本发明属于制药领域，具体而言，本发明涉及对hcv感染具有治疗作用的核苷类ns5b聚合酶抑制剂(2s)-2-(((((2r,3r,4s,5r)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(asc21)的制备方法。
背景技术：
丙型肝炎病毒(hcv)是单链正义rna病毒，属于病毒的黄病毒(flaviviridae)科、肝炎病毒属。rna多基因的ns5b区域编码rna依赖性rna聚合酶(rdrp)，其对于病毒复制是至关重要的。在最初的急性感染后，由于hcv优先在肝细胞中复制而不直接引起细胞病变，大多数感染的个体发展为慢性肝炎。特别地，缺乏有力的t淋巴细胞响应和高病毒突变倾向似乎促成了高比率的慢性感染。慢性肝炎可以进展为肝纤维化，导致肝硬化、晚期肝病和hcc(肝细胞癌)，使其成为肝移植的主要原因。
存在六种主要的hcv基因型和超过50种的亚型，其地理分布不同。hcv基因型1是欧洲和美国的主要基因型。hcv的广泛的遗传异质性有重要的诊断和临床含义，也许可以解释在疫苗开发中的困难和对目前的治疗缺乏响应。
ns5brdrp对单链正义hcvrna基因组的复制是绝对必要的，这使其成为抗病毒化合物开发的有吸引力的靶标。有两大类ns5b抑制剂：非核苷抑制剂(nni)和核苷类似物。nni结合到蛋白的变构区域，而核苷抑制剂合成代谢(anabolize)为相应的核苷酸并充当聚合酶的供选择的底物。随后形成的核苷酸掺入新生rna聚合物链并且可以终止该聚合物链的生长。目前，ns5b的核苷和非核苷抑制剂均是已知的。
申请号为wo2016140615的专利申请公开了一种可用于治疗hcv感染的核苷类ns5b聚合酶抑制剂(2s)-2-(((((2r,3r,4s,5r)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯，结构如下式asc21所示；在本发明中为了方便，将该化合物命名为asc21，其化学式为c21h26clfn3o9p，该核苷类ns5b聚合酶抑制剂适合制备hcv感染的治疗药物。
申请号为wo2016140615的专利申请同时公开了一种用于制备如上式所述的asc21的方法，参考该专利提供的工艺制备。该路线具有以下缺点：工业化成本较高，后续环境污染较大，并且使用大量的dmpu(1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-嘧啶酮)，容易残留到产品中，且难以用tlc检测反应，后续需经反相柱纯化去除，成本高昂。
技术实现要素：
因此，本发明的一个目的是克服现有技术的缺点和不足，提供一种用于制备核苷类ns5b聚合酶抑制剂asc21的方法，该方法具有成本低、易操作、易质量控制且适合大规模工业化操作的优点。
在本发明中，除非特别说明，所述式asc21-rm1所示的化合物的化学名称为(2r,3r,4s,5r)-5-(4-苯甲酰氨基-2-氧代嘧啶-1(2h)-基)-4-氯-4-氟-2-((4-甲基苯甲酰氧基)甲基)-3-甲基-4-甲基苯甲酸甲酯：
所述式asc21-a所示的化合物的化学名称为(2r,3r,4s,5s)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2h)-基)-4-氟-2-((4-甲基苯甲酰氧基)甲基)四氢呋喃-3-基4-甲基苯甲酸酯：
所述式asc21-b所示的化合物的化学名称为1-((2r,3s,4r,5r)-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1h,3h)-二酮：
所述式asc21-rm2所示的化合物的化学名称为(s)-异丙基2-((s)-(五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸异丙酯：
一方面，本发明提供了一种式asc21所示的核苷ns5b聚合酶抑制剂的制备方法，包括下述步骤：
步骤1.在酸存在下，式asc21-rm1所示化合物进行水解反应，得到式asc21-a所示化合物；
步骤2.在碱存在下，式asc21-a所示的化合物进行水解反应，得到式asc21-b所示化合物；
步骤3.在不使用dmpu的条件下，在叔丁基氯化镁存在下，式asc21-b所示化合物与式asc21-rm2在10～15℃下反应，得到式asc21所示化合物；
根据本发明所述的方法，其中，在所述步骤3中，在不使用dmpu的条件下，在-15～-10℃下滴加叔丁基氯化镁并在1～2小时内滴完，随后缓慢升温至10～15℃，式asc21-b所示的化合物与式asc21-rm2所示的化合物反应，得到式asc21所示化合物；
上述制备方法的反应方程式如下所示：
根据本发明所述的方法，其中，在步骤1中，所述酸为有机酸，优选为醋酸、甲酸、丙酸或三氟乙酸；
优选地，所述反应在水中进行；
优选地，所述反应的温度为110～120℃；
优选地，所述反应的时间为18～20h。
根据本发明所述的方法，其中，在步骤2中，所述碱为有机碱，优选为三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、正丙胺或正丁胺；
优选地，所述反应在有机溶剂中进行；更优选地，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或异丁醇；
优选地，所述反应的温度为65℃～70℃；
优选地，所述反应的时间为18～20h。
根据本发明所述的方法，其中，在步骤3中，所述升温的时间为2～3小时，且每小时升温5℃；
优选地，所述反应在有机溶剂中进行；更优选地，所述有机溶剂为四氢呋喃、甲基四氢呋喃或二氧六环；
优选地，升温后，所述反应的时间为8小时。
本发明的发明人发现，通过本发明的方法，在不使用dmpu的前提下，通过适当提高反应温度来加快反应速度，并且减少tbumgcl的投料量，能使反应转化率达到预期，同时还能将二磷酸酯杂质控制在一个可接受的范围(反应液中9％～15％)；
在一个具体的实施方案中，t-bumgcl的投料量从原来的2.2个当量降到1.3当量。
在一个优选的实施方案中，所述制备方法各步骤的反应方程式如下所示：
其中，所述方法包括以下步骤：
步骤1.向反应容器中加入式asc21-rm1所示化合物、冰醋酸和水，磁力搅拌，加热至110～120℃进行反应18h，过滤，干燥，得到式asc21-a所示化合物；
步骤2.向反应容器中加入式asc21-a化合物、甲醇和三乙胺，磁力搅拌，加热至65～70℃进行反应18h，浓缩，萃取，过滤，结晶，干燥，得到式asc21-b所示化合物；
步骤3.在氮气的保护下，在不使用dmpu的条件下，向反应容器中加入式asc21-b所示化合物、四氢呋喃和式asc21-rm2所示化合物，搅拌，转速为250～300r/min，降温至-15～-10℃并控温在-15～-10℃，向反应容器中滴加叔丁基氯化镁并在1～2小时内滴完，然后缓慢升温至10～15℃，反应8小时，淬灭，萃取，浓缩，柱层析，过滤，干燥，即得。
其中，所述柱层析使用硅胶柱层析。
其中，在所述反应过程中，使用tlc检测。
与现有技术相比，本申请提供的制备方法具有以下优点：
成本较低，操作容易，反应检测容易，后续产品纯化较易，易于质量控制，后续的环境降解容易，对环境污染较小，更适合大规模的工业化生产。
具体实施方式
实施例1wo2016140615的合成路线
1.1工艺路线
1.2制备方法
步骤1：asc21-a的制备
1.向洁净玻璃反应釜中加入醋酸(26.05kg，434mol，70.8eq)，水(13.35kg，741mol，120eq)和3.8kg的asc21-rm1(3.8kg，6.13mol，1.0eq)，搅拌加热回流(110～120℃)反应18h。
2.中控hplc检测反应完毕后，反应液降温至60℃，加入13.35kg的水，搅拌降至室温，搅拌2h。过滤，滤饼用12.5kg水洗涤，收集滤饼。
3.干燥：滤饼在通风干燥箱40℃下干燥24h，得2.7kg灰白色固体。hplc纯度91.4％，收率85％。
步骤2：中间体asc21-b的制备(使用正丙胺)
1.反应：向洁净玻璃反应釜中加入asc21-a(2.72kg，5.26mol，1.0eq)、21.3kg甲醇，而后加入正丙胺(3.1kg52.4mol，10eq)，28℃下反应22h。
2.浓缩：中控合格后，反应液在40℃减压浓缩至冷凝器基本无馏分。
3.萃取：加入6.4kg水和16.9kg二氯甲烷，搅拌后，萃取，静置分层，收集水相，水相再用二氯甲烷重复萃取两次，有机相再用1.5kg水洗，合并水相。而后用3mol/l盐酸调至ph＝1.12，再用11kg2-甲基四氢呋喃萃取，难于分层。
4.过滤：在漏斗上垫硅藻土，将粗品溶液过滤，用2-甲基四氢呋喃洗涤滤饼，而后静置分出有机相。
5.结晶：滤液在60℃减压蒸馏，而后浓缩物反复用醋酸异丙酯夹带，至目测析出大量固体。降温至20-25℃搅拌10-15分钟。过滤，滤饼用醋酸异丙酯洗涤，得灰白色固体。
6.干燥：滤饼在35℃，减压干燥15.5h，得1123.9g灰白色固体。hplc纯度99％，收率76％。
步骤3：asc21的制备
1.反应：向洁净玻璃反应釜1中加入16.55kg四氢呋喃和asc21-rm2(22.119kg，4.67mol，1.25eq)，dmpu(4.526kg，35.3mol，9.5eq)在18-23℃搅拌待用，向反应釜2中加入asc21-b(1044g，3.72mol，1.0eq)，22.15kg四氢呋喃，氮气保护降温至-9℃，控温-8～-10℃，向底物中滴入20.7％叔丁基氯化镁-四氢呋喃溶液(4.45kg，7.88mol，2.1eq)，67分钟滴完。滴毕，-10℃左右搅拌42分钟。控温-8～-10℃将反应釜1中的物料缓慢加入到反应釜2中，反应15h。
2.淬灭：中控合格后，滴入9.92kg1mol/l盐酸，控温≤8℃。
3.萃取：加入21.3kg甲苯，升温至20℃，静置分层，收集上层有机层。有机层用9.93kg1mol/l盐酸洗涤，然后用5wt％碳酸钠洗涤3次(10kg/次)，收集上层有机层。合并碱水层，用甲苯/四氢呋喃混合液(8.25kg甲苯+8.25kg四氢呋喃)萃取，收集上层有机层。合并有机层，依次用8.25kg含0.1mol/lhcl的25wt％nacl水溶液、8.25kg25wt％nacl水溶液洗涤。
4.浓缩：有机层在50℃下减压浓缩而后用甲醇夹带去除甲苯，形成甲醇的溶液。
5.柱层析：残余物的甲醇溶液用自制的反相色谱柱(bp-c，18.4um，0.15％tfa)纯化。洗脱剂为甲醇/水(从1/1到3：2到4：1，v/v)，
6.萃取：所得目标物洗脱液减压浓缩除去大量甲醇，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用硫酸镁干燥，过滤
7.浓缩：滤液减压浓缩至无馏分，向残余物中加入4kg丙酮再次浓缩，重复此操作2次。
8.干燥：白色固体在50℃下真空烘干得1432.2g类白色固体(hplc纯度98.4％，收率70％)。
在根据该实施例的制备方法中，dmpu使用的量较多，产品中残留较大，最终产品中含有0.15％的dmpu；而且dmpu、asc21、二磷酸酯杂质三者在tlc监控反应时发现很难分开。
实施例2本发明的合成路线
2.1工艺路线
2.2制备方法
步骤1：asc21-a的制备
表1物料配比
操作步骤：
1.反应：向洁净干燥的1l三口瓶中加入43.0gasc21-rm1、294.8g冰醋酸和151.1g水，磁力搅拌，加热至110℃反应。反应18h。
2.过滤：中控合格后，降温至60℃，滴入150.5g水，搅拌30分钟。再降温至15℃，搅拌1h。过滤，滤饼用150.5g水洗涤，收集滤饼。
3.干燥：滤饼在40℃，-0.085～-0.098mpa下减压干燥12h，得31.8g灰白色固体。hplc纯度87.8％，收率88.8％。
步骤2：中间体asc21-b的制备
表2物料配比
操作步骤：
1.反应：向洁净干燥的500ml三口瓶中加入30.6gasc21-a、192.8g甲醇和59.9g三乙胺，磁力搅拌，加热至70℃反应。反应18h。
2.浓缩：中控合格后，反应液在50℃水浴，-0.070mpa下旋蒸至冷凝器基本无馏分。
3.萃取：加入120g水和100g正庚烷，搅拌5分钟后静置分层，收集下层。上层再用100g水洗，收集下层。合并下层，用3mol/l盐酸调节ph＝2，再用2-甲基四氢呋喃萃取3次(103g/次)，收集上层。
4.过滤：在布氏漏斗上垫2.0g硅藻土，将粗品溶液过滤，用31g2-甲基四氢呋喃洗涤滤饼，收集滤液。
5.结晶：滤液在50℃水浴，-0.098mpa下旋蒸至剩100ml残余物，趁热滴入89g醋酸异丙酯，逐渐析出固体。继续旋蒸至剩100ml残余物，加入178g醋酸异丙酯。继续旋蒸至剩150ml残余物，降温至15℃搅拌0.5h。过滤，滤饼用18g醋酸异丙酯洗涤，得灰白色固体。
6.干燥：滤饼在40℃，-0.098mpa下减压干燥8h，得10.8g灰白色固体。hplc纯度99.5％，收率65.6％。
步骤3：asc21的制备
表3物料配比
1.反应：氮气保护下，向洁净干燥的500ml玻璃反应釜中加入12.6gasc21-b、189.5g四氢呋喃和26.5gasc21-rm2，开启搅拌，转速250r/min，降温至-10℃。控温-10℃，向底物中滴入59ml叔丁基氯化镁，2h滴完。滴毕，缓慢升温至15℃反应(每小时约升温5℃)。反应8h，取样约0.3ml进行hplc中控，控制原料asc21-b≤5.0％。若不合格，则降温至-10℃，则根据asc21-b的剩余量，依次补加1.3当量的asc21-rm2和1.3当量的叔丁基氯化镁。滴毕，缓慢升温至10℃反应(每小时约升温5℃)，再次取样。
2.淬灭：中控合格后，降温至-5℃，滴入88.4g1mol/l盐酸，控温≤12℃。
3.萃取：加入253g甲苯，升温至25℃，静置分层，收集上层有机层。有机层用126g1mol/l盐酸洗涤，然后用5wt％碳酸钠洗涤3次(126g/次)，收集上层有机层。合并碱水层，用甲苯/四氢呋喃混合液(110g甲苯+110g四氢呋喃)萃取，收集上层有机层。合并有机层，依次用160g包含0.1mol/lhcl的25wt％nacl水溶液、160g25wt％nacl水溶液洗涤。
4.浓缩：有机层在65℃水浴，-0.098mpa下旋蒸至冷凝器无馏分。
5.柱层析：残余物用柱层析纯化。200～300目硅胶用量为200g，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(30/1，v/v)，tlc监控(展开剂：二氯甲烷/甲醇(10/1，v/v)，254nmuv显色)收集rf约0.5的主点。所得目标物洗脱液在35℃水浴，-0.098mpa下旋蒸至冷凝器无馏分，得11.9g类白色固体。hplc纯度98.2％，收率63.9％。
6.过滤：将类白色固体溶于160.0g丙酮，过滤，收集滤液。
7.浓缩：滤液在40℃水浴，-0.070mpa下旋蒸至冷凝器无馏分。
8.溶解：向残余物中加入3.8g丙酮和124.9g甲基叔丁基醚，搅拌溶请，再加入25.2g甲基叔丁基醚，待用。
9.结晶：向1l三口瓶中加入457.4g正庚烷，开启机械搅拌，转速450r/min，降温至5～10℃。将上述配好的产物溶液滴入正庚烷中，析出白色固体，约1小时滴完。滴毕，继续搅拌30分钟。
10.过滤：抽滤，用25.2g正庚烷洗涤滤饼。
11.干燥：滤饼在45℃，-0.098mpa下干燥16h后，取样检测残留溶剂，要求正庚烷≤5000ppm。若不合格，则继续干燥。4小时后再次取样检测残留溶剂，直至合格。得11.3g类白色固体。hplc纯度98.2％，收率60.7％。
实施例3本发明的合成路线
3.1工艺路线
3.2制备方法
步骤1：asc21-a的制备
表4物料配比
操作步骤：
1.反应：向洁净干燥的1l三口瓶中加入43.0gasc21-rm1、294.8g三氟乙酸和151.1g水，磁力搅拌，加热至120℃反应。反应20h。
2.过滤：中控合格后，降温至65℃，滴入150.5g水，搅拌30分钟。再降温至5℃，搅拌1h。过滤，滤饼用150.5g水洗涤，收集滤饼。
3.干燥：滤饼在50℃，-0.085～-0.098mpa下减压干燥12h，得31.8g灰白色固体。hplc纯度：80.2％，收率：62.4％。
步骤2：中间体asc21-b的制备
表5物料配比
操作步骤：
1.反应：向洁净干燥的500ml三口瓶中加入30.6gasc21-a、192.8g异丙醇和76.36gdiea，磁力搅拌，加热至65℃反应。反应20h。
2.浓缩：中控合格后，反应液在60℃水浴，-0.098mpa下旋蒸至冷凝器基本无馏分。
3.萃取：加入120g水和100g正庚烷，搅拌10分钟后静置分层，收集下层。上层再用100g水洗，收集下层。合并下层，用3mol/l盐酸调节ph＝1，再用2-甲基四氢呋喃萃取3次(103g/次)，收集上层。
4.过滤：在布氏漏斗上垫2.0g硅藻土，将粗品溶液过滤，用31g2-甲基四氢呋喃洗涤滤饼，收集滤液。
5.结晶：滤液在60℃水浴，-0.070mpa下旋蒸至剩90ml残余物，趁热滴入89g醋酸异丙酯，逐渐析出固体。继续旋蒸至剩90ml残余物，加入178g醋酸异丙酯。继续旋蒸至剩150ml残余物，降温至5℃搅拌0.5h。过滤，滤饼用18g醋酸异丙酯洗涤，得灰白色固体。
6.干燥：滤饼在50℃，-0.085～mpa下减压干燥8h，得10.8g灰白色固体。hplc纯度98.3％，收率56.2％。
步骤3：asc21的制备
表6
1.反应：氮气保护下，向洁净干燥的500ml玻璃反应釜中加入12.6gasc21-b、189.5g四氢呋喃和26.5gasc21-rm2，开启搅拌，转速300r/min，降温至-15℃。控温-15℃，向底物中滴入59ml叔丁基氯化镁，1h滴完。滴毕，缓慢升温至10℃反应(每小时约升温5℃)。反应8h，取样约0.3ml进行hplc中控，控制原料asc21-b≤5.0％。若不合格，则降温至-15℃，则根据asc21-b的剩余量，依次补加1.3当量的asc21-rm2和1.3当量的叔丁基氯化镁。滴毕，缓慢升温至15℃反应(每小时约升温5℃)，再次取样。
2.淬灭：中控合格后，降温至5℃，滴入88.4g1mol/l盐酸，控温≤12℃。
3.萃取：加入253g甲苯，升温至15℃，静置分层，收集上层有机层。有机层用126g1mol/l盐酸洗涤，然后用5wt％碳酸钠洗涤3次(126g/次)，收集上层有机层。合并碱水层，用甲苯/四氢呋喃混合液(110g甲苯+110g四氢呋喃)萃取，收集上层有机层。合并有机层，依次用160g包含0.1mol/lhcl的25wt％nacl水溶液、160g25wt％nacl水溶液洗涤。
4.浓缩：有机层在50℃水浴，-0.070mpa下旋蒸至冷凝器无馏分。
5.柱层析：残余物用柱层析纯化。200～300目硅胶用量为200g，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(30/1，v/v)，tlc监控(展开剂：二氯甲烷/甲醇(10/1，v/v)，254nmuv显色)收集rf约0.5的主点。所得目标物洗脱液在55℃水浴，-0.070mpa下旋蒸至冷凝器无馏分，得11.9g类白色固体。hplc纯度为97.1％，收率63.2％。
6.过滤：将类白色固体溶于160.0g丙酮，过滤，收集滤液。
7.浓缩：滤液在50℃水浴，-0.098mpa下旋蒸至冷凝器无馏分。
8.溶解：向残余物中加入3.8g丙酮和124.9g甲基叔丁基醚，搅拌溶请，再加入25.2g甲基叔丁基醚，待用。
9.结晶：向1l三口瓶中加入457.4g正庚烷，开启机械搅拌，转速350r/min，降温至5～10℃。将上述配好的产物溶液滴入正庚烷中，析出白色固体，约1小时滴完。滴毕，继续搅拌30分钟。
10.过滤：抽滤，用25.2g正庚烷洗涤滤饼。
11.干燥：滤饼在40℃，-0.085mpa下干燥16h后，取样检测残留溶剂，要求正庚烷≤5000ppm。若不合格，则继续干燥。4小时后再次取样检测残留溶剂，直至合格。得9.7g类白色固体，hplc纯度98.2％，收率52.1％。
实施例4本发明的反应条件的筛选
本发明的发明人发现，现有技术中得到本申请的产物，需要使用dmpu助溶，该反应在-10～-20℃的低温下进行，使反应液呈均相，以加快反应速度。但dmpu在水相和有机相均有较好的溶解性，后处理完成以后仍有大量dmpu残留到产品中去。而且dmpu、asc21、二磷酸酯杂质三者在tlc监控反应时发现很难分开，难以用普通的正相硅胶进行分离，而需要用c-18反相硅胶进行分离。使用反相硅胶分离虽然分离效果很好，但是也有很多缺点。首先反相硅胶价格昂贵，是普通硅胶价格的200～300倍。其次，考虑到反相硅胶需反复使用，产品在上柱前必须严格处理，不能将其他异物带入到反相硅胶中，影响后续使用，这便增加了后处理的难度。最后，反相硅胶柱层析必须严格控制残留溶剂，以免影响柱效，这也给后处理带来一定难度。
出乎意料地，发明人发现，不使用dmpu，通过适当提高反应温度来加快反应速度。通过减少tbumgcl投料量，从原来的2.2个当量降到1.3当量提高反应温度，能使反应转化率达到预期，也能将二磷酸酯杂质控制在一个可接受的范围(反应液中9％～15％)。
具体地，比较本申请与现有技术的方法，发明人发现，使用本发明的方法，在满足目标产物的质量指标前提下，避免使用难以去除的dmpu，使得产品较容易纯化。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。