加入8.0mmol相应的酸，升温回流搅拌反应20分钟，反应结束后冷却至室温，减压蒸除溶剂，即得查尔酮双曼尼希碱类化合物（i）的盐，其化学结构经1hnmr和esi-ms确证。