区域选择性可控化固定双分子薄膜及其制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料领域，且特别涉及一种区域选择性可控化固定双分子薄膜及其制备方法。

背景技术：

生物材料的生物相容性对生物材料的临床应用具有决定性的意义。由于材料植入人体后将首先与人体组织、血液接触，因此材料表面所发生的界面生物学反应对材料的生物相容性具有决定性的作用。表面改性是提高材料生物相容性的主要方法之一，通过表面改性可以有效地改变材料表面的物理化学性质，从而可以调控组织(体液)与材料之间的相互作用，提高材料的生物相容性。表面改性的方法除了一直以来的覆膜方式，近年来兴起了一种新的手段，微图形化技术，即利用材料表面微纳米图形控制细胞行为，从而为新型的生物功能材料的开发和应用提供新途径。图形化方法是综合物理化学与生物化学方法而形成的特殊的改性方法。通过控制微图形的尺寸和形状，可以调控细胞的粘附、铺展、排列、生长方向、蛋白表达等生长行为。

现有报道中采用光刻技术对生物材料或器械表面进行微图形化改性处理，以实现区域功能化修饰，其中通过在材料表面涂覆具有正电荷的甲壳素分子可以与带负电荷的蛋白分子之间形成强烈的静电相互作用，并形成稳定的蛋白微图形，或利用疏水性表面与蛋白疏水基团之间的强烈疏水相互作用，在材料表面制备疏水/亲水交替微图形结构，则疏水区域可以吸附蛋白质形成蛋白微图形，但经过修饰后的材料或器械表面携载生物分子单一，导致薄膜层功能化单一。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜薄膜，该区域选择性可控化固定双分子薄膜通过接枝具有不同功能的功能化分子，协同作用实现了薄膜的多功能化。

本发明的另一目的在于提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜的制备方法，该通过微图形技术能够快速制备得到具有多功能的薄膜，增加了薄膜应用的实效性。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明提出一种区域选择性可控化固定双分子薄膜，其包括功能化分子层a、功能化分子层b以及反应底膜；反应底膜具有分别与功能化分子a和功能化分子b发生反应的活化微图形区域；

部分反应底膜的活化微图形区域与功能化分子a接枝形成功能化分子层a，剩余反应底膜的活化微图形区域与功能化分子b接枝形成功能化分子层b。

本发明提出一种区域选择性可控化固定双分子薄膜的制备方法，包括以下步骤:在基体材料上制膜以形成反应底膜，而后在反应底膜上涂布光刻胶，而后剥离部分光刻胶；

反应底膜上剥离分部光刻胶的部分与功能化分子a进行反应，形成功能化分子层a；

而后剥离反应底膜上剩余的光刻胶，而后功能化分子b与反应底膜上剥离剩余的光刻胶的部分进行反应形成功能化分子层b。

本发明的有益效果是：本发明的区域选择性可控化固定双分子薄膜通过在反应底膜上接枝不同的功能化分子，形成不同的功能化分子层，使得最终的双分子膜具有不同生化功能，在通过物理手段调控细胞生长行为与功能的同时，通过双分子功能化协同作用或者互补作用进一步调控细胞的生长行为与功能，从而增加了其应用的实效性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1的区域选择性可控化固定双分子薄膜的荧光显示表征图；

图2为实施例1的区域选择性可控化固定双分子薄膜的光学显微镜表征图；

图3为实施例2的区域选择性可控化固定双分子薄膜的no催化释放曲线；

图4为实施例2的区域选择性可控化固定双分子薄膜的人脐静脉内皮细胞培养1天的荧光图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

下面对本发明实施例的区域选择性可控化固定双分子薄膜及其制备方法进行具体说明。

一种区域选择性可控化固定双分子薄膜，其包括功能化分子层a、功能化分子层b以及反应底膜。反应底膜具有分别与功能化分子a和功能化分子b发生反应的活化微图形区域；

部分反应底膜的活化微图形区域与功能化分子a接枝形成功能化分子层a，剩余反应底膜的活化微图形区域与功能化分子b接枝形成功能化分子层b。

反应底膜可以与具有不同生物功能地功能化分子a和功能化分子b进行接枝，继而得到的区域选择性可控化固定双分子薄膜同时具有功能化分子a和功能化分子b的功效，同时，还可能产生协同作用提升功能化分子a和/或功能化分子b的功效，且该区域选择性可控化固定双分子薄膜可以应用于生物医用材料。

进一步地，活化微图形区域是指可以分别与功能化分子a和功能化分子b进行反应的区域，而该具有可以被设置为不同地形状。

进一步地，反应底膜的活化微图形区域上具有可以分别与功能化分子a和功能化分子b进行迈克尔加成和/或席夫碱反应的官能团。通过迈克尔加成和/或席夫碱反应可以在活化微图形区域不同的区域进行反应，继而接枝不同的功能化分子a和功能化分子b，继而形成双分子结构。

进一步地，功能化分子a和功能化分子b均为含有氨基和/或硫醇基团的化合物。

且反应底膜为儿茶酚聚合物形成的底膜；

优选，儿茶酚聚合物是以儿茶酚类化合物作为单体经过聚合反应后得到的聚合物；

更优选，儿茶酚类化合物为多巴胺、左旋多巴、咖啡酸、真黑素、去甲肾上腺素和氢化咖啡酸中的任意一种或者至少两种。且本发明实施例中可以采用的儿茶酚类化合物不限于上述记载的物质，现有技术中的其他的儿茶酚类化合物也可利用。

进一步地，儿茶酚聚合物是将浓度为0.01mg/ml-20g/ml的儿茶酚类化合物在15-40℃、ph为5-12的条件下反应5分钟-72小时后形成的聚合物。儿茶酚聚合物的制备采用现有技术中的制备方法即可，本发明实施例不再进行详述。

利用儿茶酚类与含有氨基(-nh2)或硫醇(-sh)的功能化分子发生迈克尔加成与席夫碱反应形成有机沉积层从而实现薄膜层的表面改性，将表面功能由单一转向多功能。也就是说采用儿茶酚类化合物为单体制备反应底膜能够确保其与功能化分子a和功能化分子b发生反应。且采用的功能化分子a和功能化分子b是具有不同生化功能的分子，例如功能化分子a可以选用促进细胞粘附、抗凝血、促进舒张血管以及一氧化氮释放的药物溶液，或者其他现有技术中具有不同生化功能的药物溶液。而功能化分子b则选择生化功能不同于功能化分子a的生化功能的药物即可。并且双分子膜中引入含有氨基(-nh2)或硫醇(-sh)的功能化分子提供高活性的反应位点，为其进一步应用提供了较大发展空间，进而较大程度优化薄膜的功能化。

进一步地，本发明实施例还提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜的制备方法，包括以下步骤：

s1、制备反应底膜；

首先，选择合适的基体材料，基体材料可以选用金属、陶瓷和碳素中的任意一种，金属优选为316l不锈钢、铁及其合金、钴基合金、钛合金、镁合金、锌锰合金中的任意一种，陶瓷优选为活性陶瓷。采用上述基体材料生物相容性较好，对人体影响较小。

而后对基体材料进行清洗，清洗方式为现有的常规清洗方式，例如超声洗涤、溶剂冲洗等。

而后在基体材料表面制膜以形成反应底膜，具体地，是利用现有技术中的浸涂法制备该反应底膜，浸涂法制备反应底膜的条件为现有技术，本发明实施例不再进行详述。

s2、制备功能化分子层a；

首先，在反应底膜上涂布光刻胶，使得光刻胶均匀分布在反应底膜表面，而后进行软烘，光刻胶膜里面的溶剂缓慢地、充分地逸出来，使光刻胶干燥，软烘的时间为10分钟-6小时。

接着进行掩膜，且掩膜的时间为1-120秒。掩膜是利用掩膜板可以在反应底膜表面形成不同大小、不同形状的可以分别与功能化分子a和功能化分子b反应的活化微图形区域，继而便于形成两层功能化分子层a和功能化分子层b。

采用的掩膜板掩盖图形的形状多种多样，例如可以为长条形、方格形、椭圆形等任意一种或多种，且掩膜板掩盖图形的尺寸规模为0.01-5000μm之间的任意一种或多种进行组合，继而可以有效控制形成的功能化分子层a、功能化分子层b的形状和规格。

而后进行显影和坚膜，经过上述操作后使得部分活化微图形区域暴露出来，继而便于与功能化分子a进行反应。显影的时间为1-120秒，后烘的时间为10分钟-6小时。

而后将剥离部分光刻胶的基体材料浸入含有功能化分子a的溶液中反应底膜上裸露出来的活化微图形区域上的活性官能团与功能化分子a发生迈克尔加成和/或席夫碱反应继而形成的功能化分子层a。

进一步地，每毫升含有功能化分子a的溶液中含有功能化分子a为10微克-50毫克，采用上述浓度的溶液能够加速接枝形成功能化分子层a。

s3、制备功能化分子层b；

而后剥离剩余的光刻胶，再将含有功能化分子层a的基体材料浸入另一种含有功能化分子b的溶液里，使得反应底膜上剩余的活化微图形区域与功能化分子b接枝，继而形成功能化分子层b。

进一步地，每毫升含有功能化分子b的溶液中含有功能化分子b为10微克-50毫克，采用上述浓度的溶液能够加速接枝形成功能化分子层b。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜，区域选择性可控化固定双分子薄膜功能化分子层a、功能化分子层b以及反应底膜。其中，反应底膜为多巴胺聚合物形成的薄膜即为聚多巴胺薄膜；功能化分子层a为fitc-sh与部分聚多巴胺薄膜接枝后形成的fitc-sh薄膜层；功能化分子层b为rhodamine-sh与剩余聚多巴胺薄膜接枝后形成rhodamine-sh薄膜层。

本实施例还提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜的制备方法：

s1、制备反应底膜；

选用316l不锈钢为基体材料，采用浸涂法在经过清洗后的316l不锈钢材料表面沉积聚多巴胺薄膜，待用：其中，聚多巴胺是将浓度为0.001mg/ml的多巴胺在40℃、ph为10的条件下反应72小时后形成的聚合物。

s2、制备功能化分子层a；

将上述薄膜材料置于匀胶机的吸盘上，旋涂光刻胶，旋涂光刻胶后进行软烘，软烘的温度为70℃以上，软烘时间为20min以上；

将上述薄膜样品放入紫外光刻机规模为20μm*20μm条形掩膜板下用紫外光曝光10秒以上；

再用显影剂进行显影，而后进行后烘，后烘的温度为70℃以上，后烘的时间为10min以上，得到具有活化微图形区域的薄膜；

将上述薄膜材料表面浸入fitc-sh溶液中在暴露的聚多巴胺表面制备fitc-sh薄膜层，每毫升fitc-sh溶液中含有fitc-sh为10微克。

s3、制备功能化分子层b；

将上述样品浸入丙酮溶液中剥离剩余的光刻胶，随后将上述薄膜材料表面浸入rhodamine-sh溶液(每毫升rhodamine-sh溶液中含rhodamine-sh为10微克)在剥离出来的聚多巴胺表面制备rhodamine-sh薄膜层，从而得到同时含有两种荧光的微图形化区域选择性可控化固定双分子薄膜。

实施例2

本实施例提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜，区域选择性可控化固定双分子薄膜功能化分子层a、功能化分子层b以及反应底膜。其中，反应底膜为多巴胺聚合物形成的薄膜即为聚多巴胺薄膜；功能化分子层a为seca(硒代胱胺)与部分聚多巴胺薄膜接枝后形成的seca薄膜层；功能化分子层b为cysa(胱胺)与剩余聚多巴胺薄膜接枝后形成cysa薄膜层。

本实施例还提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜的制备方法：

s1、制备反应底膜；

选用316l不锈钢为基体材料，采用浸涂法在经过清洗后的316l不锈钢材料表面沉积聚多巴胺薄膜，待用：其中，聚多巴胺是将浓度为0.01mg/ml的多巴胺在15℃、ph为6的条件下反应72小时后形成的聚合物。

s2、制备功能化分子层a；

将上述薄膜材料置于匀胶机的吸盘上，旋涂光刻胶，旋涂光刻胶后进行软烘，软烘的温度为70℃以上，软烘时间为20min以上；

将上述薄膜样品放入紫外光刻机规模为10μm*10μm条形掩膜板下用紫外光曝光120秒；

再用显影剂进行显影，而后进行后烘，后烘的温度为70℃以上，后烘的时间为10min以上，得到具有活化微图形区域的薄膜；

将上述薄膜材料表面浸入seca溶液(每毫升seca溶液中含有seca为30微克)中在暴露的聚多巴胺表面制备seca薄膜层。

s3、制备功能化分子层b；

将上述样品浸入丙酮溶液中剥离剩余的光刻胶，随后将上述薄膜材料表面浸入cysa溶液(每毫升cysa溶液中含有cysa为30微克)在剥离出来的聚多巴胺表面制备cysa薄膜层，从而得到具有舒张血管以及一氧化氮释放等多种协同功能的微图形化区域选择性可控化固定双分子薄膜。

实施例3

本实施例提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜，区域选择性可控化固定双分子薄膜功能化分子层a、功能化分子层b以及反应底膜。其中，反应底膜为多巴胺聚合物形成的薄膜即为聚多巴胺薄膜；功能化分子层a为redv-nh2(氨基化的redv肽，redv肽为精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)与部分聚多巴胺薄膜接枝后形成的redv-nh2薄膜层；功能化分子层b为seca与剩余聚多巴胺薄膜接枝后形成seca薄膜层。

本实施例还提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜的制备方法：

s1、制备反应底膜；

选用316l不锈钢为基体材料，采用浸涂法在经过清洗后的316l不锈钢材料表面沉积聚多巴胺薄膜，待用：其中，聚多巴胺是将浓度为20mg/ml的多巴胺在30℃、ph为7的条件下反应6小时后形成的聚合物。

s2、制备功能化分子层a；

将上述薄膜材料置于匀胶机的吸盘上，旋涂光刻胶，旋涂光刻胶后进行软烘，软烘的温度为70℃以上，软烘时间为20min以上；

将上述薄膜样品放入紫外光刻机规模为20μm*20μm条形掩膜板下用紫外光曝光10秒；

再用显影剂进行显影，而后进行后烘，后烘的温度为70℃以上，后烘的时间为10min以上，得到具有活化微图形区域的薄膜；

将上述薄膜材料表面浸入redv-nh2溶液(每毫升redv-nh2溶液中含有redv-nh2为50毫克)中在暴露的聚多巴胺表面制备redv-nh2薄膜层。

s3、制备功能化分子层b；

将上述样品浸入丙酮溶液中剥离剩余的光刻胶，随后将上述薄膜材料表面浸入seca溶液(每毫升seca溶液中含有seca为50毫克)在剥离出来的聚多巴胺表面制备seca薄膜层，从而得到促进内皮细胞粘附以及抗凝等双重功能的微图形化区域选择性可控化固定双分子薄膜，

实施例4

本实施例提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜，区域选择性可控化固定双分子薄膜功能化分子层a、功能化分子层b以及反应底膜。其中，反应底膜为多巴胺聚合物形成的薄膜即为聚多巴胺薄膜；功能化分子层a为rgd-nh2(氨基化的rgd肽)与部分聚多巴胺薄膜接枝后形成的rgd-nh2薄膜层；功能化分子层b为heparin-sh(巯基化肝素)与剩余聚多巴胺薄膜接枝后形成heparin-sh薄膜层。

本实施例还提供一种区域选择性可控化固定双分子薄膜的制备方法：

s1、制备反应底膜；

选用316l不锈钢为基体材料，采用浸涂法在经过清洗后的316l不锈钢材料表面沉积聚多巴胺薄膜，待用：其中，聚多巴胺是将浓度为0.5mg/ml的多巴胺在25℃、ph为9的条件下反应20小时后形成的聚合物。

s2、制备功能化分子层a；

将上述薄膜材料置于匀胶机的吸盘上，旋涂光刻胶，旋涂光刻胶后进行软烘，软烘的温度为70℃以上，软烘时间为20min以上；

将上述薄膜样品放入紫外光刻机规模为30μm*30μm条形掩膜板下用紫外光曝光1秒；

再用显影剂进行显影，而后进行后烘，后烘的温度为70℃以上，后烘的时间为10min以上，得到具有活化微图形区域的薄膜；

将上述薄膜材料表面浸入rgd-nh2溶液(每毫升rgd-nh2溶液中含有rgd-nh220毫克)中在暴露的聚多巴胺表面制备rgd-nh2薄膜层。

s3、制备功能化分子层b；

将上述样品浸入丙酮溶液中剥离剩余的光刻胶，随后将上述薄膜材料表面浸入heparin-sh溶液(每毫升heparin-sh溶液中含有heparin-sh为20毫克)在剥离出来的聚多巴胺表面制备heparin-sh薄膜层，从而得到具有促进内皮细胞粘附以及抗凝等双重功能的微图形化区域选择性可控化固定双分子薄膜。

实施例5-实施例7

按照实施例1提供的方式制备含有两种荧光的微图形化区域选择性可控化固定双分子薄膜，区别在于具体地操作条件不同。

实施例5

采用的单体为左旋多巴，聚合物的反应条件为：左旋多巴单体的浓度为1mg/ml，反应温度为25℃，ph为8，反应时间为3小时。

基体材料为活性陶瓷，软烘的时间为24小时，掩膜的时间为24小时。掩膜板为方格形，尺寸为0.01um*0.01um，显影的时间为0.01分钟，后烘的时间为30分钟。且每毫升fitc-sh溶液中含有fitc-sh为5毫克，每毫升rhodamine-sh溶液中含有fitc-sh为5毫克。

实施例6

采用的单体为去甲肾上腺素，聚合物的反应条件为：去甲肾上腺素单体的浓度为2mg/ml，反应温度为35℃，ph为6.5，反应时间为20小时。

基体材料为钛合金，软烘的时间为2小时，掩膜的时间为5秒。掩膜板为方格形，尺寸为100μm*100μm，显影的时间为120分钟，后烘的时间为2分钟。且每毫升fitc-sh溶液中含有fitc-sh为35毫克，每毫升rhodamine-sh溶液中含有fitc-sh为35毫克。

实施例7

采用的单体为氢化咖啡酸，聚合物的反应条件为：氢化咖啡酸单体的浓度为10mg/ml，反应温度为37℃，ph为7.5，反应时间为30小时。

基体材料为钴基合金，软烘的时间为30分钟，掩膜的时间为5分钟。掩膜板为方格形，尺寸为50μm*50μm，显影的时间为60分钟，后烘的时间为30分钟。且每毫升fitc-sh溶液中含有fitc-sh为500微克，每毫升rhodamine-sh溶液中含有fitc-sh为500微克。

对实施例1制备得到的双分子层进行荧光显示，具体结果参见图1。图1中(b1)为fitc-sh功能化染料在491nm激发，(b2)为rhodamine-sh功能化红染料激发在545nm，(b3)为实施例1的双分子层荧光显微镜图像，通过图1发现荧光染料的接枝图案，重叠的荧光图像(b3)清楚地表明成功剥离了基底上全部的光刻胶以及制备了均一的条纹状微图形，得到同时含有两种荧光的微图形化区域选择性可控化固定双分子薄膜。

对实施例1的双分子膜进行光学显微镜(om)表征，具体参见图2，其中图2(a)为聚多巴胺pdam涂层，(b)紫外光刻胶pr涂层，(c)第一次pr显影后的pdam@pr微图案和(d)第二次pr显影后的表面的光学显微镜(om)图像，根据图2可知，在第一次显影后成功制备出了规整的微条纹表面，并在第二次显影后成功剥离了剩余的光刻胶，从而得到了较均匀表面。

对实施例2的双分子膜进行生化检测，具体检测包括no的催化养释放以及人脐静脉内皮细胞培养，检测结果参见图3和图4，其中，图3为pdam和cysa@seca-pdam的no催化释放曲线，图4为316lss、pdam和cysa@seca-pdam表面人脐静脉内皮细胞培养1天的荧光图片。

根据图3可知，一氧化氮释放速率曲线可知，接枝了cysa@seca-pdam的样品一氧化氮释放速率明显增多。

根据图4可知，与316lss对照样相比，cysa@seca-pdam样品表面内皮细胞密度明显更多，并且呈现一定的取向性，说明微图形化双分子薄膜具有促进内皮细胞粘附以及调控其生长的功能。

综上所述，本发明的区域选择性可控化固定双分子薄膜通过在反应底膜上接枝不同的功能化分子，形成不同的功能化分子层，使得最终的双分子膜具有不同生化功能，在通过物理手段调控细胞生长行为与功能的同时，通过双分子功能化协同作用或者互补作用进一步调控细胞的生长行为与功能，从而增加了其应用的实效性。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。